UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPASFacultad de ciencias químicas

Campus IV (Extensión Ocozocoautla)

Práctica 2“Estudio del bombeo de protones por

levaduras”Bioquímica

Profesor: Dra. Ana Cañas Olivia Cañas Urbina

Licenciatura: Químico Farmacobiólogo

Integrantes:

Espinoza López YuridiaGómez Pérez Maritza ElizabethMorales Gonzales Ana Laura

Hernández Nigenda Diana LauraZamayoa Espinosa Aida Patricia

Cuarto semestre

Extensión Ocozocoautla de Espinosa Chiapas,

A 26 de Agosto del 2015

IntroducciónPara la realización de esta práctica fundamentaremos en el por qué

debemos realizarla y para ello primero debemos tener en claro que son las

levaduras:

Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se

dividen por gemación. Gonzalez, A. y Valenzuela, L. nos dicen que la levadura es

un nombre genérico que agrupa a una variedad de hongos, incluyendo tanto

especies patógenas para plantas y animales, como especies no solamente

inocuas sino de gran utilidad. De hecho, las levaduras constituyen el grupo de

microorganismos más íntimamente asociado al progreso y bienestar de la

humanidad. Algunas especies de levaduras del género Saccharomyces, son

capaces de llevar a cabo el proceso de

fermentación, propiedad que se ha explotado

desde hace muchos años en la producción de

pan y de bebidas alcohólicas. Desde el punto

de vista científico, el estudio de las levaduras

como modelo biológico ha contribuido de

manera muy importante a elucidar los

procesos básicos de la fisiología celular.

Dentro del género Saccharomyces, la especie cerevisiae constituye la levadura y

el microorganismo eucariote más estudiado (Fig. 1). Este organismo se conoce

también como la levadura de panadería, ya que es necesario agregarla a la masa

que se utiliza para preparar el pan para que este esponje o levante; de hecho el

término levadura proviene del latín levare, que significa levantar.

En general, se considera que las levaduras, se desarrollan mejor en medios

ácidos (3.8 -5.6), más sin embargo, estas pueden tolerar un rango de pH que va

desde 2 hasta 8 y en una temperatura de entre 0 – 50 °C (García, V. s.f.).

En el manual de laboratorio de la UNAM nos dice que las levaduras común con

otras células eucariontes, tienen un núcleo (en donde reside la información

Práctica 2“Estudio del bombeo de protones por

levaduras”Bioquímica

Profesor: Dra. Ana Cañas Olivia Cañas Urbina

Licenciatura: Químico Farmacobiólogo

Integrantes:

Espinoza López YuridiaGómez Pérez Maritza ElizabethMorales Gonzales Ana Laura

Hernández Nigenda Diana LauraZamayoa Espinosa Aida Patricia

Cuarto semestre

Extensión Ocozocoautla de Espinosa Chiapas,

A 26 de Agosto del 2015

Figura 1. Levaduras Saccharomyces cerevisiae

genética de la célula), mitocondrias (en donde se lleva a cabo la síntesis de ATP)

y un retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la síntesis de

proteínas cuya localización final es la membrana plasmática o el exterior. A nivel

de la membrana plasmática, las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla la

hidrólisis del ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Como

resultado de la actividad de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un

gradiente electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de

nutrientes al interior de la célula, proceso catalizado por sistemas de transporte

llamados simportadores o uniportadores. Las levaduras tienen otra bomba de

protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa, que se

encarga de la síntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana

plasmática, el flujo de protones a través de la ATP sintasa induce la síntesis de

ATP.

Las levaduras son organismos heterótrofos por lo que requieren de carbono

orgánico para obtener energía y el carbono para la síntesis de sus componentes

celulares. Sin embargo, los requerimientos nutricionales específicos de las

levaduras pueden variar considerablemente entre las diferentes especies. Como

por ejemplo:

Según García, V. (s.f.) nos dice que los azúcares constituyen el mejor alimento

energético de las levaduras con las que pueden catalizar la GLUCOSA, ya se en

forma aerobia (respiración) o anaeróbica (fermentación).

Entre otras fuentes de carbono que utilizan, están como la glucosa, fructosa,

manosa y galactosa. Por norma general, las levaduras mantienen dos tipos de

metabolismo muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones en las que

existen altas concentraciones de glucosa, fructosa o maltosa, la tendencia es a

realizar una fermentación alcohólica de estos, es decir, se realiza la glucólisis y

posteriormente se forma etanol y una vez que los azúcares escasean, se produce

la respiración del etanol, vía ciclo de Krebs (Gonzales, et al., s.f.)

Entonces decimos que la glucolisis es la ruta central del catabolismo de la

glucosa. Se degrada la glucosa con un doble objetivo:

a) obtener energía en forma de ATP

b) suministrar precursores para la biosíntesis de componentes celulares

Se produce en todas las células de mamíferos, siendo casi la fuente de energía

exclusiva.

En el 2003 Vázquez nos dice que la fosforilación oxidativa es la

transferencia de electrones en la cadena de transporte de electrones es

energéticamente favorable porque el NADH es un poderoso donador de electrones

y el Oxígeno molecular es un potente aceptor de electrones. De hecho el flujo neto

de electrones desde el NADH hasta el Oxígeno resulta en la síntesis de ATP. El

evento vital se lleva a cabo en la membrana plasmática bacteriana, en la

membrana interna mitocondrial y en los tilacoides de los cloroplastos.

Posteriormente se verificó que la síntesis de ATP es una reacción endergonica, en

la cual la respiración o consumo de 02 acopladas a la fosforilación del ADP,

genera energía. En los seres vivos la oxidación de moléculas orgánicas tiene

como resultado el movimiento de protones (H+) del interior de la matriz

mitocondrial al espacio intermembranal en mitocondrias y cloroplastos o bien al

citoplasma en las bacterias. La cadena de transporte de electrones y la

fosforilación oxidativa estuvieron separadas conceptualmente por mucho tiempo.

Las observaciones de la formación del ATP hacían pensar a los investigadores en

buscaba un intermediario fosforilado de la reación. Hasta que en 1961 Peter

Mitchell propuso la hipótesis quimiosmótica en la cual propuso que el intermediario

energético necesario para la formación del ATP (o fosforilación del ADP), era una

diferencia en la concentración de protones a través de la membrana.

Objetivo:

Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras.

Hipótesis:

Si las levaduras consumen glucosa, se observará una disminución progresiva de

su concentración en el medio de cultivo con el tiempo y cambios en el pH

extracelular.

Material y método (Utilizados en el laboratorio)

Material:3 vasos de precipitado de 100 ml Agua destilada

Pipetas de 5 y 7 ml Tiras indicadoras de pH

Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ml

Solución glucosa (10 %) para una concentración final de 1 %

Método realizado:

1. (Nota: Este procedimiento se realizó dos veces por error de cálculo)

Se realizaron las diluciones de levadura y glucosa para soluciones de 5 ml.

2. Se diluyeron 5 ml de levadura en 40 ml de agua

3. Se determinó el pH de la solución luego, se repitieron las mediciones dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal.

4. Se adicionó 5 ml de glucosa a 10 %, agitando y midiendo el pH.

5. Se determinó el pH de la solución cada 5 minutos 4 veces, y luego cada 10 minutos 2 veces más.

Resultados De acuerdo con los cálculos realizados, para la soluciones (paso 1 y 2). Las

mediciones de pH tomadas en diferentes tiempos se muestran en las tablas 1, 2 y

3 el cual se comparó la gráfica 2 con la gráfica 1.

PASO 1

100 ml de solución 10 g de glucosa

5 ml de solución

Entonces se requieren 0.5 5 g de glucosa en 4.5 ml de H2O.

PASO 2

1 g de levadura para una solución total de 5 ml

Entonces se requieren 1 g de levadura en 4 ml de H2O

.

Para obtener los resultados, el PH fue tomado con el siguiente material:

0.5 g de glucosa

Tabla 1. Linea Basal

Tiempo Minutos pH1 0 52 3 53 6 6

Tabla 2. Levadura + Glucosa cada 5 minutos

Tiempo Minutos pH1 0 52 5 43 10 4.54 15 55 20 4.8

Tabla 3. Levadura + Glucosa cada 10 minutos

Tiempo Minutos pH1 30 42 40 4

Gráfica 1. Línea basal

Grafica 2. Se observa los cambios de pH en los diferentes intervalos de tiempo

mostrados en la tabla 2 y la tabla 3, en el eje “Y” se muestra el pH medido y en el

eje X se muestra los tiempos tomados

1 2 34.44.64.8

55.25.45.65.8

66.2

pH de la levadura

pHde la levadura

TIEMPO

pH

Discusión de resultadosDe acuerdo a como se mencionó en los resultados el pH inicial (línea basal) fue de

5, según Parés & Juárez (2002) en el libro de Microbiología mencionan que el pH

de la levadura oscila entre 3.5 y 4.5 más sin embargo este dio un cambio

repentino pero; así como dice también García, V. las levaduras, se desarrollan

mejor en medios ácidos (3.8 -5.6), más sin embargo, estas pueden tolerar un

rango de pH que va desde 2 hasta 8, entonces como este estaba en un rango de 5

y sube a 6 podemos decir que la línea basal esta correcta.

Con respecto a los resultados del pH de levadura + glucosa La gráfica 2 nos

muestra el aumento y disminución de iones hidrógeno en el medio extracelular,

como nos menciona Campbell en el 2005 que el medio se encontraba más ácido,

esto es debido a la oxidación de los transportadores de electrones que hace que

se produzca el bombeo de protones, aunque esto no se cumplió del todo en la

práctica ya que hubieron cambios repentinos de pH que se pudieron observarse

en la experimentación durante los 20 minutos esto se debió a los problemas

técnicos, el cual no se utilizó el potenciómetro, esto hizo que afectara los

resultados y como la lectura se realizó con tiras de pH dependen del observador y

por ello la gráfica pudo mostrar las variaciones.Transcurrido los 30 minutos la

gráfica 1 muestra una constante del pH, esto podría deberse a lo que menciona

1 2 3 4 5 6 70

1

2

3

4

5

6

Cambios de pH en la levadura + glucosa

Cambios de pH en la levadura + glucosa

TIEMPO

pH

Cebedo en el 2010 que la ATPasa lleva a la homeostasis del pH de la levadura, se

piensa que si no estuviera esta enzima la célula moriría por acidosis al igual que

en las células del organismo, la célula necesita mantener este equilibrio

homeostático debido a que el pH del organismo no puede variar demasiado

porque rompería este equilibrio.

.

Conclusión Se comprobó la hipótesis planteada que si las levaduras consumen glucosa, tendrá un

cambio en el pH y por ende, una disminución de concentración en el medio con el

incremento del tiempo, hasta llegar a un equilibrio.

En la práctica se observó una variación del pH, pero finalmente este

disminuye, debido a la ATPasa que es la enzima localizada en la

membrana de saccharomyces cerevisiae y es la encargada de bombear

protones para regular el pH.

Se piensa que la saccharomyces cerevisiae, al ser una levadura que

requiere del aporte de glucosa para la obtención de energía, y a su vez

producen un cambio de pH por la fosforilación oxidativa.

Referencias

Trabajos citadosCampbell, J. &. (2005). Biología (7a ed.). Madrid, España: Panamericana. Recuperado el 22 de

Agosto de 2015, de https://books.google.com.mx/books?id=QcU0yde9PtkC&pg=PA175&dq=fermentacion+alc oholica&hl=es&sa=X&ved=0CCQQ6AEwAmoVChMIl8Hp1O27xwIVC0qSCh3xog8W#v=onep age&q=fermentacion%20alcoholica&f=false

Cebedo, M. (28 de Mayo de 2010). Caracterización de la regulación de la protón ATPasa PMA1 por parte de la ruta TOR en levadura S. Valencia: UPV. Recuperado el 22 de Agosto de 2015, de https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/18485/TFC%20Marc%20cabedo.pdf?seque nce=1

Garcia, V. (s.f.). Introducción a la microbiología. Recuperado el 22 de Agosto de 2015, de https://books.google.com.mx/books?id=K_ETVnqnMZIC&pg=PA108&dq=QUE+SON+Las+levaduras&hl=es-419&sa=X&ved=0CBwQ6AEwAGoVChMI4MO8seHHxwIVxwmSCh29lgpG#v=onepage&q&f=false

Gonzalez, A. y. (s.f.). Saccharomyces cerevisiae. Recuperado el 23 de Agosto de 2015, de Departamento De Genetica Molecular, Instituto De Fisiologia Celular. Universidad Nacional Autonoma De Mexico: http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap16/

González, C. e. (s.f.). RAPIDEZ DE FERMENTACIÓN POR Saccharomyces cerevisiae DE ALGUNOS TIPOS DE GLUCIDOS. Recuperado el 24 de Agosto de 2015, de http://www.acmor.org.mx/sites/default/files/1103.pdf

MANUAL DE PRACTICAS DE LABORTORIO . (s.f.). Recuperado el 22 de Agosto de 2015, de http://www.facmed.unam.mx/fm/pa/2010/practicas/practicas_bioquimica.pdf

Vazquez, E. (04 de Octubre de 2003). Bioquimica y biología molecular en linea. Recuperado el 25 de Agosto de 2015, de Instituto de químicas, UNAM: http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/introduccion%20fosforilacion%20oxidativa.html

Parés, R. & Juaréz, A. (2002). Microbiologia de los organismos. Barcelona España: REVERTÉ. Recuperado de: https://books.google.com.mx/books?id=eHK7eHXBRk4C&pg=PA44&dq=ph+de+la+levadura&hl=es&sa=X&ved=0CCcQ6AEwAmoVChMIkpjHyKTFxwIVR6qACh1ctg-I#v=onepage&q=ph%20de%20la%20levadura&f=false

Alarcón, O., Muñoz, K., García, A. & García, M. (2014). Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los inhibidores de la cadena de transporte de electrones y desacoplantes. Recuperado de: https://www.academia.edu/8081279/Bioq_1_rep_2_