CÁNCER DE MAMA Y AUTORRENOVACIÓN DE CÉLULAS MADRE TUMORALES

Tema: cáncer de mama

Autores / Authors: Luz Pombo Parada*, Jesús Ferre Fernández#, Paola Castro García#, Carmen Gil Gas#, Paloma Honrubia Gómez#, Carmen Belén Álvarez Simón#, Antonio Fernández Aramburo*, Ana Isabel Ferrer Pérez*,José Luis Sánchez Sánchez*, Carmen Soriano Rodríguez*.

Filiación: *Sección de Oncología Médica, Complejo Hospitalario Universitario de Albacete. #Centro Regional de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Castilla-la Mancha.

Introducción / IntroductionLas Células madre, como población quiescente con capacidad autorrenovante, han sido identificadas en gran parte de los procesos cancerosos. Los problemas actuales de recaídas y reversión de los tumores son debidos a la presencia de células madre tumorales, resistentes a los tratamientos actuales y capaces de regenerar un tumor desde una sola célula. El estudio de la autorrenovación de la célula madre tumoral es muy útil para conseguir controlar e inhibir dicho proceso en futuras terapias antitumorales. Se ha demostrado el efecto de la proteína PEDF en la capacidad de autorrenovación. En las células madre PEDF se une a receptores de membrana y esta unión se realiza a través del dominio C-terminal. Además, la versión truncada de PEDF puede inhibir de forma competitiva el efecto de la proteína completa. Sin embargo, poco se sabe de la cascada de señalización por la cual esta proteína ejerce su efecto. Por tanto, el conocimiento de la ruta de señalización y el estado de PEDF son objetivos de máxima actualidad e importancia como clave de las futuras aplicaciones terapéuticas. Los ensayos con PEDF y su fragmento carboxilo-terminal, tanto in vivo como en líneas tumorales, pueden abrir nuevas vías de estudio sobre el ciclo celular y su control en eventos tumorales.

* Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, Weissman IL.Nature 2001; 414:105-1* Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, Weissman IL.Nature 2001; 414:105-1* Kondo, Cancer Biomarkers, 3 (2007) 245–250* Kondo, Cancer Biomarkers, 3 (2007) 245–250* Nagrath et al. NATURE, Vol 450, 20/27 December 2007* Nagrath et al. NATURE, Vol 450, 20/27 December 2007* Bidlingmaier S, J Mol Med, 2008* Bidlingmaier S, J Mol Med, 2008

Referencias / References:

Objetivos / ObjetivesEn este trabajo se pretende estudiar el mecanismo de acción por el cual PEDF está implicado en la regulación de la autorrenovación de las células madre tumorales. Para ello, se usan la proteína PEDF y su extremo C-terminal como herramienta en ensayos in vivo sobre células madre presentes en líneas. Se estudian, por tanto, los fenómenos de proliferación, perpetuación y la posible inactivación de estas células, así como el perfil genético del ciclo celular.

Métodos / MethodsObtención de proteínas en medios condicionados por transfección de 293T, cuantificación y comprobación de las proteínas obtenidasCultivo, tratamiento y monitorización de la línea celular comercial de ascitis de mama MCF7 y de la línea obtenida del ascitis de un paciente con carcinoma mamario en estado avanzado Pa00

Fotografiado, recuento celular y curvas de crecimiento, ensayos de seguimiento de división celular Time Lapse.Análisis de expresión génica: extracción de ARN, síntesis de cADN, PCR cuantitativa en tiempo real.

Resultados / Results

Conclusiones / Conclusions*El extremo C-terminal de la proteína PEDF hace que disminuya la población de células quiescentes, reduce la tasa de proliferación final y puede conducir al agotamiento del cultivo.*La velocidad de división en la fase temprana de cultivos tratados con C-terminal aumenta con respecto a las células no tratadas, posiblemente debido a la desaparición de células quiescentes y explicando el agotamiento del cultivo.*El aumento de la expresión en genes de ciclo como en la ciclina D1 y la ciclina kinasa CDK4 (proteínas iniciadoras del ciclo celular) parece indicar que C-terminal activa el ciclo célular como se corrobora con el aumento en la velocidad de división en fase temprana.

Curva de crecimiento Pa00

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 5 10 15 20

Mill

on

es

de

cé

lula

s

DIV

Pa00

Pa00-PEDF

Pa00-Cter

Logarítmica(Pa00)

Logarítmica(Pa00-PEDF)

Logarítmica(Pa00-Cter)

Curva de crecimiento MCF7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0

DIV

Mil

lon

es d

e cé

lula

s

MCF7

MCF7-Cter

MCF7-PEDF

Logarítmica(MCF7)

Logarítmica(MCF7-Cter)

Logarítmica(MCF7-PEDF)

Curvas de crecimiento de las líneas Pa00 y MCF7 tratadas con PEDF y C-ter. Las células tratadas con PEDF (línea amarilla) se expanden menos con respecto a las células control. Las células tratadas con el extremo C-ter (línea rosa) ven su expansión mucho mas reducida con respecto tanto al control como a las células tratadas con PEDF.

Fotos de distintos pases de las células tumorales MCF7 tratadas con PEDF y C-ter. Las células tratadas con PEDF presentan una disminución del crecimiento con respecto a las células control a lo largo de los pases. En las células tratadas con C-ter el cultivo se agota con los pases y a simple vista se aprecia un cambio en la morfología a lo largo de los tratamientos.

8,28,8

4,65,4

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

MCF7 Pa00

Tiem

po d

e di

visi

ón c

elul

ar (h

oras

)

Control

Cter

43%

90%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Control C-ter

% c

élu

las q

uie

scen

tes

P21

11,39

1,050,34

0

2

4

6

8

10

12

14

Pa00 P-PEDF P-C-Ter

P27

1,13 0,74

3,62

0

2

4

6

8

10

12

14

Pa00 P-PEDF P-C-Ter

D1

2,21

0,221,00

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Pa00 P-PEDF P-C-Ter

CDK4

0,421,01

3,60

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Pa00 P-PEDF P-C-Ter

División celular en MCF7 y Pa00 tratadas con C-ter en fase temprana del cultivo. Las células tratadas con C-ter se dividen en menos horas que las líneas control. C-ter hace que las células se dividan de forma más rápida. En la gráfica se aprecia el resultado del estudio llevado a cabo en 100 puntos micrográficos por línea

Micrografias secuenciales de las “flat cell” o células quiescentes (Señaladas con flechas) en la línea MCF7. En la línea control las células quiescentes mantienen su morfología y no entran en división a lo largo del tiempo. En la línea tratada con C-ter este tipo de célula entra en división y desaparece. Este estudio llevado a cabo en 100 células por línea resulta en un descenso del 45% en el número de células quiescentes en células tratadas con C-ter con respecto a la línea control.

Estudio preliminar de la expresión génica de genes de ciclo en Pa00 tratadas con PEDF y C-ter. Aumenta la expresión de los inhibidores de ciclo, de las ciclinas D1 y B1 y de la ciclina kinasa CDK4 en las células tratadas con C-ter con respecto a la línea control. Disminuye ligeramente la expresión de genes de ciclo en células tratadas con PEDF.