Upload
chiper-zaharia-daniela
View
219
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
n
Citation preview
CAPITOLUL 17SCREENING-UL DE MARE CAPACITATE ŞI ANALIZA MICROARRAY
17.1. Screeningul sistemelor de analiză de mare capacitate în testarea preclinică a medicamentelor
17.1.1. Introducere
Screeningul sistemelor de analiză de mare capacitate (high throughput
screening - HTS) conţine o combinaţie de robotică modernă, procesare de date şi
software pentru control, dispozitive de manipulare a lichidelor şi detectori sensibili
care permit prelucrarea eficientă şi fără probleme a milioane de teste biochimice,
genetice sau farmacologice într-un timp scurt. Acesta oferă o metodă rapidă, cu un
cost eficient pentru screening-ul potenţialelor surse de molecule noi, folosite frecvent
în producţia medicamentelor.
Spre deosebire de procedurile de screening convenţionale sau manuale, HTS
permite manipularea unei largi varietăţi de probe de intrare; fiecare probă este
etichetată cu un set propriu de date şi de urmărire a rezultatelor şi produce noi
rezultate experimentale. HTS face posibilă obţinerea unor cantităţi mari de date
experimentale, legate de observaţii în ceea ce priveşte reacţiile biologice la expunerea
la compuşi chimici diferiţi. În toxicologia competitivă şi farmaceutică, intervalul de
timp pentru dezvoltarea medicamentelor şi testarea preclinică în trialuri clinice este
deosebit de importantă.
Abordările tradiţionale ale cercetătorilor din industria farmaceutică nu
îndeplinesc cerinţele actuale ale programelor de dezvoltare a medicamentelor. HTS
foloseşte automatizări de laborator pentru a colecta cantităţi mari de date toxicologice
şi farmacologice şi profiluri fiabile pentru o serie de activităţi biologice, în cele din
urmă informaţia fiind încorporată în biblioteci/arhive de produse chimice mari.
Disponibilitatea acestor biblioteci şi sisteme robotizate pentru bioteste permite sinteza
şi testarea a mii de compuşi zilnic.
17.1.2. Proceduri
În pregătirea pentru un test, godeurile microplăcilor sunt umplute cu o ţintă
biologică cum ar fi o proteină, celule intacte sau un embrion de origine animală. Ţinta
absoarbe, se leagă de, sau reacţionează cu compuşii din godeuri după un timp de
incubare prestabilit. Măsurătorile sunt înregistrate manual sau automat în toate
godeurile plăcii*. Analizele automate se desfăşoară pe mai multe probe simultan
folosind indicatori, cum ar fi reflexivitatea sau transmisia luminii polarizate prin
intermediul ţintei. Datele rezultate sunt înregistrate ca o grilă de valori numerice, cu
fiecare număr identificându-se valoarea obţinută dintr-un singur godeu.
Echipamentele pentru analizele de mare capacitate măsoară zeci de plăci în minute,
generând astfel rapid mii de puncte de date experimentale.
17.1.3. Echipament
Staţia de lucru HTS conţine un manipulator de lichide, o placă de replicare şi
dispozitive de umplere şi etanşare a plăcii. O varietate de microplăci cu godeuri sunt
utilizate; majoritatea au de la 96 la 384 godeuri. Fiecare godeu este marcat cu ţinte
experimentale, compuşi chimici sau este blanc/liber. În plus, există dispozitive
automate de manipulare a lichidelor, de detectare şi alte sisteme robotizate.
Cititoarele de absorbanţă a plăcilor şi detectoarele sunt utilizate pentru măsurători
cinetice în teste enzimatice sau celulare.
Citometrele cu scanare laser a fluorescenţei pentru microplăci oferă un
screening cu conţinut înalt la o capacitate compatibilă cu protocoalele primare şi
secundare de screening pentru testele bazate pe fluorescenţă.
Caracteristicile robotice îndeplinesc sarcini autonome sau preprogramate şi
sunt capabile de screening-ul de biblioteci combinatorice faţă de screening-ul ţintelor,
utilizând teste pe bază de celule. Capacităţile medii zilnice a celor 480 de microplăci
pot genera peste 180 000 de date punctuale.
* Măsurătorile manuale sunt deseori necesare atunci când examenul microscopic este utilizat pentru a detecta modificări în dezvoltarea embrionară, cauzate de compuşii de test.
2
17.1.4. Aplicaţiii
Aplicaţiile biologice şi chimice pentru descoperirea medicamentelor şi
analizele toxicologice sunt aplicabile pentru identificarea compuşilor activi
toxicologic sau farmacologic, a anticorpilor şi genelor care modulează căi
biomoleculare speciale. Aceste rezultate furnizează puncte de plecare pentru design-
ul de medicamente şi pentru înţelegerea mecanismelor sau interacţiunii moleculelor
ţintă în procesele biochimice (Cummins, Velculescu, 2006).
În plus, tehnologia este utilă în identificarea medicamentelor candidate noi faţă
de cele existente în bibliotecile de substanţe chimice pentru abilitatea lor de a
modifica ţinte (de exemplu, capacitatea unui agent chimic de a modifica o protein
kinază ţintă).
Ca metodă folosită pentru producţia unor medicamente, HTS, depistează
proprietăţile biologice şi fizice ale ţintelor şi construieşte un model de predicţie
pentru a clasifica substanţele chimice care interacţionează cu un situs activ (sau
receptor) de interes.
Odată ce o serie de molecule active sunt stabilizate cu suficientă potenţă a
ţintei, selectivitate şi proprietăţi favorabile asemănătoare medicamentelor, unul sau
mai mulţi compuşi desemnaţi principali sunt propuşi pentru dezvoltarea
medicamentelor; alţi compuşi sunt consideraţi "back-up-uri" (de rezervă). Nu este
neobişnuit pentru sectoarele de cercetare şi dezvoltare să realizeze screening-ul a
100000 până la 300000 de compuşi per screening pentru a genera 100 - 300 "reuşite".
În medie, una sau două reuşite sunt atribuite seriilor de compuşi activi. Screening-uri
mari de la 2 milioane la 3 milioane compuşi [screening-uri de ultracapacitate
(UHTS)] sunt necesare pentru a genera 7–10 compuşi activi/lead compounds
(compuşi chimici care au activitate biologică sau farmacologică).
Aceştia sunt folosiţi ca puncte de plecare pentru modificări chimice cu scopul
de a îmbunătăţii potenţa, selectivitatea şi parametrii farmacokinetici. Îmbunătăţirile în
generarea de compuşi activi vin de asemenea, din optimizarea diversităţii
bibliotecilor.
3
17.1.5. Direcţii viitoare în HTS
Candidaţii pentru dezvoltarea unor medicamente utilizate în intervenţii
terapeutice şi identificarea agenţilor toxici au crescut interesul pentru a produce
candidaţi clinici pentru noi medicamente şi respectiv construcţia de modele pentru
analiza riscului uman. Cererea a stimulat identificarea compuşilor activi cu o rată
mult mai rapidă decât cea disponibilă în prezent. Acest imperativ a forţat o schimbare
tehnologică faţă de formatul plăcilor de mare densitate (1536 şi 9600 godeuri),
pipetarea de ordinul nanolitrilor şi imagistică simultană.
Testele de miniaturizare pot fi capabile să faciliteze screening-ul de până la
500000 compuşi per săptămână, în timp ce se minimizează costurile reactivilor.
Chimia combinatorie a oferit oportunităţi duble în dezvoltarea bibliotecilor mari de
compuşi pentru screening-ul cu analogi rapizi ai compuşilor activi.
În cele din urmă, HTS s-a extins spre identificarea ţintei, validarea şi conversia
testelor pentru substanţe active definite pe calea generării informaţiei, fie pe calea
screening-urilor sau prin testarea în aval, ADME de mare capacitate (absorţie,
distribuţie, metabolism şi excreţie) şi a toxicităţii.
17.2. Sisteme microarray
17.2.1. Introducere
Microarray-urile sunt teste în miniatură ale fragmentelor de gene ataşate
lamelor de sticlă. Prezentarea a mii de fragmente de gene într-un singur test permite
detectarea modificărilor expresiei genelor într-o fracţiune semnificativă din totalitatea
genomului. Array-urile/aranjamentele lineare de molecule sunt imobilizate în locaţii
discrete, pe o suprafaţă inertă care permite analize simultane.
Tehnologia microarray este utilizată frecvent pentru că este conceptual simplă,
uşor de pus în aplicare şi este bine controlată având în vedere interesul tot mai mare
pentru studiile paralele de mare capacitate. În ultimul deceniu, microarray-urile au
evoluat de la array-uri bazate pe membrane cu densitate joasă la cipuri de siliciu cu
mare densitate.
4
17.2.2. Tipuri de aray-uri
Microarray-urile ADN au moleculele ADN imobilizate în locaţii specifice, pe
suprafaţa de sticlă sau de siliciu. Acestea sunt dezvoltate ca platforme pentru
studierea expresiei genice şi detectarea mutaţiilor şi vor fi analizate mai jos. În mod
similar, microarray-urile pentru proteine care încorporează anticorpi la nivelul
poziţiilor imobilizate nu au fost încă utilizate pe scară largă.
17.2.3. Designul microarray-urilor ADN
Microarray-urile ADN sunt fabricate în două formate, în funcţie de tipul de
moleculă imobilizat. Array-urile conţinând produşi PCR de 200 - 2000 kilobaze
perechi sunt imobilizate de-a lungul lungimi moleculelor prin legături încrucişate
uşoare la suprafaţa arrayului/membranei (adesea menţionată ca un ADN
complementar sau array ADNc ). Alternativ, sonde oligonucleotidice pot fi sintetizate
in situ pe array sau pre-sintetizate şi apoi fixate prin legături covalente terminale.
Figura 17.1 prezintă o procedură pentru un protocol asociat cu plăcile microarray
ADNc.
Figura 17.1. Producţia şi paşii în tehnologia ADNc microarray (Sursa: National Human Genome Research Institute, U.S. National Institutes of Health, http://www.genome.gov/10000533.)
5
Protocolul în tehnologia microarray ADNc începe cu marcarea fluorescentă a
moleculelor de ARNm prezente în celule mamiferelor de interes. ARNm marcat este
apoi pipetat în godeurile lamei de microarray şi hibridizează cu secvenţele
complementare de ADNc pe microarray. Intensitatea fluorescenţei este proporţională
cu numărul de molecule ARNm produse de gradul de activitate al genei de interes,
indicând hibridizarea corepunzătoare a ADNc (Lettieri, 2006).
17.2.4. Obţinerea microarray-urilor
Microarray-urile sunt produse pe baza unor tehnologii diferite, inclusiv
fotolitografia, spoturile robotice şi imprimarea (metode pe bază de pini/ace şi metode
piezoelectrice cu pini). Fotolitografia este metoda cea mai utilizată pe scară largă
pentru sinteza ADN in situ pe array-uri pentru a forma microarray-uri
oligonucleotidice (Gibson, 2006). Tehnica permite sinteza unui număr mare de array-
uri cu densitate înaltă.
Spoturile robotice folosesc un braţ robotic pentru a depozita oligonucleotidele
presintetizate şi fragmentele ADN amplificate prin PCR pe suprafaţa array.
Dispozitivul conţine o piesă intermediară pentru oprirea lamelor imprimate şi un braţ
robotic care utilizează pini speciali pentru a ridica soluţiile de la o sursă, de obicei
plăci cu 384 de godeuri.
În metoda de imprimare bazată pe pini, un exemplu de sistem cu două căi de
imprimare prin contact, pinii de oţel sunt utilizaţi pentru a transfera volume fixe de
soluţie ca spoturi pe suprafaţa array. Vârful plat al pinilor formează spoturi de un
diametru corespunzător diametrului vârfului. Cantitatea de soluţie absorbită de către
vârful pinului este proporţională cu tensiunea superficială a lichidului. Ulterior, când
pinul atinge suprafaţa array, volume fixe de soluţie sunt eliberate. Volumul soluţiei
eliberate depinde de mulţi factori, în special de chimia suprafaţei lamei şi a timpului
de contact între cele două suprafeţe.
Imprimarea piezoelectrică pe bază de pini este un exemplu de metodă non-
contact care conţine un rezervor pentru soluţia de imprimare şi un capilar pentru
6
distribuire.Cristalele piezoelectrice sunt dispuse aproape de capilar. Atunci când la
nivelul cristalelor este aplicată o tensiune, ele se deformează, comprimând împreună
pereţii capilarului şi forţând lichidul să iese prin orificiu.
17.2.5. Tehnologia de detectare
Cele mai multe dintre sistemele actuale se bazează pe detectarea fluorescenţei.
Sistemele sunt sensibile pentru transcripţii biologic activi, mai sigure de manipulat
decât metodele bazate pe radionuclizi şi permit detectarea de probe multiple.
Cele două tipuri principale de sisteme de detecţie disponibile pentru
microarray-uri sunt scanerele şi camerele optice mai puţin utilizate pe scară largă.
Scanerele utilizează mişcarea optică sau substraturi pentru a colecta semnale de la
zone mici de pe lamă pentru forma o imagine întreagă. Alternativ, camerele optice
preiau producţia de pe întregul array, adică de pe întreaga membrană simultan. Ca şi
alte detectoare de fluorescenţă utilizate frecvent în testele de citotoxicologie,
aparatura este programată pentru a evalua controalele, blancurile, normalizarea
datelor (egalizarea datelor din experimente comparative) şi autofluorescenţa.
Datele generate de obicei, sunt analizate ca puncte dispersate care reprezintă
comparaţia profilelor expresiei genelor din diferite condiţii experimentale. De obicei,
intensităţi fluorescente de la diferiţi coloranţi corespunzând la lungimi de undă
diferite sunt schiţate unul faţă de celălalt; culoare roşie este folosită pentru a descrie
supra-exprimarea şi verde este folosit pentru sub-expresie. Figura 17.2 prezintă o
lamă de sticlă microarray ADNc cu fluorescenţă tipică pentru detectarea datelor
rezultate fluorescente.
17.2.6. Aplicaţii ale tehnologiei microarray ADN
17.2.6.1. Expresia genică
Microarray-urile ADNc sunt cele mai utilizate pe scară largă pentru studiul
expresiei genelor. ARNm este izolat din celulele de interes, în absenţa sau prezenţa
unui agent toxic sau medicament. ADNc este preparat din cele două probe marcate
folosind coloranţi fluorescenţi roşu (cel mai frecvent verde fluoresceina şi rodamina).
7
Astfel cum este descris mai sus, după hibridarea moleculelor de ADNc cu sonda pe
membrană raportul de fluorescenţă roşu-verde este proporţional cu nivelurile relative
ale genei din test şi probele de referinţă. Expresia genei în protocoalele tradiţionale de
cercetare are multe aplicaţii în cercetare şi în clinică, dintre care unele sunt descrise
mai jos.
Figura 17.2 Exemplu de microarray imprimat pe lamă de sticlă format standard 1"×3". Lamele sunt accesibile scanerelor microarray 1"×3" standard (după Barile, 2004)
17.2.6.2. Genotipare / Detectarea SNP
De asemenea microarray-urile sunt folosite pentru dezvoltarea de cipuri pentru
detectarea şi screening-ul polimorfismelor mononucleotidice (SNPs). Un SNP este o
variantă a unei secvenţe de ADN, ce apare atunci când un singur nucleotid din genom
diferă între membrii unei specii sau între cromozomii pereche la un individ. Tehnica
este aplicabilă pentru detectarea diferenţelor mononucleotidice din fragmentele
8
secvenţelor de ADN în două alele de la persoane diferite (de exemplu, AAGCCTA la
AAGCTTA). Diferenţelor de hibridizare datorate schimbărilor unei singure perechi
de baze sunt detectate prin intermediul aranjmentelor oligonucleotidice, ceea ce
asigură condiţii pentru un control riguros al hibridizării.
Alternativ, sunt de asemenea folosite metode bazate pe extinderea primerilor
care exploatează incapacitatea mai multor ADN polimeraze să extindă catena unde
nucleotidul teminal 3' nu este potrivit perfect.
17.2.6.3. Detectarea agenţilor de mediu
Aplicaţiile toxicologice de mediu ale tehnologiei ADN microarray s-au
multiplicat, ca urmare a capacităţii sistemului de a monitoriza contaminanţi. De
exemplu, microarray-urile sunt utilizate pentru detectarea rapidă a microbilor în apa
contaminată, pentru indentificarea agenţilor patogeni în alimentele prelucrate, precum
şi pentru monitorizarea alterării produşilor alimentari şi medicamentoşi (Breitting,
2006).
9