Comportamientos intracelulares :retculo endoplsmico, complejode Golgi, endosomas' lisosomasy peroxlsomas

T-t

-l estudio de las clulas eucariotas pasa por la compren-sin de una serie de orgnulos intracelulares de membra-na, que llevan a cabo diferentes actividades celulares. Entreellas se encuentran el almacenamiento yla transcripcin deinformacin gentica, la sntesis de protelnas de secrecin,la hidrlisis de cidos grasos de cadena larga y muchos otrosprocesos metablicos propios de las clulas eucariticas,que tienen lugar en cada orgnulo. Adems de esto, es esen-cial que el intercambio de molculas entre los orgnulos, co-nocido como trfico, est regulado de forma muy precisa,para asegurar que cada orgnulo recibe los componentesapropiados a su estructura y funcin. As pues, el conoci-miento del papel de las membranas intracelulares y de lacompartimentacin de funciones, es bsico en el estudio delas clulas eucariotas.

En el Captulo 4 describimos brevemente los principa-les orgnulos de las clulas eucariotas posteriormente, enlos Captulos 10 y 11 nos ocupamos de las mitocondrias ylos cloroplastos. Estamos ahora en disposicin de conside-rar en detalle otros orgnulos. Aqu nos centraremos en losque aparecen destacados en la Figura 12.1. Comenzaremoscon el retculo endoplsmico rugoso y liso y con el complejode Golgi" qae son los lugares de sntesis, procesamiento y dis-tribucin de protenas. Luego analizaremos los iisosomas ylos endosomas. Los endosomas tempranosy tardos son or-gnulos esenciales en el transporte y distribucin de losmateriales que la clula toma por endocitosis, as como enla maduracin de los lisosomas, que son los orgnulos res-

ponsables de la digestin celular, tanto de sustancias extra-celulares, como de los componentes intracelulares super-fluos o daados. Para terminar discutiremos la coleccin defunciones propias delos peroxisomts, en los que tienen lu-gar reacciones qumicas que generan perxidos y que son,adems, esenciales en la oxidacin de cidos grasos y en lasntesis de ciertos lpidos de membrana.

Cuando estudiemos estos orgnulos, tendremos pre-sente que el retculo endoplsmico, el aparato de Golgi, losendosomas y los lisosomas (pero no los peroxisomas), per-tenecen al denominado sistema de endomembranas de lasclulas eucariotas. La envuelta nuclear, que se analizar enel Captulo 18, es tambin parte"de este sistema. Como sepuede apreciar en la Figura l2.I,la membrana externa dela envuelta nuclear es continua con la membrana del ret-culo endoplsmico y el espacio perinuclear,limitado por lasdos membranas de la envuelta, se contina con el espaciodel retculo endoplsmico, conocido como luz o lumen delRE. A resultas de esto, las molculas difunden librementeentre estos compartimientos. El material tambin puedefluir desde el retculo endoplsmico al aparato de Golgi,losendosomas y los lisosomas, por medio de vesculas de inter-cambio, que actan de lanzaderas entre diferentes orgnu-los. Tales vesculas portan lpidos y protenas de membra-na, as como molculas solubles. En suma, los orgnulos ylas vesculas que los conectan, forman un sistema nico demembranas y espacios internos, a servicio del metabolismocelular. como veremos en breve.

Comportamientos intracelulares: retculo endoplsmico, complejo de Golgi, endosomas, lisosomas y peroxisomas 351

Membrana plasmtica

Vescula deEndosomatardo

tsJ

Vesculasde transporte

Aparatode Golgi

Vesculasde secrecin

Vesculasendoplsmicol iso

Ribosomasde transicin

Retculoendoplsmicorugoso

CIToSoL

Figura 12'L Estructuras celulares analizadas en este captulo. Esta leccin se centra en el estuclio del retculo endoplsmico, el complejo deGolgi y los peroxisomas, incluyendo tambin referencias a la envuelta nuclear v a la membrana plasmtica. El espacio perinuclear enir" lasdos membranas de la envuelta nuclgar es contiguo con el interior del retculo ndoplsmico. ri., u ,,-, vez, est relacionado con los espaciosinternos del complejo de Golgi, de los endosomas y de los lisosomas, gracias a las vesculas que se intercambian entre ellos. Este con;unto demembranas y espacios internos (excluyendo a los peroxisomas) constituyen el denominado iirt.-u de endomembranas de las clulaseucariotas; el resto del citoplasma se denomina citosol.

LisosomaEnvueltanuclear

IVEDIO FXTRACEIULAR

Espacio per inuclear

Luzde l RE

nidad por los colorantes bsicos. Dichas regiones se deno-minaron con el nombre genrico de ergastoplasma, cuyosignificado permaneci oscuro hasta los aos 50, con el ad-venimiento de la microscopa electrnica. De esta forma, Iosbilogos celulares reconocieron la red elaborada de mem-branas del RE e iniciaon la investigacin de su papel en losprocesos celulares. sta es una situacin frecuente en losdescubrimientos cientf icos: ios progresos en el conoci-miento ocurren, a menudo, a remolque de los progresos tec-nolgicos en campos afines, o incluso no relacionados di-rectamente. Ms recientemente, Ios avances en la tecnologade microchip y en tcnicas de protemica-el estudio in vi-tro de las interacciones protena-protena- ha arrojadoms luz al conocimiento de la estructura y funcin del RE.

Hoy en da se sabe que las enzimas presentes en el REson responsables de la sntesis de protenas que se incorpo-ran en el propio RE, el complejo de Golgi, los endosomas,los lisosomas y la membrana plasmtica. En el RE se sinte-

@ol,P*

9oPeroxisomas - \=-

El retculo endoplsrnieoEl retculo endoplsmico (RE) es una red continua de sa-cos aplanados, tbulos y vesculas, que se distribuye portodo el citoplasma de las clulas eucariotas. Su nombre aun-que pueda sonar rimbombante, es muy descriptivo. Endo-plsmico significa

tizan tambin las protenas que sern segregadas por la c-luia. Asimismo, el RE es pieza clave en la biosntesis de lpi-dos, incluyendo a los triglicridos, el colesterol y compues-tos relacionados. El RE es la fuente de la mayora de loslpidos que forman parte de las membranas intracelularesy de la membrana plasmtica.

Los dos tipos bsicos de etculo endoplsmico difierenen estfuctura y funcinLos dos tipos de retlculo endoplsmico propios de las clu-las eucariotas, se distinguen por la presencia o ausencia deribosomas anclados en la cara externa de su membrana (Fi-gtna I2.2). El retlculo endoplsmico rugoso (RE rugoso)tiene ribosomas unidos en la cara citslica (externa) de sumembrana (Figura 12.2a). Los ribosoms contienen RNA,responsable de la intensa tincin con colorantes bsicosusados para identificar el ergastoplasma, hoy da reconoci-do como RE rugoso. Un territorio especfico del RE,los ele-mentos de transicin (ETs), intervienen en la formacin delas veslculas de transicin, que exportan lpidos y protenashacia el aparato de Golgi. El retculo endoplsmico liso(RE liso) tiene tal apariencia por la ausencia de ribosomasen su membrana (Figura I2.2b).

Ambos retculos pueden distinguirse, adems, por sumorfologa. Como se ve en la Figura 12.1, las membranasdel RE rugoso forman, en general, sacos aplanados, mien-tras que las del RE liso tienden a formar tubulos. Los ele-mentos de transicin del RE rugoso constituyen una ex-cepcin a esta regla, y a menudo recuerdan al RE liso. Lapresencia o ausencia de ribosomas, refleja la diferencia fun-cional entre los dos tipos de retculos de las clulas euca-riotas. En todo caso, no son orgnulos independientes; lamicroscopa electrnica demuestra la continuidad entre lasluces de ambos. Asl, los materiales pueden viajar entre el REliso y el rugoso, sin necesidad de vesculas de transporte.

Los dos tipos de retculo estn presentes en la mayorade las cluias eucariotas, si bien su volumen vara conside-rablemente en funcin de la actividad celular. Las clulasque llevan a cabo una importante actividad de sntesis deprotelnas, suelen tener una red muy desarrollada de retcu-lo rugoso. Por otra parte, en las clulas que producen hor-monas esterodicas, hay un claro predominio del RE liso.

Cuando se homogeneizaun tejido para obtener frac-ciones subcelulares, las membranas del RE suelen romper-se en pequeos fragmentos, que se cierran espontnea-mente en vesculas denominadas microsomas. Cuando losmicrosomas son sometidos a centrifugacin diferencial, sepuede aislar una fraccin sin y otra con ribosomas, que re-flejan su lugar de procedencia. Este tipo de preparacin esextremadamente ti1 para el estudio de las dos variedadesde RE. Tngase presente que los microsomas no existen enlas clulas, sino que son artefactos de la tcnica. En el Ane-xo 12A se facilita informacin detallada al respecto de lafragmentacin subcelular por centrifugacin diferencial.

El RE rugoso est implicado en la sntesis ypfooesamento de protenasLos ribosomas unidos ala cara citoslica de la membranadel RE rugoso, son los responsables de la sntesis de prote-nas, tanto solubles, como de membrana, Estas protenassuelen incorporarse en los sistemas de endomembranas y enla membrana plasmtica, o bien son exportadas como pro-ductos de secrecin.

Cmo entran las protelnas en el sistema de endomem-branas? Muchas de ellas son descargadas hacia la luz del RErugoso durante su propia slntesis (insercin cotraslacio-nal). Despus de la biosntesis las protenas de membranaquedan ancladas a la membrana del retculo por sus regio-nes hidrfobas o por uniones covalentes de llpidos de mem-brana. Las protenas solubles ylamayoria de las protenas

(a) Retculo endoplsmico rugoso

Figwa L2.2 Retculo endoplsmico liso y rugoso. (a) Micrografta electrnica del retculo endoplsmico. El RE rugoso est salpicado conribosomas (TEM). (b) Micrograffa electrnica del retlculo endoplsmico liso (TEM).

-q5tr' (b) Retculo endoplsmico l iso r--:-;---------'lu , 5 p m

El retculo endoplsmico 353

Anexo

Le cENrRrFUcACrN: uNA rcNrceIMPRESCINDIBLE EN BIoLoce CELULARLa centrifugacin es una tcnica insustituible para elaislamiento y purificacin de orgnulos y macromolculas. Estemtodo se basa en el hecho de que cuando una partcula sesomete aunafuerza centrfuga, su velocidad de desplazamientoen una disolucin dada, depende deI tamaoy densidad delapartcula, as como de la viscosidad y densidad de la solucin.Cuanto mayor y ms densa sea la partcula, mayor es Iavelocidad de sedimentacin, o de movimiento por la solucin.Puesto que la mayora de los orgnulos y macromolculasdifieren sustancialmente unos de otros en tamao o densidad,centrifugando una mezcla de componentes de la clula, sesepararn, o resolvern, Ios de migracin ms rpida de los mslentos. Este procedimiento se conoce como fraccionamientosubcelular y permite a los investigadores aislar y purificarorgnulos especficos y macromolculas, para su posteriormanipulacin y estudio.

En 1974 Albert Claude, George Palade y Christian de Duvecompartieron el Premio Nobel, por sus trabajos pioneros en lacentrifugacin y fraccionamiento subcelular. Claude desempeun papel esencial en el desarrollo de la centrifugacindiferencial, como mtodo de aislamiento de orgnulos. Paladeestuvo presto a usar esta tcnica en el estudio del retculoendoplsmico y complejo de Gogi, estableciendo las funcionesde estos orgnulos en la biosntesis, procesamiento y secrecinde protenas. De Duve, por su parte, descubri dos nuevosorgnulos -lisosomas y peroxisomas-. El descubrimiento delos lisosomas por de Duve se bas enla centrifugacindiferencial, mientras que su descubrimiento de los perodsomas,analizados en este captulo, se apoy enla centrifugacin enequilibrio de densidad. Adems de la centrifugacin diferencial yIa de equilibrio de densidad,Ia centrifugacin en gradiente dedensidad se emplea habitualmente para resolver orgnulos. Estasdos ltimas tcnicas son tambin usadas para separarmacromolcuias, como cidos nucleicos y protenas.Analizaremos cada una de ellas, empezando con unaconsideracin general de las centrfugas y Ia preparacin de lasmuestras.

CentrfugasUna centrfuga est formada, bsicamente, por un rotor -amenudo confinado en una cmara refrigerada- impuisado porun motor elctrico. El rotor est unido al soporte de los tubosque contienen las soluciones o suspensiones de partculas afraccionar. Existen dos tipos principales de rotores: rotores dengulo fijo, en los que los tubos se mantienen con undeterminado ngulo (Figura l2A.la) y rotores flotanfes, quepermiten que los tubos alcancen la posicin horizontal, comoconsecuencia del giro del rotor (Figura l2A.lb). Paracentrifugar a alta velocidad -por encima de 20.000revoluciones por minuto (rpm)- se requiere unaultracentrfuga equipada con un sistema de vaco para reducirla friccin (entre el rotor y el aire) y con una jaula de proteccinalrededor delacmara,por si se produjera un accidente.Algunas ultracentrfugas giran a unas 100.000 rpm, sometiendo

Partculaa sedmentar

(b) Rotor basculanteFigura L2,A1" Rotores de centrifuga. Los rotores de centrfuga (a)pueden mantener a los tubos con un ngulo fijo (b) o bien tener uncabezal basculante, que permite al tubo alcanzar la posicinparalela a la direccin de la fuerza centrfuga.

a las muestras a fuerzas 500.000 veces mayores que la fuerza degravedad (g).Preparacin de las muestrasLos tejidos deben ser homogeneizados antes de que loscomponentes celulares puedan ser separados porcentrifugacin. Para preservar la integridad de los orgnulos,la homogeneizacin se hace, habitualmente, en una solucinisotnica fra, como sacarosa 0,25 M. La ruptura de las clulaspuede conseguirse hacindolas pasar por un orificio estrecho,

354 Capitulo 12 Compoftamientos intracelulares: retculo endoplsmico, complejo de Golgi, endosomas, lisosomas y peroxisomas

o o o\ - / \ - /

l_lol_llill -lnUUo

o Partculas con coeficiente de sedimentacin elevado Partculas con coeficiente de sedimentacin intermedio. Partculas con coeficiente de sedimentacin bajo

Figwa L2,A2 Centrifugacin diferencial. Esta centrifugacin permite separar partculas en base a sus diferencias en la velocidad desedimentacin, que refleja, a su vez, diferencias en tamao o densidad. Se ilustra aqu la tcnica para tres partculas que difierensignificativamente en tamao. Las partculas, que forman parte de un homogeneizado inicial, se someten sucesivamente a cincocentrifugaciones iguales (nmeros encerrados en crculos). Las partculas grandes o densas (esferas moradas), sedimentan rpidamente, lasde tamao o densidad intermedias (esferas azules), sedimentan algo ms lentamente y las menores o de ms baja densidad (esferas negras),sedimentan muy lentamente. Finalmente todas las partculas alcanzarn el fondo del tubo, a menos que el proceso se interrumpa pasado uncierto tiempo.

tro l , /o)(' a

1 5q)o

-) Ribosomas y polisomas

Protenas ,/ \solubles -/ . , . \

b V* \rPeroxisomas --.-----aNcleos

f i c n c n m a e

l-""". * N/itocondrias

sometiendo al tejido a vibracin ultrasnica, por choqueosmtico o manualmente, con mortero y almirez. Elhomogeneizado resultante es una suspensin de orgnulos,pequeos componentes celulares y molculas. Si el tejido sehomogeneiza con suficiente suavidad, la mayora de losorgnulos y otras estructuras permanecen ntegros, reteniendosus propiedades bioqumicas originales.

Centrifugacin diferencialLa centrifugacin diferencial permite separar orgnulos enfuncin de su tamao o densidad. Como se indica en la FiguraIZ{.2,las partculas mayores o ms densas (esferas moradas),sedimentan rpidamente, las de tamao o densidad intermedio

-DRNA

DNA-

solubles

(esferas azules), sedimentan a una velocidad intermedia y lasms pequeas o de menor densidad (esferas negras),sedimentan lentamente.

Podemos expresar el tamao relativo de un orgnulo omacromolcula en trminos de coeficiente de sedimentacin,una medida de la velocidad a la que sedimenta una partcula,cuando es sometida a centrifugacin. El coeficiente desedimentacin se expresa en unidades Svedberg (S), enreconocimiento a Theodor Svedberg, el qumico sueco quedesarroll la ultracentrfuga, entre 1920y 1940. En Ia Figura12A.3 se indican los coeficientes de sedimentacin de algunosorgnulos, macromolculas y virus.

(contina)

Cloroplastos

Figura 12,A3 Coeficientes desedimentacin de orgnulos,macromolculas y virus. El coeficiente desedimentacin de una partcula,expresado en unidades Svedberg (S),indica cun rpidamente sedimentarcuando sea sometida a una fuerzacentrfuga. Los valores altos de S indicanuna mayor velocidad de sedimentacin. ds5i4ad de una partcula (expresadaen g/cmr), determina qu bandaalcanzar cuando sea sometida acentrifugacin en equilibrio de densidad.( Vase elProblema 12.1 1.)

1 , 9

&100 1000 104 105 106

Coef iciente de sed i mentacln (S) ------------>

El retculo endoplsmico 355

Anexo

La Figura 12A.4 ilustra un ejemplo de la centrifugacindiferencial. Primero se homogeneiza eI tejdo de inters O.Luego se procede al aislamiento de las fracciones subcelulares,sometiendo al homogeneizado y subsiguientes sobrenadantes acentrifugaciones sucesivas, que van aumentando en intensidad yduracin (@-O). El sobrenadante es la suspensin de aspectoms claro que queda despus de que las partculas, de untamao y densidad dadas, hayan sido retiradas en forma deperla (

l-=t-f-t lt l.t)

o oIr---1 T---1

:f-1o o o

Mezcla departculas

Gradiente de densidad ^ ^ " " i h ^ ^ h ^ i ^u 4 t I t u a a u a l u

abajo. Si la centrifugacin se prolonga demasiado, las bandasvan alcanzando, una tras otra, el fondo del tubo, arruinando elverdadero propsito del proceso.

La centrifugacin en gradiente de densidad suele utilizarsepara separar, tanto orgnulos, como macromolculas. En laFigura 12A.6 se aprecia la separacin de mitocondrias ylisosomas, con esta tcnica. El tejido a estudiar se homogeneizay somete a centrifugacin diferencial, para obtener un pelletenriquecido en mitocondrias y lisosomas O. Posteriormente, seresuspende el pellet en un pequeo volumen de solucinisotnica y se coloca sobre un gradiente de soluto, dispuesto entubo de plstico y cuya concentracin crece desde la partesuperior al fondo @.

Durante la centrifugacin, las mitocondrias, que sonmayores y ms densas que los lisosomas, se desplazan por elgradiente, como una banda de sedimentacin rpida @.Despus de un tiempo apropiado, se detiene la centrfuga, sepincha la base del tubo y se colectan las fracciones@.Lasmitocondrias, que se desplazan ms rpidamente que loslisosomas, estn ms prximas al fondo del tubo y por tanto, serecolectan primero. Los lisosomas aparecern en fracciones mstardas. Analizando las fracciones con marcadores de enzimasespecficas para mitocondrias y lisosomas, se podrn identificarlas fracciones, as como el grado de contaminacin en cada unade ellas.

Centrifugacin en equlbrio de densidadLa centrifugacin en equibrio de densidad (o isopcnica) esun mtodo muy efrcaz para la separacin de orgnulos ymacromolculas, basado en diferencias de densidad (FiguraI2A.3). Como la centrifugacin en gradiente de densidad, eneste caso se emplea un gradiente creciente, pero en este caso, la

concentracin del soluto se encuentra en los valores dedensidad de los orgnulos o macromolculas que se pretendenseparar. Para separar orgnulos, suele emplearse un gradiente desacarosa, establecido entre 1,10 y 1,30 g/cm' (0,75-2,3 M desacarosa). Este mtodo tambin es vilido para separar lasdiferentes formas de DNA y RNA, en base a sus diferentesdensidades. Dado que estas macromolculas son ms densasque los orgnulos, el gradiente suele hacerse con sales demetales pesados, como el cloruro de cesio (CsCl). En Ia figura19.4 se resume un experimento clsico en el que se emplea ungradiente de cesio para separar DNA dicatenario, que contieneel istoporaN del que tiene el istopo lsN, asl como DNAshbridos.

La Figura l2 A.7 describe la separacin de orgnulos basadaen la centrifugacin en equilibrio de densidad. El tejido deinters se homogeneiza y se centrifuga diferencialmente, paraobtener un pellet enriquecido en mitocondrias, Iisosomas yperoxisomas @. El pellet se resuspende luego en una solucin desacarosa 0,25 My se dispone sobre un gradiente de sacarosa,que abarque las densidades de los tres orgnulos @. Durante lacentrifugacin, los orgnulos se desplazan por el gradiente,hasta alcanzar su densidad de equilibrio o flotacin-el puntoen el que la densidad de la sacarosa iguala a la densidad delorgnulo- @. En la densidad de flotacin, las fuerzas sobre elorgnulo se anulan y, por tanto, no se desplaza. Pasado untiempo pertinente, todos los orgnulos alcanzan su densidad deflotacin caracterstica, detenindose en la correspondienteposicin. Cuando se supone que todos los orgnulos hanalcanzado el equilibrio, se detiene la centrfuga, se perfora labase del tubo y se colectan las fracciones @. Dadas susdiferentes densidades, los tres orgnulos se recogen enfracciones diferentes @.

(contina)

a Partculas con coeficiente de sedimentacin elevadoo Partculas con coeficiente de sedimentacin medio' Partculas con coeficiente de sedimentacin bajo

Figura 12.A5 Gentdfugacin en gradiente de densidad. Al igual que la centrifugacin diferencid, (vaseIaFgura 12A.2), es una tcnica quepermite separar partculas en base a diferencias en la velocidad de sedimentacin. Aqu, sin embargo, la muestra a fraccionar se dispone en lasuperficie de un gradiente de soluto cuya densidad aumenta progresivamente desde la parte superior del tubo a la inferior. El ejemplo aqulmostrado es para tres partculas que difieren significativamente en tamao. Sometidas a cinco centrifugaciones consecutivas de igual fuerza(nrimeros encerrados en crculos), las partculas emigran a travs del gradiente, en forma de bandas diferentes.

El retculo endoplsmico 357

An exo

I Aislamiento del precipitado Foe panrcuras granoes I I(pasos 1-3 de ra Fisura 12A.4) lf=|l t t li l t l

r{VI R"rrspensin delDrectDtiaoo en una

solucin de sacarosa,que se coloca sobreun gradienteoe sacarosa

Centrifugado 20.000 gdurante t h, las partculasse desplazan por el gradienie,en funcin de su coeficientede sedimentacin, formandobandas

LisosomasMitocondrias

Perforacin del tuboy recoleccin de las gotasen diferentes viales

Parte altadel gradiente

ldenti f icacin de lasfracciones enriquecidas

Figura 12.AG Centilfugacin en gradiente de densidad y aislamientode orgnulos.

de secrecin se vierten a luz del RE. Algunas protenas se in-corporan en el retculo despus de ser traducidas (insercinpostraslacional), circunstancia esta que es la que tiene lugar,de forma generalizada en los peroxisomas, las mitocon-drias y los cloroplastos. En el Captulo 22 se analizarn endetalle los mecanismos de biosntesis y distribucin de pro-tenas en el RE.

Adems de la sntesis de polipptidos, el RE es el lugardonde tienen lugar las primeras etapas de adicin y proce-

o

Aislamiento del precipitado Pde partculas grandes I I(pasos 1-3 de la Figura 12A.4) l__ltf--lli l t l| i li l i l

a'vResuspensin del t Iprecipitado en una \ I Isolucin de sacarosa, \ laflque se coroca soore A llun oradiente ,/ | llde acarosa Sacarosa/ ll ll0,75 M ll il

Sacarosa--\o/2,30 M I

Sacarosa0 ,15 MSacarosa0,60 M

Gradientede densidadde sacarosa

Gradientede densidadde sacarosa

nFnnEryUUUUt\__YJ

Fracciones ricasen mitocondrias

n55Er, rqFrT| | | | | lUUUUUTFracciones ricasen mitocondrias

It-tIt-lll-lf- LlFlf-nU+t-1t llflVnnU I.-J

Centrifugado 60.000 9durante 2 h, las partculasse desplazan por el gradlente,en funcin de su coeflciente,hasta alcanzar su densidadde eouil ibrio

Perforacin del tuboy recoleccin de las gotasen diferentes viales

ldentificacin de lasfracciones enriquecidas

Figuta L2.A7 Centdtugacin en equilibrio de densidad y aislamientode orgnulos.

samiento de los grupos hidrocarbonados de las glicoprote-nas, el plegamiento de protenas, el reconocimiento y eli-minacin de polipptidos mal plegados y el ensamblaje deprotenas multimricas. Como es lgico, la dotacin pro-teica del RL incluye las enzimas que catalizan las modifica-ciones co- y post-traduccin. La glicosilacin de protenasse estudiar en este mismo captulo. Un ejemplo de prote-na implicada en el plegamiento de cadenas polipeptdicasesla disulfuro isomerasa,que cataliza la formacin y ruptu-

+

Gapitulo 12 Comportamentos intracelulares: retculo endoplsmico, complejo de Golgi, endosomas, lisosomas y peroxtsomas

ra de puentes disulfuro entre residuos de cistena. Como yaestudiamos en el Captulo 3, la formacin de estos enlaceses esencial para el correcto plegamiento de los polipptidos(vanse Figuras 3.5 y 3.7). Volveremos a considerar el ple-gamiento proteico en el Captulo 22.

Adems de facilitar el plegamiento y ensamblaje de pro-tenas, el RE es el lugar del control de calidad. Las protenasque no han sido correctamente modificadas, plegadas o en-sambladas, se expulsan del RE en un proceso conocidocomo degradacin asociada alkE (ERAD). Antes de que es-tas protenas alcancen el aparato Golgi, son degradadas porlos proteasomas del citosol (v ase Fig,sr a 23.38). Varias en-fermedades, entre las que se encuentran la fibrosis qusticayla hipercolesterolemia familiat tienen su origen en defec-tos en estos procesos.

El RE liso est mplcado en la detoxificacion,el metabolismo de hidratos de carbono y ottos procesoscelulafes

El RE liso interviene en multiples procesos celulares, inclu-yendo la eliminacin de sustancias txicas, el metabolismode hidratos de carbono, el almacenamiento de calcio o labiosntesis de esteroides. Dentro de esta ltima categora, esespecialmente importante la sntesis de las hormonas se-xuales masculina y femenina y las hormonas esterodicas dela corteza adrenal.

Detoxificacin de flmacos. Una reacin comn a la mayo-ra de las rutas de detoxificacin y de la biosntesis de este-roides, es la hidroxilacin, es decir,la adicin de grupos hi-droxilo a molculas orgnicas aceptoras. En cada caso, lahidroxilacin depende de un elemento de la familia de pro-tenas citocromo P-450. Los miembros de esta fama estnesp,ecialmente bien representados en el RE liso de los hepa-tocitos (clulas del hgado), pero aparecen tambin en lospulmones y en clulas del intestino. En el RE liso existe unsistema de transporte, que transfiere electrones desde elNADPH o el NADH a una protena citocromo P450. La for-ma reducida de la protena P-450, es ahora capaz de donarun electrn al oxgeno molecular (Or), permitiendo la hi-droxilacin de la molcula. La siguiente reaccin se mues-tra esquemticamente, donde R es el aceptor proteico de hi-droxilos, actuando el NADPH, o el NADH, como donantede electrn es:

RH + NAD(P)H + H+ + or---ROH + NAD(P)+ + H2o(12.1)

Mientras que el NADH es el donante de electrones parala detoxificacin y la sntesis de esteroides, el NADH es eI re-ductor en la hidroxilacin de cidos grasos. Adems delNADPH o el NADH, el ogeno molecular es la otra mol-cula esecial en las hidroxilaciones. Como se indica en Ia reac-cin I2.I, uno de los tomos de la molcula de oxgeno, seusa para hidroxilar al sustrato, mientras que el otro es re-

ducido aagaa.Las enzimas que catalizan estas reacciones sedenominan oxidasas de funcin mixta o monooxigenasas.

La hidroxilacin aumenta la solubilidad en agua de lamayora de las drogas hidrfobas. Esta modificacin es cr-tica, pues la mayora de los compuestos hidrfobos son so-lubles en los lipdos de las membranas y son, por tanto, re-tenidos por el organismo, mientras que los compuestoshidrosolubles se eliminan fcilmente, primero hacia la san-gre, y luego hacia el exterior (excrecin).

Por ejemplo, la eliminacin de barbitricos aumentacuando son hidroxilados por las enzimas del RE liso. Estose puede demostrar inyectando a una rata, el sedante feno-barbital. Uno de los efectos ms notables es el rpidoaumento de las enzimas detoxificantes de barbitricos en elhgado, acompaado de una proliferacin dramtica delRE liso. Anlogamene se comprueba que, en las personasadministradas regularmente con fenobarbital, se precisandosis crecientes del mismo, para conseguir los mismos efec-tos sedativos. Ms an, la especificidad de las oxidasas defuncin mifa es tan amplia,.que pueden hidroxilar portanto solubilizar, a muchos otros agentes tiles, como anti-biticos, anticoagulantes y esteroides. El uso crnico de losbarbitricos, tiene como resultado la disminucin de la efi-cacia de los barbitricos y otros muchos frmacos.

Otro grupo importante de protenas P-450 propias delRE liso, implicadas tambin en reacciones de hidroxilacin,es el de las enzimas del complejo denominado hidroxilasadehidrocarburos de arilo. Este complejo participa en el me-tabolismo de hidrocarburos policclicos, que son molculasorgnicas compuestas por dos o ms anillos bencnicosunidos. Si bien la hidroxilacin de estas molculas txicaspuede ser til, pues aumenta su solubilidad en agua, losproductos oxidados son, a menudo, incluso ms txicosque los compuestos de partida. Se ha comprobado que la hi-droxilasa de hidrocarburos de arilo puede convertir a car-cingenos potenciales en sus formas qumicamente acti-vas. Los ratones que expresan niveles elevados de lahidroxilasa, presentan una mayor incidencia en el desarro-llo espontneo de cnceres, que los ratones normales, mien-tras que los tratados con un inhibidor de la hidroxilasa dehidrocarburos de arilo, desarrollan pocos tumores. Cabecitar aqu, que el humo del tabaco es un potente inductorde la hidroxilasa de hidrocarburos de arilo.

Metabolismo de hidratos de carbono. El RE liso de los hepa-tocitos est tambin involucrado en la hidrlisis enzimti-ca del glucgeno, como lo demuestra la presencia dela glu-cosa-6-fosfatasa. La glucosa-6-fosfatasa es una de lasenzimas exclusivas de la membrana del RE y se usa, a me-nudo, como marcador del retculo durante el fracciona-miento celular. Catalizalaliberacin del grupo fosfato des-de la glucosa-6-fosfato, para formar glucosa libre y fosfatoinorgnico (P1):

Glucosa-6-fosfato * HrO -----+ glusosa * Pr (12.2)

El retculo endoplsmico 359

Para comprender la importancia de esta fosfatasa, nece-sitamos recordar primero cmo almacenan el glucgenolas clulas hepticas y las razones y mecanismos de su pos-terior ruptura.

Uno de los papeles principales del hgado es el mante-nimiento, relativamente constante, de los niveles de gluco-sa en sangre. Almacena la glucosa en forma de glucgenoy la libera segn la va requiriendo el cuerpo, especialmen-te entre comidas y como respuesta a la actividad muscular.El glucgeno heptico se almacena en forma de grnuiosasociados al RE liso (Figura 12.3a). La liberacin del glu-cgeno heptico est bajo control hormonal (vqselaFi-gura 14.24) y precisa de la activacin de la glucgeno fosfo-rilasq, enzima que rompe al glucgeno en unidades deglucosa-1-fosfato (Figura 12.3b). La glucosa-l-fosfato seconvierte fcilmente en el citosol en glucosa-6-fosfato, gra-cias a la enzima fosfoglucomutasa.

Sin embargo, las membranas suelen ser bastante imper-meables alos azucares fosforilados. Para abandonar la c-lula heptica y entrar en el torrente sanguneo, Ia glucosa-6-fosfato debe ser transformada en giucosa libre. Laglucosa-6-fosfatasa unida a las membranas del RE, eliminael fosfato, permitiendo a la glucosa salir del hepatocito, gra-cias a una permeasa (e1 transportador de glucosa dei Cap-tulo 8; yasela Figura 8.8). Una vez en la sangre, se distri-buye hacia otras clulas que necesiten energa. Resultainteresante recordar que la actividad glucosa-6-fosfatasa es

propia del hgado, rin e intestino, faltando en msculo ysistema nervioso. Las clulas musculares y nerviosas retie-nen la glucosa-6-fosfato y la emplean para satisfacer suspropias necesidades energticas.

Almacenamiento de calcio, En ciertas clulas, como las mus-culares, existen subdominios en el RE liso, especializados enel almacenarniento de iones calcio. En estas clulas, la luz delRE presenta concentraciones elevadas de protenas ligantesde calcio. Los iones de calcio son bombeados al interior delRE por bombas de calcio dependientes de ATP (NlPasas) y seliberan en respuesta a seales extracelulares (vaselaFigu-ra 14.12).EI retculo sarcoplsmico de las clulas musculareses un ejemplo de RE liso especializado en el almacena-miento de calcio. Las ATPasas de calcio estn introducien-do constantemente e1 ion en el retculo sarcoplsmico. Launin de los neurotransmisores a sus receptores de la su-perficie de las clulas musculares, desencadenada una cas-cada de sealizacin que culmina con Ia liberacin de cal-cio y Ia contraccin de las fibras musculares.

El RE desempea un papel esencial en la biosntesisde membranasLos estudios de la biosntesis de ipidos y los destinos de s-tos en las ciulas eucariotas, reveian que el RE es la fuenteprimaria de lpidos de membrana, incluyendo a los fosfol-

Grnulosd o n l r n a n n

RE i i so

MitocondriaHEPATOCITO

(a) Proximidad delg lucgeno a l RE i i so

0 5 r r m

irir:i,it,;r i.:.-:r Papel del RE liso en el catabolismo heptico delglucgeno. (a) En esta micrografa electrnica de una clulaheptica de mono, se observan numerosos grnulos de glucgenoen ntima asociacin con el RE liso (TEM). (b) La degradacin delglucgeno se realiza eliminando unidades de glucosa, en forma deglucosa-1-fosfato, que son luego convertidas a glucosa-6-fosfato enel citosol. La liberacin del grupo fosfato depende de 1a glucosa-6-fosfatasa, enzima asociada a la membrana de1 RE liso. Una vez libre,1a giucosa sale hacia la sangre, gracias a una permeasa de lamembrana plasmtica. (b) Process of glycogen breakdown in l iver

RE l iso

360 Captulo 12 Compoftamientos intracelulares: retculo endoplsmico, complejo de Golgi, endosomas, lisosomas y peroxisomas

pidos y el colesterol. De hecho, la mayora de las enzimasque se requieren para la sntesis de varios fosfolpidos demembrana no se encuentran en ninguna otra parte de la c-lula. Ha pese a todo, excepciones. Por ejemplo, mientrasque las mitocondrias importan desde el RE toda la fosfati-dilcolina, el fosfatidilinositol y la fosfatidilserina de susmembranas, tanto externa, como interna, la fosfatidileta-nolamina Ia sintetizan ellas mismas, por descarboxilacinde la fosfatidilserina, previamente importada. Otras excep-ciones significativas son la biosntesis del colesterol y el do-licol de los peroxisomas y la de los lpidos propios de los clo-roplastos, que tiene lugar en dichos orgnulos.

La biosntesis de los fosfolpidos est restringida a unamonocapa de la membrana del RE. Los centros activos delas enzimas implicadas estn expuestos hacia el citosol y loslpidos recin sintetizados, se incorporan a la monocapaque mira hacia el citosol. Sin embargo, las membranas ce-Iulares son bicapas lipdicas, con fosfolpidos en ambos Ia-dos. As pues, debe existir un mecanismo de transferenciade fosfolpidos. Dado que es termodinmicamente desfa-vorable que los fosfolpidos pasen de forma espontnea,ycon una tasa significativa, de un lado al otro de la mem-brana, la transferencia depende de los traslocadores de fos-folpidos o flipasas, que catalizan dicha traslocacin en lasmembranas del RE.

Los traslocadores de fosfolpidos, como otras enzimas,son muy especficos y afectan tan slo a la velocidad del pro-ceso. En definitiva, ser la dotacin de transportadores dis-ponibles,la que determine qu tipo de fosfolpidos son trans-feridos. As pues, la especificidad de los traslocadorescontribuye aIa asimetra de la membrana, descrila en el Ca-ptulo 7. Por ejemplo, la membrana del RE tiene el trasloca-dor de fosfatidilcolina, pero no los de fosfatidiletanolamina,fosfatidilinositol o fosfatidilserina. En consecuencia, la fos-fatidil colina aparece distribuida en ambas caras de la mem-brana del RE, mientras que los otros tres fosfolpidos quedanconfinados en la cara citoslica. Cuando las vesculas for-madas en el RE se fusionen con otros orgnulos del sistemade endomembranas, esta distribucin diferencial estableci-da en el R-E, se transferir a las otras membranas celulares.

El movimiento de los fosfolpidos desde el RE a las mi-tocondrias y los cloroplastos, entraa una dificultad aadi-da. A diferencia de los orgnulos del sistema de endomem-branas, Ias miotocondrias y los cloroplastos no crecen porfusin con vesculas derivadas del RE. En lugar de eso, en elcitoplasma existen unas protenas de intercambio de fos-folpidos (o protenas de transferencia de fosfolpidos), quellevan a los fosfolpidos desde la membrana del RE a lasmembranas externas de las mitocondrias y los cloroplastos.Cada tipo de protena de intercambio reconoce un tipo es-pecfico de fosfolpido, que extrae de una membrana y lo lle-va, a travs del citosol, a la otra membrana. Esta transfe-rencia contribuye tambin al movimiento de fosfolpidosdesde el RE a otras membranas de la clula, incluyendo a lamembrana olasmtica.

Aunque el retculo es la fuente de la mayora de los lpi-dos de membrana, su composicin vara significativamen-te de la de otras membranas de la clula (Tabla 12.1). Porejemplo, una carcterstica tpica de la membrana plasm-tica de los hepatocitos, es su contenido relativamente bajode fosfoglicridos y alto de colesterol, esfingomielina y gli-colpidos. Se ha podido comprobar que se produce un au-mento progresivo de colesterol en las membranas, durantesu progresin desde el RE hacia otros compartimientos finalmente, hacia la membrana plasmtica. Paralelamente,se registra un gradiente de incremento en el grosor de lamembrana. Las membranas del RE tienen un grosor apro-ximado de unos 5 nm, mientras que la membrana plasm-tca alcanza los 8 nm. Algunos bilogos creen que el au-mento en grosor tiene implicaciones en los fenmenos deciasificacin y distribucin de protenas de membrana, quesern discutidos despus de que consideremos el aparato deGolgi y el papel que desempea en el procesamiento deprotenas.

Tabla t2.l Composicin de las membranas del REy plasmtica en hepatocitos de rata

Membranadel leticulo

Gomponentesde la membrana

Membranaplasmtica

Peso porcentual de cada componente de membrana, referidoal peso total de la membrana

CarbohidratosProtenasLpidos totales

106227

105436

40 24t 7 75 46 1 75 1 9

frazas 727 22

Peso porcentual de los lpidos de membrana, referido al totalde lpidos

FosfatidiicolinaFosfatidiletanolaminaFosfatidilserinaColesterolEsfingomielinaGlicolpidosOtros lpidos

El complejo de GolgiNos centraremos ahora en el complejo de Golgi, un compo-nente del sistema de endomembranas, ntimamente ligado alRE, tanto fsica, como funcionalmente. El complejo de Gol-$ (o aparato de Golgi) debe su nombre a Camillo Golgi, elbilogo italiano que lo describi por primera vez en 1898.Utilizando tetrxido de osmio para teir neuronas, not lapresencia de un precipitado del metal, formando una red de-licada alrededor del ncleo. Posteriormente se pudo com-probar el mismo tipo de reaccin en diferentes tipos celula-res y con distintos metales pesados. Pese a todo, los resultadoseran inconsistentes y no se pudo identificar ninguna estruc-

El complejo de Golgi 36r

tura celular responsable de la tincin. Como consecuencia,lanaturaleza-e incluso la propia existencia- del comple-jo de Golgi, fue muy controvertida hasta los aos 50, cuan-do pudo por fin identificarse, gracias al microscopio elec-trnico. Desde entonces se ha progresado mucho en lacomprensin de la estructura y funcin del aparato de Gol-gi, sus relaciones con el RE y su papel en las modificacionesqumicas, clasificacin y empaquetamiento de las protenasque recibe, va vesculas de transicin, desde el RE.

El complejo de Golgiest fomado por una seilede cistemas

El complejo de Golgi est integrado por una serie de cis-ternas aplanadas de membrana, con forma de sacos discoi-dales, apilados como se muestra en la Figura 12.4a. Cadaagrupacin se denomina pila de Golgi (o dictiosoma) y f-cilmente identificable en el microscopio electrnico (Figu-ra 12.4b). Generalmente hay de 3 a 8 cisternas por cadapila, si bien en algunos casos pueden ser varias docenas. Elnmero y tamao de los dictiosomas depende del tipo ce-lular y de la actividad metablica de la clula. Algunas tie-nen un nico gran dictiosoma, mientras que otras -espe-cialmente las muy activas en secrecin- poseen centenares,e incluso millares, de apilamientos de Golgi. La luz del com-plejo de Golgi, es parte de la red de espacios internos del sis-tema de endomembranas (Figura 12.1).

Vesculas de tmnsporte. La visin esttica del retculo en-doplsmico y el aparato de Golgi, que resulta de las micro-

grafas electrnicas, como la de la Figura 12.4b, pueden re-sultar equvocas; estos orgnulos son, en realidad, estruc-turas muy dinmicas. Tanto el RE como el complejo deGolgi estn rodeados de multitud de vesculas de trans-porte, que parten de sus membranas en una regin de la c-lula y se fusionan con otras membranas. Thles vesculas por-tan lpidos y protenas desde los elementos de transicin delRE al complejo de Golgi, entre las cisternas del propio dic-tiosoma y desde el complejo de Golgi hasta varios destinoscelulares, como los grnulos de secrecin, los endosomas ylos lisosomas.

Lamayoria de las vesculas implicadas en la transferen-cia de lpidos y protenas, se consideran vesculas cubiertas,debido a la presencia de cubiertas, o capas, de protenas, querodean a su cara citoplsmica, a medida que la vescula seva formando. Las cubiertas son responsables de incurvar aIa membrana, facilitando la vesiculacin y desaparecen dela vescula antes de que sta se fusione con la membrana dedestino. La composicin de la cubierta depende de Ia fun-cin de cada vescula en particular. Las protenas de cu-biertas ms estudiadas son la clatrina. COPIy COPI/. (COPes la abreviatura de , en espaol, protena dela cubierta.) La presencia de vesculas cubiertas es una ca-racterstica comn en la mayora de los procesos celularesrelacionados con la transferencia o intercambio de sustan-cias, bien entre los diferentes compartimientos de mem-brana de una clula eucariota, bien entre el interior y el ex-terior celular. Analizaremos ms tarde en este captulo, laformacin de las vesculas cubiertas y su papel en el trans-porte de lpidos y protenas.

eee

intermedias

Vesfculas de

@e

ffi[{i[\'e'!\'\9

(a) Dict iosoma en una clula animal RTGFiguta L2,4 Apatato de Golgi. Cada unidad (dictiosoma) del aparato o complejo de Golgi, est formado por un nmero reducido decisternas aplanadas. (a) En la cara cis,las vesculas de transicin provenientes del RE se fusionan con las membranas de la red cls-Golgr(RCG).Desdelacaratranspartenvesculasdetransporte,queseformanenlared trans-Golgi(RTG).Lasvesculasdetransportel levnIpidos y protenas hacia otros componentes del sistema de endomembranas, o forman vesculas de secrecin. (b) En esta micrografaelectrnica de una clula de un alga, se muestra un dictiosoma del aparato de Golgi (destacado en azul), junto a Ia en'uelta nuclear (TEM).

(b) Dict iosoma en una clula de un alga

362 Gaptulo 12 Comportamientos intracelulares: retculo endoplsmico, complejo de Golgi, endosomas, lisosomas y peroxisomas

Las dos caras del dictiosoma. Cada pila del Golgi tiene dosIados (o caras) distintas (Figura 12.4).Lacara cis (o de for-macin), mira hacia los elementos de transicin del RE. Elcompartimiento del Golgi ms prximo a dichos elementosde transicin, es una red tubular denominada red cis-Golgi(RCG). Las vesculas cubiertas provenientes del RE, cargadascon lpidos y protenas recin sintetizados, estn llegandocontinuamente a la RCG, con cuyas membranas se fusionan.La cara opuesta del complejo de Golgi es la cara trans (o demaduracin). Los compartimientos de este lado, anloga-mente a la RCG. forman una red de tbulos, conocida comored trans-Golgi (RTG). Aqu se forman constantemente ve-sculas cubiertas de transporte, que llevan las protenas pro-cesadas, desde el complejo de Golgi hasta los grnulos de se-crecin, los endosomas, los lisosomas y Ia membranaplasmtica. Las cisternas situadas entre la RCG yla RTG, sonlas cisternas intermedias del dictiosoma y en ellas tiene lu-gar gran parte del procesamiento de protenas.

Las redes RCG y RTG y las cisternas intermedias, sonbioqumica y funcionalmente diferentes; cada comparti-miento tiene su propia dotacin de enzimas, necesarias encada paso del procesamiento de protenas y membranas. Lastcnicas de tincin inmunolgicas y citoqumicas, han de-mostrado que en la RCG se acumulan ciertas protenas re-ceptoras y enzimas, diferentes de las de las cisternas inter-medias o de las de la RTG. Esta polaridad bioqumica seilustra en la Figura 12.5, que muestra un dictiosoma de unaclula renal de conejo. La tincin especfica de la N-acetil-glucosamina transfereasa I, la enzima que aade N-acetil-glucosamina a las cadenas glucdicas de las glicoprotenas,demuestra que la enzima se concentra en Ias cisternas in-termedias del complejo de Golgi.

Las redes RCG y RTG y las cisternas intermedias, tam-bin difieren en los tipos de vesculas cubiertas que llevanasociadas. Las vesculas formadas en el RE para el transpor-te de protenas y lpidos hacia la RCG, estn revestidas porprotenas COPII, mientras que las vesculas que parten dela RTG o de las cisternas intermedias, estn cubiertas porCOPI. Por ltimo, las vesculas de la RTG, pueden estar cu-biertas por COPI o clatrina.

Flujo de lpidos y proteinas a travs del complejo de GolgiSe han propuesto dos modelos para explicar el movimien-to de lpidos y protenas desde la RCG a la RTG, pasandopor las cisternas intermedias del complejo de Golgi. Deacuerdo con el modelo de cisterna estacionaria, cada com-partimiento del dictiosoma es una estructura estable. Eltrfico intercisternal est mediado por vesculas de trans-porte, que se forman por gemacin en una cisterna y se fu-sionan con otra, generalmente la siguiente de la secuenciade cis a trans.Las protenas destinadas a la RTG -que se-rn clasificadas y empaquetadas en vesculas con mltiplesdestinos- no tienen necesidad de ser seleccionadas y con-centradas, sino que viajan hacia adelante, en vesculas de

Figwa L2.5 Tincin inmunocitoquimica del complejo de Golgi,En esta micrografa electrnica se puede apreciar un dictiosoma deuna clula renal de conejo. La seccin celular se ha teidoespecficamente, para demostrar la presencia de la enzimaN-acetilglucosamina transferasa I que interviene en la glicosilacinterminal de protenas. La flecha y el corchete sealan a cisternas noteidas, demostrando que la enzima se concentra en unas pocascisternas mediales, prximas ala cara cls del dictiosoma. De aqupuede concluirse que la adicin de N-acetilglucosamina a Iosoligosacridos unidos previamente a protenas, se produce al pocode que dichas protenas ingresen en el aparato de Golgi (TEM).

transporte; por el contrario, las molculas pertenecientes alRE y sucesivos compartimientos del Golgi, deben ser rete-nidas o recuperadas.

De acuerdo con el segundo modelo, conocido comomodelo de maduracin cisternal, las cisternas del Golgison compartimientos transitorios, que cambian gradual-mente desde la RCG a la RTG, pasando por las cisternas in-termedias. En este modelo, Ias vesculas del transicin delRE convergen para formar la RCG, en la que se acumulanlas enzimas necesarias para el procesamiento inicial de lasprotenas. Paso a paso, mientras adquieren enzimas adicio-nales, cada cisterna cls se va transformando primero en cis-terna intermedia y luego en cisterna trans.Las enzimas quevan dejando de ser necesarias, regresan, va vesculas, des-de los compartimientos tardos a los tempranos. Por ultimo,la RTG forma vesculas o grnulos de secrecin de conteni-do especfico, que sern dirigidos a diferentes destinos msall del complejo de Golgi.

Los dos modelos no tienen por qu ser mutuamente ex-cluyentes: de hecho, ambos deben coexistir en cierto grado,

El complejo de Golgi 363

dependiendo del organismo y del papel de la clula. Aun-que el primer modelo est apoyado por muchas eviden-cias, parece claro que algunos componentes de la clula pre-sentes en el compartimiento intermedio, son demasiadograndes para ser transportados en las pequeas vesculas detransporte. Por ejemplo, las escamas polisacardicas de al-gunas especies de algas, se forman en los compartimientostempranos del Golgi. Pese a ser excesivamente grandes paracaber en las vesculas de transporte, acaban apareciendo enlos compartimientos tardos, que finalmente se fusionancon Ia membrana plasmtica, liberando el producto finalque se incorpora a la pared vegetal.

Tlanspolte rettgtado y antetgtado. El desplazamiento dematerial desde el RE hacia el complejo de Golgi y la mem-brana plasmtica, se denomina transporte antergrado.|unto con los lpidos y las protenas a transportar (el ) en las vesculas estn presentes las molculas esencia-les para el empaquetamiento del cargo y para dirigir a las ve-sculas hacia el destino apropiado.Cadavezque un grnulode secrecin se fusiona con la membrana plasmtica, libe-rando su contenido por exocitosis, una fraccin de la mem-brana que se origin en el RE, pasa a formar parte de la su-perficie celular. Para mantener el balance en el flujo delpidos hacia la membrana plasmtica, asegurando la en-trada de componentes para la formacin de nuevas vescu-las, la clula recicla los lpidos y protenas, que ya han cu-bierto sus funciones en etapas tardas del transporteantergrado. Esta funcin se verifica por medio del trans-porte retrgrado, es deci el flujo de vesculas de vuelta des-de el complejo de Golgi al RE.

En el modelo de cisterna estacionaria, el flujo retrgra-do facilita la recuperacin de lpidos y protenas especficos,que pasan del RE a la cara cls de un dictiosoma prximo, oel retorno de protenas especficas de cada parte de las cis-ternas mediales. El material destinado a la RTG continahacia adelante. No est claro si este flujo retrgrado se pro-duce desde cada cisterna intermedia hacia el RE, o si tienelugar de forma discreta, retrocediendo sucesivamente, decisterna en cisterna. En el modelo de maduracin cisternal.el flujo retrgrado recupera el material gracias a comparti-mientos recin formados, en los que se incluyen los recep-tores y enzimas, que ya no son necesarios en los comparti-mientos ms maduros.

Papel del RE y el complejo de Golgien la glicosilacin de protenas

Buena parte del procesamiento de protenas que tiene lugaren el complejo de Golgi, est relacionado con la glicosila-cin, es decir, la adicin de cadenas laterales de hidratos decarbono, a residuos aminoaclicos especficos de protenas,para formar las glicoprotenas. Posteriormente se modifi-ca el oligosacrido aadido, en una serie de reacciones ca-

talizadas enzimticamente. Existen dos tipos de glicosila-ciones (vasela Figura 7.25).La glicosilacin asociada a N(o glicosilacin en N) supone la adicin de una unidad es-pecfica de oligosacrido al grupo amino terminal de cier-tos residuos de asparagina, que aparecen como parte de lasecuencia de tres residuos Asn-X-Ser o Thr, siendo X cual-quier aminocido, excepto prolina (vasela Thbla 3.3, paralas abreviaturas de los aminocidos). La glicosilacin en Oconsiste en la adicin del oligosacrido al grupo hidroxilode determinados residuos de serinas o treoninas. Cada eta-pa de la glicosilacin es estrictamente dependiente del pasoprecedente. lJn error en una etapa, debido quiza una en-zima an6mala, puede bloquear futuras modificaciones delcarbohidrato y terminar con consecuencias graves para elmetabolismo celular, que a menudo provocan la enferme-dad del organismo.

Nos centraremos ahora en la glicosilacin en N. Con-ceptualmente, el proceso puede dividirse en dos etapas-la glicosilacin inicial y las modificaciones posterioresen la cadena lateral-. Como se ilustra en la Figura I2.6,lasenzimas que catalizan varios pasos de la glicosilacin y mo-dificaciones subsecuentes, se encuentran en diferentes com-partimientos, o grupos de compartimientos, del RE y elcomplejo de Golgi.

La primera etapa de la glicosilacin en N, denominadaglicosilacin central, se verifica en el RE. El az,car que seune directamente a la asparagina, es siempre N-acetilgluco-samina (GIcNAc),hidrato de carbono modificado, que ya vi-mos en el Captulo 3 (vaseFigura3.26a). Pese a la variedadde oligosacridos encontrados en las glicoprotenas madu-ras, todos los hidratos de carbono aadidos a las protenasen el RE, tienen un esqueleto comn rico en manosa, for-mado por dos unidades de GlcNAc, nueve de manosa y tresde glucosa. Este oligosacrido central, se ensambla por laadicin secuencial de los monosacridos a un transporta-dor activado, de naturalezalipidica, denominado dolicolfosfato. El ensamblaje del oligosacrido central se muestraen la Figura 12.7. Obsrvese que las etapas tempranas delproceso tienen lugar en la cara citoslica de la membranadel RE y las tardas en Ia luz del propio RE. La traslocacindesde el citosol hacia la luz del RE, est catalizadapor unaflipasa especfica. Unavez completado el ncleo, se trans-fiere por completo desde el dolicol al residuo de asparagi-na de la protena, reaccin catalzada por la enzima demembrana, oligosacaril transferasa. Normalmente la adi-cin del oligosacrido central se produce conforme se sin-tetiza el polipptido, en un ribosoma asociado a la mem-brana del RE. Esta glicosilacin cotraslacional colabora enel correcto plegamiento de la protena. La inhibicin de laglicosilacin resulta en la aparicin de agregados de prote-nas mal plegadas.

Durante la segunda etapa de la glicosilacin en N, el oli-gosacrido central se recorta y modifica. Como en la glico-silacin central, las etapas iniciales se producen en el RE ya menudo ocurren antes de que se haya completado la bio-

364 Gapitulo 12 Compoftamientos intracelulares: retculo endoplsmico, complejo de Golgi, endosomas, lisosomas y peroxisomas

. Biosntesis del oligosacrido centralpara la glicosilacin en N deresiduos de asparagina

. Procesamiento inicialdel oligosacrido central

. ldentificacin y eliminacinde protenas mal plegadas

\J^u-r\-- \-/- -A ) . unlon de l',r-acEiilgaracto.urn,nu \)

(^) a serina o treonina I-^. . Prlmera etapa en la toslorllaclon I

. Eliminacin de manosa

. Segunda etapa en la fosforilacin

o Eliminacin de manosa. Unin de N-aceti lglucosamina

. Adicin de cido sil ico

Adicin deSulfatacin\sr

o

Oa)

!o'-

oEoO

o)@.c)(.:Cc'

=

Figura 12.6 Compartlmentacin de las etapas de la $icosllacin ysubsecuentes modificaclones de ptoteinas' Las enzimas quecatalizanla glicosilacin y modificaciones posteriores de Iasprotenas, residen en diferentes compartimientos, o grupos decompartimientos, del RE y el complejo de Golgi. El procesamientotiene lugar secuencialmente, conforme las protenas emigran de uncompartimiento a otro. Las etapas enumeradas en la figura, sonejemplos de modificaciones posibles, que no tienen porqu ocurriren todas las glicoprotenas.

sntesis de la cadena polipeptdica. Por la accin de gluco-sidasas y manosidasas, se eliminan tres unidades de gluco-sa y una de manosa. Durante este proceso, interaccionan va-rias protenas del RE con la glicoprotena recin sintetizada,para asegurar su correcto plegamiento. La calnexina (CNX'protena de membrana) o la calreticulina (CRT, soluble)pueden unirse a la glicoprotena monoglucosilada y pro-mover la formacin de puentes disulfuro, gracias a que for-man un comPlejo con la glicoprotena y una tiol oxidorre-ductasa conocida como Erp57. Una vez formado el puentedisulfuro, el complejo protico se disocia y la unidad finalde glucosa se elimina por la enzima glucosidasa II.

En este punto, una glucosil transferasa del retculo, laUGGT (uDP- glucosa:glicoprotena glucotransferasa) actuacomo un sensor del correcto plegamiento de la glicoprote-na recin sintetizada. La UGGT se une a las protenas mal

plegadas, aadiendo una unidad de glucosa, consiguiendoque la glicoprotena entre en un nuevo ciclo de unin aCNX/CRT, para formar puestes disulfuro. Una vez que laprotena se ha plegado correctamente, no vuelve a ser reco-nocida por la UGGT y es libre para salir del RE y alcanzarel complejo de Golgi. Cuando llegue aqu,la glicoprotenasufrir nuevas modificaciones, a medida que vaya pasando,desde la cara cis, hacia las cisternas intermedias y la caratrans. Estas glicosilaciones terminales muestran una va-riabilidad destacable, que responde a la gran diversidad enestructura y funcin de las cadenas laterales de oligosacri-dos de las glicoprotenas.

La glicosilacin terminal incluye siempre la eliminacinde unas cuantas de las unidades que se aadieron comoparte del oligosacrido central. En algunos casos no hayningn procesamiento cuando la glicoproteina alcanza elcomplejo de Golgi. Los oligosacridos ricos en manosa re-sultantes, retienen las dos unidades de GlcNAc y de seis aocho de las manosas. En otros casos se generan oligosacri-dos complejos, por adicin ulterior de N-acetil-glucosami-na y otros carbohidratos) como la galactosa, el cido silicoo la fucosa (las estructuras de la galactosa y del cido sili-co se muestran en la Figura 7.26a). En funcin del carbo-hidrato, la adicin tendr lugar en un compartimiento me-dial, prximo a la cara trans del complejo de Golgi, o en laRTG. Cuando las glicoprotenas salen del complejo de Gol-gi, pueden llevar exclusivamente oligosacridos ricos enmanosa, oligosacridos complejos, o ambos.

Visto el papel del complejo de Golgi en Ia glicosilacin,no sorprende que dos de las ms importantes categoras deenzimas presentes en los dictiosomas) sean las glucn sinte-tasasylas glucosil transferasal Las glucn sintetasas catali-zan la formacin de oligosacridos a partir de monosacri-dos, y las glucosil transferasas unen carbohidratos a lasprotenas. Como indicador de la posible complejidad de lascadenas laterales de oligosacridos, baste citar que hay cien-tos de glicosil transferasas diferentes en el RE y el comple-jo de Golgi. Estas y otras enzimas se distribuyen en el dic-tiosoma de forma consistente con su papel en el proceso deglicosilacin, de manera que cada cisterna contiene una co-Ieccin especfica de enzimas.

Conviene destacar que la glicosilacin ocurre exclusiva-mente en la cara luminal y no en la citoslica de Ias mem-branas del RE y complejo de Golgi. Las glicoprotenas y gli-colpidos ensamblados en estos orgnulos son, por tanto,elementos que contribuyen a la asimetra de la membra'ha.Siguiendo a su biosntesis, las protenas y lpidos glicosila-dos miran alaluz del RE y complejo de Golgi. Cuando lasvesculas de transporte parten de estos orgnulos para fu-sionarse con otras membranas, tambin se exporta Ia asi-metra establecida durante la glicosilacin. Dado que la caraluminal del RE es topolgicamente equivalente a la super-ficie externa de la clula, se comprende por qu todos losoligosacridos de las glicoprotenas, se encuentran en lacara extracelular de la mernbrana plasmtica.

Papel del RE y el complejo de Golgi en la glicosilacin de proteinas 365

(a) Dolicol fosfato

CH. CHl ' l - i ' IcHr- c : cH-cHr-l:Hr- c : cH- cH ? ?\

r -cH2-c -cH2-cr . -o- e-o )

cH, "

,/

MEMBRANA DEL RE

LUZ DEL RE

4 Dolicol-P-manosa

4 Dolicol-P

3 Dolicol-P-glucosa

3 Dolcol-P

(b) Sntesis secuencialdel oligosacridocentral

UDP-GlcNAc

UIVIP

CITOSOL

5 GDP*manosa

5 GDP

(c) Translocacindesde el ctosola la luz del RE

(d) Transferencia a la protena

ll

H Ot i lN - C

/-cHr - cH\

?fl ic

I

Asparagina de la protefna

(e) Procesamiento fnaldel oligosacrido

N - C - C H 2 - C H

FilutaL2'7 Glicosilacin en N: ensamblaie del oligosacrido central y transferencia a una protena. (a) El fosfato de dolicol es eltransportador de unidades del oligosacrido, que se transfieren a residuos de asparagina de determinadas protenas. En mamferos, n sueleser 18. (b) Sntesis secuencialdel oligosacrido central, rico en manosa, por adi-in iucesiva de unidades e N-acetilglucosamin (N),manosa (M) y glucosa (G)' a la cadena en crecimiento. (c) Un translocaor de fosfolpidos (flipasa) expone al oligosicrido, arin incmpleto,hacia el interior del RE. (d) El oligosacrido central, ya maduro, se transfiere desde el dolicol a-un residuo de asparagina de la protena.(e) Eliminacin en el RI' de ciertas unidades de glucosa y manosa, antes de que la glicoprotena sea transferida f CJfgi.

366 Captulo 12 Comportamientos intracelulares: retculo endoplsmico, complejo de Golgi, endosomas, Iisosomas y peroxtsomas

Funciones del RE y el complejode Golgi en el trfico de protenas

Las protenas solubles y de membrana sintetizadas en ri-bosomas asociados al RE rugoso, deben dirigirse a dife-rentes localizaciones intracelulares, que incluyen al propioRE, al complejo de Golgi, a los endosomas y a los lisosomas.Es ms, una vez que una protena llega al orgnulo en el quese supone debe permanecer, tiene que apoyarse en algnmecanismo que impida su salida. Otro grupo de protenassintetizadas en el RE rugoso, estn destinadas a su incor-poracin en la membrana plasmtica o a su liberacin ha-cia el medio extracelular. Cada protena tiene una especfica que permite su inclusin en la vescula detransporte apropiada. En funcin de la protena y su des-tino, la marca puede ser una secuencia especfica de ami-nocidos, una cadena lateral oligosacardica, un dominio

hidrfobo u otra particularidad. Las etiquetas se puedenutilizar tambin como elementos a excluir de ciertas ve-sculas.

Recientemente se ha demostrado que los lpidos de mem-brana tambin se pueden etiquetar, facilitando que las ves-culas alcancen los destinos apropiados. La marca puede seruno o ms fosfatos aadidos a las posiciones 3,4 5 de unamolcula de fosfatidil inositol (PI) de la membrana. As, porejemplo, se ha visto que para se distribuyan correctamente lasvesculas hacia la vacuola de una levadura, es preciso que estpresente una Pl-3-quinasa funcional. La inhibicin de lasquinasas de inostidos en mamferos, perturban el trfico devesculas hacia el lisosoma. Adems de las etiquetas, la longi-tud y e1 grado de saturacin de ciertos lpidos de membrana,parecen ser importantes en el trfico de vesculas.

El trfico asociado al RE y el complejo de Golgi se es-quematiza en Ia Figura l2.8.La clasificacin de protenascomienza en el retculo y compartimientos tempranos del

Transporteantergradoo

Secrecinconstitutiva

ooP... -\o @ @@. ee_q(& ' Vescutas e/ | o '". "l:"'"'J"?:'r"ru -gJfuI C

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Exocitosis

Endocitosis

Membranaplasmtica

,-@3{;..., oo_o! 4*.:*il-"''ry;g temprano'o

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I nr rugo.o

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Transporte Oretrgrado

Figuta 12,8 Tlfico en el sistema de endomemblanas. Las vesculas que transportan lpidos y protenas pueden seguir varias rutas desde elRE y el compiejo de Golgi, dando lugar a vesculas de secrecin, endosomas y lisosomas. @ Las protenas se sintetizan en ios ribosomasunidos a la cara citoslica del RE rugoso. @ Las etapas iniciales de la glicosilacin tienen lugar en la luz del RE. Las vesculas de transicinllevan hacia la RCG a Ios lpidos y glicoprotenas recin sintetizados. @ Los lpidos y protenas se desplazan por el dictiosoma gracias avesculas o a cisternas que van madurando. Desde la RTG parten las que sern las vesculas de secrecin @ y las que formarn parte de losendosomas @, en funcin de su contenido proteico. Las vesculas de secrecin se dirigen hacia la membrana plasmtica, donde liberan, sucontenido por exocitosis, bien @ constitutiva, bien @ como respuesta a una seal. @ La clula toma por endocitosis Protenas y otrosmateriales, fabricando as vesculas de endocitosis, que se fusionan con los endosomas tempranos. @ Los componentes no destinados a Iadigestin que sigue a la endocitosis, son reciclados hacia la membrana plasmtica. @ Los endosomas tempranos, con el material destinado ala digestin, maduran dando lugar, primero a los endosomas tardos, y luego a los lisosomas. @ El trfico retrgrado permite el retorno deprotenas especficas a sus compartimentos correspondientes.

Funciones del RE y el complelo de Golgi en el trfco de protenas 367

dictiosoma, en los cuales existen mecanismos para recupe-rar o retener sus protenas especficas. ste es un paso im-portante en el proceso de clasificacin, pues preserva la fun-cin inherente al compartimiento, que permite que sepuedan llevar a cabo la glicosilacin y otros procesamientos.La clasificacin final del material que debe abandonar elcomplejo de Golgi, tiene lugar en la RTG, donde lpidos yprotenas se empaquetan selectivamente en diferentes po-blaciones de vesculas de transporte, cada una destinada a unlugar diferente de la clula. En algunas clulas, el complejode Golgi est tambin involucrado en el procesamiento deprotenas que entran en la clula por endocitosis.

Las protenas especficas del RE llevan etiquetasde recuperacinLa composicin del RE se mantiene a base de prevenir lafuga de protenas durante los fenmenos de vesiculacin, yde recuperar a las protenas que han alcanzado la RCG. Noest claro cmo se retienen las protenas, ni cules son lasseales que permiten tal retencin. De acuerdo con unateora, las protenas que permanecen en el RE rugoso for-man complejos muy extensos, que quedan fsicamente ex-cluidos de las vesculas de transicin.

La recuperacin -que se produce por flujo retrgradode vesculas de transporte desde la RCG al RE (Figura 12.8,@)- es mucho mejor conocida. Muchas de las protenassolubles residentes del R-E, llevan etiquetas que se unen areceptores de membrana especficos, orientados hacia laluz del complejo de Golgi. Estas etiquetas son secuenciascortas de aminocidos, como KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu),en mamferos y HDEL (His-Asp-Glu-Leu), en levaduras(secuencias basadas en las abreviaturas de aminocidos deuna sola letra1' vaselalista en Ia Thbla 3.3). Cuando una pro-tena que lleve esta seal se una al receptor, ste sufrir uncambio conformacional y el complejo receptor-ligado seempaquetar en vesculas de transporte, que retornarnal RE.

La importancia de las etiquetas de recuperacin se evi-dencia en experimentos con protenas quimricas. Una pro-tena quimrica est formada por fragmentos polipeptdi-cos derivados de dos protenas diferentes, que se unen paraformar un polipptido nico. En este tipo de experimentos,se altera una protena de secrecin para que incluya una se-cuencia que contiene una etiqueta de retencin en el RE. Enmuchos casos, estas protenas vuelven al RE tras sufrir unprocesamiento parcial en el complejo de Golgi. El procesa-miento de las protenas quimricas por enzimas que slo seencuentran en el aparato de Golgi, indica que la etiqueta nose limita a impedir el escape de las protenas, sino que seproduce una autntica recuperacin desde el dictiosoma. Loque no est claro an, es si el transporte retrgrado se pro-duce desde una cisterna cualquiera del dictiosoma directa-mente al RE, o si se ocurre pasando de una cisterna a la pre-cedente y as, de una en una, hasta alcanzar el RE.

Las protenas del complejo de Golgise pueden clasificarpor la longitud de sus dominios transmembranaAl igual que ocurre con las protenas del ER, es probable quealgunas de las protenas residentes en el aparato de Golgi,posean secuencias de aminocidos, que sirvan como eti-quetas para la retencin o la recuperacin. Adems, y comoya se sugiri para las protenas especficas del RE, en el apa-rato de Golgi se pueden formar grandes complejos, quequedan fsicamente excluidos de las vesculas de transpor-te. Por ltimo, hay un tercer mecanismo de clasificacin, es-pecfico de este orgnulo.

Todas las protenas residentes conocidas del complejo deGolgi estn en la membrana. Por tanto, cada una de ellas tie-ne uno o ms dominios hidrfobos, que la atraviesan, faci-litando su anclaje. La longitud de una protena en particu-lar, puede determinar en qu cisterna queda confinada,conforme avanza por el dictiosoma. Recordemos que elgrosor de la membrana aumenta progresivamente desde elRE (unos 5 nm) a la membrana plasmtica (unos 8 nm). Enel complejo de Golgi se comprueba que hay un incremen-to en la longitud de los segmentos transmembrana de lasprotenas, desde la RCG a la RTG. Las protenas tienden adesplazarse de compartimiento en compartimiento, hastaque el grosor de la membrana excede la longitud de los seg-mentos transmembrana, detenindose la emieracin.

La distribucin de protenas lisosomales hacialos endosomas y lisosomas, es un ejemplode la clasificacin de protenas en la RTGDurante su viaje a travs del RE ylos compartimientos tem-pranos del aparato de Golgi, las enzimas lisosomales solu-bles y otras glicoprotenas, sufren la glicosilacin en N, se-guida de eliminacin de unidades de glucosa y manosa.Posteriormente, dentro del complejo de Golgi, se fosforilanlos residuos de manosa de las cadenas glucdicas laterales delas enzimas lisosomales, dando lugar a oligosacridos queposeen manosas-6-fosfato. Esta etiqueta oligosacrida dis-tingue a las protenas lisosomales solubles de otras glico-protenas y asegura su llegada a los lisosomas (Figura 12.9).

La fosforilacin de los residuos de manosa est cataliza-da por dos enzimas especficas del Golgi. La primera, loca-lizada en un compartimiento temprano del dictiosoma, esuna fosfotransfererasa que aade GlcNAc-1-fosfato al to-mo de carbono 6 de la manosa. La segunda, propia de uncompartimiento intermedio del Golgi, elimina GlcNAc,destapando el residuo manosa-6-fosfato.

En correspondencia, la superficie interna de la mem-brana de la RTG, presenta receptores manosa-6-fosfato(RMF).El pH en la RTG est en torno a 6,4,1o que favore-ce la unin de las enzimas solubles lisosomales a los receo-tores. Una vez unidas a los RMF, los complejos receptor-ii-gando se empaquetan en vesculas de transporte cubiertaspor clatrina y se distribuyen hacia los endosomas. En las c-

368 Captulo 12 Compoftamientos intracelulares: retculo endoplsmico, complejo de Golgi, endosomas, lisosomas y peroxisomas

RedIrans Golgi

lulas animales, las enzimas lisosomales necesarias para la de-gradacin del material tomado por endocitosis, se trans-portan desde la RTG, hasta unos orgnulos conocidos comoendosomas tardos. stos constituyen la evolucin de losendosomas tempranos, formados por la reunin de ves-culas originadas en la RTG y en la membrana plasmtica.Conforme maduran hacia endosomas tardos, el pH en laluzbaja hasta aproximadamente 5,5. Esta acidez hace quelas enzimas lisosomales se disocien de sus RMF y previeneel movimiento retrgrado de dichas enzimas hacia el com-

I Sintesis de la enzimailsosomat y aotctondel azcar

! Fosfori lacinde manosa,por la accinsecuencial de dosenzimas

plejo Golgi durante el reciclado de los receptores, que l.uel-ven en vesculas a la RTG. Por ltimo, el endosoma tardomadura para formar un nuevo lisosoma o libera su conte-nido en un lisosoma activo. Las protenas de membrana aso-ciadas a los lisosomas siguen una ruta ms larga, viajandohacia la membrana plasmtica y reentrando en la clulapor endocitosis y transporte hacia un endosoma temprano.

En el conocimiento de esta forma de distribucin de lasenzimas lisosomales, han sido esenciales los estudios de unaalteracin hereditaria humana, conocida como mucolipi-

RE rugoso

RedCls Golgi

I La manosa-6josfatov

se une al receptory las enzrmasa m n i ^ r r a l a n

en vesrculasde transporte

! Reciclaooa 1 l r ^ t ^ r

I Er ouo PH de losv

enoosomas Iarotospromuevela disociacind a a n T i m \ / r a . a n t ^ r

Figura 12.9 Distribucin de enzimas lisosomales solubles hacia los endosomas y lisosomas, mediada por la etiqueta manosa-6-fosfato. @ En elRE, las enzimas lisosomales sufren una glicosilacin en N, seguida de eliminacin de unidades de glucosa y manosa. @ Una vez en elcomplejo de Golgi, los residuos de manosa de las enzimas lisosomales, se fosforilan en dos reacciones enzimticas. En la primera se aade N-acetilglucosanina- 1-fosfato al carbono 6 de la manosa y en Ia segunda se elimina N-acetilglucosamina, exponiendo el residuo de manosafosforilada. @ Las enzimas lisosomales, ahora etiquetadas, se unen a los receptores manosa-6-fosfato de la RTG y se empaquetan en vesculascubiertas de transporte, que alcanzan a los endosomas tardos. @La actdez de la luz de los endosomas tardos, hace que se disocien lasencimas de sus receptores. @ Los receptores se reciclan en vesculas que vuelven a la RTG. Los endosomas tardos maduran, formandolisosomas, o transfieren su contenido a un lisosoma activo.

@-Lrsosoma

8

El retculo endoplsmico 369

dosis de tipo II. Los fibroblastos de los pacientes son capa-ces de sintetiza\ en cultivo, todas las enzimas lisosomales,pero en lugar de incorporarlas en los lisosomas, vierten lamayora de ellas hacia el medio extracelular. La ausencia deresiduos manosa-6-fosfato en las cadenas laterales oligosa-cridas, es una caracterstica comn a todas las protenasmal dirigidas. Es evidente de la etiqueta glucdica modifi-cada es la responsable del desvo de las glicoprotenas solu-bles hacia la ruta de secrecin. Hoy da se sabe que la mu-colipidosis de tipo II est originada por una deficiencia enla fosfotransferasa, la primera de las enzimas implicadas enla adicin de manosa-6-fosfato a las enzimas lisosomales.De todas formas, adems de los residuos manosa-6-fosfa-to, debe haber otros mecanismos implicados en la distri-bucin de las enzimas, pues en los enfermos de mucolipi-dosis de tipo II, s se detectan hidrolasas cidas lisosomalesen las clulas hepticas.

Las rutas de secrecin transportan molculas haciael extedor de la clulaLas rutas de secrecin forman parte del trfico de vescu-las esquematizado en la Figura 12.8. Estas rutas se basan enel desplazamiento de protenas desde el RE y u travs delcomplejo de Golgi, hasta las vesculas de secrecin y gr-nulos de secrecin, que luego descargan su contenido al ex-terior (@). El papel coordinado del RE y el aparato de Gol-gi en la secrecin, fue demostrado por primera yez porGeorge Palade y sus colaboradores, que emplearon mtodosautorradiogrficos para trazar eldestino de protenas mar-cadas radiactivamente, en clulas de las glndulas salivales.

Los resultados de uno de los experimentos de Palade seresumen en la Figura 12.10. A los pocos minutos de inyec-tar en conejos un aminocido radiactivo, las protenas re-cin sintetizadas, identificables por contener el aminocidoradiactivo, se encuentran slo en el RE del tejido secretor.Poco despus, la radiactividad se empieza a detectar en elcomplejo de Golgi, alcanzando el mximo a los 30-40 mi-nutos. A los 30 minutos, las protenas marcadas se encuen-tran tambin en vesculas que parten de Ia RTG, a las quePalade llam vacuolas de condensacin. Alos 90 minutos, laradiactividad se acumula en los grnulos de secrecin, queson vesculas que vacan su contenido hacia el exterior. Aun-que no se muestra en la figura, las protenas marcadas ter-minan por aparecer en el medio extracelular, demostrandoque los grnulos de secrecin, realmente vierten su conte-nido ms all de la membrana plasmtica.

Gracias a los experimentos de Palade y colaboradores ya otros similares realizados posteriormente, la rutas de se-crecin de la Figura 12.8, son hoy da bastante bien cono-cidas. En las clulas eucariotas existen dos formas de secre-cin. La secrecin constitutiva es la descarga continua devesculas en la membrana plasmtica, mientras que la re-guladase caracterizapor la descarga rpida y controlada, ge-neralmente en respuesta a una seal extracelular.

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Leyendas: - RE rugoso- Complejo Golgi- Vesculas TGN- Grnulos de secrecin

Figwa t2.L0 Autonadiografa de la ruta de secrecin, para seguirel destino de las protenas recin sintetizadas en una clula, GeorgePalade y sus colaboradores inyectaron conejos con un aminocidoradiactivo e hicieron autorradiogramas de las glndulas salivales, adiferentes tiempos post-inyeccin, para comprobar la distribucinde las protenas radiactivas. En el Apndice se describe laautorradiograffa aplicada a la microscopa.

Secrecin constitutiva. Despus de su formacin en la RTG,algunas de las vesculas de secrecin se dirigen directamen-te a la superficie celular, donde se fusionan de inmediatocon la membrana plasmtica y liberan su contenido. Esteproceso, que es continuo e independiente de seales extra-celulares especfi.cas, se conoce como secrecin constituti-rra. Como ejemplo, citemos a la secrecin de mucus porparte de las clulas que tapizan el intestino o la secrecin deglicoprotenas hacia la matriz extracelular.

Durante muchos aos, se ha supuesto que la secrecinconstitutiva erala ruta por defecto para las protenas sinte-tizadas en ribosomas asociados al RE. De acuerdo con estemodelo, todas las protenas destinadas al transporte desdeel RE al complejo de Golgi, deban tener etiquetas que lespermitieran salir de la secrecin constitutiva. A menos queuna secuencia aminoaclica o un oligosacrido lateral se-alaran a una protena para su retencin, sta se desplaza-ra por el sistema de endomembranas, hasta ser liberada alexterior. Este modelo estaba apoyado en estudios en los quese eliminaban las etiquetas de recuperacin de protenasespecficas del RE y se exploraba su nuevo destino. La eli-minacin de las secuencias KDEL de protenas residentes enel RE, generalmente resultan en su secrecin, Sin embargo,hay evidencias recientes que permiten suponer la existen-cia de varias secuencias cortas de aminocidos, que marcana las protenas para seguir una de las diferentes rutas de se-crecin constitutiva.

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370 Captulo 12 Comportamientos intracelulares: retculo endoplsmico, complejo de Golgi, endosomas, lisosomas y peroxtsomas

Seclecin fegulada. Mientras que las vesculas que contie-nen las protenas de secrecin constitutiva, estn siendoconstantemente enviadas desde la RTG a la membranaplasmtica, las vesculas implicadas en la secrecin regula-da, se acumulan en la clula y slo se fusionan con la mem-brana plasmtica cuando reciben una orden extracelularespecfica. Un ejemplo bien conocido es la liberacin deneurotransmisores que ser descrita en el Captulo 13 (Fi-gura 13.19). Otros dos ejemplos ms sonlaliberacin de in-sulina por las clulas B de los islotes de Langerhans del pn-creas y la secrecin de enzimas digestivas por las clulasacinares del pncreas.

Las vesculas de secrecin regulada salen de la RTGcomo vesculas inmaduras, que pierden la cubierta de cla-trina e inician un proceso de maduracin. sta implica laconcentracin de las protenas -conocida como conden-sacin- a menudo, el procesamiento proteoltico de laprotena. La veslcula madura se dirige hacia la regin por laque ser secretada, donde permanecer hasta recibir la se-al de liberacin por exocitosis.

Las veslculas de secrecin regulada maduras suelen sermucho mayores y llevan una mayor concentracin de pro-teia que las de secrecin constitutiva. Estas grandes vesl-culas se denominan generalinente grnulos de secrecino dezimgeno, para distinguirlas de otras vesculas. Como semuestra en la Figura 12.11,Ios grnulos de zimgeno (ZG)se concentran en la regin situada entre los dictiosomas, delos cuales proceden, y la porcin de membrana plasmticaque limita la luz en la que descargarn los grinulos.

LUZ Oer acrno' 2,5 rm

figwaL2.LL Grnulos de zimgeno. Micrografia electrnica delos grnulos de zimgeno (ZG) de una clula acinar (secretora) delpncreas exocrino de una rata. Los grnulos de zimgeno suelenconcentrarse entre la zona del complejo de Golgi, a partir de la cualse forman y Ia membrana plasmtica que bordea la luz del acino, ala cual vierten precisamente su contenido, por exocitosis (TEM).

La informacin necesariapara dirigir a una protenahacia una vescula, es posiblemente inherente a su propia se-cuencia aminoaclica, si bien lanattraleza de la seal y losmecanismos de clasificacin, no estn claros. Hay eviden-cias de que las protenas de secrecin forman grandes agre-gados,que excluyen a protenas no secretoras. Este fenme-no podra tener lugar, bien en la RTG, en la que slo losagregados se empaquetaran en vesculas destinadas a sergrnulos de secrecin, o bien en los propios grnulos de se-crecin. El pH de la RTG y de los grnulos de secrecin,puede servir como desencadenante de la agregacin. Lasprotenas solubles que no puedan integrarse en el agregadoen la RTG o el grnulo de secrecin, podran ser empaque-tadas en vesculas de transporte y dirigidas hacia otros des-tinos.

Exocitosis y endocitosis: transportede material a travs de la membrana

plasmticaLos dos mtodos de intercambio de material a travs de lamembrana plasmtica sonla exocitosis, por la cual los gr-nulos de secrecin segregan su contenido hacia el exterioryla endocitosis, por la que las clulas introducen los mate-riales del exterior. Ambos procesos son exclusivos de clu-las eucariotas. Consideraremos primero la exocitosis por serel paso final de una ruta de secrecin que comienza en el REy el complejo de Golgi.

La exocitosis libera molculas de la clula en el medioextracelulal

En la exocitosis, las protenas retenidas en el interior de lavescula, se descargan al exterior, cuando la veslcula se fu-siona a la membrana plasmtica. Por este mtodo se ex-portan multitud de protenas, tanto en las clulas animales,como en las vegetales. Las clulas animales segregan ppti-dos y protenas hormonales, mucus, protenas lcteas y en-zimas digestivas. Las clulas de vegetales y las bacterias, se-gregan protenas asociadas con la pared celular, incluyendoa protenas estructurales y enzimticas.

Las etapas de la exocitosis se ilustran esquemticamen-te en la Figura I2.l2.Las vesculas que contienen los pro-ductos celulares destinados a la secrecin, se dirigen a la su-perficie celular (@), donde se funden las membranas vesicaly plasmtica ( @ ). La membrana plasmtica se expande, fa-cilitando la secrecin (@). Durante el proceso, la membra-na de la vescula se integra en la membrana plasmtica, deforma que la superfrcie interna (luninal) de la vescula, seconvierte en la superficie externa de la membrana plasm-tica ( @ ). Las glicoprotenas y glicolpidos que permanecenanclados a la membrana, se exponen hacia el espacio ex-tracelular.

Exocitosis v endocitosisi: transporte de material a travs de la membrana plasmtica 371

CIToSoL MFDIOEXTRACELULAR

II VesculaJ secrelora

I Rproximacin de lavescula de secrecina la membrana plasmtica

Interior de la vesculaMembrana de la vescula

! fusiOn de membranas

Protenas de la hojainterna de la membrana

Q Ruptura de la membrana

Membranaplasmtica

I

I Liberacion del contenidode la vescula haciael exterior, La membranade la vescula se integraen la membrana plasmtica

Figwa 12.12 Exocitosis. Liberacin al exterior del contenido deun grnulo o vescula de secrecin. Para mayor claridad, se hanomitido las protenas que facilitan el anclaje y fusin de la vesculacon la membana plasmtica. Vase\a Figura 12.19 para msdetalles.

Los mecanismos que subyacen al desplazamiento de lasvesculas de exocitosis, no estn claros an. Las evidenciasactuales apuntan hacia los microtbulos, tanto en la exoci-tosis, como en la endocitosis. Por ejemplo, en algunas clu-las, las vesculas parecen desplazarse desde el complejo deGolgi hacia la membrana plasmtica, a lo largo de

I La vescula en formacinse estranguta,

de la vescula

Figwa L2,L3 Endocitosis, Toma de materiales del erteior. Paramayor claridad, se han omitido las protenas de la cubierta, tanto enla zona de invaginacin, como alrededor de la vescula deendocitosis. La Figura 12.15 detalla la endocitosis dependiente declatrina.

evolucionan hacia endosomas, que se fusionan con las ve-sculas de la RTG, adquiriendo enzimas digestivas y madu-rando para formar nuevos lisosomas. Generalmente sueledistinguirse entre fagocitosls (del griego, ingesta celular) ypinocitosis (bebida celular). A su vez, la pinocitosis se sub-divide en endocitosis mediada por receptores -tambinconocida como endocitosis dependiente de clatrina-y en-docito sis independiente de clatrina.

Fagocitosis. La toma de grandes partculas ()0,5 lm dedimetro), incluyendo agregados macromoleculares, partesde otras clulas, microorganismos e incluso otras clulas, sedenomina fagocitosis. Para muchos organismos eucariotasunicelulares, como las amebas y los protozoos ciliados, la fa-gocitosis es una forma habitual de alimentacin. En muchosanimales primitivos, como los platelmintos, los celentera-dos y las esponjas, sigue siendo un mecanismo de uso rela-tivamente habitual. Sin embargo, en organismos ms com-plejos, la fagocitosis suele quedar limitada a unas clulasespeciales, Ilamadas fagocitos. Por ejemplo, en nuestrocuerpo hay dos clases de leucocitos, que fagocitan de formarutinaria: neutrfilos y macrfagos. Ambos tipos de clulasse valen de la fagocitosis para realizar funciones de defen-sa, ms que de nutricin. Engloban y digieren los materia-les extraos, as como los microorganismos invasivos, pre-sentes en la sangre o en tejidos erosionados. Los macrfagos

pueden actuar, adems, como (rastreadores>, ingiriendorestos celulares presentes en Ia sangre. En ciertas circuns-tancias hay otras clulas de mamferos capaces de fagocitar.Por ejemplo,los fibroblastos del tejido conjuntivo, puedenfagocitar colgeno, para remodelar el tejido y las clulasdendrticas del bazo, fagocitan bacterias, como parte de larespuesta inmune.

La fagocitosis se ha estudiado en detalle en las amebas.La superficie de la mayora de estas clulas est rodeada poruna cubierta, de glicosaminoglicanos, en la que stos pue-den formar prolongaciones finas, que adsorben y atrapanalimentos, partculas u organismos ms pequeos. El con-tacto con las dianas apropiadas, desencadena la respuesta fa-goctica que se muestra en la Figura I2.l4.La actina poli-meriza haciendo que la membrana desarrolle repliegues

Bacteria Pseudpodo

Vesculade fagocitosis

Endosomatemprano

Contacto transitorio,durante la maduracin,

con endosomas tempranos

CITOSOL

Membranaplasmtica

Protenasde la hojaexlerna oeta memorana

Proteinas dela hoja internade la membrana

La membrana se invaginaformando un bolsi l loque engrooaa macromolculasy otros materiales delexterior de la clula

encerrando el materialextracelular

La membrana se cierraalrededor del materialinvaginado, formandoIa vescula

La vescula se separa dela membrana plasmtica,llevando el material delexterior encerrado en unamembrana, que deriva dela membrana plasmiica

Vescula Irecren 1formada I

lnterior dela vescula

.

y tardios\A .^ r^^^ -^l f l l Lr ruuur I rd

\o/ tardo

Lrsosoma maouro/ t ^ k ^ ^ + ^ " i ^ ^ ^ t i ^ ^ ^t t d u d u L E t t d u J i l s d u d

por las hidrolasas l isosomales)

Figwa L2.t4 Fagocitosis. La unin de partculas omicroorganismos a los receptores de la superficie celular,desencadena el inicio de la fagocitosis. La membrana desarrollaunos repliegues llamados pseudpodos, cuya formacin depende lapolimerizacin de actina, que engloban a la partcula. Finalmente,los bordes del pseudpodo se encuentran y se forma :una yacuolafagoctica. Posteriormente, Ia vacuola se fusiona @ con unendosoma temprano o se conecta @ transitoriamente (indicadopor las lneas de puntos) con endosomas tempranos y tardos,madurando para dar lugar a un lisosoma, en el cual se digiere elmaterial interiorizado.

Exocitosis y endocitosisi: transpofte de material a travs de la membrana plasmtica 373

denominados pseudpodos, que rodean progresivamente alobjeto. Finalmente los pseudpodos se encuentran y encie-rran a la partcula, formando una vacuola fagoctica intra-celular. Esta vescula, llamada tambn fagosoma)se fusionaposteriormente con un endosoma tardo o madura direc-tamente hacia lisosoma, formando una gran vacuola en laque se digiere el material capturado. En las vacuolas fago-cticas de los macrfagos, con el fin de aumentar Ia capaci-dad de destruir a los microorganismos, se generan variosoxidantes, como el perxido de hidrgeno o el cido hipo-cloroso.

Endocitosis mediada por receptores. Denominada tambinendocitosis dependiente de clatrina, permite la concen-tracin e ingestin de molculas extraceluiares, gracias a lapresencia de receptores especficos en Ia superficie externade la membrana. (Aunque 1a fagocitosis est tambin me-diada por receptotes, en ella no se concentran sustancias, nies dependiente de clatrina.) La endocitosis mediada por re-ceptores es el mecanismo ms importante de introduccinde la mayora de las macromolculas, en las clulas euca-riotas. Segn el tipo celular, las clulas de mamferos pue-den ingerir, por este sistema, hormonas, factores de creci-miento, enzimas, protenas sricas, anticuerpos, hierro eincluso algunos virus y toxinas bacterianas.

El descubrimiento de la endocitosis mediada por recep-tores y su papel en la entrada de las lipoprotenas de baja

densidad (LDL), se analiza en el Anexo l2B.La endocitosisde LDL permite la entrada de colesterol en las clulas de ma-mferos. Su inters por el estudio de la hipercolesterolemiafamiliar, predisposicin hereditaria a tener elevados nivelesde colesterol en sangre y, por tanto a la aterosclerosis y do-lencias cardacas, permiti a Michael Brown y loseph Golds-tein descubrir la endocitosis mediada por receptores, hechopor el cual compartieron el Premio Nobel en 1986.

El proceso se ilus