Capitulo3- FUNDAMENTOS PARA EL DX MICOLÓGICO

7/22/2019 Capitulo3- FUNDAMENTOS PARA EL DX MICOLGICO

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La medicina basada en la evidencia, consisteen la aplicacin rigurosa de criterios cientficos altrabajo diario, en micologa debe estar encaminadoa proporcionar datos que ayuden en el cuidado delenfermo o en la prevencin de la enfermedad o sudiseminacin. La finalidad es garantizar alta calidady coste efectividad [1].

Para alcanzar el xito en el diagnstico mico-lgico es fundamental realizar adecuadamente larecogida de la muestra, su transporte y procesamien-to, la siembra de la misma en los medios idneos y ala temperatura adecuada, as como la identificacine interpretacin correcta de los aislamientos. nica-mente con el procesamiento adecuado se puederecuperar el hongo claramente asociado con el pro-ceso infeccioso [2].

Teniendo siempre presente, a la hora de valo-rar un crecimiento fngico, la necesidad de diferen-ciar un aislamiento significativo de otros debidosa hongos contaminantes, ya que no es lo mismoidentificar una especie fngica que diagnosticar unamicosis.

En este Captulo se detallan los fundamentosy recomendaciones bsicas del diagnstico micol-

gico y en los siguientes, las caractersticas especfi-cas del procesamiento de cada muestra segn elorigen anatmico de la misma.

3.1. Recogida de muestras

El diagnstico de las micosis comienza conla sospecha clnica y una adecuada obtencin de lamuestra, a partir de la lesin, y su correcta manipu-lacin, para mantener la viabilidad del agente etiol-gico y evitar posibles contaminaciones, son aspectosfundamentales que siempre deben tenerse en cuentapara la obtencin de un correcto diagnstico mico-lgico.

No debe olvidarse la importancia de etiquetary rellenar adecuadamente el volante de peticin, deforma que refleje claramente la sospecha clnica ylos factores predisponentes del paciente; destacan-do, si los hubiera, la existencia de tratamientos quepudieran interferir en el aislamiento del miceto.Tambin es necesario reflejar la localizacin anat-mica, cuando ha sido recogida, el medio de trans-porte, si lo hay, cmo ha sido el transporte y cuantotiempo ha durado.

3.1.2. Consejos generales para optimizarla recogida de muestras

El mtodo de recogida vara segn el tipo demicosis y su localizacin; as ocurre, por ejemplo,en el caso de las dermatofitosis.

1. Debe disponerse de un protocolo de recogida demuestras actualizado peridicamente.

2. Es necesario recoger las muestras aspticamente,utilizando contenedores estriles, remitirlas allaboratorio antes de 2 h y sembrarlas lo antesposible.

3. La muestra debe recogerse antes de instaurar eltratamiento y siempre de la parte activa de lalesin (cuando se sospecha una micosis pulmo-nar es preferible una muestra respiratoria antesque un hemocultivo).

4. Los hisopos deben ser evitados, siempre que eltipo de lesin lo permita. Pero hay muestras(conducto auditivo, faringe, vagina o crvix) queno pueden ser recogidas de otra manera.

5. En el caso de heridas abiertas, drenajes o lesio-nes superficiales, debe limpiarse la zona previa-

mente para evitar contaminaciones.6. Las muestras de lesiones cerradas y abscesos

suelen ser de gran rendimiento. Deben ser aspi-radas con jeringa y transferidas a un contenedorestril, con ClNa al 0,85% no bacteriosttico.Alternativamente, lavar la jeringa y aguja conClNa al 0,85% no bacteriosttico o caldo estrily remitir la jeringa, slo cuando se pueda perderla muestra sino se hace as. Hay que prestaratencin a la recogida de grnulos, si los hubie-se.

7. El raspado de lesiones de piel y faneras puederealizarse con distintos materiales; los ms utili-zados son bistur, moqueta o cepillo.

8. En situaciones que requieran un estudio epide-miolgico, debe establecerse la necesidad de unarecogida de muestras ambientales, familiares oanimales.

9. El laboratorio debe ser informado de la sospechade hongos peligrosos en la manipulacin (p. ej.,Coccidioides spp e Histoplasma spp) y aquellosque requieren un procesamiento especial(Malassezia spp), as como de viajes u origen depaciente.

10.Histoplasma capsulatum no sobrevive por perio-dos largos a la refrigeracin o hielo seco.

11. En general, no se recomiendan los hisopados deheridas abiertas o drenado de lesiones, ya queestn contaminados frecuentemente.

Asociacin Espaola de Micologa

2007RevistaIberoamericana

deMicologa-ISBN:978-84-611-8776-8

3-1Fundamentos bsicos para el diagnstico micolgico

3Antonio Rezusta LpezAurora Snchez Sousa

Joaquina Gil Toms


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3.3. Procesamiento de las muestras

En trminos generales, los procedimientosutilizados en el laboratorio de bacteriologa son ade-cuados para el cultivo de hongos, pero hay que teneren cuenta que, habitualmente, la carga microbianaes inferior en el caso de los hongos con respecto alas bacterias. Esto obliga a recoger mayor cantidadde muestra para obtener un rendimiento ptimo.

Las muestras inaceptables no deberan serprocesadas y el facultativo remitente informadoinmediatamente. Todo laboratorio debe distribuirpor escrito las normas de rechazo de muestras.

3.3.1. Consejos generales para optimizarel procesamiento de muestras

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.

2. Registrar toda la informacin necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra y querepresente inters diagnstico (aspecto, color,olor, consistencia, cogulos, etc.), as como todo

lo relacionado con su recogida, transporte y con-servacin.

3. Durante el procesamiento, deben seguirse todasla medidas de seguridad necesarias, tanto para elpersonal como para la muestra.

4. El procesamiento debe llevarse a cabo tan prontocomo sea posible para garantizar la viabilidaddel hongo, utilizando el medio de cultivo y latemperatura de incubacin ms adecuado.

5. La recuperacin de los hongos es imprescindiblepara su identificacin y la realizacin de pruebasde sensibilidad.

6. El tipo de procesamiento y los medios utilizadosdependen de las caractersticas de cada muestra.

3.3.2. Preparacin de la muestra

Para optimizar tanto la observacin micros-cpica como el cultivo, es necesario preparar lamuestra, aunque algunas se pueden inocular directa-mente sin que sea necesaria su manipulacin previa.Todas las muestras deben observarse macroscpica-mente y seleccionar la parte ms representativa. Enmuestras como esputo y tejidos deben buscarse laszonas de pus, caseificacin, o necrosis [6].

12. En general, con la excepcin de biopsias, reali-zar una muestra por da y por localizacin (sinexceder de 3 por semana).

13. La cantidad de muestra necesaria para el diag-nstico micolgico en general es superior al deldiagnstico de las infecciones bacterianas.

14. Es necesario reflexionar sobre afirmacionescomo el laboratorio tiene la responsabilidad deproporcionar el personal en las reas de recogida(zona quirrgica, en la cama del enfermo, opacientes ambulatorios), que proporcione lasinstrucciones adecuadas [2].

3.2. Transporte de las muestras

Todas las muestras deben remitirse sin con-servantes. Las muestras deben ser transportadas enun recipiente estril, humidificado y a prueba devertidos; sin embargo, las muestras dermatolgicaspueden transportarse en un recipiente seco (placa dePetri, papel de fotografa negro, entre dos portas) o,de forma ideal, sembrada directamente sobre elmedio de cultivo.

No deben introducirse en medios de trans-porte, a no ser que sea fcil retirar la muestra delmedio.

Los raspados corneales y hemocultivosdeben sembrase directamente en el medio de cultivoadecuado.

Las muestras, una vez obtenidas, deben sem-brarse lo antes posible despus de la recogida.Aunque hay pocos estudios sobre el descenso de laviabilidad de los hongos a temperatura ambiente opor la accin del hielo seco, es conocida la dificul-tad de recuperar Rhizopus arrhizus en muestrasdemoradas y, tambin, la prdida de viabilidad dealgunos hongos por la desecacin, temperatura ele-

vada (>37 C) o baja (


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Tabla 3.1. Muestras ms comunes, hongos productores ms frecuentes, recogida y transporte.

Muestra Hongo Recogida Tiempo y temperatura Notaprobable y transporte (transporte / conservacin)

Absceso / Levaduras Muestra aspirada y Muestra del margen activo.herida Filamentosos transporte en jeringa Si la muestra se recoge por

sin aguja. Remitir en ciruga, remitir tambin unacontenedor estril porcin de la pared del absceso.

Si se utiliza hisopo, deberanremitirse varios.

Grnulos - Grnulo blanco: Recoger pus, exudado, 2h, TA / 24h, TA Granos o grnulos ensubcutneos Acremonium falciforme, biopsia y drenaje eumicetoma

Acremonium recifei, tractos sinuosos.Aspergillus nidulans, Lavar los grnulosNeotestudina rosatii, con solucin salinaPseudoallesheria boydii; conteniendo antibiticos- Grnulo negro:Exophiala jeanselmei,Leptosphaeria senegalensis,Madurella grisea,Madurella mycetomatis,Pyrenochaeta romeroi

Abscesos Aspirar con jeringa y 2h, TA / 24h, TA Muestra de la base de la lesinsubcutneos agua. Transporte y pared del absceso

anaerobio o inoculacindirecta 1ml

Sangre Candidaspp., Desinfectar la zona con 2h, TA / 24h, TA La mayora de las Candidaspp.Malasseziaspp., compuesto iodado. se pueden recuperar en los

Cryptococus neoformans, Lisis centrifugacin. sistemas de hemocultivos.Histoplasma capsulatum Sistemas automatizados. Si se usa sistema automatizadoMedios bifsicos de infusin determinar qu hongoscerebro-corazn. pueden ser detectados.Extraer la mxima cantidad Para los hongos dimrficosrecomendada por el fabricante (lisis centrifugacin).

Puede detectarse antgeno deCryptoccocus, de Histoplasmao de Aspergillus

Mdula sea Cryptococus neoformans, Preparar para incisin Como la sangre Si se usa un sistemaHistoplasma capsulatum quirrgica. automatizado, revisar las

Lisis centrifugacin. normas del fabricanteMedio apropiado en lacabecera del enfermo

Catter Candidaspp., 5 cm distales, colocarlos No estandarizado actualmenteMalasseziaspp. en contenedor estril

Raspado Candida albicans, Inocular directamente Inocular directamente Sembrar tocando con amboscorneal Cryptococus neoformans. en el medio y en el porta, en la cabecera del lados de la esptula dibujando

Hongos filamentosos mediante raspado con enfermo una C en el mediomuchas especies esptula(Aspergillusspp.,Fusariumspp.,Paecilomycesspp.,Penicilliumspp.,hongos dematiceos)

Lquido Recoger en un contenedor 15 min, TA / 24h, TA Si es lavado intraocular,intraocular estril, o inocular centrifugar antes de sembrar

directamente

Sigue




Fundamentos bsicos para el diagnstico micolgico 3-3


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Fundamentos bsicos para el diagnstico micolgico3-4

2007RevistaIberoamericanadeMicologa-ISBN:978-84-611-8776-8

Tabla 3.1 (cont.). Muestras ms comunes, hongos productores ms frecuentes, recogida y transporte.

Muestra Hongo Recogida Tiempo y temperatura Notaprobable y transporte (transporte / conservacin)

Pelos* Trichophytonspp., Seleccionar el rea, Contenedor seco, sobre Para el transporte no usar tubosMicrosporumspp. arrancar 10-12 pelos de papel. que mantengan la humedad,(tinea capitis) y recoger escamas. Si se hace con hisopo favorece el sobrecrecimiento

En nios con exudado sembrar directamente. bacteriano.puede ser til frotar 72h, TA / 72h, TAcon un hisopo.

Uas* Trichophytonspp., Desinfectar con 72h, TA / 72h, TA La humedad favoreceEpidermophyton floccosum, alcohol 70%. el sobrecrecimientoMicrosporumspp., Raspar la ua y cortar bacterianoCandidaspp., trozos pequeos,

Scopulariopsis brevicaulis, recoger detritus.otros hongos filamentososde ms difcil interpretacin

Piel* Trichophytonspp., Desinfectar con Directamente sobre el La humedad favoreceE. floccosum, alcohol 70%. medio o en contenedor el sobrecrecimientoMicrosporumspp., Raspar los mrgenes estril o entre dos portas bacterianoCandidaspp., de la lesin 72h, TA / 72h, TAMalasseziaspp.,Sporothrix schenkii

Respiratorio Levaduras Recoger 3 esputos 2h, TA / 24 h, 4 C Esputo de 24 hHongos filamentosos en 3 das consecutivos no es aceptable.

despus de tos profunda. Los hongos dimrficosCuando sea posible sobreviven poco tiempolavado broncoalveolar, Considerar P. jiroveciencepillado bronquial. inmunodeprimidosContenedor estril >1 ml

Oral Candidaspp., Hisopar la lesin activa; 2h, TA / 24h, TA Medio selectivo paraParacoccidioides brasiliensis enjuagar con solucin levaduras

salina para Candida.Medio de transporte para elel hisopo o contenedor estril

Seno nasal Recoger el contenido del 2h, TA / 24h, TAseno quirrgicamente.Inocular directamente o enuna gasa estril hmeda

Lquidos Candidaspp., Recoger como para 15 min, TA o 30 C / El aspirado o biopsiaestriles H. capsulatum, bacterias, al menos 2 ml o 24h, TA. cerebral pueden ser

C. neoformans en contenedor estril Nunca refrigerar. necesarios

Tejidos / Levaduras, En contenedor estril 15 min, TA / 24h, TA Biopsias por Punchbiopsias hongos filamentosos aadir un poco de SF pueden utilizarse para

estril no bacteriosttico las lesiones de pielpara prevenir la desecacin

Orina Levaduras Primera or ina de la 15 min, TA / 24h, 4 C Recoger la or ina a mitadC. neoformans, maana en contenedor de la miccin.C. immitis, estril. Puede utilizarse paraH. capsulatum, Orina obtenida por sondaje. deteccin de antgenoB. dermatitidis Orina postmasaje prosttico de Histoplasma

Odo externo Aspergillus niger, Girar con firmeza el < 2h, TA / < 24h, 4 CAspergillus flavus hisopo en el canal externo

Vagina C. albicans, Como para bacterias Medio de transporte.C. glabrata, < 2h, TA / < 24h, TACandidaspp.

*La toma de muestras se realizar preferentemente en el laboratorioTA: temperatura ambienteModificado de Shea et al. [5] y Sutton [2]


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1. Los tejidos deben ser troceados e inoculados enpequeos trozos en el medio de cultivo con elfin de facilitar el crecimiento o la penetracin dealgunos colorantes como el blanco de calcoflor.La utilizacin de homogenizadores no est com-pletamente aceptada ya que puede destruir a loshongos no septados. El troceado puederealizarse con tijeras o bistur, el proceso puederealizarse en una placa de petri aadiendo unasgotas de agua destilada estril.Las muestras altamente viscosas, como el es-puto, deben fluidificarse, sin diluirlas exce-sivamente. Y si son muy diluidas debenconcentrarse mediante centrifugacin. Este pro-ceso es especialmente til para Pneumocystisjiroveci.

2. Los lquidos orgnicos (LCR, pleural, peritone-al, articular, etc.) deben concentrase por centri-fugacin (1500-2500 g durante 10 min) ofiltracin (0,2 m de poro), siempre que hayasuficiente cantidad. Estas muestras puedenrequerir un procesamiento especial o ser sem-bradas directamente en el medio de cultivo.

3. Los fragmentos ungueales se trocean progresiva-mente con un bistur y se pulverizan.

3.3.3. Cultivo de la muestra

En la Tabla 3.2 se resumen los medios decultivo recomendados habitualmente segn el tipode micosis.

3.3.4. Observacin de la muestra

El diagnstico definitivo de la mayora de lasmicosis requiere el aislamiento e identificacin delhongo a partir del cultivo, lo que supone, con fre-cuencia, varios das o semanas de dilacin.

No obstante, el mtodo ms rpido para ladeteccin de estructuras fngicas en una muestraclnica es el examen microscpico de la misma. Esteexamen puede aportar, en ocasiones, un diagnsticodefinitivo (pitiriasis versicolor) y en otras, un diag-nstico de sospecha previo a la confirmacin defini-tiva por cultivo. Por lo tanto, es un procedimiento

que debera ser realizado en todos los laboratoriosya que puede realizarse mediante tcnicas sencillas,aunque a veces puede requerir tinciones complejas,permitiendo dirigir los medios adecuados para elcultivo de la muestra. En el Captulo 14a de estaGua se detallan las caractersticas de las tcnicas deexamen microscpico ms utilizadas en Micologa.Sin embargo, si la muestra es escasa, el cultivo debeser prioritario. Las tcnicas moleculares comienzana ser una realidad y permitirn un diagnsticoms rpido que el cultivo, si bien estn menos desa-rrolladas que para las bacterias o los virus(Captulo 20).

Las limitaciones y los problemas del examenmicroscpico tambin deben ser tenidos en cuenta:i) un examen negativo no excluye la infeccin; ii) elexamen microscpico puede originar falsos positi-vos al confundirse ciertas estructuras con elementosfngicos (linfocitos lisados por C. neoformans en latincin con tinta china, fibras de colgeno o del

Tabla 3.2. Medios de cultivo bsicos recomendados.

Micosis superficiales Agar glucosado de Sabouraud (SDA) + cloranfenicol (SDAC) Agar glucosado de Sabouraud + cloranfenicol + cicloheximida (Mycobiotic,

Mycosel) Dermatophyte test medium(DTM), opcional

Ante la sospecha de Malasseziautilizar medio de Leeming (LNA) o de Dixonmodificado (mDixon), en el caso de pitiriasis no es necesario el cultivo para eldiagnstico

Para la deteccin de Candidaen las muestras mucocutneas, la utilizacin demedios cromognicos facilita la deteccin de cultivos mixtos y la identificacinrpida

Micosis subcutneas SDA, SDAC, Mycobiotic o Mycosel (MYC), Agar infusin cerebro-corazn (BHIA)

Micosis sistmicas SDAC BHIA (Dimrficos) Agar de Staib (Cryptococcus) BHIA con antibacterianos e, incluso, con cicloheximida en muestras muy contami-

nadas (Dimrficos) LNA o mDixon (Malassezia)

Miscelnea SDAC(aspergilosis, mucormicosis, otomicosis)


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pueden contener esporas podran tratarse deesfrulas de Coccidioides immitis. Sin embargo,Rhinosporidium seeberi tambin puede mostraresfrulas grandes y endosporas.

h. Clulas gemantes de paredes gruesas acompaa-das o no de pseudohifas, pueden corresponder aMalassezia. Cuando la lesin es caracterstica depitiriasis, este es el procedimiento correcto pararealizar el diagnstico

Elementos miceliales

(con o sin otras estructuras asociadas)

a. Hifas no septadas, de pared gruesa, algunas de

las cuales pueden mostrar ramificaciones en 90:Rhizopus spp.,Mucorspp.,Absidia spp.

b. Hifas septadas, ramificadas, algunas en V, con osin cabezas deAspergillus, posiblemente corres-pondan aAspergillus spp.

c. Hifas septadas, pigmentadas (marrones oscuras)con o sin cuerpos esfricos, pueden pertenecer ahongos dematiceos.

d. Racimos de pared gruesa y oscura, con aparien-cia de gemas, posiblemente pertenezcan a unagente de cromomicosis.

e. Fragmentos de hifas con o sin esporas, con o sinlevaduras probablemente correspondan a derma-tofitos o aM. furfurcomplex.

Las tcnicas ms habitualmente utilizadaspara la observacin microscpica de las muestras seresumen en la Tabla 3.3.

3.4. Medios de cultivo

El objetivo fundamental de la utilizacin delos medios de cultivo es optimizar el crecimiento delos microorganismos. El primer medio de cultivoque permiti el aislamiento de los grmenes enmedios artificiales fue el propuesto por Koch, en1876, basado en el uso de gelatina. Posteriormente,Frost en 1909 utiliz medios deshidratados y, en1919, aadi agar, lo que proporcion un gran avan-ce en el estudio de la microbiologa.

La composicin bsica de un medio incluyenutrientes, agente solidificante (en los medios sli-dos o semislidos), pH adecuado y componentesespecficos. En los medios de cultivo para el aisla-miento de hongos, los antimicrobianos se utilizancon frecuencia, tanto para inhibir el crecimientobacteriano como el de otros hongos ambientales.

Atendiendo a su composicin, los medios de cultivo

hisopo pueden confundirse con elementos fngicos,gotas de grasa con levaduras gemantes, etc).

El examen microscpico debe realizarse, almenos, en todas las muestras con alta sospecha demicosis; aunque lo ideal sera realizarlo siempre quefuese posible.

Las muestras para estudio micolgico debenser examinadas tanto macroscpica como microsc-picamente:

Observacin macroscpica

Antes de inocular los medios de cultivo yrealizar el examen microscpico, la muestra debeser examinada en busca de grnulos, material caseo-so, purulento, hemorrgico o necrtico.

Examen microscpico

La observacin microscpica se realiza conbajo aumento, seguida de alto aumento en seco y, sies necesario, con objetivo de inmersin. Las dosformas observadas habitualmente son levaduras y/oelementos miceliares.

Es aconsejable utilizar peridicamente con-troles positivos y negativos y, si una tincin se

emplea ocasionalmente, deben incluirse siemprecontroles que aseguren su correcta utilizacin.

Aunque es muy difcil identificar una especiefngica por la morfologa observada en el examenmicroscpico directo de la muestra, algunas imge-nes pueden asociarse a ciertos gneros o especies:

Levaduras

a. Clulas, con o sin gemas, de varios tamaos yformas, posiblemente sean Candida spp. u hon-gos dimrficos.

b. Clulas de pared gruesa, generalmente con una

gema de base amplia, podran corresponder aBlastomyces dermatitidis.

c. Clulas de pared delgada con gemacin mltiplerodeando a la clula madre, posiblemente seanParacoccidioides brasiliensis.

d. Clulas rodeadas de una cpsula grande, proba-blemente corresponden a C. neoformans.

e. Clulas pequeas, de gemacin simple observa-das en tinciones especiales, posiblemente sonH. capsulatum.

f. Clulas con pseudohifas: Candida spp.,Geotrichum spp., o Trichosporon spp. Las dosltimas pueden mostrar artrosporas.

g. Clulas redondas de pared gruesa de varios

tamaos, algunas de las cuales (las ms grandes)




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puede ser generales, enriquecidos, selectivos, dife-renciales y especializados:

A. Generales: El ms caracterstico y clsico es elagar glucosado de Sabouraud (SDA) y su equi-valente en EEUU, el medio para mohos. Ambosse utilizan frecuentemente para el aislamiento apartir de la muestra y para la descripcin de lascaractersticas de la mayora de los hongos.

B. Enriquecidos: Se utilizan especialmente enmicosis sistmicas endmicas (histoplasmosis,coccidioidomicosis, etc.), un ejemplo es la infu-sin cerebro-corazn (BHI).

C. Selectivos: Son medios que favorecen el aisla-miento de los microorganismos deseados impi-diendo el de otros. Los componentes msutilizados como agentes selectivos son antibac-terianos (cloranfenicol, gentamicina, penicilina,estreptomicina) y tambin inhibidores de hon-gos, como la cicloheximida que es especialmen-te til en las muestras cutneas y respiratorias demicosis sistmicas endmicas.

E. Diferenciales: Se utilizan para ayudar a la iden-tificacin del hongo basada en la apariencia deste en dicho medio, merced a la adicin dedeterminados componentes como por ejemplosustancias cromgenas, o indicadores de pHcomo en el DTM (que tambin es selectivo).

F. Especializados: Son aquellos medios que con-tienen algn componente (Guizotia abyssinica)destinado a aislar un agente concreto(Cryptococcus neoformans) o a favorecer laidentificacin de ciertas especies (medio deCzapeck).

3.4.1. Preparacin de los medios de cultivo

La buena calidad de los medios es indispen-sable para conseguir el aislamiento y la identifica-cin en Micologa; por lo tanto, cuando se utilicenmedios comerciales es necesario tener en cuenta lagaranta que aporta el proveedor y la calidad de ladistribucin.

Cuando se prepara un medio deshidratadodeben seguirse rigurosamente las instrucciones delfabricante, evitando errores en la forma de disolver-lo o suspenderlo, en la temperatura y/o duracin dela esterilizacin, para preservar la calidad del pro-ducto final. La esterilizacin en autoclave es mseficaz si se utilizan frascos de volmenes inferioresa 500 ml; si se han utilizado imanes para la disolu-cin, deben retirarse antes de introducir los mediosen el autoclave. Tambin hay que tener presente quealgunos antibiticos deben aadirse al medio unavez esterilizado y a la temperatura adecuada, parano ser desactivados por las altas temperaturas de laesterilizacin.

3.4.2. Control de calidad

Para asegurar la correcta utilizacin de losmedios, debe controlarse peridicamente sus carac-tersticas ms importantes: apariencia, esterilidad,pH y funcionamiento. El funcionamiento se puedeevaluar utilizando las cepas de control adecuadaspara cada medio. En este proceso se recomiendaseguir las especificaciones del documento M22-Adel CLSI (antes NCCLS) en aquellos casos en losque est establecido [3].




Tabla 3.3. Tcnicas de observacin microscpica.

En fresco Tinciones________________________________________ _____________________________________________________

KOH KOH + tinta Parker negra, KOH + blanco calcoflor:Uso general

KOH + tinta Parker negra Giemsa: micetoma, histoplasmosis, coccidioidomicosis,

KOH + blanco calcoflor neumocistosis, otras micosis cutneas con exudado o pus

Tinta china (Cryptococcus) PAS: micetoma, coccidioidomicosis, onicomicosis

Grocott: neumocistosis

Fontana Masson: neumocistosis

Inmunofluorescencia:neumocistosis



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Como norma general, todos los mediosdeben utilizarse antes de la fecha de caducidad indi-cada por el fabricante y, antes de su utilizacin,deben atemperarse durante unos minutos.

3.4.5. Eleccin de los medios de cultivo

Los medios ms utilizados en el cultivo dehongos son: agar glucosado de Sabouraud, habitual-mente con la modificacin de Emmons (SDA); agarinfusin cerebro-corazn (BHIA) con o sin sangrede cordero al 5%, con o sin antibacterianos; agar

inhibidor para mohos (MIA); agarMycosel/Mycobiotic y agar glucosado de patata(PDA). Sin embargo, los hongos tambin puedencrecer en medios no selectivos, incluidos la mayorade los medios bacteriolgicos, si se incuban el tiem-po suficiente.

La eleccin y el nmero de medios a utilizarestn condicionados por el coste, la disponibilidad ylas preferencias personales, pero siempre se debenincluir medios con antibacterianos y sin ellos.

La incorporacin de cicloheximida, inhibidorde muchos hongos considerados contaminantes,ayuda especialmente en las micosis de la piel, aun-que pueda inhibir algunos patgenos fngicos

importantes; por ello, debe utilizarse siempre encombinacin con otro medio sin cicloheximida.

El aislamiento de algn hongo puede versedificultado por otros factores como la acidificacindel medio utilizado (para impedir el crecimiento debacterias) o, en el caso de Malassezia spp., la utili-zacin de gentamicina. [9]

Los medios ms empleados en Micologapueden agruparse en dos categoras en funcin de suutilidad: aislamiento e identificacin. Para el aisla-miento, la utilizacin de 3-4 medios prcticamentecubre todas las necesidades: SDA con/sin antimicro-bianos (el ms utilizado en Europa y sustituido confrecuencia en EE.UU. por MIA); un medio concicloheximida y agar infusin cerebro corazn, paralas micosis sistmicas endmicas.

Sin embargo, en ciertas situaciones es reco-mendable la utilizacin de otros medios:

i) ALN, Dixon, o SDAC con aceite de oliva para elaislamiento deMalassezia;

ii) medio cromognico en las muestras de mucosas,para facilitar el diagnstico de infecciones mixtaspor levaduras;

iii)medio para Cryptococcus, para facilitar su detec-cin en muestras donde es frecuente el aisla-miento de otras levaduras (muestras respiratorias).

Los controles de calidad deben realizarsetanto a los medios elaborados en el laboratorio,como a los medios comerciales ya preparados; eneste caso, es conveniente solicitar al fabricante loscontroles a utilizar y los resultados para el lotesuministrado. En el Captulo 18 de esta Gua sedetallan los aspectos del control de calidad.

3.4.3. Soporte de los medios de cultivo

El soporte habitual para los medios de culti-vo en Micologa suele ser tubos de cristal o placasde Petri (90 mm). La eleccin depende del usuario;autores como De Hoog y Guarro proponen el usohabitual de placas excepto, por razones de seguri-dad, en los casos de sospecha de histoplasmosis,coccidioidomicosis, blastomicosis, paracoccidioido-micosis e infecciones por Penicillium marneffei [4].

Si se utilizan tubos, deben incubarse en posi-cin horizontal las primeras 24 h para que el inculono se concentre en el fondo. Los tubos no deben serlos habituales de Microbiologa porque, en ellos, lascolonias no son fciles de aislar. Si los tubos utiliza-dos son de tapn de rosca, el cierre debe mantenerseparcialmente abierto para garantizar las mejorescondiciones atmosfricas.

Cuando se eligen placas, es conveniente quecontengan 40 ml de medio para evitar que se sequeny deben sellarse con cinta adhesiva para que no seabran involuntariamente, protegiendo al personal delos hongos patgenos y evitando la contaminacincon hongos externos. El precintado debe ser perme-able al aire, ya que cuando el aire circula librementese favorece la produccin de pigmento y la superfi-cie del agar se seca, permitiendo el desarrollo demicelio areo y esporas.

3.4.4. Almacenamiento

Los medios se deben guardar refrigerados a2-8 C. Para mejorar su conservacin y prevenir ladesecacin, es aconsejable invertir las placas eintroducirlas en bolsas de plstico.

Las placas de Petri suelen conservarse enbuen estado unos tres meses, mientras que losmedios semislidos o lquidos en tubo de rosca seconservan bien hasta seis meses. Sin embargo, cier-tos medios, al contener sustancias inestables (anti-biticos, vitaminas, sangre, etc.), no se conservan enbuen estado tanto tiempo. Tambin hay que tenerpresente que algunos componentes de ciertosmedios pueden verse afectados por la luz, por lo queestos medios deben almacenarse en contenedores

opacos.


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Para la identificacin, puede ser necesario unnmero mayor de medios que depender de las etio-logas ms probables en la zona geogrfica, lasposibilidades del laboratorio y el nivel diagnsticoesperable segn el tipo de centro.

3.4.6. Medios de cultivo ms utilizados

A continuacin se detallan las principalesindicaciones, composicin, forma de preparacin ylos controles de calidad de los medios de cultivoms utilizados en el laboratorio de Micologa clni-ca. Los medios comerciales pueden presentarpequeas variaciones respecto a lo expuesto en loscuadros.

Agar Czapek Dox*

Se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmente Aspergillusspp. y Penicilliumspp. Es el medio de referenciapara la identificacin de Aspergillusspp.

Composicin

Nitrato sdico (NO3Na) . . . . . . . . . . . . . . . . .3 gFosfato dipotsico (PO4K2H) . . . . . . . . . . . .1 gSulfato magnsico (SO4Mg.7H2O) . . . . . . .0,5 gCloruro potsico (ClK) . . . . . . . . . . . . . . . .0,5 g

Sulfato ferroso (SO4Fe.7H2O) . . . . . . . . .0,01 gSacarosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Calentar hasta disolver todos los componentes.b) Esterilizar a 121 C durante 15 min.c) Dispensar en placas de Petri.

Control de calidad

Apariencia: mbar plido, slido trasparente.pH final a 25 C: 7,3 0,2.

Aspergillus flavus: crece, colonia amarilla-verde.

(*) Disponible comercialmente (Becton Dickinson, Difco, Merck, Remel)

Agar agua

Estimula la formacin de conidios. Recomendable para hifomicetes de pigmentacin oscura (dematiceos) e incluso

para dermatofitos poco o nada esporulados. Favorece la esporulacin de hongos saprofitos.

Composicin

Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gAgua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Calentar hasta disolver todos los componentes.b) Esterilizar a 121 C durante 15 min.c) Dispensar en placas de Petri.d) De forma opcional, se pueden depositar fragmentos de papel estril en la superficie del medio solidificado.

Control de calidad

Aspecto: slido transparente.

Microsporum canis:abundante produccin de macroconidios principalmente en la zona de contacto entre el agar agua y

los bordes del fragmento de colonia poco o nada esporulada.


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Agar extracto de malta (MEA)*

Medio para el aislamiento y recuento de levaduras y hongos miceliares. Adecuado para la identificacin de zigomicetesy especies de Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, etc. Se han descrito varias formulaciones que incluyen el extractode malta y agar suplementados con peptonas, maltosa y/o dextrina y/o glicerol.

Composicin

Extracto de malta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gPeptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 gGlucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 gAgua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Calentar hasta disolver todos los componentes.b) Esterilizar a 121 C durante 15 min.c) Enfriar a 45 C.d) Dispensar en placas de Petri.

Importante: no recalentar.

Control de calidad

Aspecto: mbar, transparente.pH final: 5,6 0,1.

Aspergillus nigerATCC 9642: micelio blanco, conidias negras.Candida albicansATCC10231: buen crecimiento, colonias crema.

Si se desea ajustar el pH a 3,5, enfriar a 55C aadir 2-3 ml de cido lctico al 10% a 100 ml de agar extracto de malta.Una vez acidificado no se debe volver a calentar.

(*) Disponible comercialmente (Merck; Oxoid)

Agar Dixon modificado (mDixon)

Utilizado en el cultivo de Malasseziaspp. Puede modificarse aadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida.

Composicin

Extracto de malta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36 gPeptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 gOx bile, desecada . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gTween 40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 mlGlicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 mlcido oleico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 mlAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin


Control de calidad

Aspecto: Blanco amarillento, no muy slido.pH final: 6,0

Malassezia restricta: Crece.En el medio inhibidor:

M. restricta: Crece.Aspergillus flavus: Inhibicin parcial o completa.Staphylococcus epidermidis: Inhibicin parcial o completa.

Comprobar el crecimiento de las 7 especies.


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Agar glucosado de Sabouraud*

Medio poco utilizado ya que normalmente se usa la modificacin de Emmons.Puede no crecer Blastomyces dermatitidis.

Composicin

Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 gGlucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta su disolucin completa.b) Esterilizar a 121 C durante 15 min.c) Dispensar en tubos o placas (si se utilizan tubos de cristal, tambin se puede dispensar antes de esterilizar).d) Solidificar en posicin inclinada.

Modificacin

Aadir cloranfenicol (50 mg/l).

Control de calidad

Aspecto: medio slido, mbar, transparente.pH final a 25 C: 5,6 0,2.

Trichophyton mentagrophytes: crece.Staphylococcus epidermidis: inhibicin parcial o total en el medio con cloranfenicol.

(*) Disponible comercialmente (Becton Dickinson, Fluka, Oxoid, Remel, Sigma)

Agar glucosado de patata* (PDA)

Es un medio utilizado para la estimulacin de la formacin de conidias, en la preparacin de inculos de hongos mice-liales y en la estimulacin de produccin de pigmentos: rojo en Trichophyton rubrum, rosa salmn enMicrosporum audouiniiy amarillo en Microsporum canis. Se utiliza con frecuencia en microcultivos para observar lascaractersticas morfolgicas.

Composicin

Patata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 gGlucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Pelar las patatas, cortarlas en cubos y hervir en agua durante 1 h.b) Filtrar, aadir la glucosa y el agar y hervir hasta disolver el agar completamente.c) Ajustar el volumen a un litro.d) Esterilizar a 121 C durante 15 min.

Control de calidad

Aspecto: incoloro o amarillo suave, medio slido, transparente o translcido.pH final a 25 C: 5,6 0,2.

M. audouinii: pigmento salmn en el reverso de la colonia.T. rubrum: rojo intenso en el reverso de la colonia.T. mentagrophytes: pigmento marrn en el reverso.

(*) Disponible comercialmente (Becton Dickinson, bioMrieux, Merck, Oxoid, Remel)


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Agar glucosado de Sabouraud modificado por Emmons* (SDA)

Es el medio estndar para el aislamiento, esporulacin y conservacin de muchos hongos. El cambio en el pH y laconcentracin de glucosa favorece la esporulacin.

Composicin

Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 gGlucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta su disolucin completa.b) Esterilizar a 121 C durante 15 min.

c) Dispensar en tubos o placas (si se utilizan tubos de cristal, tambin se puede dispensar antes de esterilizar).d) Solidificar en posicin inclinada.

Modificacin (SDAC)

Aadir cloranfenicol (50 mg/l).

Control de calidad

Aspecto: medio slido, mbar, transparente.pH final a 25 C: 7,0 0,2.

Trichophyton mentagrophytes: crece.Staphylococcus epidermidis: inhibicin parcial o total en el medio con cloranfenicol.

(*) Disponible comercialmente (Becton Dickinson, bioMrieux, Fluka, Oxoid, Remel)

Agar harina de avena (OA)

Favorece la esporulacin. Recomendable para la identificacin de especies de Acremonium, Cladosporium, Fusarium,Paecilomyces, Phialophora, Scopulariopsis, etc. y para la obtencin de las formas teleomrficas asociadas.

Composicin

Harina de avena . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 gSO4Mg.7H2O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 gPO4H2K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1,5 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 gAgua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Hervir lentamente los 30 g de harina de avena en 1 l de agua durante 1 h.b) Filtrar y ajustar el volumen del caldo a 1 l.c) Aadir las sales y calentar hasta su disolucin.d) Esterilizar a 121 C durante 15 min.e) Dispensar en placas de Petri.

Control de calidad

Aspecto: medio slido, blanquecino, opaco.

Fusarium solani: crecimiento rpido, colonia blanco amarillenta, mucosa en el centro.Cladophialophora carrioni: crecimiento lento, colonia gris verdosa, pulverulenta.


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Agar infusin de cerebro corazn* (BHIA)

Puede utilizarse como medio enriquecido para aumentar los aislamientos de Cryptococcus neoformans a partir demuestras estriles como el LCR. Mantenimiento de la fase levaduriforme de algunas micosis sistmicas, ya sea consangre o sin ella. En general est indicado para el aislamiento de una gran variedad de patgenos, incluyendo levadu-ras, mohos y bacterias como Nocardia. Adicionado con sangre de carnero al 10%, se utiliza para el aislamiento detodos los hongos incluidos los dimrficos. Pueden aadirse antibacterianos (cloranfenicol y/o gentamicina) para conver-tirlo en selectivo. En algunas ocasiones tambin puede adicionarse cicloheximida (facilita el aislamiento de Histoplasmacapsulatumy Blastomyces dermatitidis).

Preparacin

a) Preparar de acuerdo con el fabricante.b) Hervir los componentes hasta su completa disolucin.

c) Dispensar en matraces o tubos.d) Esterilizar a 121 C durante 15 min.e) Enfriar en posicin inclinada, si se utilizan tubos.

Control de calidad

Aspecto: mbar claro a semitransparente, sin precipitado (cuando no est adicionado de sangre).pH final: 7,4 0,2.

Neisseria meningitidisATCC 13090: crecimiento aceptable a bueno.Candida albicans:crece bien.Sporothrix schenckii:conversin a levadura a 37 C.

(*) Disponible comercialmente. Tambin puede utilizarse en forma de caldo (Becton Dickinson, Biomedic, Difco, Fluka,Oxoid)

Agar harina de maz con Tween 80* (Corn Meal Agar, CMA)

Se utiliza en el cultivo y diferenciacin de especies de Candidabasndose en las caractersticas miceliales. El Tween80 se incorpora para demostrar la formacin de clamidosporas. Si se le aaden 10 g de glucosa puede utilizarse en ladiferenciacin de Trichophyton rubrumy Trichophyton mentagrophytesbasndose en la produccin de pigmento.

Composicin

Harina de maz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gTween 80 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 mlAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Mezclar la harina de maz en agua.

b) Hervir a fuego lento durante 1 h.c) Filtrar con gasa.d) Medir y completar hasta 1.000 ml.e) Esterilizar a 121 C durante 10 min. Filtrar.f) Aadir el agar y el Tween 80 y calentar hasta disolver.g) Esterilizar a 121 C durante 15 min.h) Dipensar en placas de Petri.

Control de calidad

Candida albicansproduce clamidosporas.

(*) Disponible comercialmente (Becton Dickinson, Difco, Remel)


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Agar con leche, glucosa y prpura de bromocresol

Puede utilizarse para la diferenciacin de Trichophyton rubrumy Trichophyton mentagrophytes. Trichophyton rubrummelanoide secreta un pigmento que puede parecer alcalinizacin. El pigmento tpico de T. rubrumpuede verse a travsde la colonia, pero no a travs del medio. T. mentagrophytesgranular puede necesitar 10 das para originar un positivoclaro. Microsporum persicolorcrece profusamente pero no alcaliniza.

Composicin

Solucin A:Leche desnatada en polvo . . . . . . . . . . . . .80 gPrpura de bromocresol 1,6% . . . . . . . . . . .2 ml (diluido en etanol)Agua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Solucin B:Glucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 g

Agua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 ml Solucin C:

Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . .800 ml

Preparacin

a) Preparar las soluciones A y B y esterilizar por separado a 115 C durante 8 min.b) Hervir la solucin C hasta disolver el agar completamente y esterilizar a 121 C durante 15 min.c) Aadir las soluciones A y B a la C, mezclar, enfriar a 50 C y ajustar el pH a 6,6 con cido clorhdrico 1N.d) Dispensar aspticamente en tubos y dejar enfriar en posicin inclinada.

Control de calidad

Aspecto: medio slido, azul cielo, opaco.pH final a 25 C: 6,6 0,1.

T. rubrum: Crecimiento restringido y sin cambio de pH a los 7 das a 25 C.T. mentagrophytes: Crecimiento profuso y alcalinizacin a los 5 das a 25 C.

Agar inhibidor para mohos* (MIA)

Es un medio enriquecido con sales inorgnicas y adicionado con cloranfenicol y gentamicina. Se utiliza en el aislamientode hongos sensibles a la cicloheximida (Cryptococcus, zigomicetos, etc.) de muestras contaminadas. Permite el desa-rrollo de la mayora de los mohos y de las levaduras.

Composicin

Triptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 gExtracto de carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 gDextrosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 gExtracto de levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 gAlmidn soluble . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 gDextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 gCloranfenicol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,125 gGentamicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 mg

Sal A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 mlSal C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 mlAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . .970 ml

Preparacin

a) Calentar hasta disolver todos los componentes. Enfriar y ajustar el pH a 6,7.b) Esterilizar a 121 C durante 15 min.c) Dispensar en placas de Petri.

Control de calidad

Trichophyton mentagrophytes: Crece.Staphylococcus epidermidis: Inhibicin parcial o completa.

(*) Disponible comercialmente (Becton Dickinson)

Sal A:PO4H2Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 gPO4HNa2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 gH2O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 ml

Sal C:SO4Mg.7H2O . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 gSO4Fe.7H2O . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,5 gClNa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,5 gSO4Mn.7H2O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . .250 ml


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Agar Leeming & Notman (ALN)

Utilizado en el cultivo de Malasseziaspp. Puede modificarse aadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida.

Composicin

Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 gGlucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 gExtracto de levadura . . . . . . . . . . . . . . . .100 mgOx bile desecada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8 gGlicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 mlMonoestearato de glicerol . . . . . . . . . . . .500 mgTween 60 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,5 mlLeche de vaca entera . . . . . . . . . . . . . . . . .10 mlAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Calentar todos los componentes (excepto la leche) hasta disolver correctamente.b) Esterilizar a 121 C durante 15 min.c) Aadir la leche.d) Dispensar en placas.

Control de calidad

Aspecto: Blanco amarillento, no muy slido.

Malassezia restricta: Crece.

En el medio inhibidor:M. restricta:crece.Aspergillus flavus:inhibicin parcial o completa.Staphylococcus epidermidis:inhibicin parcial o completa.

Agar de Leonian modificado

Indicado para estimular la esporulacin en cepas que no esporulan o que presentan estructuras aberrantes.

Composicin

Maltosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6,25 gExtracto de malta . . . . . . . . . . . . . . . . . .6,25 gExtracto de levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 gKH2PO4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1,25 gMgSO47H2O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,625 gPeptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,625 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gAgua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin


Control de calidad

Aspecto: medio slido, t ransparente.

Aspergillus fumigatusa 37 C: esporulacin caracterstica.


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Agar Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol* (MYC)

Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de hongos patgenos a partir de muestras muy contaminadas conhongos saprofitos y bacterias. Se utiliza fundamentalmente en el aislamiento de dermatofitos y hongos dimrficos.Inhibe algunas especies de hongos de inters mdico (Candidano albicans, Aspergillus, Zygomycetes, Cryptococcusneoformans, etc.).

Composicin

Se utilizan fundamentalmente Mycosel y Mycobiotic, ambos comercializados.

Preparacin

De acuerdo con las instrucciones, evitar manipular la cicloheximida.

Control de calidad

Aspecto: Agar firme, amarillento, transparente.Trichophyton mentagrophytes: Crece.Aspergillus flavus: Inhibicin parcial o completa.Staphylococcus epidermidis: Inhibicin parcial o completa.

(*) Disponible comercialmente (Becton Dickinson, Biomedics, Bio-Rad, Difco, Oxoid, Remel, Sigma)

Agar patata zanahoria (PCA)

Idneo para estimular la esporulacin de hongos miceliares; muy indicado para la identificacin de hongos dematiceos.

Composicin

Patata rallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gZanahoria rallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18 g

Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 mlPreparacin

a) Lavar, pelar y rallar o trocear los vegetales y hervirlos lentamente en 1 l de agua durante 1 h.b) Filtrar y aadir al caldo el agar correspondiente.c) Esterlizar a 121 C durante 15 min.d) Dispensar en placas de Petri o tubos.

Control de calidad

Aspecto: medio slido, transparente o translcido.

Alternaria alternata: poco micelio y abundante produccin de conidios en cadenas.


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Agar Trichophyton(1 a 7)*

Son siete medios que se utilizan en la identificacin de especies de Trichophytonbasndose en sus requerimientosnutricionales. El crecimiento se valora desde el 1 al 4 (0 = no-crecimiento; 1 = crecimiento ligero; 2 = parcialmente esti-mulado, pero inferior al control; 4 = crecimiento comparable con el control).

Composicin

Trichophytonagar #1:cidos casamnicos (libres de vitaminas) . . . .2,5 gGlucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 gFosfato monopotsico (PO4KH2) . . . . . . . . . . .1,8 gSulfato magnsico (S04Mg.7H20) . . . . . . . . . .0,1 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Trichophytonagar #2 = #1 + inositol . . . . . . .50 mg

Trichophytonagar #3 = #1 + inositol . . . . . . .50 mg+ tiamina. ClH . . . . .0,2 mg

Trichophytonagar #4 = #1 + tiamina. ClH . .0,2 mg

Preparacin

a) Mezclar los ingredientes y hervir hasta disolver completamente.b) Dispensar en tubos.c) Esterilizar a 121 C durante 15 min.d) Enfriar en posicin inclinada.

Control de calidad

Aspecto: Agar inclinado, mbar, transparente.pH final a 25 C: 6,8 0,2

(*) Disponible comercialmente (Becton Dickinson, Difco, Remel)





Agar de Staib (Guizotia abyssinica). Agar semillas de alpiste

Utilizado para aislar Cryptococcusspp. y Cryptococcus neoformans. C. neorformanses el nico que al metabolizar laGuizotia abyssinica (alpiste), produce melanina originando un color marrn oscuro. El cloranfenicol lo convierte enmedio selectivo. Tambin puede ser til en la diferenciacin de Candida dubliniensis[6].

Composicin

Glucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 gCreatinina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,78 gCloranfenicol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,05 gDifenilo (disuelto en 10 ml de etanol 95%) . . .100 mgGuizotia abyssinica . . . . . . . . . . . . . . . . . .70 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml

Preparacin

a) Moler las semillas y aadir 350 ml de agua.b) Esterilizar en autoclave y filtrar.c) Aadir agua hasta 1.000 ml.d) Aadir el resto de los componentes excepto el difenilo.e) Esterilizar a 121 C 15 min. Enfriar a 45 C.f) Aadir el difenilo antes de dispensar el medio en las placas.

Controles

C. neoformansy Cryptococcusspp.

Trichophytonagar #5 = #1+ cido nicotnico (niacina) . . .2,0 mg

Trichophytonagar #6:Nitrato amnico (N03NH4) . . . . . . . . . . . . .1,5 gGlucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 gFosfato monopotsico (PO4KH2) . . . . . . . .1,8 gSulfato magnsico (S04Mg.7H20) . . . . . . .0,1 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 g

Agua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . .1.000 ml Trichophytonagar #7 = #6

+ histidina.ClH . . . .30 mg


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CHROMagar Candida*

CHROMagar contiene diversos sustratos enzimticos que estn unidos a compuestos cromognicos. Cuando enzimasespecficas descomponen el sustrato, se produce color. Las colonias deben evaluarse a las 48 h. La siembra de mues-tras directamente aumenta un 20% el nmero de cultivos mixtos. Puede utilizarse como ayuda en la identificacin delevaduras aisladas en otros medios no cromognicos. Es interesante tambin su utilizacin para comprobar la purezade las cepas en las pruebas de sensibilidad. Permite la identificacin rpida de especies resistentes. Puede utilizarse enmucosas, heridas con flora mixta, hemocultivos y orinas, especialmente. Es necesario seguir con rigor las condicionesestablecidas por el fabricante. Incubar a 35 C, en cmara hmeda y en oscuridad, 48 a 72 h (no


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Dermatophyte test medium* (DTM)

Medio utilizado para el aislamiento de dermatofitos en muestras muy contaminadas, proporcionando una identificacinpresuntiva. Los dermatofitos producen alcalinizacin, virando el medio de amarillo a rojo, algunas bacterias y hongostambin pueden producir alcalinizacin. El pigmento caracterstico de algunos dermatofitos no se puede identificar. Lacicloheximida inhibe muchos de los hongos saprofitos.

Composicin

Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 gGlucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 gAgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 gSolucin de rojo fenol . . . . . . . . . . . . . . . . .40 mlClH 0,8 M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 mlCicloheximida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,5 gSulfato de gentamicina . . . . . . . . . . . . . . .100 g/ml

Clortetraciclina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 g/ml

Preparacin

a) Mezclar la peptona, glucosa y agar en 1.000 ml de agua desionizada y hervir hasta disolver el agar.b) Aadir 40 ml de la solucin de rojo fenol mientras se remueve (Solucin de rojo fenol: 0,5 g de Bacto-Phenol red

disolver en 15 ml de NaOH 0,1 N; completar hasta 100 ml con agua desionizada).c) Ajustar el pH aadiendo 6 ml de ClH 0,8 M mientras se remueve.d) Disolver 0,5 g de cicloheximida en 2 ml de acetona y aadir al medio caliente mientras se remueve.e) Disolver el sulfato de gentamicina en 2 ml de agua, aadir al medio mientras se remueve.f) Esterilizar a 121 C. Enfriar hasta unos 47 C.g) Disolver la clortetraciclina en 25 ml de agua desioinizada estril. Aadir al medio mientras se agita.h) Dispensar en placas o en tubos.

Control de calidad

Aspecto: Agar amarillo naranja, trasparente.

Trichophyton verrucosum:crece y alcaliniza.Aspergillus flavus:inhibicin parcial o completa.Staphylococcus epidermidis:inhibicin parcial o completa.

(*) Disponible comercialmente (Becton Dickinson, Fluka, Merck, Remel)

Medio de arroz

Se utiliza para la diferenciacin de cepas atpicas de Microsporum audouiniiy Microsporum canis.

Composicin

Arroz blanco no enriquecido . . . . . . . . . . . .8 gAgua desionizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 ml

Preparacin

a) Mezclar los ingredientes en un matraz Erlenmeyer.b) Esterilizar a 121 C durante 15 min.

Control de calidad

Aspecto: granos de arroz cocido.

M. canis: presenta buen crecimiento, pigmento amarillo y esporulacin abundante.M. audouinii: no presenta crecimiento o es escaso, coloracin marroncea.

Con asa micolgica, transferir una pequea porcin del aislamiento al matraz con los granos estriles.


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3.5.1. Observacin microscpica

Debe informarse en el da ya que aporta unaimportante ayuda al clnico; sus pacientes puedensalir de la consulta de dermatologa con un diag-nstico presuntivo (dermatofitosis), que habr queconfirmar con el cultivo o definitivo (pitiriasis ver-sicolor). La tinta china en buenas manos (criptoco-cosis) y la inmunofluorescencia (neumocistosis)tambin son diagnsticas. Otras observaciones posi-tivas permiten una orientacin teraputica (mucor-micosis, aspergilosis, etc.). Es recomendableobservar los exmenes en fresco negativos al dasiguiente.

Este informe es fundamental en toda muestraestril y permite saber si la muestra posee suficientecalidad.

El informe oral es muy importante parala correcta valoracin de la muestra y contrastar laeficiencia del laboratorio, adems de adecuar larelacin con el clnico. Todo informe oral debeseguirse de otro escrito, reflejando que existe uninforme oral previo.

3.5.2. Cultivo

El cultivo negativo se descarta, generalmen-te, a las cuatro semanas de incubacin, con lasexcepciones citadas en el tiempo de lectura.La prolongacin de la incubacin despus de tressemanas aporta poca informacin adicional y,dependiendo del sistema de lectura, puede suponeruna sobrecarga de trabajo que hay que valorar ade-cuadamente en cada laboratorio [12].

Los cultivos positivos se informan, de lamisma manera que la observacin microscpica, enel momento en el que se disponga del crecimiento.En los casos en los que hay que realizar aislamien-tos repetidos (uas), al cuestionarse el significadodel hongo aislado, se informar de la misma mane-ra. En ambos casos, hay que valorar el beneficio

para el paciente y el esfuerzo en la localizacin delclnico responsable, por lo que la utilizacin delcorreo electrnico, buzones intranet o cualquier sis-tema electrnico, siempre y cuando se asegure laconfidencialidad, para este tipo de informes, ayudasensiblemente al establecimiento de una rpida yfluida comunicacin entre el miclogo y el clnico.

En todo informe escrito debe figurar si setrata de un informe provisional o definitivo. Para losaislamientos realizados en Bacteriologa y remitidosa Micologa, debe establecerse un mecanismo quegarantice la correcta llegada del resultado al mdico:

3.4.7. Incubacin

La temperatura ptima de crecimiento de lamayora de los hongos patgenos es 30 C .Sin embargo, Sporothrix schenckii es una excep-cin, crece ms rpido a 27-28 C.

Hay laboratorios que utilizan la temperaturaambiente en lugar de 30 C, pero no es recomenda-ble, ya que los cambios de temperatura son notablesentre el da y de la noche en la mayora de los labo-ratorios. La temperatura de 37 C no se recomiendapor dos razones principales: 1) muchas muestrascontienen abundantes bacterias que crecen muy biena esta temperatura y 2) algunos hongos crecen mal a

esta temperatura o no crecen, especialmente loshongos que infectan la piel [12].

No hay ventaja en incubar simultneamente a30 C y a 37 C. La temperatura de 37 C debereservarse para hongos dimrficos o algn hongoque se desarrolle mejor a esta temperatura [10].Una estufa a 37 C es tambin necesaria para verifi-car la tolerancia a esta temperatura. Sin embargo,utilizar 37 C para el aislamiento del estadio levadu-riforme de Histoplasma o Blastomyces no aportaventajas y, adems, son morfolgicamente indistin-guibles de otras levaduras.

Si la estufa no est humedecida, es conve-niente poner un recipiente con agua cerca de las pla-

cas de cultivo [13]. Los cultivos de hongos debenincubarse durante 3-4 semanas antes de ser desecha-dos. Los cultivos no deben desecharse cuando seasla un hongo, debe completarse el periodo deincubacin [11]. Sin embargo, hay muestras que sepueden eliminar a los 7 das de forma habitual(orina y exudados de mucosas).

3.5. Informe de los resultados

El diagnstico micolgico no acaba con elaislamiento y la identificacin del agente causal.Finaliza cuando la informacin sobre el mismo llegaal conocimiento del mdico responsable del pacien-te. Esta ltima etapa del procedimiento diagnsticono es menos importante que las anteriores, por loque debe cuidarse al mximo todos los detalles de lamisma.


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2. Deben facilitarse siempre los datos que garanti-cen que el informe corresponde al paciente sobreel que se nos pregunta:

Nombre del paciente Localizacin (habitacin, centro de salud, etc.) Tipo de cultivo Fecha de recogida de la muestra Resultados

3. En el registro del laboratorio debe anotarse:

Da y hora de la llamada Nombre del mdico que recibe la informacin Persona que proporciona la informacin

4. La persona que da el informe debe seguir almenos los siguientes pasos:

Repetir el nombre del paciente Repetir la localizacin del paciente Informar el estado actual del estudio

La gestin de la informacin hay que adap-tarla a las circunstancias de cada laboratorio y unmodelo podra ser el reflejado en la Figura 3.1.

1. Si la numeracin del laboratorio es nica, se rea-lizarn informes provisionales en los que serefleje la transferencia de la cepa.

2. Si la numeracin es diferente, en el registro deMicologa figurar que es una cepa recibida deBacteriologa y su nmero original.

En el informe debe figurar el resultado defi-nitivo. En el caso de ser positivo, debe incluir laidentificacin de la especia aislada y el estudio desensibilidad, si procede.

Cuando el significado es de dudosa interpre-tacin debe hacerse constar.

3.5.3. Informe telefnico

Por sus especiales caractersticas, en estetipo de informes se deben seguir unas recomenda-ciones especiales:

1. Cuando no sea posible contactar con el facultati-vo solicitante, se intentar hablar con el respon-sable o el jefe de servicio. No se dar nunca elinforme a una persona no cualificada.

Figura 3.1. Modelo de gestin de la informacin en un laboratorio de Micologa Clnica.

Muestra no procesada.Devolver muestra y volante

a Sala de Extracciones

Registro General

ENTRADA

Revisiny emisin de informes

SALIDA

I N F O R M E F I N A L

VolanteMuestra

R E S U L T A D O

Servicio de MicrobiologaRecepcin de muestras

Comprobar datos muestra - volante

Registrar y asignar n de muestra

Muestra y volante

no

no

ss

Valorar posiblesolucin

se puedesolucionar?Correcto?

PROC. 1EXAMENDIRECTO

PROC. 2SIEMBRAS

Cultivos

PROC. 3SANGRE

Hemocultivo

PROC. 4SUERO

Cultivo hongosde otro box


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Referencias

Documents

Capitulo3- FUNDAMENTOS PARA EL DX MICOLÓGICO