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CARACTERIZACIÓN DE MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE TRICLOSAN, AISLADOS

DEL RÍO STA. MARÍA EN XICHÚ; GUANAJUATO

Luis Jorge Negrete Alcaldea, Juan Gualberto Colli Mulla, Gustavo De la Rivaa, Francisco Alejo Iturvidea y Claudia Isela González Lópeza

aInstituto Tecnológico Superior de Irapuato, Irapuato, Gto., chompy_12345@hotmail.com, jcolli@itesi.edu.mx, gudelariva@itesi.edu.mx, fralejo@itesi.edu.mx, clgonzalez@itesi.edu.mx. RESUMEN En la región noreste del estado se encuentra la región hidrológica del sistema del río Pánuco en la denominada Reserva de la Biósfera de la Sierra Gorda de Guanajuato. En la región central, se encuentra la micro cuenca formada por los ríos Xichú, El Mezquital y La Laja que forman parte importante del río Santa María. Uno de los problemas detectados en la zona, es la contaminación de los cuerpos de agua (arroyos, ríos, presas, y pozas de agua), principalmente debido a distintas actividades humanas domésticas, agrícolas, ganaderas y en menor medida industriales que desechan en ella de manera directa o indirecta, sedimentos, contaminantes y nutrientes. La presencia de contaminantes emergentes está adquiriendo cada vez más importancia debido a que son compuestos que se presentan en concentraciones traza pero que son capaces de interaccionar con los ecosistemas, un ejemplo es el Triclosán, biocida utilizado en productos domésticos y estudios recientes sugieren que actúa como disruptor endócrino ocasionando daño en diferentes organismos incluido el hombre. Este trabajo pretendió aislar y caracterizar microrganismos con capacidad para utilizar triclosán como única fuente de carbono. Se tomaron muestras de sedimento y aguas superficiales de siete puntos de muestreo provenientes principalmente de Charco Azul, Municipio de Xichú, en la Reserva de la Biosfera, en el Estado de Guanajuato. El ensayo se realizó en condiciones de laboratorio, para el asilamiento utilizó agar nutritivo y se verificó resistencia en medio mínimo con triclosán (20 ppm) y dextrosa mientras que la degradación se verificó en medio mínimo con triclosán como única fuente de carbono. Se reporta el aislamiento de un total de 5 cepas con capacidad de utilizar triclosán como única fuente de carbono. La Morfología bacteriana más comúnmente encontrada fueron bacilos Gram Negativos, se llevó a cabo una caracterización bioquímica preliminar quedando pendiente la identificación molecular que nos permita establecer oportunidades en el campo de la biotecnología como fuente potencial de aplicaciones en bioremediación. 1. INTRODUCCIÓN La Sierra Gorda se ubica en la región orográfica perteneciente a la vertiente del Golfo de México, con un relieve de origen sedimentario caracterizado por sierras altas con altitudes superiores a los 3,000 msnm y con amplios y profundos cañones labrados por los ríos Santa María, Extóraz y Moctezuma. Está ubicada en la zona de transición entre la región Neártica y la región Neotropical. La Reserva pertenece a la Región Hidrológica del río Pánuco (RH-26). El área se divide en dos cuencas: la del río Tampaón o Tamuín, y la del río Moctezuma. La primera ocupa una extensión de 2,038 km2, siendo sus principales afluentes los ríos Ayutla, Santa María y Jalpan. La segunda, abarca 1,532 km2 de la Reserva, siendo su principal afluente el río Extóraz (INEGI, 2010 y CONANP, 2005). En las últimas tres décadas los contaminantes emergentes han sido un tema muy importante debido al desarrollo tecnológico. Se puede definir como contaminante emergente a productos químicos con uso farmacéutico, pesticida, surfactantes, aditivos industriales e incluso para el

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cuidado personal, que repercuten en las funciones del sistema endocrino. Este tipo de compuestos se encuentran disueltos en productos comerciales a muy bajas concentraciones generalmente en partes por millón o partes por trillón y la mayoría sin algún tipo de regulación comercial (García-Gómez et al., 2011). Los efectos significativos de los contaminantes emergentes se ven reflejados en el sistema endocrino, como bloqueo o perturbación de dichas funciones, que afectan a seres humanos y animales aun cuando se encuentran a muy bajas concentraciones (García-Gómez et al., 2011). Todos estos contaminantes de origen antropogénico se han dispersado en al ambiente causando daños en animales acuáticos alterando su desarrollo reproductivo (Becerril 2009). Un ejemplo claro hablando de contaminantes emergentes en el Triclosán el cual es usado como bactericida, dicho contaminante emergente no posee una regulación industrial y se encuentra disperso en el medio ambiente afectando las vidas de distintos organismos. Su nombre químico es 2, 4,4’-trichloro-2’-hydroxydipheny, su formula química es C12H7Cl3O, posee un peso molecular de 289.546, su punto de función es de 55-57 ˚C, y hablando de su solubilidad es de, 0.01 g/L para el agua; 0.1 N NaOH, 23.5 g/L; etanol, y en acetona es altamente soluble (FDA 2008). Es un polvo blanquecino escasamente soluble en agua, hidrolíticamente estable y poco volátil, con una elevada hidrofobicidad. El Triclosán pertenece a la clasificación Pharmaceuticals and Personal Care Products (PPCPs) de acuerdo con la Agencia de Protección Ambiental de E.U.A, y se encuentra en productos de veterinaria, medicamentos, cosméticos, fragancias etc. La biodegradación del triclosán en el medio ambiente y las aguas residuales se ha convertido recientemente en un tema de investigación interesante. Un estudio informó que aproximadamente el 79% de triclosán se elimina mediante procesos de tratamiento biológico de aguas residuales, sugiriendo que la biodegradación puede ser un mecanismo importante (Lee, et al., 2012). 2. TEORÍA Varios estudios determinaron que el triclosán puede actuar como un agonista del receptor de estrógeno y muestra actividad estrogénica. Por lo tanto, podría tener efectos endocrinos y en el desarrollo reproductivo mediante la alteración de la señalización hormonal (Honkisz y Wojtowicz 2012). Finalmente, en un estudio publicado en la revista “Proceedings”, de la Academia Nacional de Ciencias de Estados Unidos (PNAS), se demostró que el triclosán perjudica la función de algunos músculos. Al interrumpir la comunicación entre dos proteínas fundamentales para el funcionamiento de los músculos estriados, el triclosán provocó insuficiencias musculares en células del corazón y en músculos esqueléticos, tanto en animales (ratones y peces) como en seres humanos (Cherednichenkoa, et al 2012). La biodegradación se ha sugerido como una alternativa importante para la eliminación de triclosán en las aguas residuales. Hasta la fecha, sólo unos pocos microorganismos de aguas residuales, incluyendo Sphingomonas sp. Rd1, Nitrosomonas europaea, Sphingomonas sp. PH-07 y Sphingophyxis Strain KCY1, se sabe que degradan triclosán a través de reacciones de vía cometabólica. Aunque dos bacterias de suelo son conocidas por utilizar triclosán como fuente única de carbono. Y aún se desconoce si los microorganismos de aguas residuales pueden utilizar triclosán como fuente de carbono (Lee, 2013). El objetivo de este estudio consistió en aislar y caracterizar los microrganismos resistentes y degradadores de triclosán como parte de un estudio microbiológico en siete sitios muestreados en la microcuenca del río Xichú y su intersección con el río Laja en sub-cuenca hidrológica del río Santa María de la Reserva de la Biósfera Sierra Gorda de Guanajuato. 3. PARTE EXPERIMENTAL Muestreo y Colecta

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Se seleccionaron 7 sitios de muestreo en base a la ubicación de aguas superficiales cercanas a diferentes comunidades circundantes a la microcuenca del río Xichú, se colectaron muestras de agua y sedimento y se registraron las principales características de la toma de muestra, los cuales se detallan en la Tabla No 1.

Tabla 1 Características de los Puntos de muestreo

Punto Ubicación Norte Ubicación Oeste Elevación Temperatura pH Profundidad M1 21°18´38.5¨ 100°7´41.5¨ 2354m 17°C 6.3 22cm M2 21°18¨50.6¨ 100°6´.39.2¨ 2265m 19°C 7.3 60 cm M3 21°18´44.9¨ 100°6´40.4¨ 2278m 17°C 7.2 37cm M4 21°19´12.4´ 100°9´27.3” 2378m 18°C 7.3 14cm M5 21°18´57¨ 100°6´38.6¨ 2274m 17°C 7.1 27cm M6 21°19´1.8¨ 100°6´30.3¨ 2218m 18°C 7.3 14cm M7 21°18´43.1¨ 100°6´39.5 ¨2290m 17°C 7.2 4cm

Aislamiento de Microrganismos Se sembraron diluciones seriadas (10-1 hasta 10-5) de las muestras de agua y sedimento en solución salina peptonada en placas Petri con agar nutritivo y PDA inoculando 70 µl de cada dilución por duplicado distribuyendo con ayuda de asa de Digradsky y se incubaron a 37° C durante 24 a 48 hrs. Transcurriendo el tiempo asignado se realizó el conteo y repique de colonias microbianas y fúngicas diferentes para la obtención de aislados puros. Ensayos de Resistencia y degradación de triclosán in vitro Los ensayos de degradación y resistencia de los microorganismos aislados se realizaron empleando medio mínimo sólido cuya composición en g/l fue: 13.48 g K2HPO4, 16.68 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4ˑ7H2O, 0.3 g (NH4)2SO4 y 14 g de agar bacteriológico (Aquiahuatl et al, 2004), adicionado con 20 ppm de triclosán y 10 g/l de dextrosa para el ensayo de resistencia, mientras que para los ensayos de degradación se utilizó triclosán como única fuente de carbono. Las cajas fueron incubadas a 37°C cubiertas con papel aluminio durante 72 horas y se evalúo el crecimiento de microorganismos. Tinción Gram Se realizó la tinción Gram y se evaluó la morfología de las cepas aisladas 4. RESULTADOS Los ensayos de resistencia y degradación de triclosán, permitieron el aislamiento de cinco cepas degradadoras de Triclosán, con capacidad de crecer en medio mínimo con triclosán como única fuente de carbono, las bacterias fueron rotuladas como las muestras M1SA, M1SP, M4AA, M110-3ª y M310-3ª. Se analizó la morfología colonial, y las características comúnmente encontradas fueron: diámetro de colonia que varió de 2 a 4 mm, forma irregular y elevación plana, de borde ondulado y coloración beige para la mayoría de ellas, densidad opaca y consistencia suave. En la Figura 1 se muestra la morfología bacteriana típica de las 5 cepas aisladas y gracias a la Tinción Gram, se determinó que las 5 cepas son bacilos Gram Negativos.

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Figura 1. Tinción Gram de 5 Cepas Con capacidad de crecer en medio mínimo con triclosán como única fuente de Carbono

5. CONCLUSIONES - Se logró el aislamiento de 5 cepas degradadoras de triclosán de sitios muestreados en la microcuenca del río Xichú y su intersección con el río Laja en sub-cuenca hidrológica del río Santa María de la Reserva de la Biósfera Sierra Gorda de Guanajuato. - Las cepas aisladas presentaron morfología bacteriana de bacilos Gram Negativos - se recomienda realizar análisis bioquímico y molecular para la identificación de las cepas así como su análisis filogenético 6. BIBLIOGRAFÍA

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1. APUA “Triclosan” White Paper prepared by The Alliance for the Prudent Use of Antibiotics (APUA) January 2011 Alliance for the Prudent Use of Antibiotics 75 Kneeland Street, 2nd Floor Boston, MA 02111 www.apua.org 617 636 3911

2. Aquiahuatl Ramos, M. D., & Pérez Chabela, M. D. (2004). Manual de prácticas del laboratorio de Microbiología General. Iztapalapa, D.F., México: Universidad Autónoma Metropolitana- Iztapalapa

3. Aviva Glaser 2004 “The Ubiquitous Triclosan A common antibacterial agent exposed” Pesticides and You Beyond Pesticides/National Coalition Against the Misuse of Pesticides Vol 24 No. 3

4. Becerril Bravo, J. E., “Contaminantes emergentes en el agua”, Revista Digital Universitaria, Vol. 10(8), 2009, pp. 2-5.

5. Cherednichenkoa, G., Zhanga, R., Bannisterb, R.A., Timofeyevc, V., Lic, N., Fritscha, E.B., Fenga, W., Barrientos G., Schebbd, N. H., Hammockd, B. D., Beame, K. G., Chiamvimonvatc, N. and Pessaha, I. N. (2012). “Triclosan impairs excitation–contraction coupling and Ca2+ dynamics in striated muscle en PANAS (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America), Num. 40, Vol 109, Consultada en http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1211314109/-/DCSupplemental Fecha de consulta (21-08-2013).

6. CONANP.2005. Estudio previo justificativo para el establecimiento del Área Natural Protegida Reserva de la Biosfera “Sierra Gorda de Guanajuato”. CONANP-SEMARNAT.

7. E Aldous, L Rockett and I Johnson 2009 “Proposed EQS for Water Framework Directive Annex VIII substances: triclosan” (For consultation) by Water Framework Directive - United Kingdom Technical Advisory Group (WFD-UKTAG).

8. FDA. (U.S. Food & Drug Administration Department of Health and Human Services Supporting). 2008 “Triclosan [CAS 3380-34-5]” Information for Toxicological Evaluation by the National Toxicology Program.

9. García-Gómez C., Gortáres-Moroyoqui P y Drogui P. 2011. Emerging contaminants: effects and removal treatments. Revista Química Viva - Número 2, año 10, http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=86319141004

10. Honkisz, E., Zieba, P. D. y Wojtowicz, A. K. (2012), " The effect of triclosan on hormone secretion and viability of human choriocarcinoma JEG-3 cells", Journal Elsevier, 385 pp.

11. INEGI. 2010. Guanajuato. Conteo de Población y Vivienda 12. Lee, D. G., Zhao, F, Rezenom, Y. H., Rusell, D. H. y Chu, K. (2013), "Identification of

triclosan-degrading bacteria in a triclosan enrichment culture using stable isotope probing", Journal Springer Science, 2 pp.

13. Lee, D. G., Zhao, F, Rezenom, Y. H., Rusell, D. H. y Chu, K. (2012), "Biodegradation of triclosan by a wastewater microorganism", Journal of the International Water Association, 4226 pp

14. SCBWMI January 2006 Environmental Emergence of Triclosan White Paper prepared by the Emerging Contaminants Workgroup of the Santa Clara Basin Watershed Management Initiative (SCBWMI)