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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE PLANTAS
TRANSGÊNICAS DE TOMATEIRO EXPRESSANDO A PROTEÍNA
REPRIMIDA POR AUXINA (SIARP)
RENATA KALINE SOUZA ESTEVAM ORIENTADORA: PROFª. DRA. KATIA CASTANHO SCORTECCI
NATAL- RN 2016
1
RENATA KALINE SOUZA ESTEVAM
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE PLANTAS TRANSGÊNICAS DE
TOMATEIRO EXPRESSANDO A PROTEÍNA REPRIMIDA POR AUXINA
(SIARP)
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor em
Bioquímica.
Orientadora: Profª. Drª Katia Castanho
Scortecci.
NATAL- RN
2016
2
Catalogação da Publicação na Fonte
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - Sistema de Bibliotecas
Biblioteca Central Zila Mamede / Setor de Informação e Referência
Estevam, Renata Kaline Souza.
Caracterização fenotípica de plantas transgênicas de tomateiro
expressando a proteína reprimida por auxina (SIARP) / Renata Kaline
Souza Estevam. - Natal, RN, 2016.
101 f. : il.
Tese (doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
Centro de Biociências, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.
Orientador: Profª. Drª Katia Castanho Scortecci.
1. Tomateiro (Solanum lycopersicum) - Tese. 2. Proteína Reprimida
por Auxina (ARP) - Tese. 3. Floração precoce - Tese. 4. frutificação
precoce - Tese. 5. dormência das gemas axilares - Tese . I. Scortecci,
Katia Castanho. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU 582.926.2
3
4
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, José Renato e Kátia Solange, e familiares. Em especial, ao
meu avô Abdias Barboza e à minha tia Karla Simone pela paciência, apoio e
motivação. Obrigada a todos por contribuírem de forma direta ou indireta na
minha educação e realização deste trabalho.
Às minhas amigas biólogas Nildiane Canário, Sara Caroline, Marília Gabriela,
Ana Karina, Helaine Cristiane e Amanda Medeiros pela amizade, carinho,
apoio, pelos momentos alegres e de descontração. Além de compartilharem o
saber e pelo auxílio na realização deste trabalho.
Às técnicas Socorro e Melina do Laboratório de Técnicas Histológica da UFRN
pela disponibilização e auxílio durante os processos histológicos.
Ao Professor Marcos Costa e à técnica Rebecca Diniz pela disponibilização e
auxílio nas análises de microscopia óptica no Instituto do Cérebro da UFRN.
À minha orientadora Profª. Drª Katia Castanho Scortecci.
Aos professores Adriana Ferreira Uchôa, Eduardo Luiz Voigt, Lázaro Eustáquio
Pereira Peres e Vagner Augusto Benedito pela participação na banca
examinadora.
5
RESUMO
A floração é um processo vital durante o ciclo de vida das plantas e é marcado pela conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo devido a interações de fatores internos e externos à planta. Apesar de amplo conhecimento ter sido gerado nessa área, ainda se conhece muito pouco sobre o processo de floração e frutificação em tomateiro. Pesquisas anteriores realizadas pelo nosso grupo identificaram o cDNA homólogo a Proteína Reprimida por Auxina (ARP) em bibliotecas subtrativas reprodutivas de tomateiro. Existem poucos dados sobre a proteína ARP na literatura, há relatos de que o gene ARP está relacionado com a maturação do fruto em morango, dormência da gema lateral em ervilha e maturação do pólen em tabaco, mas a função da proteína ARP ainda não está clara. Portanto, o intuito deste trabalho foi compreender o papel da proteína ARP no desenvolvimento vegetativo e nos processos de floração e frutificação por meio da perda e/ou do ganho de função deste cDNA em plantas transgênicas de tomateiro contendo o cassete de superexpressão em orientação senso e antissenso para este cDNA. Dessa forma, foram observadas algumas alterações fenotípicas e estruturais nas plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso e senso), como floração e frutificação precoce verificada nas plantas 35S::SlARP antissenso nas gerações T1 a T4, em relação às controles (transformada com o plasmídeo vazio e não transformada). Na análise histológica, notaram-se óvulos maduros nas flores das plantas 35S::SlARP antissenso (gerações T2 a T4), enquanto que as flores das controles não apresentaram óvulos maduros no mesmo período de tempo. Outra modificação observada foi o número superior de gemas laterais desenvolvidas nas plantas 35S::SlARP antissenso nas gerações T3 e T4 quando comparado às plantas 35S::SlARP senso e às plantas controles (transformada com o plasmídeo vazio e não transformada) . Essas produziram ramos com folhas, flores e frutos. Assim como alterações estruturais nos pecíolos das plantas 35S::SlARP antissenso, incluindo uma aparente quantidade maior de elementos de vaso (xilema e floema) do que os pecíolos as plantas 35S::SlARP senso e mutantes relacionados à sinalização da auxina (dgt e entire) e plantas controles. Portanto, estes dados sugerem que a proteína ARP possa estar envolvida na floração, frutificação e na dormência das gemas axilares em tomateiro. Palavras chaves: Solanum lycopersicum, Proteína Reprimida por Auxina, floração precoce; frutificação precoce; dormência das gemas axilares.
6
ABSTRACT
Flowering is a vital process during the plant life cycle and it is characterized by the conversion from the vegetative apical meristem into reproductive meristem due to internal and external factors. Despite the considerable knowledge has been produced in this field, not much is known about the flowering and fruiting process in tomato. Furthermore, previous research from our group has identified a cDNA with homology to AUXIN REPRESSED PROTEIN (ARP) in reproductive subtractive libraries from tomato. In the literature, there are few reports where the ARP gene has been associated to fruit ripening in strawberry, dormancy in pea and pollen maturation in tobacco plants, but it is not clear the ARP protein function yet. Therefore, the aim of this work was to understand the role of ARP protein in vegetative development, flowering and fruit set processes through the loss and/or gain of function using this cDNA in transgenic tomato plants with the overexpression cassette constructs in sense and antisense cDNA orientation. Thus, it was observed some phenotypic and structural modifications in transgenic plants (35S::SlARP antisense and sense) such as early flowering and fruiting that was observed in 35S::SlARP antisense plants from the T1 to T4 progeny when compared to controls plants (with the empty vector and wild type plant). In the histological analysis, it was observed mature ovule in 35S::SlARP antisense flowers (progeny T2 to T4), while for the controls plant it wasn’t observed a mature ovule at the same period of time. The other modification observed was a higher number of lateral buds developed in 35S::SlARP antisense plants (progeny T3 and T4) when compared to 35S::SlARP sense and controls plants. These plants produced branches with leaves, flowers and fruits. Besides, it has been observed some structural changes in the petioles from 35S::SlARP antisense plants, including a high number of vessel elements (xylem and phloem) when compared to 35S::SlARP sense, and to dgt and entire mutants (related to auxin signaling) and controls plants (with empty vector and wild type plant). Therefore, these data suggest that ARP protein may be involved in flowering, fruit set and dormancy of axillary buds in tomato. Keywords: Solanum lycopersicum; Auxin Repressed Protein, early flowering; early fruit set; dormancy of axillary buds.
7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Distribuição, em porcentagem, da participação dos principais
países na produção mundial de tomate.......................................................
13
Figura 2 – Distribuição da participação nacional, por regiões, na produção
do tomate......................................................................................................
14
Figura 3 – Contribuição relativa dos Estados da região Nordeste na
produção do tomate.....................................................................................
15
Figura 4 – A cultivar Micro-Tom..................................................................... 16
Figura 5 – A espécie Solanum pimpinellifolium............................................ 17
Figura 6 – Comparação do hábito de crescimento em Arabidopsis
thaliana e tomateiro......................................................................................
18
Figura 7 – Diagrama simplificado das vias da floração em A. thaliana........ 20
Figura 8 – Domínio funcional da proteína ARP em Solanum
lycopersicum.................................................................................................
41
Figura 9 – Alinhamento da proteína ARP em diferentes plantas................. 44
Figura 10 – Dendrograma da proteína ARP em plantas.............................. 47
Figura 11 - Rede de interação proteica da ARP com 73% de identidade
em Arabidopsis thaliana...............................................................................
49
Figura 12 - Rede de interação proteica da ARP com 71% de identidade
em Arabidopsis thaliana...............................................................................
50
Figura 13 - Rede de interação proteica da ARP com 47% de identidade
em Arabidopsis thaliana...............................................................................
51
Figura 14 – Rede de interação proteica da ARP em Oryza sativa............... 53
Figura 15 - Interação proteica da ARP com BRC1A em Solanum
lycopersicum.................................................................................................
54
Figura 16 – Desenvolvimento dos frutos precocemente nas plantas das
linhagens senso e antissenso na geração T1..............................................
56
Figura 17 – Características morfológicas das plantas controles e
transgênicas na geração T1.........................................................................
57
Figura 18 – Análise da distância entre o ápice e a folha proximal das
plantas controles e transgênicas na geração T1..........................................
58
Figura 19 – Amadurecimento precoce do fruto nas plantas da linhagem
8
antissenso da geração T2............................................................................ 59
Figura 20 – Número de flores das plantas controles e transgênicas na
geração T2...................................................................................................
59
Figura 21 – Floração precoce da linhagem antissenso na geração T3....... 60
Figura 22 – Análise da altura nas plantas controles e transgênicas da
geração T3...................................................................................................
60
Figura 23 – Número de gemas axilares desenvolvidas e folhas compostas
nas plantas controles e transgênicas da geração T3...................................
61
Figura 24 – Características morfológicas das plantas cv. MT e das
transgênicas na geração T3.........................................................................
62
Figura 25 – Análise do formato dos frutos das plantas controles e
transgênicas da geração T3.........................................................................
63
Figura 26 – Número de frutos com partenocarpia nas plantas controles e
transgênicas da geração T3.........................................................................
64
Figura 27 – Número de gemas laterais desenvolvidas e folhas compostas
nas plantas controles e transgênicas da geração T4...................................
65
Figura 28 – Desenvolvimento das gemas laterais nas plantas cv. MT e
nas transgênicas da geração T4..................................................................
66
Figura 29 – Seções longitudinais do ovário das flores da geração T2......... 67
Figura 30 – Seções longitudinais do ovário das flores na geração T3 e
T4..................................................................................................................
68
Figura 31 – Seções transversais do pecíolo das plantas transgênicas da
geração T2 e mutantes envolvidos na sinalização da auxina......................
70
Figura 32 – Esquemas hipotéticos da ação da ARP na gema apical em
tomateiro e no meristema floral em A. thaliana............................................
81
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Genes e mutantes que afetam o processo de floração em
tomateiro e sua homologia com A. thaliana.................................................
25
Tabela 2 – Número de linhagens independentes das plantas transgênicas
(MT Vazio, 35S::SlARP antissenso e 35S::SlARP senso), número de
sementes plantadas por linhagem de plantas transgênicas nas gerações
T1 a T4 e número de sementes da planta controle cv. MT semeadas
nestas gerações...........................................................................................
35
Tabela 3 – A sequência predita de aminoácidos para a ARP, os
homólogos descritos na literatura e a respectiva identidade, em
porcentagem, entre eles...............................................................................
41
Tabela 4 – Características fenotípicas evidentes observadas nas plantas
transgênicas (35S::SlARP antissenso e senso) nas gerações T1 a T4 em
relação às plantas controles (cv. MT e MT
Vazio)............................................................................................................
55
Tabela 5 – Surgimento das flores, em dias após o plantio, das plantas
controles e das transgênicas nas gerações T1 e T3....................................
56
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABSCEM - ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DO COMÉRCIO DE SEMENTES E
MUDAS
APE1 – APETALA1
ARF – Fatores de Resposta a Auxina (AUXIN RESPONSE FACTOR)
ARP – Proteína Reprimida por Auxina (AUXIN REPRESSED PROTEIN)
AUX/IAA - AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID
CO – CONSTANS
CDD – Conserved Domain Database – Banco de domínios conservados do
NCBI
cDNA – DNA complementar
cv. - cultivar
DGT – DIAGEOTROPICA
E - ENTIRE
FA – FALSIFLORA
FAOSTAT - FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED
NATIONS STATISTICS DIVISION
FLC – FLOWERING LOCUS C
FT - FLOWERING LOCUS T
IBGE - INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA
LFY – LEAFY
MT – Micro-Tom
35S::SlARP senso – Cassete de superexpressão do cDNA homólogo a ARP na
orientação senso em tomateiro (cv. MT).
35S::SlARP antissenso - Cassete de superexpressão do cDNA homólogo a
ARP na orientação antissenso em tomateiro (cv. MT).
MT Vazio – vetor binário pZP211 sem o inserto em tomateiro (cv. MT).
NCBI – National Center for Biotechnology Information
RT-qPCR – PCR quantitativo em tempo real (Real Time quantitative PCR)
SFT – SINGLE FLOWER TRUSS
SP – SELF-PRUNING
TFL1 – TERMINAL FLOWER
11
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 13
1.1 O cenário econômico do tomate............................................................ 13
1.2 A cultivar Micro-Tom e a espécie Solanum pimpinellifolium.................. 15
1.3 Os hábitos de crescimentos da planta: Monopodial e Simpodial........... 17
1.4 As vias do processo de florescimento em A. thaliana............................ 19
1.5 Os principais genes envolvidos no processo de floração em
tomateiro.......................................................................................................
24
1.6 A identificação do cDNA homólogo à proteína reprimida por auxina
(ARP) em tomateiro e as funções dos homólogos da ARP.........................
26
1.7 Ação da auxina e citocinina nos principais processos do
desenvolvimento vegetal..............................................................................
29
2 OBJETIVOS.............................................................................................. 32
2.1 Objetivo Geral......................................................................................... 32
2.2 Objetivos Específicos............................................................................. 32
3 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 33
3.1 Análise in silico....................................................................................... 33
3.2 Extração de DNA de tomateiro............................................................... 34
3.3 PCR para confirmar presença do vetor binário nas plantas
transformadas...............................................................................................
36
3.4 Seleção de plantas transformadas por germinação in vitro .................. 36
3.5 Análise fenotípica dos transgênicos....................................................... 37
3.5.1 Análise estatística................................................................................ 38
3.6 Estudos histológicos.............................................................................. 38
4 RESULTADOS.......................................................................................... 40
4.1 Identificação e análise da sequência do cDNA homólogo à proteína
reprimida por auxina (ARP) em tomateiro....................................................
40
4.2 Análise fenotípica das plantas contendo o cDNA homólogo à ARP em
tomateiro.......................................................................................................
54
4.3 Análise histológica das flores e dos pecíolos das plantas 35S::SlARP
antissenso e senso.......................................................................................
66
5 DISCUSSÃO............................................................................................. 71
6 CONCLUSÃO............................................................................................ 83
12
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 84
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 O cenário econômico do tomate
O tomate é um dos alimentos mais consumidos no mundo seja in natura
ou na forma processada. Segundo a Organização das Nações Unidas para
Agricultura e Alimentação, 2013 (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION
OF THE UNITED NATIONS STATISTICS DIVISION - FAOSTAT, 2013),
163.963.770,00 toneladas de tomate foram produzidas no mundo. A China é o
maior produtor correspondendo a mais de 30% da produção dessa hortaliça,
seguida pela Índia, Estados Unidos, Turquia, Egito, Irã e Itália. O Brasil ocupa a
oitava posição no ranking mundial, contribuindo com 2,55% (ou 4.187.646,00
toneladas) da produção total (Figura 1) (FAOSTAT, 2013).
Figura 1 - Distribuição, em porcentagem, da participação dos principais países na
produção mundial de tomate (Fonte: FAOSTAT, 2013).
No Brasil, em relação ao ano de 2015, houve redução na safra de
tomate, na qual foram produzidas 3.686.816,00 toneladas, ou seja,
aproximadamente 12% a menos quando comparada ao ano de 2013 (produção
de 4.187.646,00 toneladas) e redução de 14,1% em relação à safra de 2014,
na qual foram produzidas 4.302.777,00 toneladas (INSTITUTO BRASILEIRO
DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA – IBGE, 2016). As principais cultivares que
dominam o mercado de tomate de mesa no país são as do subgrupo Santa
Cruz, Salada, Cereja e Italiano que variam em relação ao formato e tamanho
30,83%
11,12% 7,67% 7,21%
5,20% 3,76% 3,01% 2,55% 2,25% 2,00%
24,40%
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
Total da produção mundial de tomate (%)
14
dos frutos; além do sistema de cultivo (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DO
COMÉRCIO DE SEMENTES E MUDAS - ABCSEM, 2009).
A produção nacional concentra-se nas regiões Sudeste (50,6% da
produção total) e Centro-Oeste (22,0%) do país, sendo o Estado de Goiás com
participação de 21,4% da produção total, São Paulo com 20,8% e Minas Gerais
com 20,2% os maiores produtores de tomate (Figura 2) (IBGE, 2016).
Figura 2 - Distribuição da participação nacional, por regiões, na produção do tomate
(Fonte: IBGE, 2016).
A região Nordeste ocupa a terceira posição nacional com 14,9% de
participação na produção de tomate, entretanto, destacam-se os Estados da
Bahia (6,8%), Ceará (4,0%) e Pernambuco (3,1%) como maiores produtores
regionais (Figura 3). Apesar das condições climáticas favoráveis, o Estado do
Rio Grande do Norte apresenta uma pequena porcentagem de participação na
produção da cultura (0,1%). Este fato decorre, principalmente, por pequenos
produtores rurais que exploram essa hortaliça e a prática agrícola por outras
olericulturas de grande valor econômico, como o meloeiro e a melancia (IBGE,
2015; VIDAL, 2010; PRODUÇÃO AGRÍCOLA MUNICIPAL - PAM, 2013). Além
da cultura do tomateiro ser atacada pela praga mosca-branca (Bemisia tabaci)
que provoca alterações no amadurecimento do fruto, causando prejuízos
econômicos aos produtores rurais (MOURA et al., 2014).
0,4%
14,9%
50,6%
12,2%
22,0%
Participação na produção do tomate (%)
Norte
Nordeste
Sudeste
Sul
Centro-Oeste
15
Figura 3 – Contribuição relativa dos Estados da região Nordeste na produção do tomate
(Fonte: IBGE, 2016).
1.2 A cultivar Micro-Tom e a espécie Solanum pimpinellifolium
A família Solanaceae inclui diversas espécies de importância econômica
no cenário mundial como o tomate, a batata, o tabaco e a pimenta (LOZANO et
al., 2009). Existem aproximadamente 95 gêneros e 2.800 espécies arbóreas e
herbáceas distribuídas no mundo inteiro, principalmente em regiões tropicais e
temperadas, na qual a maior diversidade encontra-se nas Américas Central e
Sul (KNAPP, 2002).
O tomateiro pertence ao gênero Solanum, seção Lycopersicon, que
abrange uma espécie domesticada, Solanum lycopersicum, e 12 espécies
relativamente selvagens como S. pimpinellifolium, S. pennellii e S. peruvianum
que se desenvolveram em locais distintos e possuem determinadas variações
genéticas naturais, como o número de flores produzidas por inflorescência
(GRANDILLO et al., 2011; PERALTA et al., 2008).
A espécie Solanum lycopersicum compreende praticamente todas as
formas de cultivares de tomateiro. Estas variam nos aspectos foliares, na
arquitetura da planta, no número de flores ou no formato e coloração dos frutos
(PÉRILLEUX et al., 2014). Dentre estas, a cultivar (cv.) Micro-Tom é
amplamente utilizada como modelo vegetal por abrigar características atrativas
para estudos genéticos, fisiológicos, evolutivos e de desenvolvimento vegetal
devido a seu ciclo de vida relativamente curto entre 70 a 90 dias até o período
0,1% 0,1%
4,0%
0,1% 0,5%
3,1%
0,1% 0,1%
6,8%
0,0% 1,0% 2,0% 3,0% 4,0% 5,0% 6,0% 7,0% 8,0%
Participação na produção do tomate (%)
16
de coleta dos frutos maduros; conter um genoma pequeno (950 Mb), assim
como as outras cultivares de tomateiro; apresentar tamanho reduzido (10 a 20
cm de altura); ser capaz de crescer em altas densidades (acima de 1.357
indivíduos/m2) e pode produzir três a quatro gerações em um ano (Figura 1)
(FLORES et al., 2015; MEISSNER et al., 1997). Na figura 4, pode-se observar
a arquitetura da cv. Micro-Tom, o pequeno porte (Figura 1A), o arranjo das
flores por inflorescência (Figura 1B) e a disposição dos frutos (Figura 1C). A
cv. Micro-Tom tem sido utilizada em estudos genéticos e moleculares por meio
da metodologia de mutagênese, marcadores genéticos e através da ferramenta
de transformação mediada pela bactéria Agrobacterium tumefaciens (CHETTY
et al., 2013; DAN et al., 2006; MATSUKURA et al., 2008; SUN et al., 2006).
Figura 4 – A cultivar Micro-Tom. Fotografia mostrando as características da planta como o
pequeno porte (A), a organização da inflorescência (B) e dos frutos (C) na espécie Solanum
lycopersicum (cv. Micro-Tom), fotografias tiradas por Renata Kaline (Laboratório de
Transformação de Plantas e Microscopia, UFRN). Algumas folhas proximais foram excisadas
em C. Barras = 1 cm.
A
B C
17
Outra espécie relacionada ao tomateiro atrativa para estudos de
melhoramento genético é Solanum pimpinellifolium (Figura 5). Na figura 2,
visualiza-se a arquitetura da planta S. pimpinellifolium linhagem WVa700 (LI et
al., 2014) (Figura 5A), a organização das flores na inflorescência (Figura 5B) e
dos frutos (Figura 5C). Esta planta é considerada selvagem, isto é, ainda não
foi completamente domesticada pelo homem, e alguns acessos dessa espécie
preservam características agronômicas desejáveis, incluindo resistência às
doenças, tolerância ao estresse abiótico e frutos avermelhados de alta
qualidade (FOOLAD et al., 2002; FOOLAD et al., 2005; FOOLAD et al., 2008).
Salienta-se ainda que a espécie S. pimpinellifolium possui inflorescência com
mais de 10 flores (QU et al., 2015), enquanto que o tomateiro cultivado (S.
lycopersicum) apresenta 5-7 flores por inflorescência (Figura 4 e 5) (WELTY et
al., 2007).
Figura 5 – A espécie Solanum pimpinellifolium. Fotografia mostrando a arquitetura da planta
S. pimpinellifolium da linhagem WVa700 (retirado e modificado de LI et al., 2014) (A); a
organização da inflorescência (B) e, a disposição dos frutos (C). B e C: fotografias tiradas por
Sandra Knapp (Fonte: Sol Genomics Network: https://solgenomics.net/organism/770/view).
1.3 Os hábitos de crescimentos da planta: Monopodial e Simpodial
A variação no número de flores é ressaltada como uma das
características mais significantes em tomateiro. A polinização e a fertilização
C
B A
18
bem-sucedidas garantem o sucesso reprodutivo da espécie. Do ponto de vista
do agronegócio, a floração é um fator determinante para a produção agrícola,
uma vez que as sementes ou os frutos são colhidos para fins comerciais
(BLUMEL et al., 2015). Entretanto, dois hábitos de crescimento, o monopodial e
o simpodial, afetam a diversidade da arquitetura da inflorescência, isto é,
comprometem o número de flores e, consequentemente, a quantidade de frutos
(Figura 6) (IWATA et al., 2012a).
Figura 6 – Comparação do hábito de crescimento em Arabidopsis thaliana e tomateiro.
Representação esquemática do crescimento monopodial (à esquerda) em A. thaliana e
simpodial (à direita) em tomateiro. Setas em negrito correspondem à representação do
meristema lateral. O círculo fechado preenchido com cor vermelha corresponde a uma única
flor ou a 5 flores (inflorescência), respectivamente (figura retirada e modificada de TEO et al.,
2014).
Em plantas com crescimento monopodial, como os modelos vegetais
Arabidopsis thaliana e arroz (Oryza sativa), o meristema apical caulinar
vegetativo dá origem a folhas até estímulos adequados resultarem na transição
do crescimento vegetativo para o desenvolvimento da inflorescência. Durante
esta fase, o meristema apical caulinar continua a produção de inflorescências e
flores isoladas, resultando em um único ciclo que consiste nas fases vegetativa
e reprodutiva (inflorescência ou floral) (Figura 6, à esquerda) (PNUELI et al.,
1998; TEO et al., 2014).
O tomateiro exibe um padrão de crescimento simpodial da seguinte
forma: após a produção de algumas folhas (6 a 12 folhas compostas), o
19
meristema apical caulinar diferencia-se em uma flor terminal e, em seguida,
retoma o crescimento vegetativo a partir de um meristema caulinar simpodial
produzido na axila (gema lateral) da folha mais jovem (Figura 6, à direita).
Depois da produção de três folhas, denominada unidade simpodial, novamente,
o meristema caulinar simpodial reitera o padrão do meristema apical caulinar
para terminar em uma segunda inflorescência composta e iniciar a geração de
um novo meristema caulinar simpodial. Esse tipo de hábito de crescimento
resulta em uma planta indeterminada com produção contínua de
inflorescências igualmente espaçadas entre três folhas, ou seja, as fases
vegetativa e reprodutiva se alternam regularmente (Figura 6, à direita) (JIANG
et al., 2013; PNUELI et al., 1998; TEO et al., 2014; THOUET et al., 2008).
1.4 As vias do processo de florescimento em A. thaliana
As plantas passam por uma série de transformações durante seu ciclo
de vida em resposta a fatores intrínsecos e extrínsecos. A mudança do
crescimento vegetativo para o reprodutivo é regulada por uma rede complexa
de vias gênicas. As principais respostas aos estímulos ambientais são
desencadeadas pelas vias do fotoperíodo, ou seja, através da intensidade
luminosa e comprimento do dia, da vernalização (tratamento a frio) e das
giberelinas. Quanto às respostas a estímulos internos, essas são mediadas
pelas vias autônomas e dependentes de microRNAs (Figura 7) (BLUMEL et al.,
2015; KHAN et al., 2013).
20
Figura 7 – Diagrama simplificado das vias da floração em A. thaliana. Até agora, cinco vias
independentes para o florescimento foram identificadas: da vernalização, do fotoperíodo,
autônoma, das giberelinas e do desenvolvimento (microRNA). A função da via autônoma e da
vernalização é reprimir a atividade de FLOWERING LOCUS C (FLC), um repressor floral. A
proteína FLC reprime FLOWERING LOCUS T (FT) e SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION
OF CONSTANS1 (SOC1), também conhecidos como integradores das vias florais, que são
regulados positivamente pela via do fotoperíodo. Além disso, dois longos RNAs não
codificantes (lncRNAs), COOLAIR e COLDAIR, estão envolvidos na regulação de FLC. Os
sinais ambientais integrados por FT e SOC1 induzem a expressão de reguladores da
identidade meristemática (LEAFY – LFY e APETALA1 - AP1) para iniciar a formação das flores.
A via do desenvolvimento (microRNA) afeta o tempo de floração de duas maneiras: a primeira,
reprimindo a atividade de repressores da floração, permitindo, dessa forma, que a planta
responda a estímulos para o florescimento e, a segunda, regulando diretamente os
integradores da via floral e reguladores da identidade do meristema. A via do desenvolvimento
e a via das giberelinas acompanham a atividade dos microRNAs (miR156 e miR172) e dos
genes SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL3, 4, 5, 9 e 10). As setas ( )
indicam promoção da atividade gênica, as extremidades “T” indicam repressão da atividade
gênica. FRI: FRIGIDA; SVP: SHORT VEGETATIVE PHASE; FCA: FLOWERING LOCUS CA;
FY: FLOWERING LOCUS Y; CO: CONSTANS; FD: FLOWERING LOCUS D (retirado e
modificado de KHAN et al., 2013).
21
A via do fotoperíodo é o resultado de uma interação complexa entre o
ritmo circadiano e os sinais ambientais como o comprimento do dia, a
qualidade e quantidade de luz (composição e densidade dos fótons),
disponibilidade de nutrientes e de água, que culminam na ativação de genes
envolvidos na transição do meristema apical vegetativo em meristema floral (ou
reprodutivo) numa planta (BANDAY; NANDI, 2015; IMAIZUMI, 2010).
O modelo vegetal Arabidopsis thaliana é uma planta de dia longo
facultativa. Isto significa que esta planta pode ser induzida à floração quando
exposta a condições de dias longos (típicos das estações primavera e verão),
enquanto que plantas de dia curto florescem quando os comprimentos dos dias
são curtos e as noites são longas (SRIKANTH; SCHMID, 2011). Abordagens
genéticas e moleculares realizadas em A. thaliana têm identificado inúmeros
genes envolvidos na resposta ao fotoperíodo, sendo os principais genes o
CRYPTOCHROME2/FHA (CRY2), GIGANTEA (GI), FLOWERING LOCUS T
(FT), CONSTANS (CO) e FLOWERING WAGENINGEN (FWA) que possuem
funções regulatórias nesta via (Figura 7) (KHAN et al., 2013).
O gene CONSTANS (CO) é essencial para a percepção do fotoperíodo
em A. thaliana. O ritmo circadiano causa uma oscilação na expressão da
proteína CO em uma fase de 24 horas, sendo que o acúmulo máximo da
proteína CO ocorre cerca de 20 horas após o amanhecer sob condições de dia
curto (SUÁREZ-LÓPEZ et al., 2001). A expressão do gene CO é regulada pelo
ritmo circadiano através de um complexo proteico formado pelas proteínas
GIGANTEA (GI) e FLAVIN-BINDING, KELCH REPEAT, F-BOX (FKF1). Os
fotorreceptores PHYTOCROME A e CRYPTOCHROME 1 e 2 (CRY1 e CRY2)
responsáveis pela percepção da luminosidade em diferentes comprimentos de
onda também regulam os níveis de transcritos do gene CO. Assim, o ritmo
circadiano e a luminosidade (qualidade e quantidade de luz) controlam a
atividade da proteína CO (Figura 7) (KHAN et al., 2013; RIBONI et al., 2014;
SRIKANTH; SCHMID, 2011).
A proteína CO promove a transcrição dos genes FLOWERING LOCUS T
(FT) e TWIN SISTER OF FT (TSF) que influenciam no tempo de florescimento.
O gene FT é transcrito e traduzido nas folhas, mas a proteína FT, denominada
florígeno, atua como uma molécula sinalizadora sistêmica e move-se através
do floema até o ápice meristemático caulinar, onde interage com os fatores de
22
transcrição denominados FLOWERING LOCUS D (FD) e FD PARALOG (FDP)
para iniciar a transição floral somente quando o ápice meristemático encontra-
se competente, através da integração das outras vias da floração, para sofrer
as modificações morfológicas necessárias para a formação dos órgãos florais
(KHAN et al., 2013; RIBONI et al., 2014; SONG et al., 2015). Uma vez que o
heterodímero FT/FD é formado, esse complexo promove a expressão dos
fatores de transcrição SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF
CONSTANS1 (SOC1), FRUITFUL (FUL) e dos genes que definem a identidade
do meristema floral APETALA1 (AP1) e LEAFY (LFY), os quais resultam no
desenvolvimento da flor (Figura 7) (MCGARRY; AYRE, 2012; TURK et al.,
2008).
A perda de função da proteína LFY resulta na floração tardia e em flores
com estruturas anormais (HUALA; SUSSEX, 1992), enquanto mutantes ap1
também produzem flores alteradas que possuem sépalas semelhantes a folhas
e não apresentam pétalas, embora o desenvolvimento de estames e de
carpelos seja normal. Além disso, flores ectópicas são formadas nas axilas das
sépalas semelhantes a folhas, um fenótipo que foi interpretado como um
defeito na identidade do meristema floral (IRISH; SUSSEX, 1990). No entanto,
ambos os genes codificam fatores de transcrição e promovem a expressão de
outros genes da identidade do meristema floral, enquanto concomitantemente
reprimem a expressão de reguladores negativos da floração, incluindo o
TERMINAL FLOWER1 (TFL1) (SIRIWARDANA; LAMB, 2012).
O TFL1 é um repressor floral e é expresso no meristema da
inflorescência, prevenindo a expressão de genes da identidade meristemática
floral e desta forma, mantém o desenvolvimento vegetativo da planta (IWATA
et al., 2012b).
Além do fotoperíodo, a temperatura é um dos principais determinantes
do momento da floração. Algumas plantas requerem um período prolongado de
frio (vernalização) para induzirem o florescimento na primavera seguinte
(SRIKANTH; SCHMID, 2011). Em A. thaliana, estudos demonstram que a
vernalização necessita de dois genes, FRIGIDA (FRI) e FLOWERING LOCUS
C (FLC). O gene FLC é um fator de transcrição contendo o domínio MADS que
atua como um repressor floral, regulando o tempo de floração pela inibição dos
integradores florais FT e SOC1, enquanto o gene FRI age regulando
23
positivamente a expressão de FLC (Figura 7) (CREVILLEN; DEAN, 2011). A
repressão do gene FLC é regulada pelos RNAs não codificantes longos
(lncRNAs), COOLAIR e COLDAIR (Figura 7) (SONG et al., 2012).
Outro regulador da floração em resposta a temperatura é o gene SHORT
VEGETATIVE PHASE (SVP) que atua como repressor da floração e foi
demonstrado que a proteína SVP interage com a FLC para reprimir a floração
(Figura 7) (LEE et al., 2007).
A via autônoma também reprime a expressão de FLC, que
subsequentemente induz a expressão de FT e SOC1 para promover o
florescimento na planta (SHAFIQ et al., 2014). Em contraste, os mutantes da
via autônoma provocam a floração tardia independentemente do comprimento
do dia. Os membros dessa via que regulam o FLC em diferentes níveis incluem
LUMINIDEPENDENS (LD), FLOWERING LOCUS CA (FCA), FLOWERING
LOCUS Y (FY), FLOWERING LOCUS PA (FPA), FLOWERING LOCUS D
(FLD), FLOWERING LOCUS VE (FVE), FLOWERING LOCUS K (FLK) e
RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6 (REF6) (SIMPSON, 2004; KHAN et al.,
2013). As proteínas codificadas por estes genes da via autônoma geralmente
estão inseridas em duas categorias funcionais: a primeira inclui fatores de
manutenção e remodelamento de cromatina e a segunda, proteínas que afetam
o processamento do RNA. Ambas inibem a expressão do repressor floral FLC
e, portanto, promovem a floração (Figura 7) (SRIKANTH; SCHMID, 2011).
O fitormônio giberelina também induz a floração por meio da promoção
da atividade de LFY. Foi demonstrado em A. thaliana que aplicações de
giberelinas na planta aumentaram a atividade do promotor LFY em dias curtos
(BLÁZQUEZ et al., 1998). Além disso, as giberelinas regulam a expressão de
FT em paralelo com CO em condições de dias longos para promover a floração
(Figura 7) (HISAMATSU; KING, 2008). Mutantes da via da biossíntese das
giberelinas, como ga1, não produzem flores sob condições não indutivas de
dias curtos (WILSON et al., 1992).
A via floral elucidada mais recentemente, a via dependente de
microRNA, está relacionada com o desenvolvimento da planta (Figura 7).
Estudos recentes indicam que miR156 e miR172 atuam nas mudanças da fase
vegetativa (JUNG et al., 2011). O miR156 é bastante abundante na fase juvenil
e diminui durante o estágio adulto, enquanto o miR172 possui um padrão de
24
expressão oposta, isto é, miR172 é abundante na fase adulta e apresenta
níveis reduzidos na fase juvenil (WANG et al., 2009; WANG, 2014).
A superexpressão do miR156 regula negativamente a expressão de
vários genes SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL)
(Figura 7) e atrasa a transição das fases juvenil-adulto e vegetativo-reprodutivo,
afetando assim o tempo de floração. Os genes SPL também são regulados por
outras vias da floração (WANG et al., 2009). Já o miR172 promove a floração
pela via do fotoperíodo, independentemente da atuação da proteína CO.
Entretanto, a superexpressão de genes que regulam o miR172 atrasa a
transição juvenil-adulto e, portanto, atrasa a transição para o florescimento
(MATHIEU et al., 2009).
1.5 Os principais genes envolvidos no processo de floração em tomateiro
As funções dos inúmeros genes envolvidos na floração em A. thaliana
encontram-se conservadas em muitas espécies de plantas. Visto que pouco se
conhece a respeito dos processos de floração e frutificação em tomateiro, faz-
se necessário elucidar os genes que integram essa rede complexa e sua exata
função em resposta aos diversos sinais internos e externos à planta (THOUET
et al., 2012).
Estudos recentes tem resultado na descrição de alguns mutantes e na
caracterização de alguns genes envolvidos com o processo de floração em
tomateiro, como o SINGLE FLOWER TRUSS (SFT), SELF PRUNING (SP) e
FALSIFLORA (FA) (Tabela 1) (SHALIT et al., 2009; THOUET et al., 2008,
THOUET et al., 2012, respectivamente).
25
Tabela 1 - Genes e mutantes que afetam o processo de floração em tomateiro e sua
homologia com A. thaliana (retirado e modificado de THOUET et al., 2012 e de LOZANO et
al., 2009).
Gene Função Mutante Fenótipo do mutante Homologia a
A. thaliana
Referências
SINGLE FLOWER
TRUSS (SFT)
Codifica o
florígeno
sft Floração tardia; crescimento
vegetativo; produção de
poucas flores e frutos.
FLOWERING
LOCUS T (FT)
Krieger et al.,
2010; Park et
al., 2014.
SELF PRUNING
(SP)
Codifica um
repressor
da floração
sp Desenvolvimento do
meristema simpodial alterado
TERMINAL
FLOWER1 (TFL1)
Quinet et al.,
2011, Pnueli et
al., 1998
FALSIFLORA (FA) Regula a
transição
floral
fa Floração tardia ou não
florescimento; inflorescência
altamente ramificada e
meristemas com
aglomerados de tecidos
meristemáticos.
LEAFY (LFY) Molinero-
Rosales et al.,
1999; Thouet
et al., 2012.
O tomateiro é uma planta herbácea de dia neutro, ou seja, floresce
independentemente do fotoperíodo. Sendo assim, a transição floral em muitos
cultivares ocorre principalmente pela via autônoma e a floração pode ser
acelerada pela alta disponibilidade luminosa (QUINET et al., 2006).
O gene SFT, ortólogo de FT em A. thaliana, codifica a proteína móvel
denominada florígeno que promove o florescimento. As plantas contendo o
gene mutante sft em homozigose apresentam redução nos sinais florigênicos, o
que gera a floração tardia e causa um crescimento vegetativo com redução na
produção de inflorescências que se resumem a uma ou a poucas flores e frutos
(Tabela 1) (KRIEGER et al., 2010; PARK et al., 2014; THOUET et al., 2012).
No entanto, plantas heterozigotas para a mutação em sft (sft/+), a redução
dose-dependente da atividade do florígeno resulta em atraso no florescimento
e maior número de inflorescências, flores e frutos em comparação com os
controles parentais no mesmo período de tempo (JIANG et al., 2013).
A superexpressão do gene SFT gera floração precoce com a primeira
inflorescência após o surgimento de três a cinco folhas em comparação ao
controle, no qual as flores emergem depois do surgimento de 10-12 folhas
compostas (LIFSCHITZ et al., 2006).
26
O gene SP, ortólogo ao TFL1 de A. thaliana, pertence à família gênica
CETS (CENTRORADIALIS de Antirrhinum majus, TFL1 e SELF-PRUNING)
que possuem homologia com as proteínas de ligação à fosfatidiletanolamina
(PEBPS), altamente conservadas em eucariotos (MARCHLER-BAUER et al.,
2013). Essa família gênica codifica membros de uma família proteica de
adaptadores/moduladores capazes de interagir com inúmeras proteínas de
sinalização (LIFSCHITZ et al., 2006). O gene SFT também é membro dessa
família gênica (MCGARRY; AYRE, 2012). O gene SP codifica um repressor da
floração e determina o crescimento simpodial em tomateiro (Figura 3) (QUINET
et al., 2011). Em mutantes sp, o florígeno não é inibido e o número de folhas
iniciadas em segmentos simpodiais sucessivos é gradualmente reduzido até a
produção de duas inflorescências consecutivas e o crescimento é finalizado
prematuramente, sendo o crescimento, portanto, “determinado” (Tabela 1)
(PNUELI et al., 1998).
A regularidade e a perpetuação do ciclo de crescimento simpodial
(inflorescência-três folhas-inflorescência) são realizadas, provavelmente, pelo
balanço entre os sinais que promovem o florescimento (florígeno, codificado
pelo SFT) e os sinais que reprimem a floração como o gene SP (LIFSCHITZ;
ESHED, 2006).
O gene FA, ortólogo do gene da identidade do meristema floral LEAFY
de A. thaliana, regula a transição floral. Os mutantes fa resultam em fenótipos
de floração tardia e anormalidades no desenvolvimento das inflorescências, as
quais são produzidas a partir de brotos foliares, contêm bastantes ramificações
e aglomerados de meristemas em proliferação (Tabela 1) (MOLINERO-
ROSALES et al., 1999; THOUET et al., 2012).
1.6 A identificação do cDNA homólogo à proteína reprimida por auxina
(ARP) em tomateiro e as funções dos homólogos da ARP
Diante da extrema importância econômica da produção de tomate para o
Brasil e a escassez de informações no tocante ao processo de floração em
tomateiro, pesquisas desenvolvidas anteriormente identificaram clones
extraídos de bibliotecas subtrativas utilizando o ápice meristemático das
espécies Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom e S. pimpinellifolium induzidos à
floração (após o surgimento de 7 a 10 folhas compostas) e não induzido a
27
floração (após 5 ou 6 folhas compostas) (PNUELI et al., 1998). Dos inúmeros
cDNAs identificados, selecionou-se o cDNA homólogo a Proteína Reprimida
por Auxina (AUXIN REPRESSED PROTEIN - ARP) para a sua caracterização
com o intuito de compreender o seu papel no processo de floração em
tomateiro, uma vez que este gene alvo de estudo foi identificado numa
biblioteca reprodutiva, ou seja, a planta estava induzida ao processo floral
(ESTEVAM, 2011). Além disso, existem poucos dados a respeito da proteína
ARP na literatura científica.
Reddy e Poovaiah (1990) construíram uma biblioteca de cDNA a partir
de RNAm isolados de receptáculos desprovidos de auxina em morango e
identificaram primordialmente a SAR5, homólogo da ARP, que está associada
com a maturação do fruto da seguinte forma: quando SAR5 é reprimida por
auxina, ocorre o amadurecimento do fruto.
Lee et al. (1993) isolaram de uma biblioteca de cDNA construída a partir
de RNAs extraídos do tecido cortical do fruto maduro da macieira, uma
sequência nucleotídica contendo 705 pares de bases e uma janela de leitura
(ORF- OPEN READING FRAME) que codifica um polipeptídeo de 119
aminoácidos com massa predita de 13 kDa, o qual denominam AP1. Além
disso, verificaram que os transcritos de AP1 são detectados em vários estágios
do desenvolvimento do fruto, desde os ovários das flores aos frutos maduros,
assim como seu homólogo no fruto do morangueiro. Apesar de ter sido
detectado em altos níveis no fruto da maçã, AP1 também é expresso na folha,
caule, pecíolo, sementes e raízes (LEE et al., 1993). No entanto, Steiner et al.
(2003) verificam a associação da ARP com a maturação do pólen em tabaco.
Stafstrom e colaboradores (1998) observaram que o gene ortólogo
PsDRM1, está associado com a dormência das gemas em ervilha (Pisum
sativum L. cv. Alaska). Após a remoção da gema dormente na região terminal
da planta, a quantidade de transcritos de PsDRM1 são reduzidos em
aproximadamente 20 vezes em 6 horas e, em 12 horas, os RNAm são
indetectáveis nas gemas laterais em desenvolvimento. Mais ainda, a expressão
do gene PsDRM1 está intimamente ligada a caules e raízes no estágio maduro,
isto é, transcritos acumulam-se nestes tecidos já desenvolvidos. Assim como o
gene RpARP (Robinia pseudoacacia) é altamente expresso em tecidos
maduros (PARK; HAN, 2003).
28
No repolho Chinês (Brassica rapa L. ssp. Pekinensis), os níveis de
expressão de dois genes relacionados à ARP, BrARP1 e BrDRM1, são
igualmente elevados em tecidos maduros. Lee et al. (2013) também
observaram que estes genes estão envolvidos provavelmente na suspensão do
crescimento, possivelmente inibindo o alongamento celular ou a expansão
celular, ocasionando redução no tamanho da planta Brassica rapa.
Segundo Shi et al. (2013), os genes ARPs, PpARP1 e PpARP2, podem
estar envolvidos na resposta ao ácido salicílico durante o desenvolvimento do
fruto em Pyrus pyrifolia, uma vez que os genes PpARPs são regulados
negativamente após o tratamento do mesocarpo com diferentes concentrações
de ácido salicílico. Não obstante, a expressão de PpARPs é induzida pela
auxina exógena.
Além desses, outros genes homólogos a ARP parecem estar envolvidos
na resposta ao estresse abiótico como o próprio RpARP mencionado
anteriormente, cuja expressão é detectada sob condições de frio e escassez de
sacarose (PARK; HAN, 2003); como na tolerância à seca (CHOI et al., 2002) e
na resposta ao tratamento a frio e ao estresse salino no pimentão (HWANG et
al., 2005).
Na resposta ao estresse biótico por nematoides, dois genes ARPs são
encontrados em bibliotecas subtrativas de cDNA e são diferencialmente
expressos nas raízes da soja em resposta à infecção causada por Meloidogyne
javanica (SÁ et al., 2012). O gene ortólogo EuNOD-ARP1 (Elaeagnus
umbellata) é induzido pela auxina exógena em tecidos foliares e na zona de
fixação dos nódulos de raízes não infectados com o actinomiceto Frankia (KIM
et al., 2007).
Recentemente, é observada, em plantas de tabaco, que este gene
regula negativamente o crescimento do vegetal e ativa a resistência da planta a
doenças causadas por patógenos (ZHAO et al., 2014).
Embora os homólogos desta proteína ARP já tenham sido identificados
em outras espécies de plantas, sua função fisiológica e molecular é pouco
compreendida. Além disso, pouco é conhecido sobre esses genes regulados
negativamente pela auxina.
29
1.7 Ação da auxina e citocinina nos principais processos do
desenvolvimento vegetal
Sabe-se que a auxina é um hormônio central que regula uma infinidade
de processos que envolvem o crescimento e desenvolvimento das plantas
através do controle da expressão de genes responsivos à auxina. Ao nível
celular, a auxina controla a divisão, extensão e diferenciação celular. Em
relação ao desenvolvimento vegetal, a auxina desempenha papel essencial em
processos como dominância apical, tropismo, formação de raízes laterais e
adventícias, diferenciação vascular e embriogênese (FRIML, 2003).
As respostas mediadas pelas auxinas nestes diversos eventos do
desenvolvimento vegetal podem ser reguladas através do metabolismo da
auxina, direcionamento do transporte de auxina e transdução de sinais
(CHAPMAN; ESTELLE, 2009; LUDWIG-MULLER, 2011; PETRÁSEK; FRIML,
2009; ZHAO, 2010).
Em elevadas concentrações, a auxina liga-se ao receptor TRANSPORT
INHIBITOR RESPONSE1 (TIR1) e promove a sua interação com as proteínas
da família AUX/IAA (AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID) que são repressores da
transcrição. A interação desencadeia a ubiquitinação das proteínas Aux/IAA
para a via do proteossomo 26S. As proteínas Aux/IAA são reconhecidas como
um substrato para o complexo E3 ubiquitina ligase SCFTIR1(SKP1, CDC53/
CULLIN, F-box) e a auxina aumenta a proteólise desses repressores. Na
ausência da auxina ou em baixas concentrações na célula, a Aux/IAA forma um
heterodímero inibitório com fatores de resposta à auxina (AUXIN RESPONSE
FACTORS - ARFs), que são fatores de transcrição. Essa interação pode
impedir a ligação de ARFs à região promotora dos elementos de resposta à
auxina (AuxRE) e, dessa forma, bloquear a ativação de genes responsivos à
auxina. Portanto, a degradação mediada pela auxina dos repressores Aux/IAA
acarreta na liberação dos fatores de transcrição ARFs e, consequentemente,
promove a expressão de genes responsivos à auxina (GUILFOYLE, 2015;
HAYASHI, 2012; SAUER et al., 2013).
Vinte e cinco membros da família Aux/IAA são identificados em
tomateiro (AUDRAN-DELALANDE et al., 2012). Um deles, a proteína
SIIAA9/ENTIRE (E) é um repressor da transcrição de genes responsivos à
30
auxina e é requerido para o desenvolvimento de folhas compostas e do fruto
(BEN-GERA et al., 2012). O mutante entire desenvolve frutos partenocárpicos
e folhas simples e grandes, ao invés de folhas compostas, características do
tomateiro (KOENIG et al., 2009). Estes fenótipos resultam de mutações com
perda de função de um membro da família gênica Aux/IAA (WANG et al., 2005;
ZHANG et al., 2007).
Outro gene envolvido na sinalização da auxina é o DIAGEOTROPICA
(DGT). O gene DGT codifica uma ciclofilina, LeCYP1 que é necessária para a
expressão de um subgrupo Aux/IAA. Mutantes dgt exibem fenótipos
pleiotrópicos, incluindo a redução da dominância apical e das respostas ao
gravitropismo; folhas hiponásticas; retardo no desenvolvimento vascular; níveis
elevados de antocianina e clorofila; a secreção de prótons mediada pelas
auxinas é comprometida; redução no crescimento do fruto e ausência de raízes
laterais (BALBI; LOMAX, 2003; MIGNOLLI et al., 2012; OH et al., 2006). Além
disso, foi demonstrado que a proteína DGT regula o transporte de auxina para
a formação das raízes laterais (IVANCHENKO et al., 2015)
Sabe-se que muitos hormônios interagem com auxina na regulação dos
processos de desenvolvimento e crescimento do vegetal (EL-SHOWK et al.,
2013). Dentre estes, o hormônio vegetal citocinina desempenha funções no
controle da divisão e ciclo celular; regula os meristemas (centros de células-
tronco), regulando positivamente o meristema apical caulinar através da
estimulação da divisão celular e negativamente regula o meristema apical
radicular através da promoção da diferenciação celular (SCHALLER et al.,
2014).
A citocinina atua sinergicamente ou antagonicamente à auxina nestes
processos, como a manutenção dos meristemas (SU et al., 2011). De forma
antagônica, a citocinina compromete o fluxo, a distribuição e a sinalização da
auxina. Essa por sua vez, a auxina inibe a biossíntese e, consequentemente, a
sinalização da citocinina. No entanto, interações sinérgicas ocorrem nos
processos de organogênese, iniciação foliar e posicionamento do órgão
(NASEEM; DANDEKAR, 2012). Portanto, a interação auxina-citocinina resulta
na convergência de processos que definem o sucesso reprodutivo da planta,
como a produção de flores que culminam na produção de frutos e sementes de
culturas de grande importância para a economia do país, incluindo o tomateiro.
31
Diante disso, foi realizada a caracterização fenotípica do cDNA
homólogo à ARP expresso em plantas transgênicas da cultivar Micro-Tom a fim
de analisar os efeitos biológicos causados pelos cassetes de superexpressão
nas orientações senso e antissenso para o cDNA homólogo a ARP no
desenvolvimento vegetativo e reprodutivo em tomateiro, de modo a
compreender o papel da proteína ARP. Portanto, este estudo visa contribuir
para melhor compreensão da proteína ARP nas vias da floração, frutificação e
dormência das gemas laterais nessa hortaliça de grande importância
econômica.
32
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Analisar o efeito biológico do cDNA homólogo a ARP no
desenvolvimento vegetativo e nos processos de floração e frutificação por meio
da perda e/ou o ganho de função em plantas transgênicas de tomateiro.
2.2 Objetivos específicos
Analisar in silico o cDNA homólogo a ARP por meio de ferramentas de
bioinformática.
Analisar fenotipicamente as plantas de tomateiro contendo os cassetes
de superexpressão nas orientações senso e antissenso para o cDNA
homólogo a ARP.
Analisar anatomicamente tecidos das plantas transgênicas e dos
mutantes dgt e entire envolvidos na sinalização da auxina.
33
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Análise in silico
A identidade da sequência do cDNA homólogo a AUXIN REPRESSED
PROTEIN (ARP) obtida na biblioteca subtrativa foi confirmada através do
programa BLASTx de modo a identificar as regiões de similaridade entre
sequências nos bancos de dados (GERTZ et al., 2006). As análises in silico
foram realizadas por meio de comparações em diferentes bancos de dados de
diversos organismos, sendo considerado o e-value inferior a 1x10-15 das
sequências pesquisadas, incluindo o banco do National Center for
Biotechnology Information, Bethesda, Md (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nihgov) e o
banco do Phytozome 10.3 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html), no qual a
maioria das espécies foi identificada. Algumas sequências encontradas a partir
das buscas foram convertidas em sequências peptídicas pelo programa ORF
FINDER (Open Reading Frame Finder;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) e analisadas por alinhamentos
múltiplos com o programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA
5.0) (TAMURA et al., 2011). Obtidas as sequências devidamente alinhadas, os
domínios funcionais para cada sequência foram pesquisados utilizando o
programa Conserved Domain Database (CDD:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml). A identidade de alguns
homólogos da ARP descritos na literatura e das espécies identificadas no
banco de dados do Phytozome foi obtida através do programa BL2SEQ que
utiliza o alinhamento de duas ou mais sequências de aminoácidos (BLASTp) no
banco de dados do NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
As sequências peptídicas resultantes dos alinhamentos múltiplos foram
convertidas para o formato FAS, utilizando a ferramenta do próprio MEGA 5.0
(TAMURA et al., 2011), para então serem utilizadas nas reconstruções
genéticas. O programa MEGA 5.0 foi utilizado para as análises dos domínios
proteicos das sequências das espécies pesquisadas para a proteína ARP,
utilizando o método estatístico Neighbor-joining (NJ) e 1000 réplicas para
cálculo dos valores de bootstrap. O interatoma predito para a proteína ARP foi
pesquisado nos programas Search Tool for Interactions of Chemicals 4.0
(STICH 4.0 - http://stitch.embl.de/) e Search Tool for the Retrieval of Interacting
34
Genes/Proteins 10 (STRING 10 - http://string-db.org/), utilizando o grau de
confiança média (0.400) e até dez interações com melhores escores como
parâmetros. A massa e o pI deduzidos para a sequência peptídica da ARP
prospectada em biblioteca subtrativa de tomateiro foi obtida pelo programa
ExPASY (http://web.expasy.org/peptide_mass/). Além disso, a presença e a
localização do peptídeo sinal para a sequência da ARP foi predita no programa
SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (PETERSEN et al.,
2011) e sua possível localização celular foi atribuída ao programa PSORT
(http://www.psort.org/).
3.2 Extração de DNA de tomateiro
O evento de transformação foi realizado anteriormente (ESTEVAM, 2011),
no qual as construções dos cassetes de superexpressão do cDNA homólogo a
ARP nas orientações senso (35S::SlARP senso) e antissenso (35S::SlARP
antissenso), além do pZP211 sem o inserto (MT Vazio), utilizado como
controle, foram introduzidas na cultivar Micro-Tom via Agrobacterium
tumefaciens pelo método de discos cotiledonares (PINO et al., 2010). As
plantas regeneradas cresceram em casa de vegetação e produziram frutos.
Assim, as sementes da geração inicial (T0) foram obtidas e a partir disso, estas
sementes foram semeadas e a geração seguinte (T1) foi adquirida. Essa
geração (T1) também produziu sementes que foram colhidas e semeadas para
obter a próxima geração (T2) e assim sucessivamente.
Dessa forma, as sementes das linhagens independentes das plantas
transgênicas (35S::SlARP antissenso, 35S::SlARP senso e MT Vazio) da
geração T1, T2, T3 e T4 e controle cv. Micro-Tom foram crescidas em vasos de
250 mL contendo substrato orgânico e vermiculita na proporção de 1:1,
fertilizante NPK (Nitrogênio, Fósforo e Potássio) 10:10:10 (1g/L) sólido
comercial (Murer) em sala de crescimento com condições controladas (23 °C
durante o dia e 18 °C durante a noite, 80% umidade relativa, fotoperíodo de 12
horas, intensidade luminosa de 30 mol.m-2.s-1). Assim, na geração T1, foram
semeadas três linhagens 35S::SlARP antissenso e 35S::SlARP senso e uma
linhagem MT Vazio. Para cada linhagem foram plantadas 15 sementes e para a
controle cv. MT, 20 sementes. Na geração T2, foram semeadas duas linhagens
35
35S::SlARP senso e MT Vazio e três linhagens 35S::SlARP antissenso, sendo
que para cada linhagem foram plantadas 10 sementes, inclusive para a
controle cv. MT. Na geração T3, foram semeadas cinco linhagens 35S::SlARP
antissenso e 35S::SlARP senso e uma MT Vazio. Para cada linhagem foram
plantadas 5 sementes e para a controle cv. MT, 15 sementes. Por fim, na
geração T4, foram semeadas duas linhagens 35S::SlARP antissenso e uma
linhagem 35S::SlARP senso e MT Vazio. Para cada linhagem foram plantadas
10 sementes, inclusive para a controle cv. MT (Tabela 2).
Tabela 2 – Número de linhagens independentes das plantas transgênicas (MT Vazio, 35S::SlARP antissenso e 35S::SlARP senso), número de sementes plantadas por linhagem de plantas transgênicas nas gerações T1 a T4 e número de sementes da planta controle cv. MT semeadas nestas gerações.
Gerações
Número de linhagens Número de
sementes por
linhagens
Número de
sementes da planta
controle cv. MT
MT Vazio 35S::SlARP
antissenso
35S::SlARP
senso
T1 1 3 3 15 20
T2 2 3 2 10 10
T3 1 5 2 5 15
T4 1 2 1 10 10
As folhas cotiledonares ou folíolos das plantas S. lycopersicum cv. MT,
MT Vazio, 35S::SlARP antissenso e 35S::SlARP senso foram coletadas e em
seguida, foram adicionados 400 L do tampão de extração de DNA (Tris-HCl
200 mM pH 7,5; ácido etilenodiamino tetra-acético - EDTA 25 mM pH 8,0; NaCl
250 mM; dodecil sulfato de sódio - SDS 0,5%) em microtubo de centrífuga (1,5
mL). O tecido foi triturado com o auxílio de um pistilo, e posteriormente, foram
acrescentados 400 L de clorofórmio. Após centrifugação a 9.500 g por 10
minutos (centrífuga Hettich MIKRO 200R), o sobrenadante foi transferido para
outro microtubo de centrífuga de 1,5 mL. Foram adicionados 400 L de
isopropanol em cada microtubo e misturados suavemente. Imediatamente após
centrifugação a 9.500 g por 15 minutos (min), o isopropanol foi descartado e o
sedimento foi lavado com 150 L de etanol 70% (v/v). Os tubos foram
invertidos em papel absorvente e incubados à temperatura ambiente por
aproximadamente 1 hora (h). Após este período de secagem, foram
adicionados 100 L de água ultrapura e as amostras foram armazenadas em
freezer -20°C para posterior reação em cadeia da polimerase (PCR).
36
3.3 PCR para confirmar presença do vetor binário nas plantas
transformadas
Os produtos da extração de DNA genômico das plantas 35S::SlARP
antissenso e senso, MT Vazio e cv. MT foram submetidos à técnica de PCR
para a amplificação da sequência do gene que confere resistência à
canamicina (nptt) presente no vetor binário pZP211. Para isso, foram utilizados
os iniciadores forward Kan-F (5’ GCTTGGGTGGAGAGGCTATTCG 3’) e
reverse Kan-R (5’ GCCATGTGTCACGACGAGATCC 3’).
A confirmação da construção do cassete de superexpressão de ARP nas
orientações senso e antissenso foi obtida através da utilização de 100-200 ng
de DNA; tampão Taq DNA polimerase 1X; MgCl2 1,5 mM; iniciador Kan forward
e reverse 0,3 pmol, dNTPs 0,2 mM, Taq DNA polimerase 1-1,25U e água
ultrapura foi utilizada para completar os 20 L de volume final. A PCR das
amostras ocorreu em termociclador (eppendorf – vapo protect) seguindo a
programação de: 94 ºC durante 2 min, 94 ºC durante 50 segundos, 55 ºC
durante 1 min, 72 ºC durante 1 min e 72 ºC durante 5 min, sendo repetidos por
35 ciclos a partir da segunda até a penúltima etapa. Os produtos desta reação
de amplificação por PCR foram separados e analisados em gel de agarose 1%
(m/v), contendo tampão TAE 1X (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM e EDTA 1
mM) e SYBR® Green I Stain (LONZA). A eletroforese foi conduzida a 90 mA e
120 V por 1,5 h (SAMBROOK et al., 2010).
3.4 Seleção de plantas transformadas por germinação in vitro
A técnica de germinação de sementes in vitro também permite identificar
plantas supostamente transgênicas através do cultivo em meio seletivo
contendo o antibiótico canamicina. Portanto, as sementes das plantas
transgênicas (35S::SlARP antissenso, 35S::SlARP senso e MT Vazio) das
gerações T3 e T4 e do controle cv. MT foram germinadas in vitro em meio MS
(MURASHIGE; SKOOG, 1962) contendo Sacarose 2,5% (m/v), ágar 0,6% (m/v)
e o antibiótico para seleção (canamicina 50 g/mL). O controle cv. MT foi
germinado na ausência do antibiótico. Primeiramente, cinco sementes de cada
linhagem contendo o cDNA homólogo a ARP na orientação senso e
antissenso, controle pZP211(MT Vazio) e cv. MT foram conduzidas à assepsia,
37
na qual as sementes foram submetidas à solução comercial de hipoclorito de
sódio a 30% acrescido de duas gotas de detergente comercial por 15 minutos
sob agitação orbital à temperatura ambiente. Com auxílio de uma peneira
previamente esterilizada, realizou-se a tríplice lavagem nas sementes com
água pura autoclavada. Essa etapa de lavagem foi realizada no fluxo laminar
vertical. As sementes foram transferidas para frascos contendo somente meio
de cultura MS sólido (30 mL) para o controle cv. MT e frascos contendo meio
de cultura MS sólido adicionado a antibiótico para o controle cv. MT e
transgênicos (35S::SlARP antissenso, 35S::SlARP senso e MT Vazio), como
descrito acima. Após 15 dias, as plantas crescidas nesse meio de seleção
foram transferidas para substrato e aclimadas em sala de vegetação.
3.5 Análise fenotípica dos transgênicos
Os fenótipos das plantas 35S::SlARP antissenso, 35S::SlARP senso e
MT Vazio além do controle selvagem (cv. MT) nas gerações T1, T2, T3 e T4
foram avaliados semanalmente com relação a curva de crescimento [altura
(cm) e largura (cm); distância do entrenó entre a folha proximal e a seguinte
(cm); distância entre o ápice e a folha proximal (cm)], a arquitetura foliar
(quantidade de folhas e folíolos produzidos, textura e coloração), o
desenvolvimento de gemas axilares, o comprimento e distribuição dos
tricomas, o início da antese, o número de botões florais, flores em pré-antese,
em antese e pós-antese, o número de flores por inflorescências durante os três
meses iniciais do ciclo de vida da planta para cada geração (T1 a T4). Além da
quantidade de frutos por plantas, número total de sementes e quanto à
existência de partenocarpia, massa (g), altura (cm), diâmetro mediano (cm) e
quantidade de lóculos formados nos frutos das plantas transgênicas e controles
que foram avaliados durante o período de frutificação das plantas, ou seja,
cinco meses para cada geração (T1 a T4). As medidas foram obtidas através
de paquímetro universal e a massa (g) dos frutos foi obtida em balança
semianalítica com precisão de 0,01 g (UX-4200H) (CHARLO et al., 2009;
KOENIG et al., 2009; LILJEGREN et al., 1999; WANG et al., 2005; WELTY et
al., 2007).
38
3.5.1 Análise estatística
As inferências estatísticas foram realizadas através do método ANOVA
com nível de significância 5% pelo programa GraphPad prism 5 (GraphPad
Software, Inc.).
3.6 Estudos histológicos
Para as análises histológicas, a quarta folha distal foi coletada de cada
linhagem e foram realizadas duplicatas dos seguintes tecidos: pecíolos e flores
das plantas transgênicas (MT Vazio, 35S::SlARP senso e 35S::SlARP
antissenso) e da controle cv. MT. O número de linhagens analisadas variou
conforme as gerações: na geração T2, os tecidos coletados para as análises
histológicas foram provenientes de duas linhagens 35S::SlARP senso e
35S::SlARP antissenso; em T3, foram avaliadas três linhagens de 35S::SlARP
antissenso e duas 35S::SlARP senso; enquanto que para a geração T4, foram
duas linhagens 35S::SlARP antissenso e uma linhagem 35S::SlARP senso; e,
para a controle MT Vazio, uma linhagem foi utilizada para as análises
histológicas nas gerações T3 e T4. Além disso, foram efetuadas triplicatas dos
pecíolos dos mutantes envolvidos na resposta a auxina, dgt e entire. Todos os
tecidos foram fixados em FAA (etanol 70% (v/v):ácido acético
glacial:formaldeído, na proporção 18:1:1) (HERR, 1971) por 48 horas.
Decorrido este período, a solução de FAA foi substituída por álcool etílico 70%
(v/v) até o processamento das amostras (JOHANSEN, 1940).
Posteriormente, o material vegetal passou por sucessivas desidratações
com concentrações crescentes de álcool etílico (70, 80, 90 e 100%) e, para
cada etapa de desidratação, as amostras permaneceram por 1 h em cada
solução. Em seguida, foi realizado o processo de clareamento, no qual os
tecidos permaneceram imersos durante 1 h em xilol absoluto (1:1) e álcool
etílico absoluto (1:1). Logo após, foram embebidos em parafina e xilol absoluto
por 1 h. As amostras foram introduzidas em parafina líquida por 1 h e por fim,
emblocadas em parafina histológica para a realização dos cortes histológicos
(KRAUS; ARDUIN, 1997).
O material parafinado foi seccionado em 10m de espessura em
micrótomo LEICA RM 2125RT do Laboratório de Técnicas Histológicas, situado
39
no Departamento de Morfologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN). Dois cortes histológicos foram selecionados para o processo de
coloração, sendo que uma seção foi corada com azul de toluidina 0,05% (m/v)
em tampão fosfato 0,1 M pH 6,8 e a outra, em safranina 1% (m/v) (O’ BRIEN et
al., 1965). Os cortes histológicos das flores e pecíolos foram analisados no
microscópio reto binocular Zeiss Imager A.2 de fluorescência e campo claro e
fotografados com auxílio do software Zen2011 (ZeissExaminer Z.1), realizados
no Laboratório de Microscopia do Instituto do Cérebro (UFRN).
40
4 RESULTADOS
4.1 Identificação e análise da sequência do cDNA homólogo à proteína
reprimida por auxina (ARP) em tomateiro
A sequência da proteína reprimida por auxina (ARP) foi encontrada na
biblioteca subtrativa de tomateiro, na qual foram utilizados ápices
meristemáticos induzidos e não induzidos à floração das espécies Solanum
lycopersicum cultivar Micro-Tom (modelo vegetal) e S. pimpinellifolium (espécie
selvagem que abriga maior número de flores por inflorescência que a cv. MT)
com o intuito de identificar prováveis genes envolvidos no processo de floração
do tomateiro (ESTEVAM, 2011). Para este trabalho, dentre os inúmeros clones
de cDNA identificados, o cDNA com homologia à proteína ARP foi selecionado
para a caracterização funcional em tomateiro, uma vez que foram anotadas 16
sequências para este gene numa biblioteca reprodutiva (ESTEVAM, 2011).
Portanto, foram construídos os cassetes de superexpressão do cDNA
homólogo a ARP nas orientações senso e antissenso frente ao promotor 35S
do Vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV35S) no vetor intermediário pBC
(Stratagen) e depois estes cassetes foram transferidos para o vetor binário
pZP211 e foram obtidos as plantas transgênicas contendo estes cassetes
(ESTEVAM, 2011).
Inicialmente, foi realizada uma análise in silico para verificar a relação
gênica do cDNA homólogo à proteína reprimida por auxina – ARP (AUXIN
REPRESSED PROTEIN) de tomateiro com outras sequências em diferentes
espécies de plantas. A sequência nucleotídica do gene ARP em estudo
consiste de 522 nucleotídeos e codifica um polipeptídeo predito com 109
resíduos de aminoácidos (Tabela 3), massa molecular de 12,67 kDa e pI 8,89
(http://web.expasy.org/peptide_mass/). Ainda, a sequência da proteína ARP prediz
ter um peptídeo sinal direcionado para regiões transmembranas
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) e possível localização no núcleo
(http://www.psort.org/).
A partir da sequência proteica deduzida para a ARP em estudo, foi
encontrado o domínio Auxin_repressed superfamily que se inicia na posição 39
da sequência peptídica e termina na posição 106 (Figura 8). Este domínio
proteico tem sido associado à dormência/auxina e apresenta-se conservado
41
em todas as espécies analisadas, porém a função dessa família proteica é
pouco compreendida até o momento.
Figura 8 - Domínio funcional da proteína ARP em Solanum lycopersicum. O domínio funcional (representado em vermelho) pertencente à superfamília Auxin_repressed com um e-value inferior a 1 x 10
-15 em tomateiro. Retirado do programa Conserved Domain Database -
CDD.
Além disso, alinhando-se a sequência polipeptídica da ARP de interesse
em tomateiro com algumas sequências homólogas descritas na literatura,
verificou-se que esta ARP apresentou 64% de identidade com a SAR5 do
morango (REDDY; POOVAIAH, 1990); 70% com a PsDRM1 de ervilha
(STAFSTROM et al., 1998); 71% com a RpARP (PARK; HAN, 2003) e 75%
com a ARP da pera (PpARP1) (SHI et al., 2013) (Tabela 3).
Tabela 3 – A sequência predita de aminoácidos para a ARP, os homólogos descritos na literatura e a respectiva identidade, em porcentagem, entre eles (Fonte: NCBI - http://www.ncbi.nlm.nihgov).
Proteína Sequência Proteica Identidade Acesso Referência
ARP mmxwsspdkwtrqtqkephysilvvnqekdlastrdlcsmpamssrrqdtpvt
ptnisptvrkenvwrsvfhpgsnlatrrigaevfdkpshpnaptvydwlytwehqi
- - Este
trabalho
SAR5 mvlldklwddivagpqperglgmlrkvpqplnlkdegesskitmpttpttpvtpttp
isarkdnvwrsvfhpgsnlssktmgnqvfdspqpnsptvydwmysgetrskh
hr
64% AAA73872 Reddy;
Poovaiah,
1990
PsDRM1 mldklwddivagpqpergleklrkltttlkddgasnqlmrstsipttpttpvtpttpss
arkvdnvwrsvfnpgsnsatksigahvfdkplpntptvydwmysgdtrskhr
70% AAB84193 Stafstrom
et al., 1998
RpARP mvlleklwddvvagphperglgklrklstnvkdegegskllnlsmpstpttpvtptt
pttplsgrkadnvwrsvfhpgsnsatktigaqmfdkplpntptvydwlysgetrsk
hr
71% AY009094 Park; Han,
2003
PpARP1 mvlleklwddivagpqperglgmlrkpspkplnikvegessklampmspgtpg
tpgtpgtpasarakdnvwrsvfhpgsnlatksmgnqvfdkpqpnsptvydwly
sgetrsihhr
75% KC422235 Shi et al.,
2013
Com base nisso, realizaram-se alinhamentos múltiplos para investigar se
o domínio funcional da proteína ARP de interesse em tomateiro encontrava-se
completo e conservado entre as espécies pesquisadas no banco de dados do
Phytozome (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html).
42
Desta maneira, a sequência do domínio funcional predita para a ARP de
interesse em tomateiro foi alinhada com 25 sequências selecionadas para a
análise do domínio funcional Auxin_repressed superfamily (Figura 9). O
alinhamento múltiplo revelou que 25 sequências primárias apresentavam dois
domínios conservados, o domínio 1, localizado na região N-terminal, com o
motivo WD (indicativo de triptofano e aspartato, respectivamente) que auxilia
nas interações proteicas e o domínio 2 com 18 aminoácidos idênticos em sua
região C-terminal, sugerindo que esta região altamente conservada pode ser
importante para o desempenho da função proteica (Figura 9, asteriscos).
Entretanto, a sequência deduzida da ARP de interesse em tomateiro não
possuía o domínio 1 localizado na região amino terminal, apresentando apenas
o domínio 2 completo e conservado (Figura 9, “Solanum lycopersicum”).
Diante disso, a sequência predita do domínio funcional da proteína ARP
de interesse em tomateiro foi examinada em detalhes ainda através do
alinhamento múltiplo a fim de compreender sua estrutura molecular primária,
visto que pouco se sabe sobre o domínio proteico Auxin_repressed
superfamily.
Comparando-se a estrutura primária predita para a ARP de interesse
com outras sequências homólogas, notou-se que a região C-terminal da
sequência deduzida da ARP em tomateiro apresentou alguns grupos de
aminoácidos que foram específicos da família das solanáceas (Figura 9, seta
em cor vermelha), outros foram exclusivos ao longo da sequência da ARP,
como o aminoácido apolar metionina (M) foi único desta sequência (Figura 9,
seta em negrito a esquerda), enquanto que nas outras espécies de Solanum, o
aminoácido polar presente foi a serina (S). As demais espécies não
apresentaram aminoácidos alinhados nesta região, porém a briófita
Physcomitrella patens continha o aminoácido polar com carga negativa, o
aspartato (D) (Figura 9).
Outro exemplo diz respeito ao grupo polar com carga negativa, o
aspartato (D) presente na sequência de interesse e ausente nas demais
sequências alinhadas, cujos grupos variaram entre apolar e polares não
carregados (Figura 9, seta em negrito a direita). Além disso, comparando a
sequência proteica da ARP com a outra sequência em tomateiro (Solanum
lycopersicum1) notou-se que o domínio 2 apresentou alta identidade (98%) e
43
houve substituições de aminoácidos apenas nas últimas três posições da
região C-terminal (posição 107-109) (Figura 9, setas em cor azul), na qual um
aminoácido foi substituído por outro do mesmo grupo polar: a serina (S) da
Solanum lycopersicum1 foi trocada pela treonina (T) em ARP (“Solanum
lycopersicum”) (posição 107). No entanto, os aminoácidos substituídos nas
posições subsequentes (108 e 109) pertenciam a diferentes grupos. Por
exemplo, a glicina (G- grupo apolar) da Solanum lycopersicum1 foi trocada pelo
triptofano (W- grupo aromático) em ARP (“Solanum lycopersicum”) (posição
108) e a asparagina (N- grupo polar) foi substituída pelo glutamato (E- grupo R
com carga negativa) em ARP (posição 109) (Figura 9, setas em cor azul),
sugerindo que o domínio 2 pode ser importante para a função proteica
desempenhada pela ARP em estudo. Esta sequência indica também um
possível evento de duplicação gênica, uma vez que esta sequência de
interesse diferiu molecularmente da outra ARP de tomateiro (Figura 9, Solanum
lycopersicum1).
44
Domínio 1
Domínio 2
Figura 9 - Alinhamento da proteína ARP em diferentes plantas. O alinhamento foi
construído utilizando os parâmetros do ClustalW no programa MEGA 5.0. Asteriscos (*)
correspondem aos aminoácidos idênticos. Seta em negrito, aos aminoácidos exclusivos da
sequência de interesse da ARP (direita, metionina; esquerda, aspartato). Seta em vermelho,
aos grupos de aminoácidos específicos das solanáceas (direita, grupo polar não carregado;
esquerda, grupo apolar). Seta em azul destaca as substituições dos aminoácidos entre as
sequências de tomateiro. 1. S lycopersicum é a sequência de interesse da Proteína Reprimida
por Auxina em Solanum lycopersicum. 2. S lycopersicum1 (Número de acesso:
45
Solyc02g077880.2.1); 3. S tuberosum, Solanum tuberosum (PGSC0003DMP400022709); 4. C
clementina, Citrus clementina (Ciclev10017193m); 5. C papaya, Carica papaya
(evm.model.supercontig_373.3); 6. G raimondii Gossypium raimondii (Gorai.010G155600.2); 7.
T cacao, Theobroma cacao (Thecc1EG029828t1); 8 e 9. A thaliana (1) (Arabidopsis thaliana,
AT2G33830.1 e AT5G44300.1, respectivamente); 10. A lyrata, Arabidopsis lyrata (330970); 11.
B rapa (Brassica rapa, Bra036020); 12. C rubella, Capsella rubella (Carubv10027631m); 13. M
esculenta, Manihot esculenta (cassava4.1_019549m); 14. R communis, Ricinus communis
(30190.m011325); 15. M truncatula, Medicago truncatula (Medtr2g014240.1); 16. P trichocarpa,
Populus trichocarpa (Potri.004G047100.4); 17. P vulgaris, Phaseolus vulgaris
(Phvul.006G183600.2); 18. P persica, Prunus persica (ppa013510m); 19. M domestica, Malus
domestica (MDP0000323212); 20. F vesca (Fragaria vesca, mrna29730.1-v1.0-hybrid); 21. S
bicolor, Sorghum bicolor (Sb01g016810.1); 22. Z mays, Zea mays (GRMZM2G123896_T04);
23. O sativa, Oryza sativa (LOC_Os11g44810.1); 24. S italica (Setaria italica, Si003306m); 25.
P virgatum, Panicum virgatum (Pavirv00048995m) e 26. P patens, Physcomitrella patens
(Pp1s291_22V6.2).
Para investigar a relação de parentesco entre a proteína ARP em cv.
Micro-Tom (S. lycopersicum) de interesse e as 25 sequências analisadas no
alinhamento múltiplo foi gerado um dendrograma com as sequências dos
domínios funcionais das espécies estudadas (Figura 10).
O dendrograma indicou uma estreita relação da ARP em tomateiro com
os 25 homólogos identificados em 24 espécies segundo o banco de dados do
Phytozome (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html), devido aos valores de
bootstrap estarem abaixo do esperado (acima de 80) (Figura 10). Entretanto,
estes homólogos da ARP apresentaram uma variação na identidade (entre
62% a 89%) com a sequência do domínio funcional deduzida para a ARP em
tomateiro. Além disso, foi observado que em cada ramo do dendrograma a
maioria das espécies estavam agrupadas em famílias botânicas e a espécie
externa (Physcomitrella patens) pertencente à família Funariaceae de briófitas
encontrava-se em sua região basal. O arroz (Oryza sativa), o milho (Zea mays),
o sorgo (Sorghum bicolor), Setaria italica e Panicum virgatum pertencem à
família Poaceae das monocotiledôneas (Figura 10, retângulo em verde). A
sequência ARP (S. lycopersicum) pertence à família Solanaceae que também
inclui a batata (S. tuberosum) (Figura 10, retângulo vermelho). Além destes, há
a família Brassicaceae que compreende a Arabidopsis thaliana, A. lyrata, ao
nabo (Brassica rapa) e Capsella rubella (Figura 10, retângulo azul); a família
Euphorbiaceae que compreende a mamona (Ricinus communis) e a mandioca
(continuação)
46
(Manihot esculenta) (Figura 10, retângulo cinza); o feijão (Phaseolus vulgaris) e
Medicago truncatula pertencem à Fabaceae (Figura 10, retângulo roxo); já o
pessegueiro (Prunus persica), a macieira (Malus domestica) e Fragaria vesca
fazem parte da família Rosaceae (Figura 10, retângulo laranja); e por fim, as
demais espécies (Citrus Clementina, Carica papaya, Theobroma cacao,
Populus trichocarpa e Gossypium raimondii) pertencem ao clado das Rosídeas
que englobam também as famílias Fabaceae, Rosaceae, Brassicaceae e
Euphorbiaceae. Isto sugere que essa sequência pode apresentar conservação
entre as famílias botânicas (Figura 10).
47
Figura 10 - Dendrograma da proteína ARP em plantas. O dendograma foi construído
utilizando o método estatístico Neighbor-joining e modelo Dayhoff do programa MEGA 5.0. O
número abaixo das linhas são os valores de bootstrap em 1000 replicadas. O retângulo em
vermelho compreende a família Solanaceae. S lycopersicum é a sequência de interesse da
Proteína Reprimida por Auxina em Solanum lycopersicum, S lycopersicum1 (Número de
acesso: Solyc02g077880.2.1) e S tuberosum (PGSC0003DMP400022709). Em verde, a família
Poaceae: P virgatum (Panicum virgatum, Pavirv00048995m), O sativa (Oryza sativa,
LOC_Os11g44810.1) Z mays (Zea mays, GRMZM2G123896_T04), S bicolor (Sorghum bicolor,
Sb01g016810.1) e S italica (Setaria italica, Si003306m). Brassicaceae (azul): A thaliana (1)
(Arabidopsis thaliana, AT2G33830.1 e AT5G44300.1, respectivamente), A lyrata (330970), B
rapa (Brassica rapa, Bra036020), C rubella (Capsella rubella, Carubv10027631m). Em roxo,
representa a Fabaceae: M truncatula (Medicago truncatula, Medtr2g014240.1) e P vulgaris
(continuação)
48
(Phaseolus vulgaris, Phvul.006G183600.2). Rosaceae (laranja): F vesca (Fragaria vesca,
mrna29730.1-v1.0-hybrid), P persica (Prunus persica, ppa013510m) e M domestica (Malus
domestica, MDP0000323212). Em cinza, Euphorbiaceae: M esculenta (Manihot esculenta,
cassava4.1_019549m) e R communis (Ricinus communis, 30190.m011325). C clementina
(Citrus clementina, Ciclev10017193m); C papaya (Carica papaya,
evm.model.supercontig_373.3); T cacao (Theobroma cacao, Thecc1EG029828t1); P
trichocarpa (Populus trichocarpa, Potri.004G047100.4); G raimondii (Gossypium raimondii,
Gorai.010G155600.2); P patens (Physcomitrella patens, Pp1s291_22V6.2).
Com base nos dados obtidos acima em relação ao alinhamento dos
domínios proteicos e do dendrograma, nos quais se observou que houve grau
de conservação da proteína ARP nas diferentes espécies de plantas
analisadas, foi realizada uma busca por possíveis interações proteicas da ARP
no modelo vegetal Arabidopsis thaliana, nas espécies Solanum lycopersicum e
Oryza sativa através da ferramenta Interatoma com o intuito de explorar e
compreender com quais proteínas a ARP pode interagir para desempenhar sua
função nas dicotiledôneas e monocotiledôneas.
Dessa forma, foram utilizados os programas STITCH 4.0
(http://stitch.embl.de) e STRING 10 (http://string-db.org/), nos quais foi inserida a
sequência completa deduzida para ARP em estudo nestes programas. No
entanto, foi selecionado o programa STITCH 4.0 para as espécies A. thaliana e
O. sativa devido ao fato de apresentar melhor grau de identidade em relação
ao programa STRING 10. Assim, foram geradas três opções de redes de
interação para a A. thaliana com identidades variando entre 47-73% com a
ARP de interesse (Figuras 11, 12 e 13).
A interação que apresentou 73% de identidade continha homologia com
a proteína associada à dormência (DORMANCY-ASSOCIATED PROTEIN-
LIKE 1 - DYL1), interagindo com duas outras proteínas associadas à dormência
(AT2G33830 e AT1G56220), uma proteína contendo o domínio CBS
(AT5G10860), três proteínas não identificadas ou desconhecidas (AT3G15450,
AT3G15630 e DL3175W), duas proteínas quinases (SNF1-RELATED
PROTEIN KINASE REGULATORY SUBUNIT GAMMA 1 - KING1 e
AT5G21170), uma proteína de ligação ao zinco (AT3G47160) e uma proteína
MEE14 (maternal effect embryo arrest 14) (Figura 11).
(continuação)
49
Figura 11 - Rede de interação proteica da ARP com 73% de identidade em Arabidopsis
thaliana. DYL1: DORMANCY-ASSOCIATED PROTEIN-LIKE 1 (Acesso: AT1G28330.2, esfera
vermelha). AT2G33830: dormancy/auxin associated family protein (AT2G33830.2).
AT1G56220: dormancy/auxin associated family protein (AT1G56220.3). AT5G10860: CBS
domain containing membrane protein (AT5G10860.1). DL3175W: unknown protein
(AT4G14270.1). AT3G15450: unknown protein (AT3G15450.1). AT3G15630: unknown protein
(AT3G15630.1). KING1: SNF1-RELATED PROTEIN KINASE REGULATORY SUBUNIT
GAMMA 1 (AT3G48530.1). AT5G21170: 5'-AMP-activated protein kinase beta-2 subunit,
putative (AT5G21170.2). AT3G47160: protein binding/zinc ion binding (AT3G47160.1). MEE14:
maternal effect embryo arrest 14 (AT2G15890.1). Grau de Confiança Média (0.400). São
mostradas apenas as 10 interações com melhores score. Linha contínua azul com espessura
grossa representa forte interação. Linha contínua azul com espessura fina representa fraca
interação.
Enquanto que a interação que continha 71% de identidade mostrava
homologia ao membro da superfamília Auxin_repressed, a proteína associada
à dormência/auxina (AT2G33830) que interagiu com outras duas proteínas
associadas à dormência (DYL1 e AT1G56220), duas proteínas não
identificadas ou desconhecidas (AT3G15450 e AT3G15630), uma proteína
contendo o domínio CBS (AT5G10860), um fator de transcrição contendo o
domínio AP2 (AT5G61590), uma proteína de choque térmico (J8), uma
proteína de ligação ao zinco (AT3G47160), uma proteína envolvida na síntese
50
da tiorredoxina (WCRKC THIOREDOXIN 1 - WCRKC1) e uma proteína MEE14
(maternal effect embryo arrest 14) (Figura 12).
Figura 12 - Rede de interação proteica da ARP com 71% de identidade em Arabidopsis
thaliana. AT2G33830: dormancy/auxin associated family protein (Acesso: AT2G33830.2, esfera
vermelha). DYL1: DORMANCY-ASSOCIATED PROTEIN-LIKE 1 (AT1G28330.2). AT1G56220:
dormancy/auxin associated family protein (AT1G56220.3). AT3G15450: unknown protein
(AT3G15450.1). AT3G15630: unknown protein (AT3G15630.1). AT5G10860: CBS domain
containing membrane protein (AT5G10860.1). AT5G61590: AP2 domain-containing
transcription factor family protein (AT5G61590.1). J8: heat shock protein binding/unfolded
protein binding (AT1G80920.1). WCRKC1: WCRKC THIOREDOXIN 1 (AT5G06690.2). MEE14:
maternal effect embryo arrest 14 (AT2G15890.1). Grau de Confiança Média (0.400). São
mostradas apenas as 10 interações com melhores score. Linha contínua azul com espessura
grossa representa forte interação. Linha contínua azul com espessura fina representa fraca
interação.
Outra interação proposta, com identidade de 47%, sugeriu a proteína
associada à dormência/auxina (AT5G44300) interagindo com duas proteínas
não identificadas ou desconhecidas (AT3G28820 e AT3G01250), uma
acetiltransferase (3-KETOACYL-COA SYNTHASE 21 - KCS21), proteína de
ligação a lipídeos (GLYCINE-RICH PROTEIN 20 - GRP20), uma proteína
quinase dependente de calmodulina (CPK24), uma proteína de ligação ao
cálcio (ARABIDOPSIS POLLEN CALCIUM-BINDING PROTEIN 1 - APC1), uma
51
proteína de ligação ao cobre (SKU5 Similar 11 - sks11), um fator de transcrição
(AT1G72570), uma ATPase (Arabidopsis H(+)-ATPase 6 - AHA6) e uma
proteína UNE15 (unfertilized embryo sac 15) (Figura 13).
Figura 13 - Rede de interação proteica da ARP com 47% de identidade em Arabidopsis
thaliana. AT5G44300: dormancy/auxin associated family protein (Acesso: AT5G44300.1,
esfera vermelha). AT3G28820: unknown protein (AT3G28820.1). AT3G01250: unknown protein
(AT3G01250.1). KCS21: 3-KETOACYL-COA SYNTHASE 21 (AT5G49070.1). GRP20:
GLYCINE-RICH PROTEIN 20 (AT5G07560.1). CPK24: ATP binding/calcium ion binding/
calmodulin-dependent protein kinase (AT2G31500.1). APC1: ARABIDOPSIS POLLEN
CALCIUM-BINDING PROTEIN 1 (AT5G17480.1). sks11: SKU5 Similar 11 (AT3G13390.1).
AT1G72570: DNA binding / transcription factor (AT1G72570.1). AHA6: Arabidopsis H(+)-
ATPase 6 (AT2G07560.1). UNE15: unfertilized embryo sac 15 (AT4G13560.1). Grau de
Confiança Média (0.400). São mostradas apenas as 10 interações com melhores score. Linha
contínua azul com espessura grossa representa forte interação. Linha contínua azul com
espessura fina representa fraca interação.
Apenas uma rede de interação para O. sativa com identidade de 71% foi
encontrada para a ARP em estudo. Entretanto, foi selecionado o interatoma
sugerido para o arroz (O. sativa), pois representou a interação da proteína ARP
ao contrário da proteína associada à dormência visualizada nas interações
52
preditas em A. thaliana, apesar de a ARP estar envolvida também na
dormência da planta. Além disso, a ARP homóloga em O. sativa poderia
interagir com proteínas que a princípio poderiam estar envolvidas em múltiplas
vias que controlam o desenvolvimento vegetal (Figura 14), as quais poderiam
levar aos fenótipos observados nas plantas transgênicas contendo as
construções do cDNA homólogo a ARP nas orientações senso e antissenso em
tomateiro que serão descritas mais adiante.
Assim, no interatoma proposto, a proteína ARP em Oryza sativa (Figura
14, esfera vermelha) possui uma forte interação com outra ARP, proteína de
membrana contendo o domínio CBS, dois fatores de transcrição da família TCP
(TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR),
proteína regulada pela luz (LIR1), proteína específica do caule (TSJT1),
proteína contendo o domínio ACT (Figura 14, linha contínua azul com
espessura grossa) e uma fraca interação com três proteínas envolvidas na
ativação da ubiquitina, as enzimas ativadoras de ubiquitina (E1) (Figura 14,
linha contínua azul com espessura fina).
53
Figura 14 - Rede de interação proteica da ARP em Oryza sativa. ARP: Auxin-repressed
protein (Acesso: LOC_Os11g44810.1, esfera vermelha e LOC_Os03g22270.1, verde claro).
TSJT1: stem-specific protein (LOC_Os04g58280.1). CBS: CBS domain containing membrane
protein (LOC_Os03g52690.1), ACT: ACT domain containing protein (LOC_Os05g02220.1).
LIR1: light-induced protein 1-like (LOC_Os01g01340.1). TCP: TCP family transcription factor
(LOC_Os09g24480.1, verde e LOC_Os03g49880.1, azul). E1: ubiquitin-activating enzyme
(LOC_Os12g01520.1, azul; LOC_Os11g01510.2, roxo, LOC_Os07g49230.1, rosa). Grau de
Confiança Média (0.400). São mostradas apenas as 10 interações com melhores score. Linha
contínua azul com espessura grossa representa forte interação. Linha contínua azul com
espessura fina representa fraca interação.
Além disso, foi encontrado em Solanum lycopersicum, através do
programa STRING 10, que a ARP poderia interagir apenas com um membro da
família de fatores de transcrição denominada TCP (TB1 CYCLOIDEA PCF), o
BRANCHED1A (BRC1A) (Figura 15).
54
Figura 15 - Interação proteica da ARP com BRC1A em Solanum lycopersicum. Auxin-
repressed protein (ARP) (Acesso: Solyc02g077880.2.1) e BRANCHED1A (BRC1A)
(Solyc03g119770.2.1). Grau de Confiança Média (0.400). e-value: 1e-32.
4.2 Análise fenotípica das plantas contendo o cDNA homólogo à ARP em
tomateiro
A metodologia de produção de plantas transgênicas permite a análise
fenotípica da provável função do gene em questão. Por essa razão, foram
construídos cassetes de superexpressão do cDNA homólogo a ARP em
orientação senso que permitiu observar o fenótipo da cultivar (cv.) Micro-Tom
superexpressando o gene alvo. Enquanto que o cassete em orientação
antissenso proporcionou observar o fenótipo de plantas com a redução dos
transcritos de RNAm endógeno do gene ARP em tomateiro. Além disso, as
plantas cv. MT contendo o plasmídeo binário pZP11 sem o inserto (MT Vazio)
foram utilizadas como controle. Assim, com estas duas construções, foi
possível caracterizar o gene alvo por meio de análises fenotípicas e
moleculares.
As características como a altura da planta, as distâncias do ápice
meristemático à folha proximal e dos entrenós entre a folha proximal e a folha
seguinte, o desenvolvimento das gemas laterais, o número de folhas
produzidas, o início da antese, o número de flores formadas, assim como a
existência de partenocarpia, massa, altura e diâmetro do fruto, presença de
lóculos e a quantidade de frutos e sementes foram avaliados nas gerações T1
a T4.
Entretanto, somente algumas dessas características fenotípicas
analisadas foram mais expressivas ou estatisticamente significantes em plantas
transgênicas (35S::SlARP antissenso e senso) de uma geração do que em
outras gerações, porém nem sempre persistiram ao longo das gerações como,
por exemplo, as plantas 35S::SlARP antissenso das gerações T1, T3 e T4
apresentaram gemas laterais desenvolvidas que formaram hastes com folhas e
alguns com ramos florais e, consequentemente, frutos, o que poderia ter
55
ocasionado uma aparente arquitetura simpodial modificada com o padrão de
crescimento desordenado. Enquanto na geração T2, esta característica não foi
evidenciada nas plantas 35S::SlARP antissenso e senso em relação as
controles. Além de outras características avaliadas que estão sumarizadas na
Tabela 4.
Tabela 4 - Características fenotípicas evidentes observadas nas plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso e senso) nas gerações T1 a T4 em relação às plantas controles (cv. MT e MT Vazio).
Geração Características
T1 Floração Precoce
Frutificação Precoce
Desenvolvimento de gemas axilares
Distância entre o ápice meristemático e a folha proximal
T2 Frutificação precoce
Total de flores
T3 Floração precoce
Altura da planta
Desenvolvimento de gemas axilares
Total de folhas compostas
Total de frutos partenocárpicos
T4 Desenvolvimento de gemas axilares
Total de folhas compostas
Na geração inicial (T0), as plantas transgênicas contendo os cassetes de
superexpressão do cDNA homólogo a ARP (35S::SlARP) nas orientações
senso e antissenso não mostraram fenótipos distinguíveis quando foram
comparadas com as plantas controles (cv. MT e MT Vazio). Entretanto, as
gerações subsequentes (T1 a T4) apresentaram diferenças fenotípicas em
relação às plantas controles (não transformada e com o vetor binário sem o
inserto).
De modo geral, as plantas 35S::SlARP antissenso das gerações T1 e T3
apresentaram evidente floração precoce quando comparadas as plantas
35S::SlARP senso e as controles: cv. MT e MT Vazio (Tabela 5). Na geração
T1, as flores das três linhagens de plantas 35S::SlARP antissenso surgiram 66-
68 dias após o plantio, as flores das três linhagens de plantas 35S::SlARP
senso emergiram 4-5 dias após as plantas transgênicas na orientação
antissenso e as controles produziram flores 80 dias após o plantio. Enquanto
56
que na geração T3, quatro linhagens de plantas 35S::SlARP antissenso
emergiram 56-58 dias após o plantio, as duas linhagens de 35S::SlARP senso
e uma linhagem de MT Vazio produziram flores 60-62 dias após o plantio e as
flores da controle cv. MT surgiram após 61-64 dias após o plantio (Tabela 5).
Tabela 5 – Surgimento das flores, em dias após o plantio, das plantas controles e das transgênicas nas gerações T1 e T3.
Geração cv. MT MT Vazio 35S::SlARP senso
35S::SlARP antissenso
T1
80
80
70-72
66-68
T3
61-64
60-62
60-62
56-58
Além disso, a maioria das plantas 35S::SlARP antissenso da geração T1
já apresentava frutos, assim como uma pequena parcela de plantas
35S::SlARP senso, enquanto as plantas controles estavam no início da floração
no mesmo período do desenvolvimento (104 dias após o plantio) (Figura 16).
Figura 16 – Desenvolvimento dos frutos precocemente nas plantas das linhagens senso e antissenso na geração T1. Visão geral das plantas, mostrando a frutificação precoce e a
diferença de tamanho entre as plantas controles (cv. MT e MT Vazio) e as transgênicas (35S::SlARP senso e antissenso) 104 dias após o plantio, respectivamente (da esquerda para a direita). Barra = 1 cm.
No mais, as plantas 35S::SlARP antissenso da geração T1 aparentaram
uma arquitetura com padrão simpodial alterado, incluindo o desenvolvimento
de gemas laterais que resultaram na produção de folhas (Figura 17C, seta
vermelha), enquanto que as plantas controles e 35S::SlARP senso, em sua
maioria, não apresentaram gemas axilares em desenvolvimento e seguiram o
cv. MT Vazio Senso AS
57
crescimento simpodial padrão (Figura 17D, seta vermelha), semelhante às
plantas controles (Figura 17A e B).
Figura 17 - Características morfológicas das plantas controles e transgênicas na geração T1. A, controle cv. MT mostrando os detalhes da planta, com botões florais prosperando (seta
azul) e gemas axilares dormentes (seta vermelha). Em B, MT Vazio (com o vetor binário pZP211) apresentando gemas axilares dormentes (seta vermelha); C, detalhes das plantas 35S::SlARP antissenso com o desenvolvimento das gemas axilares que ocasionaram no surgimento de folhas (seta vermelha); D, observam-se os detalhes das plantas 35S::SlARP senso como uma distância entrenós supostamente longa e gemas axilares dormentes (seta vermelha), assemelhando-se as plantas controles. A-D, 96 dias após o plantio. Barra = 1 cm.
Outro aspecto avaliado foi a distância entre o ápice e a folha proximal na
geração T1 que se encontrava significativamente menor entre as plantas
35S::SlARP antissenso quando comparadas as plantas 35S::SlARP senso e as
plantas controles (cv. MT e MT Vazio) (Figura 18).
A B
C D
58
Figura 18 – Análise da distância entre o ápice e a folha proximal das plantas controles e
transgênicas na geração T1. O comprimento em centímetros entre o ápice e a folha proximal
das plantas cv. MT e linhagens transgênicas: Vazio; antissenso (AS - 35S::SlARP antissenso) e
senso (35S::SlARP senso), respectivamente. Número de plantas analisadas para a cv. MT, n=
19; MT Vazio, n=4; 35S::SlARP antissenso, n=5; e, 35S::SlARP senso, n=6. Número de
linhagens avaliadas para MT Vazio, n=1; 35S::SlARP antissenso, n=2; e, 35S::SlARP senso,
n=3. Médias seguidas de letras minúsculas iguais na barra não diferem estatisticamente entre
si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
As plantas da geração T1 produziram frutos e sementes (T2) que foram
semeadas para a análise fenotípica da geração seguinte. Assim, 10 plantas
das duas linhagens de 35S::SlARP senso e 8 plantas das três linhagens de
35S::SlARP antissenso foram confirmadas por PCR.
A geração de plantas T2 também apresentou diferenças fenotípicas em
relação às controles como o amadurecimento dos frutos precoces em plantas
35S::SlARP antissenso que produziram frutos maduros 136 dias após o plantio,
enquanto a maioria dos frutos das plantas 35S::SlARP senso e controle cv. MT
estavam em processo de amadurecimento (Figura 19). As plantas MT Vazio
não foram incluídas nesta análise, pois estas apresentaram um crescimento
tardio diferente do que vinha sendo normalmente obtido para esta construção.
59
Figura 19 - Amadurecimento precoce do fruto nas plantas da linhagem antissenso da geração T2. Visão geral das plantas, mostrando o fruto maduro e a diferença de tamanho entre
a planta controle (cv. MT) e as transgênicas (35S::SlARP senso e antissenso), respectivamente,136 dias após o plantio. Barra = 1 cm.
Ainda em relação à descendência T2, observou-se que o número de
flores foi superior nas plantas 35S::SlARP antissenso e senso em relação a
controle cv. MT (Figura 20).
Figura 20 – Número de flores das plantas controles e transgênicas na geração T2.
Número de flores produzidas nas plantas cv. MT e linhagens transgênicas: antissenso (AS -
35S::SlARP antissenso) e senso (35S::SlARP senso), respectivamente. Número de plantas
analisadas para a cv. MT, n= 4; 35S::SlARP antissenso, n=2; e, 35S::SlARP senso, n=2.
Número de linhagens avaliadas para MT Vazio, n=1; 35S::SlARP antissenso, n=1; e,
35S::SlARP senso, n=1. Médias seguidas de letras minúsculas iguais na barra não diferem
estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Para a geração T3, foi observado que alguns fenótipos foram
preservados em relação às gerações anteriores, incluindo a floração precoce
em quatro linhagens das plantas 35S::SlARP antissenso, que floresceram 56-
cv. MT Senso AS
60
58 dias após o plantio, enquanto que as controles (cv. MT e Vazio) e as duas
linhagens de 35S::SlARP senso permaneceram, em sua maioria, no estágio de
botões florais (Figura 21).
Figura 21 - Floração precoce da linhagem antissenso na geração T3. Visão geral das
plantas, mostrando a produção de flores nas plantas 35S::SlARP antissenso, enquanto que as
plantas controles (cv. MT e MT Vazio) e a linhagem 35S::SlARP senso apresentavam botões
florais, 56 dias após o plantio. Barra = 1 cm.
Em relação à altura das plantas 35S::SlARP antissenso e senso da
geração T3, foi observada redução no comprimento quando comparada às
plantas controles (cv. MT e MT Vazio), as quais não diferiram entre si (Figura
22).
Figura 22 - Análise da altura nas plantas controles e transgênicas da geração T3.
Comprimento em centímetros da altura das plantas cv. MT e linhagens transgênicas: Vazio;
antissenso (AS - 35S::SlARP antissenso) e senso (35S::SlARP senso), respectivamente.
Número de plantas analisadas para a cv. MT, n= 11; MT Vazio, n=4; 35S::SlARP antissenso,
n=5; e, 35S::SlARP senso, n=3. Número de linhagens avaliadas para MT Vazio, n=1;
35S::SlARP antissenso, n=5; e, 35S::SlARP senso, n=2. Médias seguidas de letras minúsculas
iguais na barra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
cv. MT Vazio AS Senso
61
Nesta geração T3, ainda foi observado que as plantas 35S::SlARP
antissenso e MT Vazio apresentaram maior número de gemas axilares
desenvolvidas quando comparado a cv. MT e 35S::SlARP senso (Figura 23A),
o que pode ter acarretado na formação de hastes com produção de folhas,
visto que o número de folhas compostas foi significativamente superior nas
plantas 35S::SlARP antissenso, 35S::SlARP senso e MT Vazio do que nas
plantas cv. MT (Figura 23B).
Figura 23 - Número de gemas axilares desenvolvidas e folhas compostas nas plantas
controles e transgênicas da geração T3. A, número de gemas laterais desenvolvidas e B,
número de folhas compostas produzidas nas plantas cv. MT e linhagens transgênicas: Vazio;
antissenso (AS - 35S::SlARP antissenso) e senso (35S::SlARP senso), respectivamente. A:
Número de plantas analisadas para a cv. MT, n= 8; MT Vazio, n=4; 35S::SlARP antissenso,
n=5; e, 35S::SlARP senso, n=3. Número de linhagens avaliadas para MT Vazio, n=1;
35S::SlARP antissenso, n=4; e, 35S::SlARP senso, n=2. B: cv. MT, n= 15; MT Vazio, n=4;
35S::SlARP antissenso, n=5; e, 35S::SlARP senso, n=3. Número de linhagens avaliadas para
MT Vazio, n=1; 35S::SlARP antissenso, n=3; e, 35S::SlARP senso, n=2. Médias seguidas de
letras minúsculas iguais na barra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a
5% de probabilidade.
Além disso, a maioria das plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso,
35S::SlARP senso e MT Vazio) mostrou o desenvolvimento de gemas axilares
com formação de longas hastes com produção de folhas que se assemelhavam
às folhas principais em tamanho e forma e, também, a produção de
inflorescências que culminaram, consequentemente, na produção de frutos.
Enquanto que algumas gemas desenvolvidas nas plantas cv. MT produziram
apenas primórdios foliares, ao invés de ramos com folhas compostas (Figura
24A a D - setas vermelhas).
A B
62
Ainda em relação ao desenvolvimento de gemas axilares, notou-se que
as inflorescências produzidas nestas hastes encontravam-se nas axilas das
folhas mais distais, ou seja, mais antigas, ao invés de folhas jovens como
ocorre no crescimento simpodial padrão, e dessa forma, quatro linhagens das
plantas 35S::SlARP antissenso, duas linhagens de 35S::SlARP senso e uma
linhagem de MT Vazio apresentaram um aparente crescimento simpodial
alterado ou desordenado.
Figura 24 - Características morfológicas das plantas cv. MT e das transgênicas na
geração T3. A, cv. MT mostrando os detalhes da planta, com gemas axilares dormentes (seta
vermelha). B-D, detalhes das plantas transgênicas com o desenvolvimento das gemas axilares
que ocasionaram, provavelmente, no surgimento de hastes com folhas (seta vermelha). B, MT
Vazio (com o vetor binário pZP211). C, 35S::SlARP antissenso e D, 35S::SlARP senso. A-D, 81
dias após o plantio. Barra = 1 cm.
Diante do aumento no número de folhas compostas nas plantas
transgênicas, os frutos das plantas 35S::SlARP antissenso, 35S::SlARP senso
e controles (cv. MT e MT Vazio) foram avaliados a fim de averiguar se a
produtividade seria afetada, uma vez que o crescimento da planta e
especialmente os frutos dependem da relação fonte-dreno, na qual as folhas
são fontes de fotoassimilados e os frutos são os principais drenos.
A B
C
D
63
Portanto, ainda em relação à geração T3, foi visto que a massa, altura e
diâmetro mediano dos frutos das plantas 35S::SlARP antissenso e 35S::SlARP
senso não foram afetados em relação aos controles (cv. MT e MT Vazio)
durante o período de análise. Assim como o número e o formato dos frutos das
plantas 35S::SlARP antissenso, 35S::SlARP senso em comparação as plantas
MT Vazio e cv. MT (Figura 25).
Figura 25 – Análise do formato dos frutos das plantas controles e transgênicas da
geração T3. Fotografia mostrando o formato dos frutos nas plantas cv. MT; MT Vazio;
35S::SlARP antissenso e 35S::SlARP senso, respectivamente. Número de linhagens
analisadas para MT Vazio, n=1; MT 35S::ARP/AS, n=5; e, MT 35S::ARP/S, n=2. Barra = 1 cm.
Visto que o formato externo dos frutos não foi alterado nas plantas
35S::SlARP antissenso e 35S::SlARP senso, surgiu a necessidade de
examinar se o número de lóculos e de sementes estariam comprometidos
internamente nos frutos destas plantas. Assim, foi observado que o número
total de sementes não foi afetado nas plantas transgênicas (35S::SlARP
antissenso e senso) e controles (cv MT e MT Vazio) da geração T3 durante o
período de avaliação, ou seja, não houve, estatisticamente, diferença
significativa entre essas plantas, sugerindo que a ARP pode não afetar a
produtividade do fruto.
Entretanto, foi visualizado que as plantas 35S::SlARP senso possuíram
maior número de frutos partenocárpicos, isto é, frutos sem sementes do que os
frutos das plantas controles e das plantas 35S::SlARP antissenso (Figura 26),
sugerindo que a superexpressão de ARP pode interferir no desenvolvimento
das sementes.
64
Figura 26 - Número de frutos com partenocarpia nas plantas controles e transgênicas da
geração T3. A, número de frutos com partenocarpia nas plantas cv.MT e linhagens
transgênicas: Vazio; antissenso (AS - 35S::SlARP antissenso) e senso (35S::SlARP senso),
respectivamente. Número de plantas analisadas para a cv. MT, n= 10; MT Vazio, n=3;
35S::SlARP antissenso, n=4; e, 35S::SlARP senso, n=2. Número de linhagens avaliadas para
MT Vazio, n=1; 35S::SlARP antissenso, n=3; e, 35S::SlARP senso, n=1. Médias seguidas de
letras minúsculas iguais na barra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a
5% de probabilidade.
Quando foi realizada a análise fenotípica das plantas da geração T4,
visualizou-se uma diferença fenotípica similar àquelas encontradas na geração
T3 com relação ao número de gemas laterais desenvolvidas e ao número de
folhas compostas formadas nas plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso e
senso) (Figura 27). Estes resultados mostraram que estas características estão
sendo mantidas nas diferentes gerações de T1 a T4, sugerindo que a ARP
pode estar envolvida na dormência das gemas axilares.
Como foi observado um número superior de plantas crescidas nas duas
linhagens 35S::SlARP antissenso semeadas, na qual tinham-se seis plantas da
linhagem 1 e oito plantas da linhagem 2, totalizando quatorze plantas
35S::SlARP antissenso, enquanto apenas uma planta 35S::SlARP senso
desenvolveu-se, quatro plantas MT Vazio e oito plantas cv. MT cresceram.
Diferentemente, as gerações anteriores apresentaram número inferior de
plantas por linhagens, algumas continham apenas um indivíduo, o que não
permitiu gerar um gráfico estatístico. Por essa razão, as linhagens das plantas
35S::SlARP antissenso foram englobadas nas avaliações das gerações T1 a
T3 e separadas na geração T4 para as análises do desenvolvimento de gemas
axilares e número de folhas compostas.
65
Portanto, das duas linhagens de plantas 35S::SlARP antissenso
semeadas, tanto a linhagem 1, denominada AS1 quanto a linhagem 2 (AS2) da
geração T4 apresentaram número superior de gemas laterais desenvolvidas do
que a planta 35S::SlARP senso e as controles (cv. MT e MT Vazio) (Figura
27A).
Além disso, as plantas 35S::SlARP antissenso da linhagem 1 e 2 (AS1 e
AS2) da geração T4 apresentaram o número de folhas compostas elevado,
significativamente, do que a planta 35S::SlARP senso e as plantas controles
(cv. MT e MT Vazio) (Figura 27B).
Figura 27 - Número de gemas laterais desenvolvidas e folhas compostas nas plantas
controles e transgênicas da geração T4. A, Número de gemas axilares desenvolvidas nas
plantas cv. MT, MT Vazio, linhagens 35S::SlARP antissenso (AS1 e AS2) e Senso (35S::SlARP
senso). B, Número de folhas produzidas nas plantas cv. MT, Vazio, linhagens 35S::SlARP
antissenso (AS1 e AS2) e Senso (35S::SlARP senso). A: Número de plantas analisadas para a
cv. MT, n= 5; MT Vazio, n= 4; linhagem 1 da 35S::SlARP antissenso (AS1), n=4; linhagem 2 da
35S::SlARP antissenso (AS2), n=6; e, Senso, n=1. B: cv. MT, n= 7; MT Vazio, n=4; AS1, n=4;
AS2, n=6; e, Senso, n=1. A e B: Número de linhagens avaliadas para MT Vazio, n=1;
35S::SlARP antissenso, n=2; e, 35S::SlARP senso, n=1. Médias seguidas de letras minúsculas
iguais na barra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey, 5% de probabilidade.
As gemas axilares das plantas 35S::SlARP antissenso desenvolveram-
se em ramos com folhas (Figura 28C, seta vermelha), enquanto que a maioria
das gemas das plantas controles (cv. MT e MT Vazio) e da planta 35S::SlARP
senso encontravam-se dormentes (Figura 28A, B e D, respectivamente – seta
vermelha) e apenas algumas gemas laterais se desenvolveram em primórdios
foliares (Figura 28A, B e D, respectivamente – seta amarela).
A B
66
Figura 28 - Desenvolvimento das gemas laterais nas plantas cv. MT e nas transgênicas da geração T4. A, cv. MT mostrando os detalhes da planta, com gemas axilares dormentes
(seta vermelha) e o surgimento de primórdios foliares em uma das gemas laterais (seta amarela). B, MT Vazio (com o vetor binário pZP211) com gemas dormentes (seta vermelha) e observou-se o surgimento de primórdios foliares (seta amarela) em uma gema lateral. C, 35S::SlARP antissenso (linhagem 1), a maioria das gemas axilares desenvolveram-se em ramos com folhas (seta vermelha). D, 35S::SlARP senso com gemas dormentes e notou-se o surgimento de primórdios foliares (seta amarela) na gema axilar. A-D, 88 dias após o plantio. Barra = 1 cm.
4.3 Análise histológica das flores e dos pecíolos das plantas 35S::SlARP
antissenso e senso
Com base nas alterações fenotípicas observadas nas gerações T1 a T4,
pode-se notar que a característica floração precoce persistiu nas plantas
35S::SlARP antissenso ao longo das gerações, sendo que as plantas
35S::SlARP senso também floresceram antes das plantas controles (cv. MT e
MT Vazio) visualizadas, com mais evidência, na geração T1 e T3 (Tabela 5).
Então, em decorrência a esse florescimento inicial, questionou-se se os órgãos
florais estariam comprometidos devido aos níveis diminutos ou elevados da
proteína ARP nas plantas 35S::SlARP antissenso e senso, respectivamente.
A
B
C
D
67
Portanto, a fim de investigar possíveis alterações estruturais nos órgãos
reprodutivos das plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso e senso) em
comparação com as controles (cv. MT e MT Vazio) foi realizada uma análise
histológica com seções longitudinais das flores em antese destas plantas nas
gerações T2, T3 e T4. Os órgãos florais, assim como o pecíolo (ver mais
adiante) das plantas da geração T1 não foram analisados por não possuírem
características fenotípicas estáveis e pela forte pressão do processo de
heterozigose sofridas pelas plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso,
35S::SlARP senso e MT Vazio). Por essa razão, as análises morfológicas das
flores partiram da geração T2 (Figura 29) até a geração T4 (mais estáveis)
(Figura 30).
Dessa forma, foi observado em corte histológico que o ovário da flor da
planta 35S::SlARP senso da geração T2 apresentou óvulos maduros em
relação a cv. MT (Figura 29B, seta em negrito), os quais estavam ausentes no
mesmo período de tempo (120 dias após o plantio) (Figura 29A).
Figura 29 - Seções longitudinais do ovário das flores da geração T2. A, cv. Micro Tom e B,
35S::SlARP senso (geração T2), coradas em safranina 1%. Seta em negrito: óvulo maduro.
Aumento 5x. Barra= 200 m. 120 dias após o plantio.
Ainda em relação à análise da estrutura do ovário, as gerações T3 e T4
também mostraram amadurecimento dos óvulos nas flores das plantas
35S::SlARP antissenso e senso em comparação a cv. MT e a planta MT Vazio
praticamente no mesmo período de tempo (89-91 dias após o plantio) (Figura
30, setas em negrito), o que poderia refletir numa frutificação precoce
observada fenotipicamente nas plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso e
senso), principalmente, das gerações T1 e T2. No entanto, o ovário da
A B
68
35S::SlARP senso aparentou possuir menor quantidade de óvulos formados do
que as demais plantas (Figura 30), indicando que a ARP pode estar envolvida
no processo de floração em tomateiro.
Além disso, as plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso e senso)
da geração T3 aparentaram ter maior quantidade de substâncias ergásticas
(presença de produtos do metabolismo primário ou secundário), provavelmente
drusas, no ovário em relação às plantas controles (Figura 30 A, C e D, seta em
cor amarela).
Figura 30 - Seções longitudinais do ovário das flores na geração T3 e T4. A, cv. Micro
Tom; B, MT Vazio; C, 35S::SlARP senso; D e E, 35S::SlARP antissenso, geração T3 e T4,
respectivamente. A, B, C e D com 91 dias após o plantio e E, 89 dias após o plantio. Safranina
1%. Seta em negrito: óvulo maduro. Seta em amarelo: substância ergástica. Aumento 10x.
Barra= 100 m.
Outra análise histológica foi efetuada no pecíolo das plantas 35S::SlARP
antissenso e senso da geração T2 devido ao fato de que o hormônio auxina
está envolvido no desenvolvimento vascular das folhas e que a ARP, de certo
modo, possui uma função regulatória com a auxina. Assim, com o intuito de
averiguar se os níveis reduzidos ou elevados da ARP ocasionariam alterações
morfológicas no perfil vascular das plantas 35S::SlARP antissenso e senso,
respectivamente, e se essas possíveis alterações apresentariam semelhanças
na composição estrutural dos pecíolos dos mutantes envolvidos na sinalização
A B C
D E
69
da auxina (dgt e entire), os pecíolos das plantas 35S::SlARP antissenso e
senso foram comparados com os pecíolos dos mutantes dgt e entire e com o
controle cv. MT (Figura 31).
O pecíolo da planta 35S::SlARP antissenso da geração T2 apresentou
uma estrutura diferenciada da planta controle cv. MT, com o pecíolo em forma
cordada, presença de produtos do metabolismo primário ou secundário
(substâncias ergásticas), aparentemente drusas, aparente quantidade superior
de elementos de vaso (xilema e floema), aparente número maior de células
colenquimáticas na região superior do pecíolo e células do parênquima com
formato mais irregular (Figura 31A e B). Em relação à região do pecíolo
seccionada da planta 35S::SlARP senso, esta caracterizou-se pelo pecíolo com
formato arredondado e células parenquimáticas regulares, estrutura essa
semelhante a planta cv. MT (Figura 31A e C). Entretanto, comparando-se estes
dois pecíolos, 35S::SlARP senso aparentou possuir uma presença maior de
células correspondentes aos elementos de vaso (xilema e floema) do que a cv.
MT (Figura 31C).
O pecíolo das plantas 35S::SlARP antissenso e senso também foram
comparados com os mutantes envolvidos na sinalização da auxina: o mutante
dgt que apresenta reduzida sensibilidade a auxina e, o mutante entire que
mostra um aumento na resposta à auxina. Estes apresentaram o pecíolo com
formato oval diferente para o observado em 35S::SlARP antissenso e senso; os
elementos de vasos condutores estavam subdivididos em três grupos que
encontravam-se separados por camadas celulares do parênquima. Entretanto,
o mutante dgt aparentou contem maior número de camadas celulares no
parênquima, enquanto que o mutante entire aparentou conter células
parenquimáticas maiores ao longo do pecíolo (Figura 31A, D a E). A partir
destes dados obtidos, indicou-se que os níveis alterados da ARP não
causaram mudanças drásticas no desenvolvimento vascular dos pecíolos das
plantas 35S::SlARP antissenso e senso na geração T2.
70
Figura 31 - Seções transversais do pecíolo das plantas transgênicas da geração T2 e
mutantes envolvidos na sinalização da auxina. A, cv. Micro Tom e B, 35S::SlARP
antissenso, C, 35S::SlARP senso; D, mutante dgt e E, entire. A, B e C: 120 dias após o plantio.
D e E: 57 dias após o plantio. Azul de toluidina 0,05%. Aumento 5x. Barra= 200 m.
Todos os dados mencionados anteriormente, até o momento, sugerem
que a proteína ARP pode estar envolvida nos processos de floração e
frutificação, assim como na dormência das gemas axilares em tomateiro e,
desta forma, sua função pode estar conservada entre o reino vegetal.
A B C
D E
71
5 DISCUSSÃO
O cDNA homólogo a AUXIN REPRESSED PROTEIN (ARP), alvo deste
estudo, foi identificado anteriormente em uma biblioteca subtrativa de tomateiro
(ESTEVAM, 2011). Assim, a análise in silico mostra que a sequência
nucleotídica da ARP de estudo codifica um pequeno polipeptídeo com massa
molecular deduzida em 12,67 kDa que está compatível com as massas
moleculares de outras ARPs encontradas na literatura, incluindo a SAR5 (12,5
kDa), AP1 (13 kDa), BrARP1 (11,7 kDa) e ARP1 (13,5 kDa) (REDDY;
POOVAIAH, 1990; LEE et al., 1993; LEE et al., 2013 e ZHAO et al., 2014;
respectivamente). Além disso, todas as proteínas pesquisadas apresentaram o
domínio funcional Auxin_repressed superfamily contendo dois domínios
conservados, um na região N-terminal (Domínio 1) que possui o motivo WD de
interação proteína-proteína e o segundo na região C-terminal (Domínio 2) de
acordo com KIM et al. (2007), SHI et al. (2013) e LEE et al. (2013).
Os dados in silico também mostram que a sequência peptídica sinal
predita da ARP em estudo direciona para regiões transmembrana e localiza-se,
possivelmente, no núcleo. De fato, está de acordo, em parte, com o proposto
por Reddy e Poovaiah (1990), os quais sugerem que a proteína deduzida não é
transportada para o exterior da célula ou para o cloroplasto. Além disso, a
proteína BrARP1 não contém uma sequência peptídica sinal ou um
direcionamento para organelas, indicando que esta pode se localizar no citosol
(LEE et al., 2013). Entretanto, a exata localização celular da proteína ARP in
vivo ainda não está determinada na literatura.
O dendrograma mostra que a maioria dos ramos está agrupada por
família botânica, apenas com o clado das Rosídeas alternando entre Malvidae
e Faboidae, assim como os dendrogramas similares encontrados para os
homólogos da ARP (PARK; HAN, 2003; ZHAO et al., 2014). Dessa maneira,
isto indica que a ARP pode exibir um relacionamento funcional entre as
espécies vegetais, uma vez que sua identidade variou entre 62% a 89% com
as espécies estudadas. Diante disso, esses resultados reforçam a ideia de que
a função da ARP esteja preservada entre plantas e estreitamente conservada
entre tomateiros.
72
Conforme descrito na literatura, os homólogos da proteína ARP estão
associados a diferentes funções no desenvolvimento vegetal (SHI et al., 2013).
Com base nisso, os dados obtidos com as plantas transgênicas abrigando a
construção do cassete de superexpressão (35S::SlARP) nas orientações senso
e antissenso trazem novas informações a respeito da função da ARP no
desenvolvimento do tomateiro.
De fato, as plantas da geração inicial (T0) não mostram diferenças
fenotípicas quando comparadas às plantas controles, corroborando os
resultados obtidos por Park e Han (2003) e Kim et al. (2007), nos quais se
observam que as plantas transgênicas com as construções dos homólogos da
ARP apresentam um fenótipo similar ao daquelas selvagens.
Quando as plantas 35S::SlARP antissenso e senso das gerações
seguintes (T1, T2, T3 e T4) são analisadas, mudanças fenotípicas são
observadas e mantidas na maioria destas gerações.
A altura das plantas 35S::SlARP antissenso é reduzida na geração T3,
devido à provável diminuição dos níveis da ARP esperada para estas plantas
que, dessa forma, podem ter provocado uma alteração no padrão do
desenvolvimento em tomateiro, como a redução do tamanho nestas plantas,
discordando com Zhao e colaboradores (2014), os quais verificaram que o
silenciamento do gene ARP1 em tabaco causa um aumento no crescimento do
vegetal, ou seja, estas possuem altura maior que à controle. Assim como o
silenciamento dos genes BrARP1 e BrDRM1 em A. thaliana não afetam a taxa
de crescimento nem o tamanho da planta na geração T2, isto é, as alturas são
similares ao controle (LEE et al., 2013). No entanto, a superexpressão tanto do
gene ARP1 como dos genes BrARP1 e BrDRM1 ocasionam diminuição no
crescimento vegetal, concordando com o visualizado nas plantas 35S::SlARP
senso da geração T3 (ZHAO et al., 2014; LEE et al., 2013, respectivamente).
Além do mais, Park e Han (2003) sugeriram que o gene RpARP necessita ser
reprimido para que o crescimento celular ocorra, provavelmente através do
afrouxamento celular, modificações estruturais na parede celular ou um
aumento na elasticidade do citoesqueleto. Estes dados propõem que esses
homólogos da ARP podem ser repressores do crescimento vegetativo.
Portanto, é possível que a ARP em tomateiro necessite ser reprimida
completamente para que o crescimento do vegetal seja favorável.
73
As plantas 35S::SlARP antissenso das gerações T1, T3 e T4
apresentam maior número de gemas axilares desenvolvidas que resultaram na
produção de ramos com folhas, inflorescências e frutos. O crescimento da
gema lateral é regulado principalmente pelos hormônios vegetais: auxina,
estrigolactonas e citocinina que exibem efeitos antagônicos sobre o
desenvolvimento da gema axilar (FERGUSON; BEVERIDGE, 2009).
A auxina derivada do ápice caulinar inibe o crescimento de gemas
axilares e o alongamento do ramo lateral (DOMAGALSKA; LEYSER, 2011;
REDDY; FINLAYSON, 2014). As citocininas podem promover o crescimento
das gemas axilares e seus níveis próximos à ou na gema axilar podem estar
relacionados ao destino do desenvolvimento dessa gema, se permanecerá
dormente ou produzirá um ramo imediatamente ou após um intervalo de tempo
variável, dependendo de estímulos internos e externos à planta (BENNETT;
LEYSER, 2006; TANAKA et al., 2006). Além disso, os genes da via de
biossíntese da citocinina são regulados negativamente pela auxina no caule e,
desta forma, pode ter limitado a oferta de citocinina à gema, reduzindo o
crescimento desta (CHATFIELD et al., 2000; TANAKA et al., 2006), enquanto
que as estrigolactonas inibem o crescimento das gemas através da regulação
do transporte de auxina (BENNETT et al., 2006). A auxina, por sua vez, regula
positivamente a transcrição de genes envolvidos na biossíntese da
estrigolactona (TEICHMANN; MUHR, 2015). Portanto, os níveis de auxina
regulam o crescimento da gema através da manutenção local de altos níveis de
estrigolactona e baixos de citocinina. Assim, a gema axilar permanece
dormente. Entretanto, quando a gema é ativada em resposta a fatores
sistêmicos, a auxina proveniente do meristema axilar é exportada em direção
ao caule e durante este trajeto, a auxina induz o desenvolvimento vascular do
ramo (FERGUSON; BEVERIDGE, 2009).
As estrigolactonas e as citocininas podem interagir diretamente com o
membro de fatores de transcrição da família TCP (TB1 CYCLOIDEA PCF), o
BRC1 (BRANCHED1) no controle do desenvolvimento da gema lateral
(AGUILAR-MARTINEZ et al., 2007). Há a hipótese de que a estrigolactona
pode atuar a montante de BRC1, regulando-o positivamente (BRAUN et al.,
2012). Enquanto que a citoninina atua regulando-o negativamente (DUN et al.,
2012).
74
A proteína BRC1 reprime o desenvolvimento das gemas axilares em A.
thaliana (AGUILAR-MARTINEZ et al., 2007). Similar função ocorre em
tomateiro, no qual é encontrado dois genes parálogos ao BRC1 de A. thaliana,
o gene SlBRC1a e SlBRC1b (MARTIN-TRILLO et al., 2011). Estes genes são
expressos em gemas laterais dormentes e suas expressões foram reguladas
negativamente durante a remoção do ápice meristemático apical, sugerindo
que também estão envolvidos na inibição do crescimento da gema axilar
(MARTIN-TRILLO et al., 2011). Além disso, nos interatomas preditos para
Oryza sativa e S. lycopersicum, são vistos que a proteína ARP poderia interagir
com membros de fatores de transcrição da família TCP, sendo que a proteína
BRC1A, presumidamente, interage com a ARP em tomateiro. Esses fatores de
transcrição estão envolvidos no controle do crescimento e proliferação celular
nos meristemas axilares (MARTIN-TRILLO et al., 2011).
Mais ainda, Stafstrom et al. (1998) observaram que os níveis de
transcrito do ortólogo da ARP em ervilha, PsDRM1, são elevados em gemas
dormentes. Ao remover a gema dormente próxima ao ápice caulinar, os
transcritos da PsDRM1 não são detectados em gemas laterais em
desenvolvimento. Sugere-se, então, que a ARP está relacionada à dormência
da gema lateral (STAFSTROM et al., 1998).
Conforme observado, o desenvolvimento de gemas laterais em plantas
35S::SlARP antissenso nas gerações T1, T3 e T4, é possível que os níveis
reduzidos de ARP tenham ocasionado o crescimento da gema mesmo na
presença da dominância apical devido à redução do promotor da dormência
(ARP), a qual proporciona a ativação da ramificação, provavelmente através da
exportação de auxina para o caule, aumento na biossíntese de citocinina e
redução dos níveis de BRC1 na gema axilar.
Na análise histológica, são observadas modificações morfológicas no
pecíolo da planta 35S::SlARP antissenso (geração T2), que possuem forma
cordada e aparente quantidade superior de elementos de vasos. A formação do
tecido vascular da folha envolve a auxina (SCARPELLA et al., 2006).
Provavelmente, devido aos níveis reduzidos da proteína ARP nas plantas
35S::SlARP antissenso, a auxina exportada do meristema axilar para o caule
pode ter desencadeado a diferenciação do tecido vascular, porém ocasiona
uma resposta modificada no desenvolvimento do pecíolo, incluindo a aparente
75
quantidade superior de vasos condutores (xilema e floema), talvez para
transportar de forma eficaz os nutrientes necessários para o desenvolvimento
das longas hastes com folhas, flores e frutos, observadas com maior evidência,
nas plantas 35S::SlARP antissenso da geração T3. Diferentemente do
observado no pecíolo das plantas mutantes dgt, cujo gene está associado à
percepção e à sinalização da auxina (MIGNOLLI et al., 2012) e entire, que
aumenta a resposta à auxina (KOENIG et al., 2009). Ambos apresentam um
padrão de desenvolvimento vascular alterado, semelhante entre si (BALBI;
LOMAX, 2003; WANG et al., 2005).
No mais, o número total de folhas compostas é maior nas plantas
transgênicas (35S::SlARP antissenso, senso e MT Vazio) quando comparadas
às plantas controles cv. MT da geração T3, decorrente, possivelmente, de
maior número de gemas laterais desenvolvidas, sendo que a planta
35S::SlARP senso apresenta maior número de folhas em relação à cv. MT,
entrando em contradição com o exposto para seu homólogo BrARP1 ou
BrDRM1. Lee et al. (2013) verificaram que o número total de folhas é menor
nas plantas com altos níveis de expressão da proteína BrARP1 ou BrDRM1,
sugerindo que a superexpressão da ARP em Brassica rapa pode cessar o
crescimento celular. Em tomateiro, é provável que os níveis alterados da ARP
desencadeassem o desenvolvimento das gemas laterais, resultando no
crescimento programado de ramos ricamente vascularizados, providos de
nutrientes necessários para a produção de folhas, flores e frutos.
Baseado nesse aumento no crescimento de gemas axilares que
culminam na produção de ramos com folhas (fonte de fotoassimilados), a
produtividade nas plantas 35S::SlARP antissenso e senso foi analisada a fim
de verificar se os frutos (drenos) do tomateiro foram afetados na geração T3.
A produtividade do tomate depende também, em parte, do tamanho do
fruto que está relacionado ao número de sementes formadas, e por sua vez,
influencia na massa do fruto, porém é impulsionado principalmente pela
produção de dezenas de inflorescências multifloridas que resultam em cachos,
os quais se desenvolvem em conformidade com o hábito de crescimento
simpodial do tomateiro (BALBI; LOMAX, 2003; JIANG et al, 2013). Apesar das
plantas 35S::SlARP antissenso e senso da geração T3 apresentarem aparente
padrão de crescimento simpodial alterado, provavelmente, devido ao elevado
76
número de gemas desenvolvidas que resultam na formação de longas hastes
com folhas, flores e frutos, inclusive nas axilas das folhas mais antigas, ao
invés de folhas jovens como observado no crescimento padrão do tomateiro
(TEO et al., 2014), os parâmetros altura (cm), massa (g) e diâmetro (cm)
mediano do fruto não sofrem alterações significativas quando comparadas a cv.
MT. Assim como a quantidade total e o formato dos frutos são equivalentes às
plantas controles. Em relação ao número total de flores em antese, flores por
inflorescência e frutos também não são afetados pelos níveis alterados da
proteína ARP esperados nessas plantas (35S::SlARP antissenso e senso) da
geração T3 durante o período de análise, sugerindo que a ARP pode não
interferir na produtividade do tomate. No entanto, os frutos da 35S::SlARP
senso da geração T3 apresentam elevada quantidade de frutos desprovidos de
sementes (frutos partenocárpicos).
A partenocarpia é o desenvolvimento do ovário na ausência da
polinização e/ou fertilização, culminando em frutos sem sementes
(PANDOLFINI et al., 2002). Esse fenômeno pode ocorrer naturalmente ou pode
ser induzido artificialmente através da aplicação de diversos hormônios
(GORGUET et al., 2005). Sabe-se que a auxina, a citocinina e a giberelina
estão envolvidas na frutificação e desenvolvimento do fruto em tomateiro. A
superexpressão de genes da biossíntese da auxina ou a perda de função de
componentes na cascata de sinalização da auxina mostram capacidade
partenocárpica alterada (DING et al., 2013). Xiao e colaboradores (2008)
observaram que a superexpressão do gene SUN, envolvido no controle do
formato do fruto, leva ao desenvolvimento de frutos partenocárpicos, o que
pode ser causado por uma possível alteração dos níveis de auxina e sua
distribuição no fruto.
A hipótese sugerida para este trabalho é que os níveis de auxina podem
ter sido reduzidos no ovário das plantas 35S::SlARP senso em resposta à
diminuição da via de sinalização da auxina provocada pelos possíveis níveis
elevados da proteína ARP e isto pode ter desencadeado a produção de frutos
desprovidos de sementes. Portanto, os dados indicam que a superexpressão
da ARP pode afetar a produção de sementes e mais ainda, que a proteína ARP
pode estar envolvida no processo de frutificação em tomateiro e assim,
corroborando os resultados relativos ao homólogo da ARP em morangueiro,
77
SAR5, que está envolvido na maturação do fruto (REDDY; POOVAIAH, 1990).
Entretanto, será importante analisar os frutos das linhagens isogênicas das
construções da ARP em tomateiro para fortalecer essa hipótese.
A floração precoce é observada em evidência, principalmente, nas
plantas transgênicas 35S::SlARP antissenso das gerações T1 e T3, ou seja,
estas plantas florescem e, consequentemente, frutificam em menor período de
tempo do que as plantas 35S::SlARP senso e controles (MT Vazio e cv. MT) no
mesmo período de tempo.
Sabe-se que a auxina determina a iniciação dos órgãos florais com uma
resposta máxima de auxina [entre 10-6 e 10-5 M], correlacionada com a
iniciação do primórdio da flor e promove a divisão, extensão e diferenciação
celular dos tecidos vegetais (FRIML, 2003; REINHARDT et al., 2003). Ainda, Li
e colaboradores (2013) relataram a interação do gene da identidade floral
LEAFY (LFY) em A. thaliana com as vias de resposta à auxina na coordenação
do crescimento do meristema da inflorescência primordial. Há também o papel
das citocininas que estão associadas à funcionalidade do meristema apical
caulinar (MURRAY et al., 2012). Experimentos sugerem que as citocininas
estimulam o crescimento apical, que culminam na organogênese (YOSHIDA et
al., 2011). Portanto, é possível que os supostos níveis reduzidos da proteína
ARP nas plantas 35S::SlARP antissenso podem ter ocasionado indução das
vias de resposta à auxina, desencadeando um ambiente propício para o
desenvolvimento de órgãos florais precocemente através da ativação de genes
da identidade floral mediada pelo gradiente de auxina. Isto sugere que a
proteína ARP pode exercer um papel regulatório sobre a via de resposta à
auxina para iniciar a diferenciação dos órgãos reprodutivos mediado por esse
hormônio.
Para dar ênfase a essa hipótese, é mostrado in silico que a proteína
ARP pode interagir com três diferentes enzimas ativadoras de ubiquitina (E1)
no interatoma proposto, sugerindo que em plantas contendo níveis reduzidos
do transcrito ARP pode ocorrer diminuição de sua interação com a proteína E1,
liberando assim a enzima para atuar na via de sinalização Aux/IAA-ARF,
desencadeando a ubiquitinação das proteínas Aux/IAA e, consequentemente,
induz a transcrição de genes responsivos à auxina (GUILFOYLE, 2015). Sendo
assim, a ARP provavelmente pode executar um papel regulatório, talvez como
78
regulador negativo, na via de resposta à auxina no meristema apical caulinar
como mencionado acima para o desenvolvimento dos órgãos florais mediado
pela auxina.
Outra questão levantada sobre o surgimento antecipado das flores nas
plantas 35S::SlARP antissenso e senso em relação às plantas controles pode
ser melhor visualizada nas análises histológicas das flores em antese das 3
gerações (T2, T3 e T4), nas quais são observados óvulos maduros nas flores
das plantas 35S::SlARP antissenso e senso em relação às cv. MT e MT Vazio,
que ainda não apresentam amadurecimento dos óvulos no mesmo período de
tempo.
A auxina é requerida para a formação de óvulo e seu fluxo está
relacionado à localização polar das proteínas transportadoras do efluxo da
auxina, PIN-FORMED (PIN) (CECCATO et al., 2013). Além do mais, a
citocinina regula positivamente o número de óvulos, pois tem sido demonstrado
que este hormônio aumenta a expressão de proteínas PIN no óvulo
(BENCIVENGA et al., 2012). As plantas com defeitos na produção ou
percepção da citocinina comprometem a formação correta do óvulo e o número
de óvulos é bastante reduzido (HWANG et al., 2012). Estes dados corroboram
com o proposto acima para a floração precoce, na qual os níveis alterados da
proteína ARP nas plantas 35S::SlARP antissenso e senso podem proporcionar
a redistribuição da auxina e, provavelmente, sua concentração ótima nos
primórdios dos órgãos florais também induzem a formação de óvulos que
amadurecem mais cedo, do que aqueles encontrados nas flores das plantas
controles (cv. MT e MT Vazio), indicando que a ARP pode estar envolvida no
processo de floração, possivelmente, como repressor floral em tomateiro.
Além disso, Steiner et al. (2003) sugerem que o Arpl1;1 está
correlacionado à maturação do pólen em tabaco. Sabendo que a espécie
Nicotiana tabacum pertence à mesma família do tomateiro (Solanaceae), é
possível que esta outra função da ARP também esteja conservada na família
botânica Solanaceae, fortalecendo ainda mais a relação ARP e o
desenvolvimento dos órgãos florais em tomateiro.
No interatoma proposto, é encontrado duas ARPs que podem interagir
com a família de proteínas contendo o domínio ACT (aspartate kinase,
chorismate mutase e TyrA -prephenate dehydrogenase). Embora sua função
79
seja desconhecida, os níveis de transcritos apresentam-se elevados em flores
da A. thaliana (HSIEH; GOODMAN, 2002; KUDO et al., 2008). Outras proteínas
com funções desconhecidas podem interagir com a proteína ARP, incluindo as
proteínas de membrana contendo o domínio CBS (cystathionine--synthase)
que são expressas em diversos tecidos e sobre diferentes condições de
estresse em A. thaliana e arroz (KUSHWAHA et al., 2009), e a LIR1 (light-
induced protein 1-like) que é controlada pelo ciclo circadiano em arroz
(REIMMANN; DUDLER, 1993). Entretanto, sua provável função com a ARP
ainda necessita ser elucidada.
Com base nos dados obtidos são propostos dois esquemas hipotéticos
para o possível papel exercido pela ARP na gema lateral e no meristema floral
em tomateiro (Figura 32).
O primeiro esquema hipotético proposto diz respeito à provável função
da ARP na gema axilar em tomateiro. Nesse modelo, a auxina pode promover
a síntese das estrigolactonas e da proteína ARP, as quais estão envolvidas na
dormência da gema. A proteína ARP, por sua vez, pode exercer função
regulatória, talvez regulando positivamente a biossíntese das estrigolactonas e
negativamente a citocinina que também é reprimida pela auxina. A citocinina,
então, promove o desenvolvimento da gema. Entretanto, ARP, estrigolactona e
citocinina podem desempenhar efeitos antagônicos sobre o membro da família
de fatores de transcrição TCP, o BRC1, que promove a dormência da gema.
Este é reprimido pela citocinina e induzido pelas estrigolactona e,
possivelmente, também pela ARP (Figura 32A). Portanto, sugere-se que o
gene ARP pode estar envolvido na dormência das gemas axilares em plantas
de tomateiro, reforçando ainda mais a ideia central de Stafstrom et al. (1998).
O outro esquema indica o possível papel da ARP no meristema floral.
Esse esquema é baseado nos modelos descritos pelos autores Li et al. (2013)
e Teo et al. (2014) e como há poucos relatos sobre a interação das vias de
resposta à auxina e genes da identidade floral em tomateiro na literatura, o
modelo proposto sobre este provável papel da ARP é esquematizado para o
modelo vegetal A. thaliana (Figura 32B). Dessa forma, a auxina máxima no
meristema floral pode reprimir a biossíntese da citocinina e pode promover a
expressão do gene da identidade do meristema floral LFY. Esse por sua vez,
poderia promover a expressão do gene APETALA1 (AP1) que também pode
80
promover a expressão de LFY, mas a proteína AP1 pode reprimir outros genes
da identidade do meristema floral, como SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP),
SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1) ou
AGAMOUS-LIKE 24 (AGL24). O gene SEPALLATA 4 (SEP4) é reprimido por
SVP, SOC1 ou AGL4. Entretanto, todos estes genes da identidade
meristemática floral promovem a morfogênese floral e inibem o repressor da
floração, TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) que também é inibido pela proteína
LFY. Este regula positivamente a sinalização da auxina e negativamente a
biossíntese de auxina, enquanto a ARP pode inibir as vias de resposta à auxina
e dessa forma, diminuir o gradiente de auxina no órgão floral ou a auxina
máxima pode reprimir a ARP (Figura 32B).
81
Figura 32 - Esquemas hipotéticos da ação da ARP na gema lateral em tomateiro e no
meristema floral em A. thaliana. Em A, esquema hipotético do provável papel da ARP e sua
relação com os hormônios auxina, estrigolactona e citocinina e gene BRANCHED1 (BRC1) na
gema lateral em tomateiro. Em B, esquema hipotético da possível função da ARP e sua relação
com as vias de resposta a auxina e genes da identidade meristemática floral no meristema
floral de A. thaliana. As setas ( ) indicam promoção, as extremidades “T” indicam uma
inibição da interação gênica. Seta nas duas direções indica promoção mútua e a extremidade
“T” nos dois sentidos, em vermelho, indica que o efeito de inibição pode ocorrer em um ou em
outro, sua direção é desconhecida. Setas e extremidades “T” em vermelho indicam promoção
ou repressão sugestiva da interação gênica, respectivamente. LFY: LEAFY. AP1: APETALA1.
SVP: SHORT VEGETATIVE PHASE. SOC1: SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF
CONSTANS 1. AGL24: AGAMOUS-LIKE 24. SEP4: SEPALLATA 4. TFL1: TERMINAL
FLOWER 1. Genes IMF: genes da identidade do meristema floral.
Dessa maneira, um desequilíbrio nos níveis da proteína ARP nos
esquemas hipotéticos propostos acima ocasionariam o processo de floração
precoce e o desenvolvimento de gemas laterais que produziriam hastes com
folhas, flores e frutos como observados principalmente nas plantas 35S::SlARP
antissenso. Isso seria interessante no ponto de vista agrícola, visto que a
ramificação é uma importante característica que afeta a produtividade de uma
dada planta de cultivo (BOE; BECK, 2008). Além disso, a produtividade nessa
planta não é comprometida drasticamente em comparação às plantas controles
cv. MT e MT Vazio. Mais ainda, essas plantas florescem e frutificam antes das
A B
82
plantas 35S::SlARP senso, MT Vazio e cv. MT e também seria um indicativo
positivo para a produção agrícola, visto que reduziria o tempo de colheita dos
frutos. Portanto, estes dados iniciais sugerem que a planta 35S::SlARP
antissenso pode ser um futuro candidato ao melhoramento vegetal. Entretanto,
será necessário analisar as linhagens isogênicas e a qualidade dos frutos, seus
níveis de expressão em tecidos vegetais pelo método de RT-qPCR, além de
obter os resultados da proteômica e do duplo híbrido para fortalecer essas
hipóteses.
Todavia, estes dados sugerem que o cDNA homólogo a ARP pode estar
envolvido na dormência das gemas axilares e nos processos de floração e
frutificação em tomateiro.
83
6 CONCLUSÃO
Os dados apresentados neste trabalho sugerem que o cDNA homólogo
a ARP prospectado anteriormente em biblioteca subtrativa para floração em
tomateiro pode estar envolvido na dormência das gemas axilares e nos
processos de floração e frutificação, provavelmente, atuando assim como
repressor do florescimento dessa hortaliça de extremo valor econômico
mundial.
84
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