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CaractCaractéérisation drisation d’’ararèène ne dioxygdioxygéénasesnases impliquimpliquéées dans la es dans la
biodbiodéégradation des gradation des hydrocarbures aromatiques hydrocarbures aromatiques
polycycliques chez polycycliques chez MycobacteriumMycobacteriumspsp. 6PY1. 6PY1
ThThèèse prse préésentsentéée par Sylvain e par Sylvain KuonyKuony
Directeur de thDirecteur de thèèse : Yves se : Yves JouanneauJouanneau
BBSI BBSI –– CEA GrenobleCEA Grenoble
PlanPlan
IntroductionIntroductionLes HAP, les dioxygLes HAP, les dioxygéénases, nases, Mycobacterium Mycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1
Clonage de gClonage de gèènes de dnes de déégradation des HAPgradation des HAP3 loci, analyse des s3 loci, analyse des sééquencesquences
PropriPropriééttéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2Etude de lEtude de l’’activitactivitéé et de la set de la séélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2
Surexpression et purification de Pdo1 et Pdo2Surexpression et purification de Pdo1 et Pdo2RRéégulation de lgulation de l’’expressionexpressionConclusions et perspectivesConclusions et perspectives
PlanPlan
IntroductionIntroductionLes HAP, les dioxygLes HAP, les dioxygéénases, nases, Mycobacterium Mycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1
Clonage de gClonage de gèènes de dnes de déégradation des HAPgradation des HAP3 loci, analyse des s3 loci, analyse des sééquencesquences
PropriPropriééttéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2Etude de lEtude de l’’activitactivitéé et de la set de la séélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2
Surexpression et purificationSurexpression et purificationRRéégulation de lgulation de l’’expressionexpressionConclusions et perspectivesConclusions et perspectives
HAP: Hydrocarbures Aromatiques HAP: Hydrocarbures Aromatiques PolycycliquesPolycycliques
• combustion incomplète de matière organique fossile ou pyrolyse
• très stables
• peu volatils
• hydrophobes
• ubiquitaires
• toxiques : risques de cancers
HAP Légers
HAP Lourds
BiodBiodéégradation bactgradation bactéériennerienne
Utilisation des HAP comme sources de carbone Utilisation des HAP comme sources de carbone et det d’é’énergienergieHAP HAP àà 2 ou 3 cycles:2 ou 3 cycles:
EspEspèèces du genre ces du genre PseudomonasPseudomonasGGèènes, protnes, protééines et rines et réégulation gulation éétuditudiééss
HAP HAP àà 4 cycles ou plus4 cycles ou plusEspEspèèces des genres ces des genres MycobacteriumMycobacterium ou ou SphingomonasSphingomonasGGèènes, protnes, protééines et rines et réégulation gulation àà éétudiertudier
BiodBiodéégradation des HAP par les bactgradation des HAP par les bactééries :ries :cas du naphtalcas du naphtalèène et du phne et du phéénanthrnanthrèènene
• Etape initiale catalysée par une enzyme de type dioxygénase
• La voie de dégradation du phénanthrène rejoint celle du naphtalène
• Gènes organisés en clusters• Opérons nah et sal
• Minéralisation complète
BiodBiodéégradation des HAP par les bactgradation des HAP par les bactééries :ries :cas du pyrcas du pyrèènene
OH
OH
HH
OHOH COOH
COOH COOHOH
OH
H
CO2H
OHOH
OHOH
H
HO COOH
OH
O
COOH
OH OH
CHO
OH
COOH
COOH
COOH
O
COOH
CHOCOOH
COOH
Pyrène
Phénanthrène
Pyrènecis-4,5-dihydrodiol
3,4-Dihydroxyphénanthrène
Phénanthrènecis-3,4-dihydrodiol
Acide Phtalique
1 2 3 4 5
6
7 8 9 10
11
12
131415
Le systLe systèème dioxygme dioxygéénasenase
e-
NAD(P)H, H+
NAD(P)+Réductase
FADe-
Fe-S
Ferrédoxine
O2
OH
OH
HH
[2fe-2S]
Fe
Dioxygénase
Structure de la naphtalStructure de la naphtalèène ne dioxygdioxygéénasenase
Kauppi et al. Structure (1998)
MycobacteriumMycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1
Bacille, GramBacille, Gram++, actinomyc, actinomycèèteteIsolIsoléée pour sa capacite pour sa capacitéé àà crocroîître sur pyrtre sur pyrèène comme ne comme unique source de carbone et dunique source de carbone et d’é’énergienergie
Capable de croCapable de croîître sur phtre sur phéénanthrnanthrèène, benzoate et ne, benzoate et acacéétatetate
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 2 4 6 8 10 12
Pyre
ne (m
g/m
l)
Temps (Jours)
[pyrene]
Densité bactérienne
InductibilitInductibilitéé de lde l’’activitactivitéé de de minminééralisation du pyrralisation du pyrèènene
0
20
40
60
80
100
120
140
0 2 4 6 8 10min
eral
isat
ion
du p
yrèn
e (n
mol
/mg
prot
éine
)
Temps (h)
Phenanthrene
Pyrene
Benzoate
Acetate + CΑΜ
Les enzymes de dégradation du pyrène sont induites par les HAP et le benzoate
Induction de protInduction de protééines par le pyrines par le pyrèènene
P20/21
P8P6
22 polypeptides induits sur pyrène, absents sur acétate
PlanPlan
IntroductionIntroductionLes HAP, les dioxygLes HAP, les dioxygéénases, nases, Mycobacterium Mycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1
Clonage de gClonage de gèènes de dnes de déégradation des HAPgradation des HAP3 loci, analyse des s3 loci, analyse des sééquencesquences
PropriPropriééttéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2Etude de lEtude de l’’activitactivitéé et de la set de la séélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2
Surexpression et purificationSurexpression et purificationRRéégulation de lgulation de l’’expressionexpressionConclusions et perspectivesConclusions et perspectives
StratStratéégie de clonagegie de clonage
Oligonucléotides dégénérés
Séquence polypeptidiqueN-terminale et interne
Amplification parPCR
Séquençage
Construction d'unebanque d'ADN
génomique
Criblage
Analyse desséquencesSéquençage
GGèènes codant des nes codant des dioxygdioxygéénasesnases dans dans le gle géénome de 6PY1nome de 6PY1
pdoB1 pdoA1
pdoF pdoA2 pdoB2 ORF1
pdoB3 pdoA3pdoD pdoC
Locus pdo1
Locus pdo2
Locus pdo3
SouthernSouthern blots avec sondes blots avec sondes pdoA1 pdoA1 et et pdoB1pdoB1
23 kb
9,4 kb
6,5 kb
4,3 kb
2,3 kb
PM 1 2 3 4 5 6
pdoA1
23 kb
9,4 kb
6,5 kb
4,3 kb
2,3 kb
PM 1 2 3 4 5 6
pdoB1
Similitudes des gSimilitudes des gèènes de nes de dioxygdioxygéénasesnases chez les mycobactchez les mycobactééries ries
Mycobacterium sp. 6PY1pdoB3 pdoA3pdoD pdoC
Mycobacterium sp. S65nidA nidC nidH ORF 1 nidX
pdoB pdoA pdoC pdoH CDS 1 pdoX
Mycobacterium sp. PYR-1nidB2 ORF 3 nidD nidB nidA nidC
Comparaison du locus Comparaison du locus pdo2 pdo2 avec les avec les ggèènes nes phdphd de de NocardioidesNocardioides spsp. KP7. KP7
6PY1
pdoF pdoA2 pdoB2 ORF1
phdE
phdF
orf131
phdA phdB
orf72
phdG
phdH
phdC phdD
KP7
Arbre phylogArbre phylogéénnéétique de soustique de sous--unitunitéés s αα de de dioxygdioxygéénasesnases
BiphényleMono-aromatiques
HAP
Alignement des sousAlignement des sous--unitunitéés s αα de de Pdo1, Pdo2 et Pdo3 avec Pdo1, Pdo2 et Pdo3 avec NdoBNdoB
Acides aminAcides aminéés ligands du centre s ligands du centre FerFer--Soufre et du fer ferreuxSoufre et du fer ferreux
Le centre [2Fe-2S] d’une sous-unité α serait connecté au centre catalytique de la sous-unité α adjacente par l’intermédiaire de Asp205
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IntroductionIntroductionLes HAP, les dioxygLes HAP, les dioxygéénases, nases, Mycobacterium Mycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1
Clonage de gClonage de gèènes de dnes de déégradation des HAPgradation des HAP3 loci, analyse des s3 loci, analyse des sééquencesquences
PropriPropriééttéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2Etude de lEtude de l’’activitactivitéé et de la set de la séélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2
Surexpression et purificationSurexpression et purificationRRéégulation de lgulation de l’’expressionexpressionConclusions et perspectivesConclusions et perspectives
Mesure de lMesure de l’’activitactivitéé dioxygdioxygéénasenasein vivoin vivo
Induction Dépôt phase aqueuse sur colonne C18USlavage
Culture en M9 + huilede silicone avec HAP
Incubation 6h
Culture en LB
020000400006000080000
100000120000140000
Temps-->
Abondance
Analyse par CPG-SMen mode SIM
ActivitActivitéé dioxygdioxygéénasenase de Pdo1de Pdo1
Construction
3,4 phénanthrène dihydrodiol9,10 phénanthrène dihydrodiol
pdoB1pdoA1PT7
phnA3phnA4PT7
pdoB1pdoA1Ptac
pdoB1pdoA1PT7
phdDphdCPT7
pdoB1pdoA1Ptac
ActivitéProtéines produites
Pdo1
Pdo1+ PhdC+ PhdD
Pdo1
Pdo1+ PhnA3+ PhnA4
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Phénanthrène 3,4-phénanthrène dihydrodiol + 9,10-phénanthrène dihydrodiol
3,4 phénanthrène dihydrodiol9,10 phénanthrène dihydrodiol
0 0,1 0,2 0,3dihydrodiols (ppm)
SSéélectivitlectivitéé de Pdo1de Pdo1
0,0% 5,1%
69,0%
100,0%
19,1%
0,4%0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
120,0%
Benzo-
a-pyrè
neFluo
ranthè
ne
Pyrène
Phéna
nthrèn
e
Anthrac
ène
Naphta
lène
5 cycles 4 cycles 3 cycles 2 cycles
Pdo1 oxyde préférentiellement des HAP à 3 ou 4 cycles
ActivitActivitéé dioxygdioxygéénasenase de Pdo2de Pdo2Construction Protéines produites Activité
0 2 4 6 8 10
dihydrodiols (ppm)
pdoB2pdoA2PT7 Pdo2
pdoB2pdoA2PT7
phdDphdCPT7
Pdo2+ PhdC+ PhdD
0 2 4 6 8 10
pdoB2pdoA2Ptac Pdo2
pdoB2pdoA2Ptac
phdDphdCPT7
Pdo2+ PhdC+ PhdD
ActivitActivitéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2
0
2
4
6
8
10
Pdo1 Pdo2D
ihyd
rodi
olfo
rmés
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Pdo1 Pdo2
Dih
ydro
diol
form
és
OHH
H
OH
OH
HO
H
H
Pdo1
H OH
H
OH
Pdo1
pyrène Pyrène-4,5-dihydrodiol
phénanthrène Phénanthrène-3,4-dihydrodiol
Phénanthrène-9,10-dihydrodiol
SSéélectivitlectivitéé de Pdo2de Pdo2
0,0% 0,1% 3,4%
100,0%
63,4%
82,1%
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
120,0%
Benzo
-a-py
rène
Fluoran
thène
Pyrène
Phéna
nthrèn
e
Anthrac
ène
Naphta
lène
5 cycles 4 cycles 3 cycles 2 cycles
Pdo2 oxyde préférentiellement des HAP à 2 ou 3 cycles
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IntroductionIntroductionLes HAP, les dioxygLes HAP, les dioxygéénases, nases, Mycobacterium Mycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1
Clonage de gClonage de gèènes de dnes de déégradation des HAPgradation des HAP3 loci, analyse des s3 loci, analyse des sééquencesquences
PropriPropriééttéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2Etude de lEtude de l’’activitactivitéé et de la set de la séélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2
Surexpression et purificationSurexpression et purificationRRéégulation de lgulation de l’’expressionexpressionConclusions et perspectivesConclusions et perspectives
Purification de Pdo1Purification de Pdo1
pdoA1 pdoB1Ptac rbs rbs
pPDO1
MM 1 2 3 4
α
β
1. Fraction soluble2. DEAE Cellulose3. Sulfate d’ammonium 1M4. Q-HyperD
Purification de HisPurification de His66--Pdo2Pdo2
pdoA2 pdoB2Ptac rbs
pVDO2(His)6
M 1 2 3 4
50 kDa
20 kDa
1. DEAE Cellulose2. TALON3. DEAE Cellulose4. Q-HyperD
Spectre dSpectre d’’absorption UVabsorption UV--visiblevisiblede Pdo2de Pdo2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
300 400 500 600 700
Protéine réduite
Protéine oxydée
longueur d'onde
Abs
orba
nce
Masse molMasse molééculaire de Pdo2culaire de Pdo2
4
4,5
5
5,5
1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2Ve/Vo
MM = 198 kDa
Pdo2 est un Pdo2 est un hhééttéérohexamrohexamèèrere de type de type αα33ββ33
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IntroductionIntroductionLes HAP, les dioxygLes HAP, les dioxygéénases, nases, Mycobacterium Mycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1
Clonage de gClonage de gèènes de dnes de déégradation des HAPgradation des HAP3 loci, analyse des s3 loci, analyse des sééquencesquences
PropriPropriééttéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2Etude de lEtude de l’’activitactivitéé et de la set de la séélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2
Surexpression et purificationSurexpression et purificationRRéégulation de lgulation de l’’expressionexpressionConclusions et perspectivesConclusions et perspectives
RRéégulation de la synthgulation de la synthèèse des se des dioxygdioxygéénasesnases Pdo1 et Pdo2Pdo1 et Pdo2
Cultures de Cultures de MycobacteriumMycobacterium spsp. 6PY1 sur ac. 6PY1 sur acéétate, benzoate, tate, benzoate, phphéénanthrnanthrèène ou pyrne ou pyrèèneneAnalyse par Analyse par immunoimmuno--ddéétection de Pdo1 et Pdo2tection de Pdo1 et Pdo2
AcétateBenzoate
Phénanthrène
PyrènePdo2
PdoA1
PdoA2
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IntroductionIntroductionLes HAP, les dioxygLes HAP, les dioxygéénases, nases, Mycobacterium Mycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1
Clonage de gClonage de gèènes de dnes de déégradation des HAPgradation des HAP3 loci, analyse des s3 loci, analyse des sééquencesquences
PropriPropriééttéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2Etude de lEtude de l’’activitactivitéé et de la set de la séélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2
Surexpression et purificationSurexpression et purificationRRéégulation de lgulation de l’’expressionexpressionConclusions et perspectivesConclusions et perspectives
Catabolisme du pyrCatabolisme du pyrèèneneIdentification des enzymes des premiIdentification des enzymes des premièères res éétapes tapes
de la dde la déégradationgradation
1
OH
OH
HH
OHOH COOH
COOH COOHOH
OH
H
CO2H
1
OHOH
H
H
OHOH O COOH
OH
O
COOHOH OH
CHO
OH
COOH
COOHCOOH
O
COOH
CHOCOOH
COOH
Pdo1
pdoA1B1
Pdo2
pdoA2B2
P23
phdE pdoF
P15
phdG
phdHP22
P18P13
phdIphdJ
? ? ? ?
?
?
?
SSéélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2
Phén
anth
rène
Fluo
rant
hène
Pdo1
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
Pdo2
Naph
talè
neAn
thra
cène
Pyrè
ne
Benz
o-a-
pyrè
ne2 cycles
3 cycles4 cycles
5 cycles
SSéélectivitlectivitéé des des dioxygdioxygéénasesnasesRôle des rRôle des réésidus de la poche de liaison du substratsidus de la poche de liaison du substrat
ISPα
[2Fe-2S]
201 202 204 205 206 208 209 224 251 253 260 295 297 307 310 352 358
NdoB N F G D A H V F G L V H N L S F WPdoA1/A3 N F G D A H T - G L Y F N P M F FPdoA2 N F G D S H T - G L Y F N P F F F
158 aa
RRéégulationgulation
Etude de la transcription des gEtude de la transcription des gèènes codant les nes codant les dioxygdioxygéénasesnases::
NorthernNorthern blot, RTblot, RT--PCRPCRLocalisation des promoteursLocalisation des promoteurs
Construction de fusions Construction de fusions transcriptionnellestranscriptionnelles avec des avec des ggèènes rapporteursnes rapporteurs
Recherche de protRecherche de protééines de rines de réégulationgulationExpExpéériences de retards sur gelriences de retards sur gelIsolement de mutants de rIsolement de mutants de réégulationgulation
RemerciementsRemerciements
Membres du juryMembres du juryYves Yves JouanneauJouanneauEquipe Equipe «« HAPHAP »»Michel Michel SatreSatreStagiaires, doctorants et postStagiaires, doctorants et post--doctorantsdoctorantsLaboratoire BBSILaboratoire BBSI