Caratteristiche strutturali e funzionali della cellula ... · sintesi dei lipidi e di varie classi di macromolecole che compongono la parete cellulare batterica ... mureina, dello

MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/3

Caratteristichestrutturali e funzionali

della cellula procariotica


Forme di vari procarioti


Cocchi

Neisseria meningitidis - Gram-negative, coccus prokar

yote (dividing); causes meningitis

Streptococcus faecalis - coccoid prokaryote (dividing);

a pathogen causing skin andwound infections

Enterococcus faecium - Gram-positive, coccus

prokaryote (dividing); causes intestinal and skin / wound

infections.

Staphylococcus aureus - a pathogen that causes sinusitis,

food poisoning, toxic shock syndrome and skin and wound

infections (scarlet fever.)


Bastoncelli

E. coli - Gram-negative, facultatively anaerobic, rod prokaryote.

Part of human and animal microbiota. E. coli can cause urinary

tract infections, traveler's diarrhea and nosocomial infections.

Lactobacillus sp. - regular, nonsporing, Gram-positive, rod

prokaryote. Important in commercial lactic acid production

(food products). Human microbiota (oral cavity,vaginal tract

and intestine).

Bacillus megaterium, a large rod bacteriumPseudomonas aeruginosa- causes skin infections, urinary

tract infections and septicemia.


Vibrio cholerae - Gram-negative, facultatively

anaerobic, curved (vibrio-shaped), rod prokaryote;

causes Asiatic cholera.

Rhodococcus fascians - Gram-positive, filamentous prokaryote

that fragments into rod or coccoid shapes.

Actinomycete (Nocardioform).

Spirulina sp. - Gram negative, oxygenic, photosynthetic,

filamentous (spiral-shaped) cyanobacterium (prokaryote).

Haemophilus influenzae -Coccobacillus-shaped

Bacterium(causes meningitis/pneumonia),


Dimensioni di variprocarioti

Fig. 4.13

Unità di misura

* centi- (10-2) * milli- (10-3) * micro- (10-6) * nano- (10-9) * Ångstrom (10-8 cm., 0.1 nm)

DIAMETRI

Tra i più piccoli: 0.2 µm

Tra i più grandi: 50 µm

LUNGHEZZE

Tra i più piccoli: 0.2 µm

Tra i più grandi: 0.5 mm


Batterio giganteEpulopiscium fishelsoni

Fig. 4.12

50µmX0,5mm


•Lo scambio con l’esterno

aumenta con il diminuire

della taglia cellulare

•Cellule piccole !metabolismo accelerato,

sviluppo rapido ed elevato

numero di cellule

Superficie Area vs. Volume

Fig. 4.14

3SV

= r


Cellula batterica


Strutture trovate in manierauniversale nei batteri

• Alcune strutture, come l'RNA, il DNA e le

proteine, sono presenti in tutti gli organismi

e quindi anche nei batteri. Inoltre tutti i

microbi possiedono una membrana

cellulare e, molti ma non tutti, hanno una

parete cellulare.


Doppio strato fosfolipidico

Fig. 4.15

8nm


Il doppio strato lipidico

• A causa della presenza nei fosfolipidi di una testaidrofilica ed un coda idrofobica, quando si trovano insoluzione acquosa tendono ad associarsi in un doppiostrato in modo da esporre le teste polari all’acqua, e lecode idrofobiche tra di loro. Questa formazione vienedefinita “doppio strato lipidico”.

• Alcune proteine si trovano sia sulla superficie esterna,interna e dentro la membrana, mentre altre sono associatesolamente all’esterno o all’interno. Spesso le proteine cheattraversano tutto il doppio strato lipidico sono coinvoltenel trasporto o nella generazione di energia.


• Struttura della membrana citoplasmatica. Questo schema del modello a mosaico fluido della

struttura della membrana batterica mostra le proteine integrali immerse in un doppio strato lipidico.

Le proteine periferiche sono debolmente associate alla superficie di membrana. Le sferule

rappresentano le estremità idrofile dei fosfolipidi di membrana, mentre le code ondulate

rappresentano le catene idrofobe degli acidi grassi. Possono essere presenti altri lipidi di membrana

come gli opanoidi.

Fig. 4.17


Stabilizzazione delle membrane• La membrana citoplasmatica è stabilizzata dalle interazioni

idrofobiche e legami idrogeno tra lipidi vicini. Legami idrogeno

possono formarsi anche tra le proteine ed i lipidi di membrana.

• Le cariche negative sulle proteine possono formare interazioni

ioniche con cationi divalenti come Mg+2 e Ca+2.

• Alcune proteine si muovono entro il piano della membrana

mentre altre sono ancorate a strutture dentro o vicino la

membrana. Il risultato è che la membrana è praticamente fluida

con la consistenza di un olio. E’ stata quindi definita un

mosaico fluido: mosaico perché c’è un pattern definito, fluido

perché i lipidi sono liberi di muoversi lungo la membrana.

• Questa organizzazione conferisce alla membrana un certo

numero di proprietà che le consentono di svolgere molte

funzioni.


Caratteristiche della membranacitoplasmatica nei procarioti

• assenza di steroli, ma presenza di molecole pentacicliche

simili agli steroli detti opanoidi. Gli opanoidi

probabilmente hanno la funzione di stabilizzare la

membrana batterica

• Spessore di circa 5-10 nm

• presenza di fosfolipidi

• Presenza di proteine integrali e periferiche


Fig. 4.18

sterolo colesterolo opanoide diploptene

Molecole planari e rigide


I lipidi nei Batteri e negliArchaea hanno legami chimici

diversi

Estere - Batteri Etere - Archaea

Fig. 4.19

isoprene


Fig. 4.20


Fig. 4.21


Funzioni della membrana

Separa il macchinario altamente organizzato della cellula dall’ambiente

esterno

Interazione con l’ambiente esterno: assunzione di sostanze nutritive e

eliminazione dei metaboliti di rifiuto

Individuazione dei segnali ambientali per la chemiotassi

Centro di attività metaboliche:

respirazione

fotosintesi

sintesi dei lipidi

sintesi dei costituenti parietali

IMPORTANTE: le membrane non sono una struttura statica, sono

sempre in movimento


Funzioni della membrana

Fig. 4.21

MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/3Fig. 4.22


Proteine della membrana plasmatica

" permeasi: responsabili del trasporto dei nutrienti

" enzimi biosintetici: catalizzano le reazioni terminali della

sintesi dei lipidi e di varie classi di macromolecole che

compongono la parete cellulare batterica

" proteine coinvolte nella generazione di ATP durante il

trasporto degli elettroni

" sulla membrana batterica sono presenti dal 10 al 20% delle

proteine totali della cellula


Fig. 4.23

controllato

dall’energia associata

alla forza proton-

motrice

modificazione chimica

della sostanza

trasportata controllata

dal fosfenolpiruvato

coinvolge proteine di legame periplasmatiche e

l’energia viene fornita dall’ATP


Tipologie di trasporto

Fig. 4.24


Lac

per

mea

si:

sym

por

ter

Fig. 4.25


Traslocazione di gruppo: il sistema dellefosfotransferasi

Fig. 4.26


Sistemi di trasporto ABC: ATP-Binding-Cassette

Fig. 4.27


Proteine di esportazione

• Es. amilasi e cellulasi sono secrete nel mezzo esterno dove idrolizzano

rispettivamente amido e cellulosa

• Necessità di traslocasi es. sistema Sec (secrezione)

• Sequenza segnale: posta all’N-terminale, contiene residui carichi +

all’inizio, seguiti da una regione centrale con aminoacidi idrofobici e

da una regione con con residui polari

• La selezione viene effettuata dalle particelle per il riconoscimentodel segnale (SRP, signal recognition particles) che nei batteri è

costituita da una proteina e una molecola di RNA 4,5S.

• La SRP riconosce la proteina con il segnale e la rilascia in un

particolare complesso di membrana (Es. SecYEG)

(par. 4.7 e 7.16)


Membrane e antibiotici

• Alcuni antibiotici sono diretti contro le membrane(Polimixina B e Gramicidina).

• L’uso di questi antibiotici deve essere limitato inquanto anche noi possediamo un membranaplasmatica, molto simile a quella dei procarioti.

• Per questo motivo, questi antibiotici devono essereusati solo per uso topico e a basse dosi.


La parete delle celluleprocariotiche

• La parete cellulare è una delle parti più importanti dellacellula procariotica

• Ne condiziona la forma e protegge dalla lisi osmotica

• Può avere delle componenti importanti nella patogenicità

• Conferisce una certa protezione verso le sostanze tossiche

• Rappresenta il sito di azione di molti antibiotici

• La sua composizione fa reagire diversamente alla colorazionedi Gram, che può essere usata per la classificazione


Tecnica di colorazione Gram(1884)

• Colorazione con il cristal violetto(colorante basico)

• fissaggio con iodio

• Decolorazione con acetone(etanolo)

• Colorazione con safraina:

– gram+: porpora

– gram-: rossi

• Questa fase determina l’aspettodifferenziale della colorazione:

– i gram+ resistono all’azionedella decolorazionetrattenendo il cristal violetto

– i gram- perdonocompletamente il colorante


La colorazione Gram


La colorazione Gram


La colorazione Gram

• A- Stafilococchi ( Gram+)

• B- E. coli (Gram -)

AB


Gram+ e Gram- a confronto

Fig. 4.28


Peptidoglicano

• Il peptidoglicano è unpolimero formato da moltesubunità uguali. I componentibase sono l’N-acetilglucosammina (NAG),l’acido N-acetilmuramico(NAM) e molti diversiamminoacidi tra i qualiL’acido D-glutammico, la D-alanina e l’acido meso-diaminopimelico.

• Normalmente nelle proteine sitrova la forma L degliamminoacidi. I batteri usano iD-amminoacidi per la sintesidella parete cellulare. Leracemasi sono gli enzimi checonvertono la forma L- in D- eviceversa.

Fig. 4.30


acido diaminopimelico lisina


Le catene delle subunità peptidoglicanicheadiacenti sono unite per mezzo di un legametrasverso tra i peptidi

Legami crociati del peptidoglicano. a) peptidoglicano di E. coli

(gram-), con legame crociato diretto. b) peptidoglicano di

Staphylococcus aureus (gram+).

NAM NAG

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

D-Ala

DAP

D-Glu

L-Ala

NAM NAG

NAM NAG

L-Ala

D-GluNH2

L-Lys

D-Ala

D-Ala

L-Lys

D-GluNH2

L-Ala

NAM NAG

Gly -Gly -Gly -Gly -Gly-

a) b)




• Gram+• la parete è formata da un

unico strato omogeneo di

peptidoglicano, detto anche

mureina, dello spessore di

20-30 nm, posto al di fuori

della membrana

citoplasmatica

• la parete è più sottile ed al

microscopio elettronico

appare più liscia

• Envelope: involucro

esterno per indicare tutte le

strutture esterne alla

membrana citoplasmatica,

compresa la parete e la

capsula


Caratteristiche della parete deibatteri Gram +: gli acici teicoici

Gli acidi teicoici sono polimeri di alcoli

polivalenti (glicerolo e ribitolo) uniti da

legami fosfodiesterici. Gli amminoacidi,

come la D-Ala , e gli zuccheri, sono

attaccati in posizione 2 o 3 al glicerolo

(3 o 4 nel caso del ribitolo). Gli acidi

teicoici sono associati sia con il

peptidoglicano che con i glicolipidi della

membrana citoplasmatica (acidi

lipoteicoici).

Fig. 4.32


Caratteristiche della parete deibatteri Gram +: gli acici teicoici

• Sono responsabili della carica

negativa sulla superficie

cellulare e possono contribuire

al passaggio di ioni.

• Gli acidi teicoici che sono

strettamente legati ai lipidi

sono chiamati Acidi

lipoteicoici

• Nella maggior parte dei batteri

Gram+ le pareti non

contengono lipidi o proteine

(eccezioni: corinebatteri,

nocardie, micobatteri)


Gram -

Figura 4.36


• Gram-

• la parete è piùcomplessa: comprendeuno strato sottile (1-3nm) dip e p t i d o g l i c a n o ,circondato da unamembrana esterna di 7-8nm di spessore

• Spazio periplasmatico:spazio interposto tra lam e m b r a n acitoplasmatica e lamembrana esterna. Inquesto spazio sonopresenti enzimi perl’assunzione di nutrienti

Figura 4.36


Caratteristiche della parete deibatteri Gram -

• Il peptidoglicano contiene meno cross-link senza ponte

peptidico. La lipoproteina di Braun è legata in maniera

covalente al peptidoglicano ed alla membrana esterna con

dei residui idrofobici. Tramite questa proteina il

peptidoglicano è fortemente legato alla membrana esterna.

• La membrana esterna, gioca un ruolo importante nella

virulenza dei gram-. Questa membrana è costituita da un

doppio strato lipidico (come la membrana citoplasmatica),

contiene inoltre i lipopolisaccaridi (LPS). Nella membrana

esterna si distinguono due lati: il lato esterno, contenente i

lipopolisaccaridi, ed il lato interno verso il peptidoglicano.


Caratteristiche della parete deibatteri Gram-: i lipopolisaccaridi

acido 2-cheto-3-deossiottonico KDOeptosio

unità tetra o pentasaccaridiche e esosi

Esterno

Figura 4.35


• I LPS contribuiscono a formare la carica negativa della superficiebatterica.

• La catena laterale O è una corta catena polisaccaridica che siproietta dal nucleo verso l’esterno. Benché la catene laterali Osiano facilmente riconosciute dagli anticorpi dell’ospite, i batterimodificando la natura delle catene laterali riescono ad evitare ilriconoscimento.

• Il lipide A è saldamente ancorato alla membrana esterna, mentrela parte restante della molecola dell’LPS si proietta dallasuperficie verso l’esterno. Il nucleo polisaccaridico è legato allipide A. Il lipide A è un costituente della membrana esterna,contribuisce a stabilizzare la struttura della membrana ed è spessotossico. I LPS possono agire come un endotossina e causare isintomi che caratterizzano le infezioni da gram- come Salmonella,Shigella ed Escherichia.


Caratteristiche della parete deibatteri Gram-: la lipoproteina

mureinica

Lipoproteina mureinica

La lipoproteina mureinicanon è essenziale per lasopravvivenza

Nella regione C-term un residuo diLys si lega ad un residuo di acidomeso-amino-pimelico


Caratteristiche della parete deibatteri Gram-: le porine

• PORINE

• Le porine sonoaggregate tre a tre eformano dei canaliattraverso la membranache permettono ilpassaggio per diffusionedi alcune piccolemolecole (600-700 Da).

• La sintesi delle porine èstrettamente regolata


Caratteristiche della parete deibatteri Gram-: lo spazio

periplasmatico

• SPAZIO PERIPLASMATICO

• Nello spazio periplasmaticosi trovano numeroseproteine con le più svariatefunzioni:

• Enzimi idrolitici

• proteine per il trasporto(proteine leganti)

• chemorecettori

• enzimi detossificanti (esbeta-lattamasi)

• protezione osmotica

Lipoproteina mureinica


Correlazione tra la strutturadella parete cellulare e la

colorazione Gram

• Nella colorazione si forma all’interno delle cellule un

complesso insolubile di cristal-violetto che viene estratto

dall’alcol nei batteri Gram- , ma non nei Gram+.

• La spessa parete dei Gram+ si disidrata in presenza di

alcol, i pori della membrana si chiudono ed il colorante

non può uscire.

• Nei Gram -, il sottile strato di peptidoglicano non riesce

ad ostacolare il passaggio del solvente quindi il complesso

cristal-violetto viene facilmente rilasciato.


Cellule senza parete

• lisozima: rompe i legami #1,4 tra l’ NAG e

NAM.

• La cellula priva di parete viene definita

protoplasto

• Terreni isotonici: possono prevenire la

rottura della cellula


Fig. 4.33


Pseudopeptidoglicano

N-acetiltalosaminurorico


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