I frutti del mirtillo rosso americano, meglio conosciuto come cranberry, sono noti per la loro benefica azione nel contrastare le infezioni delle vie urinarie. Studi recenti hanno attribuito questa proprietà a uno specifico gruppo di composti bioattivi, le proantocianidine. La standardizzazione degli estratti di cranberry è però fondamentale per determinare il loro effetto sull’adesione dei batteri agli epiteli, impe-dendo così la formazione di colonie e del biofilm che rende poco efficace l’azione del sistema immunitario.

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Vaccinium macrocarponCaratterizzazione e quantifiCazione

delle proantoCianidine negli estratti di Cranberry

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* Massimo E. Maffei

Le bacche del mirtillo ros-so americano o cranberry (Vaccinium macrocarpon

Aiton; sinonimi Oxycoccus ma-crocarpus (Alt.) Pursh., O. palu-stris var. macrocarpus) sono sta-

te utilizzate per centinaia di anni come rimedio per le malattie del tratto urinario e hanno destato at-tenzione a causa dei loro potenzia-li benefici per la salute (Jass, Reid, 2009; Jepson et al., 2013; Maffei, 2015). Il meccanismo benefico del mirtillo è stato storicamente attribuito agli acidi dei frutti che

si ritenevano responsabili dell’ef-fetto batteriostatico nelle urine. Tuttavia, recentemente, è stato isolato dai frutti di cranberry un gruppo di proantocianidine (PAC) con legame di tipo A (PAC-A) che mostra un’attività di antiaderenza batterica contro entrambi i ceppi, antibiotico-sensibili e resistenti all’azione di batteri uropatogeni P-fimbriati di Escherichia coli, compresi i ceppi multiresistenti di E. coli (Howell et al., 2005; Gupta et al., 2007; Howell et al., 2010; Stapleton et al., 2012).Nonostante sia globalmente ri-conosciuto il ruolo importante dell’estratto di cranberry nel for-nire un valido aiuto alla riduzione delle infezioni delle vie urinarie, un’analisi delle “scientific opi-nions” dell’EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies (NDA) sulla valutazione di prodot-ti finiti per il supporto alla salute delle vie urinarie mostra un qua-dro controverso della situazione. Nella maggior parte dei casi l’EFSA afferma che non esistono relazioni di causa-effetto fra il consumo di cranberry di questa o quella azien-da e la riduzione del rischio di con-trarre infezioni del tratto urinario (http://www.efsa.europa.eu/it/ef-sajournal). Questa contraddizione nasce dalla enorme differenza nel-la titolazione dei principi attivi del cranberry fra un prodotto e l’altro e, di conseguenza, dalla diversità di efficacia.Un ruolo centrale nell’efficacia de-gli estratti di cranberry è la deter-minazione della dose ottimale di PAC-A, un requisito essenziale per preparare integratori alimentari come valido supporto alle tera-pie convenzionali (Gurley, 2011). Recenti studi hanno rivelato che estratti di cranberry che conten-gono 72 mg di PAC producono un’attiva e significativa antiade-renza batterica nelle vie urinarie (Howell et al., 2010; Micali et al., 2014; Brigo, 2016). Chiaramente, la percentuale di PAC-A biodispo-

Il frutto di Vaccinium macrocarpon

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nibili è una questione centrale per l’efficacia del cranberry, nonostan-te ci sia ancora chi sostiene che le PAC non siano le uniche molecole bioattive per combattere E. coli. Attualmente per valutare il conte-nuto di PAC nel cranberry vengo-no utilizzati quattro metodi: due metodi si basano sulla depolime-rizzazione delle PAC (ad esem-pio, il metodo a base di butanolo cloridrico noto come metodo Ba-tes-Smith e il metodo della Far-macopea Europea), e due sono metodi colorimetrici (un metodo spettrofotometrico UV-Visibile ba-sato sui reagenti blu di Prussia o Folin-Ciocalteu e il metodo BL-D-MAC). I primi due metodi, a causa della complessità delle strutture delle PAC e dei legami di tipo A, spesso portano a risultati errati e non riproducibili (Mole, Water-man, 1987a, b). Invece il metodo colorimetrico BL-DMAC (una con-densazione aldeidica della 4-dime-tilamminocinnamaldeide) è più accurato rispetto agli altri metodi ed è stato usato con successo per quantificare le PAC del cranberry (Prior et al., 2010). Inoltre, il me-todo BL-DMAC è meno probabi-le che sia soggetto a interferenze dovute alle altre componenti non proantocianidiniche del mirtillo rosso, quali gli antociani, perché la reazione viene letta spettrofoto-metricamente alla lunghezza d’on-da di 640 nm, dove gli antociani non assorbono più. Tuttavia, il me-todo BL-DMAC, anche se specifico per la quantificazione PAC, non è in grado di distinguere tra PAC di tipo A e quelle di tipo B (Krueger et al., 2013; Occhipinti et al., 2016). Pertanto, per l’autenticazione del-le PAC-A sono necessari ulteriori metodi analitici, quali i sistemi cromatografici o di desorbimen-to accoppiati a rivelatori come lo spettrometro di massa o la fluore-scenza (Prior et al., 2001).Una recente indagine sul contenu-to PAC di alcuni prodotti finiti a base di estratti di cranberry ana-

lizzati con BL-DMAC e HPLC ha rivelato che i valori di BL-DMAC per il contenuto di PAC per unità erano inferiori a quelli dichiarati dai produttori. In particolare, in alcuni integratori a base di estratto di cranberry il contenuto di PAC-A era così basso che non avrebbero avuto alcuna possibilità di forni-re benefici per la salute (Chru-basik-Hausmann et al., 2014). L’utilizzo di questi estratti è sta-to probabilmente suggerito della sovrastima del contenuto di PAC fornito dai metodi Bates-Smith e della Farmacopea Europea. Infat-ti, se da un lato questi metodi con-sentono un elevato valore percen-tuale, ben spendibile da un punto di vista del marketing, dall’altro, sovrastimando il contenuto reale delle PAC, limitano gli effetti bene-fici degli estratti di cranberry. Per contro, estratti di cranberry che al saggio BL-DMAC mostravano valori elevati di PAC totali, all’a-nalisi in spettrometria di massa rivelavano elevate concentrazioni di PAC-B (fino al 98%), annullan-do di fatto l’effetto bioattivo delle PAC-A.

Dosaggio delle PACtotali medianteil metodo BL-DMACUno studio recente sull’utilizzo di un estratto di cranberry a elevato contenuto di PAC-A (Oximacro) valutato per la prevenzione delle infezioni delle vie urinarie ha di-mostrato l’importanza e i limiti del metodo BL-DMAC (Occhipinti et al., 2016). Come abbiamo ac-cennato, il saggio BL-DMAC è sen-sibile alla presenza delle PAC-A e delle PAC-B. Quando sono stati misurati gli standard di PAC-A e PAC-B con il metodo BL-DMAC, si è notato che la stessa quantità di PAC reagiva in modo diverso con vari spettri di assorbanza. In parti-colare, le PAC-B assorbivano mag-giormente alla lunghezza d’onda del saggio (640 nm) rispetto alle PAC-A. Confrontando la dinami-

ca di reazione di 20 µg mL-1 sia di PAC-A che di PAC-B durante il saggio BL-DMAC, si notava che le PAC-B raggiungevano la massima assorbanza dopo 11 min, mentre le PAC-A mostrano un massimo di assorbanza dopo 20 min (Occhi-pinti et al., 2016). La domanda che sorge spontanea a questo punto è: “se un estratto di cranberry contiene solo PAC-B e si prepara una curva di taratura con PAC-A quale sarà il risultato?” Per determinare se una miscela di PAC-A e PAC-B con percentuali crescenti delle due PAC possa in-fluire sulla quantificazione delle PAC totali, si è saggiato il BL-D-MAC con miscele crescenti dei due tipi di PAC e si è notato che la pre-senza di PAC-B aumentava i valori di assorbanza misurati a 640 nm. Infine, è stata calcolata la quantità totale di PAC basata su una curva di calibrazione preparata con uno standard di PAC-A utilizzando mi-scele con percentuali crescenti di PAC-B e diminuendo le percentua-li di PAC-A a una concentrazione finale di 20 µg mL-1, calcolato con il metodo gravimetrico. I risultati hanno mostrato chiaramente che la quantità totale di PAC aumenta con l’aumentare del contenuto di PAC-B, nonostante sia utilizzato una quantità costante di PAC tota-li (Occhipinti et al., 2016).Quanto sopra ripotato indica che il metodo BL-DMAC è tempo-dipen-dente (nel lavoro di Occhipinti et al., il momento migliore per la re-azione delle PAC-A era di 20 min) e che tempi di reazione più brevi possono comportare una sovrasti-ma del contenuto totale delle PAC. Quest’ultimo risultato può veri-ficarsi in caso di elevate quantità di PAC-B. Inoltre, il metodo BL-D-MAC non distingue le PAC-A dalle PAC-B e anche quando si utilizza una curva di calibrazione ottenuta con PAC-A, una maggiore quanti-tà di PAC-B aumenta l’assorbanza a 640 nm, pregiudicando così la quantificazione delle PAC totali.

Pertanto, un alto valore PAC otte-nuto con il metodo BL-DMAC non indica necessariamente una quan-tità elevata di PAC-A, anche se i valori sono ottenuti con una curva di taratura calcolata con PAC-A standard.

Autenticazione delle PAC-A tramite HPLCabbinata a spettrometria di massa/massaDopo aver valutato il momento migliore per la determinazione delle PAC e averne calcolato il contenuto totale è necessario uti-lizzare altre tecniche analitiche per distinguere le PAC-A dalle PAC-B. È infatti assodato che solo le PAC-A hanno un effetto su E. coli e pertanto il loro dosaggio è indispensabile per la preparazione di integratori che possano essere utilizzati nel supporto alle infezio-ni delle vie urinarie (Howell et al., 2005; La et al., 2010; Ou et al., 2012; Occhipinti et al., 2016). In particolare si è recentemente sco-perto che sono i dimeri e i trimeri delle PAC-A ad avere il maggior effetto sulle infezioni delle vie uri-narie (Foo et al., 2000; Feliciano et al., 2012; Feliciano et al., 2014; Brigo, 2016) e che solo i dimeri di PAC-A si riscontrano nelle urine (McKay et al., 2015). Una delle tecniche analitiche uti-lizzate per la determinazione della presenza e dosaggio delle PAC-A in un estratto di cranberry è l’HPLC seguita da ionizzazione elettro-spray (EI) e accoppiata a spettro-metria di massa/massa (ESI-MS/MS). Per esempio, utilizzando un HPLC dotata di una colonna reverse pha-se C18 e separando le componenti del cranberry con gradienti a base di acqua, acetonitrile ed acido formico, si ottiene una buona se-parazione delle PAC. Collegando l’uscita della colonna con un de-tector DAD e successivamente a una trappola ionica (tandem mass spectrometry) dotata di una sor-

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gente di ionizzazione a electro-spray (ESI) che opera in modo negativo, è possibile identificare le PAC individuando gli ioni paren-tali in modalità multiple reaction monitoring (MRM) con scansioni in un range di m/z da 220 a 2200.Il risultato è la discriminazione fra dimeri, trimeri e altri polimeri di PAC sia di tipo A che di tipo B (Oc-chipinti et al., 2016). Altri metodi per l’autenticazione delle PAC-A utilizzano metodolo-gie analitiche basate su HPLC ab-binata a rivelatore in fluorescenza, dove normalmente la rilevazione viene effettuata nell’UV a 280 nm e l’emissione in fluorescenza è va-lutata in eccitazione ed emissione, rispettivamente a 276 e 316 nm (Prior et al., 2001). Un’altra tecnica basata sulla spet-trometria di massa che utilizza tecniche di ionizzazione più “de-licate” è la Matrix Assisted Laser Desorption Ionization abbinata a un detector di tempo di volo (MALDI-TOF MS). Questa tecnica rivela sia il tipo di legame (PAC-A o PAC-B) sia il grado di polimerizza-zione. Questa tecnologia permette la determinazione di gradi diversi di polimerizzazione delle proan-tocianidine e fornisce risultati con una risoluzione ancora superiore a quelli ottenuti con l’HPLC-ESI-MS/MS (Howell et al., 2005).

ConclusioniI recenti risultati della standar-dizzazione e accurata quantifi-cazione delle PAC-A in estratti di mirtillo rosso americano han-no permesso di estendere il con-cetto generale sugli effetti di 72 mg di cranberry di PAC-standar-dizzata per il supporto alle tera-pie per le infezioni dell’apparato urinario (Howell et al., 2010; Krueger et al., 2013; Micali et al., 2014).

I risultati ottenuti su volonta-ri affetti da cistite in fase acuta hanno dimostrato che 72 mg di PAC-A sono un dosaggio alta-mente efficace, suggerendo l’im-piego di dosaggi basati su PAC-A anziché su PAC totali (Occhipin-ti et al., 2016).

A causa dell’impossibilità del BL-DMAC di discriminare tra PAC-A e PAC-B, il semplice dosag-gio di PAC totali può non essere sufficiente a fornire la quantità di PAC-A richiesta e necessaria per inibire in modo significativo l’a-desione di E. coli. Questo è spes-so uno dei limiti del successo di prodotti a base di mirtillo rosso americano: la scarsa caratteriz-zazione delle PAC-A nell’estratto utilizzato per il prodotto finito.

Una fase della lavo-razione di Vaccinium macrocarpon

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30 t natural 1 luglio - agosto 2016

SCHEDA 1: PAC presenti nel cranberryLa struttura delle PAC del cranberry può influenzare l’attività biologica. Le PAC sono distinte in due tipi: PAC di tipo B, presenti in alimenti ricchi di tannini come l’uva e il cioccolato, in cui le epicatechine e catechine sono spesso col-legate tramite un unico legame; PAC di tipo A con un secondo legame etere tra l’anello A dell’unità inferiore e il carbo-nio in 2 dell’unità superiore (O7 " C2).

30 t natural 1 luglio - agosto 2016

SCHEDA 2: Metodi più utilizzati per dosare le PAC nel mirtillo rossoMetodo Bates-Smith (erroneamente indicato come UV, nonostante la lettura avvenga a 540 nm): depolimerizza le PAC ed esprime il loro contenuto sul cloruro di cianidina. Il saggio sovrastima le PAC di circa 2,5 volte rispetto al metodo BL-DMAC. Non distingue le PAC-A dalle PAC-B.

Metodo della Farmacopea Europea (basato sul dosaggio di procianidine di specie appartenenti al genere Crategus e non del mirtillo): depolimerizza le PAC ed esprime il loro contenuto sul cloruro di cianidina. Il saggio sovrastima le PAC di circa 6 volte rispetto al metodo BL-DMAC. Non distingue le PAC-A dalle PAC-B.

Metodo BL-DMAC (basato sulla condensazione aldeidica della 4-dimetillaminocinnamaldeide) è più preciso rispetto agli altri metodi ed è stato utilizzato con successo per quantificare le PAC del mirtillo rosso. La lettura del saggio è a 640 nm e non subisce l’interferenza delle cianidine libere. È attualmente il metodo utilizzato negli integratori alimentari di alta qualità. Non distingue le PAC-A dalle PAC-B.

Sopra: uno studio recente sull’utilizzo

di un estratto di cranberry a elevato contenuto di PAC-A (Oximacro) valutato per la

prevenzione delle infezioni delle vie urinarie ha dimostra-

to l’importanza e i limiti del metodo BL-DMAC

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SCHEDA 3: Protocollo per il dosaggio delle PAC con il metodo BL-DMAC

Il metodo descrive l’estrazione e la quantificazione di proantocianidine (PAC) da Vaccinium macrocarpon tra-mite il saggio spettrofotometro BL-D-MAC come riportato in letteratura (Prior et al., 2010) con alcune modifiche (vedi tabella 3).

Soluzioni e standards

Solvente di estrazione per le PACIn un cilindro di vetro, miscelare 75 mL di acetone con 24,5 mL di ddH2O e 0,5 ml di acido acetico. Questa soluzione è stabile per 1 anno a 18-25 ° C.Etanolo acidificato

Aggiungere 12,5 mL di acido cloridrico concentrato (36%) ad una miscela di 12,5 mL ddH2O e 75 mL di etanolo in una bottiglia di vetro. Questa soluzione è stabile per 1 anno a 18-25 C.

Reagente BL-DMAC (0,01 w/v)0,05 g di BL-DMAC sono aggiunti a 50 ml di etanolo acidificato. Miscelare con vortex. Tenere in ghiaccio. Questo rea-gente è preparato ogni giorno.

Soluzione standard di PAC-A2Sciogliere 5 mg di standard PAC-A2 in 50 ml di etanolo 95% v / v. Mescolare la soluzione con vortex e ottenere la concentrazione finale di 100 µg mL-1. Preparare delle aliquote in fiale in ve-tro da 1,5 ml e conservare a -80 °C. Questa soluzione standard è stabile per almeno 6 mesi.

• Etanolo 95% v/v (grado HPLC) • Acido cloridrico 36% • Acido acetico (grado HPLC) • Acetone (grado HPLC) • Acqua bidistillata (ddH2O) • Procianidina A2 (Extrasynthase, Francia - 0985S - #CAS 41743-41-3) • 4 Dimetilaminocinnamaldeide (DMAC) (Sigma-Aldrich, Stati Uniti d'America # EC-228-267-0) • Tubi di vetro da 15 ml con tappo a vite • Tubi di plastica da 1,5 ml (tubo Eppendorf) • Cilindro di vetro da 100 ml • Micropipette (P1000-P100-P10) • Pipette di vetro da 10 ml • Tubi di plastica da 50 ml • Bagnomaria ad ultrasuoni • Agitatore rotante per tubi • Centrifuga • Bilancia • Vortex • Spettrofotometro

Materiali e Strumentazioni necessarie per il saggio

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32 t natural 1 luglio - agosto 2016

EstrazionePesare 100 mg di campione in un tubo di vetro;Aggiungere 5 ml di solvente di estrazione per le PAC;Mescolare con il vortex;Estrarre le PAC con un bagnomaria a ultra-suoni per 30 minuti a 24°C;Mescolare con agitatore rotante per 1hCentrifugare i campioni per 5 min a 5000 gMantenere i campioni in ghiaccio e al buio fino al momento dell’analisi

Saggio BL-DMACDiluire i campioni (1: 100 v/v) con acetone acidificato in provette di plastica da 1,5 ml;Mescolare con vortex;Preparare la curva di taratura diluendo la soluzione madre PAC-A2 con il solvente di estrazione per le PAC. Utilizzando tubi di plastica da 1,5 ml, preparare le seguenti soluzioni: 5-10-20-30-40 µg ml-1;Aggiungere in tubi di plastica da 1,5 ml, 840 µl di reagente BL-DMAC e aggiungere 280 µl di campione diluito;Chiudere la provetta e miscelare con il vortex.Incubare la reazione fino a quando il va-lore di assorbanza non raggiunge il valore massimo (di solito occorrono almeno 20 min a temperatura ambiente al buio).Preparare il bianco mescolando 280 µl di solvente di estrazione e 840 µl di BL-D-MAC reattivo.Dopo 20 minuti, leggere l’assorbanza a 640 nm contro il bianco. Il range lineare del dosaggio è da 0,2 a 1,0 A.Calcolare la concentrazione delle PAC to-tali dalla regressione lineare ottenuta con la curva di taratura utilizzando lo standard di PAC-A2.

* UNIVERSITÀ DI TORINODipartimento di Scienze della Vitae Biologia dei Sistemi

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SCHEDA 4: Tecniche utilizzate per la identificazione e quantificazione delle PAC-A e delle PAC-BHPLC abbinata a detector in fluorescenza: permette di identificare le PAC in base ai tem-pi di ritenzione calcolati su standard puri. Non permette l’analisi del rapporto m/z.

HPLC-ESI-MS/MS: permette di distinguere dimeri, trimeri e polimeri di PAC-A e PAC-B in base agli spettri di frammentazione delle molecole isolate nella trappola ionica.

MALDI-TOF MS: permette di distinguere dimeri, trimeri e polimeri ad alto grado di polime-rizzazione di PAC-A e PAC-B in base agli spettri di massa delle molecole. È la tecnica che permette il più elevato grado di identificazione.

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Exhibition & Conference . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

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Fragaria vesca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

International News . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

Ricerca

Caratterizzazione e quantificazione

delle proantocianidine negli estratti

di mirtillo rosso

(Cranberry, Vaccinium macrocarpon) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

Fitoterapia

Cannabis e cannabinoidi:

l’approccio della fitoterapia alla sclerosi multipla . . . . .34

Speciale Corsi

I corsi universitari del settore erboristico . . . . . . . . . . . . . . . . .42

Risorse marine

Produzione di triacilgliceroli

mediante microalghe alimentate

con scarti agro-industriali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50

Alimentazione ragionata

Latte, un alimento “discusso” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61

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