Instituto de investigaciones de la Amazonía PeruanaInstituto de Investigación para el DesarrolloLaboratorio de Biología y Genética molecular - LBGM

Genética molecular y su aplicación alestudio del paiche “Arapaima gigas” en la

Amazonía peruana

Dra. Carmen Rosa García DávilaJefe del LBGM

Agosto - 2009Pucallpa - Ucayali

No c

opia

r

•Caracterización•Manejo sostenido

Pesqueria Piscicultura

CONSERVACION

•Poblaciones•Especies

•Medio ambiente

BiologiaGenética

•Manejo sostenidoNo c

opia

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Fenotipo y genotipo

Set decaracterísticas

físicas expresadaspor un organismo

Fenotipo

Genotipo AmbienteGenotipo

Set de genes presentesen un organismo

AmbienteNo c

opia

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Relacionamiento genotipico y fenotipico

Gran variación fenotipica = gran variabilidadgenética?

HeredabilidadHeredabilidad

Rango de heredabilidad:

0 = cuando toda variación escompletamente ambiental.

1 = cuando toda variación es debido

a diferencias genéticas.

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Genética

Reproductores

Heredabilidad=

Progenie

Fenotipo = Genotipo ?

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Susceptibilidad al medio ambiente

• Altos niveles de variación fenotipica

• Baja heredabilidadGran susceptibilidad almedio ambiente

Crecimiento:

- Disponibilidadde comida

- asinamiento

Temperatura:

- Metabolismo

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La diversidad biológica a sido rápidamente destruida en nuestro planetadebido directa o indirectamente a las actividades humanas. A medidaque los tamaños de las poblaciones de animales y plantas son reducidos,la perdida de diversidad genética limita sus potencialidades de adaptarsea los cambios del ambiente. Además de eso la depresión porendocruzamiento se torna una consecuencia inevitable para muchasespecies.

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Lenguaje de la vidaLenguaje de la vida

“lenguaje” en el que se especifican las instruccionespara la síntesis de proteínas.

Síntesis de proteínas

Traducción Expresión

Proteína caracter

Transcripción

RNAm Codons

Val ala leu

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Evaluación de la variabilidadN

o c

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Morfológica: Variabilidad en caracteres detectables

ejemplo: Pez disco

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Citogenética: Estudio de la morfología del cromosoma

Tinción FishBandeamiento

Ventajas:

-Importante a falta de otras tecnicas

Desventajas:

-Tamaño y nº de cromosomas en peces

- Tiempo, dificultad y costo

Cariotipo

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Interpretación de bandas:

Izoenzimas: múltiples formas moleculares de unamisma enzima

• Amplia información genética.

• Técnica relativamente barata yaccesible.

• Carácter codominante

Ventajas:

Enzimamonomérica

Enzimadimérica

Enzimatrimérica

Enzimatetramérica

Diferencias en la movilidad de laenzima representan diferencias en el

ADN

Limitaciones:• Número de loci limitado.

• Ausencia de polimorfismo genéticopara uno o varios loci.

• Baja resolución cuando comparadoa otras técnicas mas modernas.

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Marcadores basados en el análisis directo del ADN

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r

Pesado de muestra(100mg)

Digestión y maceración en buffer CTAB yproteinasa K

Separación del material genómico

Resuspensión del ADNAgua Milli-q

EXTRACCIÓN DE ADN Protocolo CTAB (Doyle & Doyle, 1987)

LavadoSecado y resuspensión del DNA

Precipitado

ADN

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Polimorfismo a lo largo de fragmentos derestrinción - RFLP

• Carácter codominante• Mayor detección de

polimorfismo que lasisoenzimas

Ventajas:

isoenzimas

• Puede cubrir todo elgenoma

Limitaciones:Sondas

• Gran nº de pasos

• Elevado costo

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Marcadores moleculares basados en PCR

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r

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

Cebador o primer

PCR

Cebador o primerADN polimerasa

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COIa 5,-AGT-ATA-AGC-GTC-TGG-GTA-GTC-3

,

COIf 5,-CCT-GCA-GGA-GGA-GGA-GAY-CC- 3

,

Perfil de temperatura

PrimersPalumbi & Benzie (1991)

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

92ºC

30 ciclosCondiciones de amplificación:MIX Para 30 l

72ºC

5’

72ºC

1’

1’

57ºC

92ºC

1’

15,15 lAgua miliQ

0,15 lTaq (5 unidades /l)

3,0 lCOIf(5 M)

3,0 lCOIa (5 M)

3,0 lMix DNTPs (1mM)

3,0 lTampón de PCR

2,7 lDNA molde (50ng/ l)

Gel de agarosa 1,0%(brometo de etídeo)

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RAPD (polimorfismo de ADN amplificadoarbitrariamente)

• Simplicidad, rapidez y bajo costo.

• Detecta diferencias directamente en elgel.

• No requiere de biblioteca genomica.

Ventajas:

• Bajo contenido de información obtenida porloci. Apenas un alelo es detectado(segmento amplificado).

• Variaciones alelicas son clasificadasconjuntamente como un alelo nulo(dominancia de RAPD).

• No reproducible.

Limitaciones:

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EPIC (Exon Primer Intron Crossing)Gen

Exon Intron Exon

CTAGCAAATTCATTACA CTAGCAAGCATTGGCA TAGCAATCATTCA

Exon Intron Exon

IntronExon Exon

IntronExon Exon

• Utiliza primers que son diseñados en zonasconservadas de los exones.

• Es fácil de realizar.

• tiene un bajo costo con relación a otras técnicas.

Ventajas:

• Muchas veces sus padrones de bandas son de difícil interpretación.

Desventaja:

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Amplificación Directa de Polimorfismo de Longitud (DALP)

Limitaciones:• Disponibilidad de información (en términos de secuencias

nucleotidicas) a respecto de regiones que posean repeticionespara el organismo que se desea estudiar.

• Amplia información genética para estudios a nivelpoblacional.

Ventajas:

3’– ACTTTCACAGGAAACAGCTATGACTT – 5’

5’ – TGAAAGTGTCCTTTGTCGATACTGAA –3’

Primer reverso

Primer selectivoDirección de la amplificación

Dirección de la amplificación

Tununtunumba Shica Habana Cerro alto

Gel de agarosa 2%

Gel de poliacrilamida 6%

para el organismo que se desea estudiar.

• Altos costos economicos.

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SECUENCIAMIENTO NUCLEOTÍDICO

• Rapidez.

• Uno de los mas eficiente para estudiarla variabilidad.

• No requiere de biblioteca genomica.

Ventajas:

• Alto costo

• Requiere laboratorios altamenteimplementados y personal tecnicoespecializado.

Limitaciones:

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r

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4

B

1 2 3 4

1 2 3 4

C

Microsatélites A

CTAGCAAATTCATTACA

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

Sitio derestricción

1 2 3 4

1 2

D

• Mayor contenido de información depolimorfismo para estudios a nivelpoblacional.

• Codominante y multialelico

Ventajas:

Limitaciones:• Gran trabajo previo para el desarrollo de los marcadores.

• Altos costos económicos.

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Arapaima gigas• Alcanza tallas de 3 metros y pesos de

mas de 200 Kg.

• Se encuentra bajo fuerte explotacióncomercial.

• Desde los años 70 Reducciónsignificativa de tamaño poblacional cercade grandes ciudades amazónicas.

• Actualmente las poblaciones naturalesestán protegidas (Listada como especie“con datos deficientes” por la CITESdesde 1975).

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Caracterización molecular del paiche en el lagoImiria

Estimar la variabilidad y

diversidad genética de la

población de paiche

Objetivo:

existente, para

compararla con la

variabilidad genética de

los paiches que serán

sembrados en la laguna.

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r

• Colecta de material biologico

(nativos y a sembrar).

• Extracción y cuantificación de

ADN.

Metodología de trabajo:

• Amplificacion y lectura de 14

locis microsatelites.

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opia

r

• Monitorear la evolución de la variabilidad genética de la

población con el tiempo y determinar el grado de

adaptación de los paiches sembrados.

• Conocer la proporción de individuos sembrados que

participan efectivamente al aumento de la población (es

Utilidad de los resultados obtenidos:

participan efectivamente al aumento de la población (esdecir a la producción de las nuevas generaciones), y si

se están reproduciendo con los paiches nativos.

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Caracterizaciónmolecular del paiche en

el lago el Dorado - RNPS

Objetivo:

• Evaluar la variacióngenética en el lago eldorado entre diferentesanos.

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Estudios moleculares del paiche en la ReservaNacional Pacaya-Samiria

• Evaluar la distribución de lavariación genética dentro y entrelocalidades de muestreo.

• Estimar efectos de procesos• Estimar efectos de procesosdemográficos pasados sobre ladistribución de la diversidadgenética.

• Estimar flujo génico (Nm) ytamaños poblacionales efectivos(Ne).

• Identificar áreas prioritarias deconservación y manejo sostenido.

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r

• Colecta de material

biologico en cuatro

puntos de la RNPS.

Metodología de trabajo:

• Extracción y

cuantificación de ADN.

• Amplificación y lecturade 14 locis

microsatelites.

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Poblaciones con baja diversidad geneticason (en promedio) las mas divergentes

(por efecto de la deriva genetica)micSat

r=0.9348 F=34.6626 P=0.0020

0.30

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

Fst

Alle

led

iver

sity

(FST = 0.1745, P < 0.001)(Bayesian exact test N.S.)

No c

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Utilidad de los resultados

• Estructura genética en el paiche es también causada poracción antropogénica?

• Reducción de la variación genética esta asociada consobrepesca?

• Existe intercambio entre las poblaciones? (Flujo génico)• Existe intercambio entre las poblaciones? (Flujo génico)

• Valores de Ne (Que proporción de la población estacontribuyendo al mantenimiento de la variabilidad)

• La mayor fracción de variación genética se encuentralejos de grandes centros urbanos?.

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Autocorrelacion espacial• Estimar la distancia geográfica a la cual las poblaciones

se diferencian genéticamente• Aplicable a especies con distribución continua, o con

poblaciones discretas conectadas por flujo génico (existeaislamiento por distancia)

• Análisis basado en correlaciones entre una matriz de• Análisis basado en correlaciones entre una matriz dedistancias genéticas con una matrix binaria (0,1) dedistancias geográficas (0=mayor o 1=menor que un valorumbral)

Fst1,2 480 1Fst1,3 Fst2,3 1600 1120 0 1Fst1,4 Fst2,4 Fst3,4 2113 1633 513 0 0 1Fst1,5 Fst2,5 Fst3,5 Fst4,5 2770 2290 1170 657 0 0 1 1

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Gracias por su atenciónN

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