CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEN-INTI

Materia de Articulación CEBI_E5:

Biología Molecular:

Clase 4

Docente a cargo:

Dra. Ana Paula Domínguez Rubio

Transcripción eucariotas vs procariotas

ARNm procariotas vs. eucariotas

extremo 5’ trifosfato extremo 3’-OH

No se modifican los extremos

Se modifican los extremos

Caperusa Cola poli-A

ARNm

policistrónico

ARNm

monocistrónico

Capping Polyadenylation

ARN polimerasa II eucariota como una

“fábrica de ARN”.

2

3

1 A medida que la polimerasa transcribe el

ADN en ARN, transporta en su cola (C-

terminal domain o CTD) proteínas para el

procesamiento del ARN:

1) capping

2) splicing

3) poliadenilación

El procesamiento del ARN ocurre al mismo tiempo que la transcripción

El estado de fosforilación del CTD de la

polimerasa cambia durante la

transcripción y regula qué proteínas se van

pegando y despegando ARN polimerasa II

1) El capping del ARN es la primera modificación

de los pre-ARNm eucariotas

La tapa final contiene un nuevo enlace 5ʹ-5ʹ entre el

residuo de 7-metil G cargado positivamente y el

extremo 5 ʹ del transcrito de ARN

El capping del ARN es la primera modificación

de los pre-ARNm eucariotas

:

Enlace inusual 5ʹ a 5ʹ 7-metil G con el

resto del ARN.

Caperusa

La caperuza en el extremo 5ʹ de los

ARNm eucariota:

- permite distinguir los ARNm de los otros

tipos de moléculas de ARN presentes

en la célula

- tiene un papel importante en la

traducción de los ARNm en el citosol,

El capuchón 5ʹ-metilo también

Las secuencias codificantes (exones) de proteínas de los genes eucariotas se

interrumpen típicamente por secuencias intermedias no codificantes

(intrones).

Ambas secuencias intrón y exón se transcriben en el ARN el splicing de ARN

elimina las secuencias de intrones de los pre-ARNm recién transcritos

2) El splicing del ARN es la segunda modificación

de los pre-ARNm eucariotas

1977

Pre-

Sólo después de que hayan tenido

lugar el procesamiento y empalme

de los extremos 5ʹ y 3, dicho ARN

se denomina ARNm.

Splicing del ARN de los pre-ARNm eucariotas

Precursor de mRNA o pre-ARNm

ARNm

El splicing de intrones ocurre en secuencias

consenso

El intrón escindido a través del splicing forma un

lazo

La maquinaria que cataliza el splicing del pre-ARNm es

compleja: consta de cinco moléculas de ARN adicionales y

varios cientos de proteínas, y se hidrolizan muchas

moléculas de ATP por evento de splicing

Splicing alternativo

Algunos de los patrones de splicing son específicos para ciertos tipos de células:

- Ej. la α-tropomiosina producida en el músculo estriado es diferente de la obtenida del

mismo gen en el músculo liso.

Sitios de poliadenilación

Los exones de pueden empalmar empalmar de diferentes maneras se

producen diferentes pre-ARNm diferentes variantes de proteínas.

Gen de α-tropomiosina de rata.

El splicing se realiza por el spliceosoma

• Los pasos clave del splicing se realizan mediante moléculas de ARN en lugar

de proteínas.

• Las moléculas de ARN especializadas reconocen las secuencias de

nucleótidos que especifican dónde se realizará el empalme y también

catalizan la unión química del empalme.

• Estas moléculas de ARN, snRNAs (small nuclear RNAs), son relativamente

cortas (menos de 200 nucleótidos cada una), y hay cinco de ellas, U1, U2, U4,

U5 y U6.

• Cada uno está complejada con al menos siete subunidades de proteínas para

formar u snRNP (small nuclear ribonucleoprotein)

El splicing se realiza por el spliceosoma

El splicing es catalizado por un conjunto de snRNPs (que se muestran como círculos de

colores) más otras proteínas (la mayoría de las cuales no se muestran), que juntas

constituyen el spliceosoma.

El spliceosoma reconoce las señales de empalme en una molécula de pre-ARNm, une los

dos extremos del intrón y proporciona la actividad enzimática para los dos pasos de

reacción requeridos

El splicing se realiza por el spliceosoma

Un conjunto de proteínas llamado complejo

de unión exón (exon junction complex:

EJC) permanece en la molécula de ARNm

empalmada

Estas proteínas marcan el sitio de un evento de splicing exitoso e influyen en el

destino posterior del ARNm.

3) Corte y poliadenilación (cola de poliA) en el

extremo 3´

Secuencias de nucleótidos consenso de escisión y poliadenilación para

formar el extremo 3´del ARNm

Formación del extremo 3´ ARNm eucariota

Exportación del ARNm maduro al citosol

Exportación del ARNm maduro al citosol

. Después de que el ARNm se haya exportado al citosol, este receptor de

exportación se disocia del ARNm y se reimporta al núcleo, donde se puede

usar nuevamente. La verificación final indicada aquí, llamada desintegración

mediada por un sin sentido, se describirá más adelante en este capítulo.

Molécula de ARNm lista para la exportación y su transporte a través del poro

nuclear

El receptor de exportación nuclear para los ARNm es un

complejo de proteínas que se une a una molécula de ARNm una

vez que se ha empalmado y poliadenilado orrectamente

Algunas proteínas viajan con el ARNm a medida que se mueve a través del poro, mientras

que otras permanecen en el núcleo.

Los ARN no codificantes también se

sintetizan y procesan en el núcleo

ARN polimerasa I

Existe un solo gen para la fibronectina (FN) en cada célula de mamífero (en

realidad dos copias, dos alelos, cuyas secuencias son idénticas). El gen tiene 70

kpb de longitud. Sin embargo, se han encontrado en el citoplasma de fibroblastos

dos RNA mensajeros de 7,7 y 8,0 kb de longitud, respectivamente.

El de 7,7 kb es idéntico en secuencia al de 8,0 kb, excepto por el hecho de que

carece de un segmento interno de 0,3 kb.

a) ¿Cómo explica la gran diferencia de tamaño entre el gen (70 kpb) y sus

mensajeros (aproximadamente 8,0 kb)?

b) ¿Cómo explica la existencia de dos tipos de RNA mensajeros de FN diferentes?

Discuta los posibles mecanismos que pudieron originar los dos mRNAs. ¿Qué

implicancias biológicas podría tener la presencia de los dos mRNAs?

Ud. supone que algunos tejidos expresan el mensajero de 7,7 kb, mientras que

otros sólo expresan el de 8,0 kb, y decide investigarlo usando hibridación de

sondas de cDNA radiactivo a preparaciones de mensajero total de distintos tejidos.

c) ¿Cuál de las dos especies de mensajero detecta en un Northern con cada una

de las siguientes tres sondas? Justifique.

i) un cDNA del mRNA de FN de 7,7 kb.

ii) un cDNA del mRNA de FN de 8,0 kb.

iii) un cDNA del mRNA del segmento diferencial de 0,3 kb.

PROBLEMA 4

Northern blot

El splicing es una reacción enzimática por la cual se eliminan los intrones del RNA

transcripto primario y los exones son unidos entre sí para formar el RNA maduro.

Se ha descripto splicing en transcriptos primarios tanto de RNAs mensajeros (el

más común) como de RNAs ribosomales y de transferencia (menos frecuentes).

Las reacciones de splicing pueden ser reproducidas "in vitro", es decir, en un tubo

de ensayo si se colocan en el mismo los sustratos adecuados y las enzimas o

complejos enzimáticos correspondientes. Se estudiaron "in vitro« dos tipos distintos

de reacciones de splicing:

I) Splicing de un transcripto primario de RNA mensajero.

II) Splicing de un transcripto primario de RNA ribosomal.

Cada uno de los transcriptos primarios marcados radiactivamente fue incubado en

presencia o en ausencia de una preparación nuclear enriquecida en spliceosomas.

A distintos tiempos (de 0 a 2 hs de incubación) se tomaron muestras y se las

sembró en calles de un gel de poliacrilamida donde, luego de la electroforesis, se

observan bandas radiactivas correspondientes a los sustratos, moléculas

intermediarias y productos de las reacciones. La posición de cada uno de éstos

está representada por diagramas, donde los rectángulos son exones y las líneas,

intrones.

PROBLEMA 5

Preguntas:

a) Identifique sustrato, producto/s y molécula/s intermediaria/s de la reacción e interprete la

variación con el paso del tiempo de las intensidades de cada banda en el panel de la

izquierda.

b) ¿Por qué el patrón de bandas del panel de la derecha es diferente?

c) ¿Qué patrón de bandas habría obtenido en los siguientes experimentos en los que la

preparación de spliceosomas hubiera sido pretratada de las siguientes maneras:

i) Calentamiento a 100ºC por 10 minutos y enfriamiento rápido en hielo.

ii) Digestión con una lipasa (enzima que degrada lípidos, es decir, grasas).

iii) Digestión con una proteasa (enzima que degrada proteínas).

iv) Digestión con una DNasa (enzima que degrada DNA).

v) Digestión con una RNasa (enzima que degrada RNA). Nota: Las enzimas mencionadas fueron eliminadas antes de agregar la preparación de spliceosomas pre-

tratada al tubo donde se ensaya la reacción de splicing in vitro.

d) Identifique sustrato, producto/s e intermediario/s de la reacción e interprete la variación

con el paso del tiempo de las intensidades de cada banda en el panel de la izquierda.

e) Dado que los patrones de bandas son idénticos en ambos paneles, es decir en

presencia o en ausencia de preparación de spliceosomas, ¿qué puede Ud. concluir sobre

el mecanismo del splicing de este RNA ribosomal comparativamente con el del RNA

mensajero?

f) ¿Cuál podría ser la causa de que la cantidad de la forma varíe con el tiempo de

incubación de manera diferente de la cantidad de la forma ?