1

微生物接着タンパク質AtaAの応用

の拡がり（分子固定、表面機能化、分子輸送等）

名古屋大学

工学部・工学研究科 生命分子工学専攻

教授 堀 克敏

【別紙5】

令和2年9月1日

2

従来技術とその問題点

• 微生物を使った化学反応は、アクリルアミドの生産などに利用されているが、一般にコストが高い。コスト低減には微生物触媒の固定化が必須であるが、よい固定化技術が存在しない。

• クモの糸のように、蛋白質材料は新機能材料としては魅力はあるが、安定性・用途・耐久性・強度・生産性（コスト）の面で、実用化レベルに達しているものは少ない。

微生物懸濁液ポリウレタンフォーム

数分間の振とう

透明化

10 µm

ポリウレタンフォームに付着するTol 5 細胞

500µm

J. Chem. Eng. Japan, 34, (2001) 1120-1126.

Appl. Environ. Microbiol. 70, (2004) 5026-5029.

Acinetobacter sp. Tol 5: 高付着性の炭化水素分解細菌

Immunoelectron micrograph with anti-AtaA antibody200 nm

AtaA ナノファイバーの形態 (周毛性, 長さ250 nm，太さ5nm): 高付着性因子

PLoS ONE 7 (2012) e48830

機能• グラム陰性細菌の病原性因子

Yersinia; Haemophilus; Neisseria; Bartonella; Salmonella; Burkholderia; Acinetobacter; E. coli• ECM (コラーゲン, フィブロネクチン, ラミニン) と宿主細胞表層への特異的接着

• 細胞自己凝集能

• 抗血清

• 宿主細胞内での運動

Yersinia spp. YadAの結晶構造

Head

Stalk

C末

N末

膜アンカー

TAAs はホモ三量体を形成し、N末-head-stalk-C末膜アンカーの共通の構成を有する

AtaA は trimeric autotransporter adhesin (TAA) familyのタンパク質

外膜

ペリプラズム

内膜

N

C

N

Sec-system

Signal peptide

NN

CCC

C

NN

BAM comlex

Passenger domain (PSD)

分泌機構

AtaAのMulti-domain 構造

Amino acid sequence of AtaA(3630a.a.)

N Signal peptideMNKIYKVIWNATLLAWVAVSELAKGKTKSTTSKSKAKSLSSSVIVGGIILTTPLSLIA/ATVQVGGGTNSGTTATASTNCADLYNYQNPENSGSGAAGNYNAGNPSVCSIAIGENAQGGTSGTGGSPGIAIGGNSKATGGLSVAIGGYAQATNVGSIALGTAALSSGFNSLAISRQAAATNNYSIAIGTTSVSKGVGSIAMGHSTNASGDQSIAIGSSDAVNSATATTTYDGTTNTQASGSKSIAIGASAKASTNNSIALGAGSVTSAQSGNSYLTGVGASATNGVVSVGTSTATRRIQNVADG-------SAASDAVTVAQLDKAYDDTNGRLAAALGTGSGAAYNAANNTYTAPTNIGGTGKNTIDDAIKATQRSVVAGSNIVVTPTTASDGSISYSVATSATPTFTSITVNNAP-------TAGTDATNKTYVDSKAAASRTEVAAGSNVSGVVKTTGANGQDVYTVNANGTTASAGSSAVTVTPGTKDANNVTDYKVDLSATTKTDIQKGVDAKNAVDTAGLKFKGDTATTSNTKKLGDTVSITGDTNISTVATTDGVQVKLNPNLDLGATGSVKTGNTTINNAGVTADQVTVGGVVINNTSGINAGGKAITNVAAP-------TNNTDAANKKYVDDAGTALTN----LGFGLKAQDGTTVNKKLGEAVDIVGSNSNISTKVNAGKVEVALSNTLDLGTTGSVTTGSTVINNAGVTATQVTANKVTINNAP-------TAGTDATNKTYVDSKAAASRTEVAAGSNVSGVVKTTGANGQDIYAVNANGTTASAGSSAVTVTPGTKDANNVTDYKVDLSATTKTDIQKGVDAKNAVDTAGLKFKGDTATTSNTKKLGDTVSITGDTNISTVATTDGVQVKLNPNLDLGATGSVKTGNTTINNAGVTADQVTVGGVVINNTSGINAGGKAITNVAAP-------TNNTDAANKKYVDDAGTALTN----LGFGLKAQDGTTVNKKLGEAVDIVGSNSNISTKVNAGKVEVALSNTLDLGTTGSVTTGSTVINNAGVTATQVTANKVTVNNAP-------TAGTDATNKTYVDSKAAASRTEVAAGSNVSGVVKTTGANGQDVYTVNANGTTASAGSSAVTVTPGTKDANNVTDYKVDLSATTKTDIQKGVDAKNAVDTAGLKFKGDTATTSNTKKLGDTVSITGDTNISTVATTDGVQVKLNPNLDLGATGSVKTGNTTINNAGVTADQVTVGGVVINNTSGINAGGKAITNVAAP-------TNNTDAANKKYVDDAGTALTN----LGFGLKAQDGTTVNKKLGEAVEVVGADSNITTKVAGGQVAIELNKNLNNLTGITVNDGTNGTNGSTVIGKDGISVKDGSGNTIAGVDNTALTVKDGSGNTETSINQAINTLNAAQGETDKFAVKYDKNADGSVNYNNITLAGTTASSTQDATTGK----ITTTGGTSLNNVASA-GDYKDVANASKGVNAGDLNNAVVDATNAATSKGFALQAADGAKVQKNLGEAVEVVGADSNITTKVAGGQVAIELNKNLNNLTGITVNDGTNGTNGSTVIGKDGISVKDGSGNTIAGVDNTALTVKDGSGNTETSINQAINTLNAAQGETDKFAVKYDKNTDGSTNYNSIT-AGNGNGTAATIGTDTAGNSVVTSGGTKISNVANG-------VNASDAVNKGQLDSLSTGLTN----TGFGLKAADGNTVNKKLGEAVDVVGADSNITTKVAGGQVAIELNKNLNNLTGITVNDGTNGTNGSTVIGKDGISIKDGSGNTIAGVDNTALTVKDGSGNTETSINQAINTLNAAQGETDKFAVKYDKNADGSANYNNITLAGTTASSTQDATTGK----ITTTGGTSLNNVASA-GDYKDVANASKGVNAGDLNNAVVDATNAATSKGFALQAADGAKVQKNLGEAVEVVGADSNITTKVVGGQVAIELNKNLNNLTGITVNDGTNGTNGSTVIGKDGISVKDGSGNTIAGVDNTALTVKDGSGNTETSINQAINTLNAAQGETDKFAVKYDKNADGSVNYNNITLAGTTASSTQDATTGK----ITTTGGTSLNNVASA-GDYKDVANASKGVNAGDLNNAVVDATNAATSKGFALQAADGAKVQKNLGEAVEVVGADSNITTKVAGGQVAIELNKNLNNLTGITVNDGTNGTNGSTVIGKDGISVKDGSGNTIAGVDNTALTVKDGSGNTETSINQAINTLNAAQGETDKFAVKYDKNADGSVNYNNITLAGTTASSTQDATTGK----ITTTGGTSLNNVASA-GDYKDVANASKGVNAGDLNNAVVDATNAATSKGFALQAADGAKVQKNLGEAVEVVGADSNITTKVAGGQVAIELNKNLNNLTGITVNDGTNGTNGSTVIGKDGISVKDGSGNTIAGVDNTALTVKDGSGNTETSINQAINTLNAAQGETDKFAVKYDKNADGSANYNNVTLAGTNGTIISNVKAG----AVTSTSTDAINGSQLYGVANSVKNAIGGSTTIDATTGAITTTNIGGTGSNTIDGAISSIKDSATKAKTTVSAGDNVVVTSGTNADGSTNYEVATAKDVNFDKVTVGSVVVDKSSNTIKGLSNT--TWNGTAVSGQAATEDQLKTVSD-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AQGETDKFAVKYDKNADGSANYNSIT-AGNGNGTAATIGTDTAGNSVVTSGGTKISNVANG-------VNASDAVNKGQLDSLSTGLTN----TGFGLKAADGNTVNKKLGEAVDVVGADSNITTKVAGGQVAIELNKNLNNLTGITVNDGTNGTNGSTVIGKDGISIKDGSGNTIAGVDNTALTVKDSSGNTETSINQAINTLNAAQGETDKFAVKYDKNADGSVNYNNVTLAGTNGTIIRNVKAG----AVTSTSTDAINGSQLYDIANSVKNAIGGSTTRDVTTGAITTTNIGGTGSNTIDGAISSIKDSATKAKTTISAGDNVVVTSGTNADGSTNYEVATAKDVNFDKVTVGNVVVDKANDTIQGLSNKDLNSTDFATKGRAATEEQLKAVITSNITEVVDGNGNKVNIIDQVVNTKPDNKNQDSLFLTYDKQGQETTDRLTIGQTVQKMNTDGIKFFHTNADTSKGDLGTTNDSSAGGLNSTAIGVNAIVANGADSSVALGHNTKVNGKQSIAIGSGAEALGNQSISIGTGNKVTGDHSGAIGDPTIVNGANSYSVGNNNQVLTDDTFVLGNNVTKTIAGSVVLGNGSAATTGAGEAGYALSVATNADKAAITKTTSSTGAVAVGDASSGIYRQITGVAAG-------SVDSDAVNVAQLKAVGNQVVTTQTTLVNSLGGNAKVNADGTITGPTYNVAQGNQTNVGDALTALDNAINTAATTSKSTVSNGQNIVVSKSKNADGSDNYEVSTAKDLTVDSVKAGDTVLNNAGITIGNNAVVLNNTGLTISGGPSVTLAGIDAGNKTIQNVANA-------VNATDAVNKGQLDSAINNVNNNVNELANNAVKYDDASKDKITLGGGATGTTITNVKDG----TVAQGSKDAVNGGQLWNVQQQVDQNTTDISNIKNDINNGTVGLVQQAGKDAPVTVAKDTGGTTVNVAGTDGNRVVTGVKEG----AVNATSKDAVNGSQLNTTNQAVVNYLGGGAGYDNITGSFTAPSYTVGDSKYNNVGGAIDALNQADQALNSKIDNVSNKLDNAFRITNNRIDDVEKKANAGIAAAMALESAPYVPGKYTYAAGAAYHGGENAVGVTLRKTADNGRWSITGGVAAASQGDASVRIGISGVID

Nhead

Chead

Nstalk

Cstalk

C-terminal transmembrane anchor (TM)

1000

250

500

750

1500

1250

2000

1750

2500

2250

3000

2750

3500

3250

Nhead Nstalk Chead Cstalk

0

FL

SP Ylhe

ad_

1FG

G_1

GAN

G_1

GAN

G_2

GAN

G_3

Trp-

ring_

1 GIN

_1Tr

p-rin

g_2 G

IN_2

GAN

G_4

GAN

G_5

Trp-

ring_

3 GIN

_3Tr

p-rin

g_4 G

IN_4

GAN

G_6

GAN

G_7

Trp-

ring_

5 GIN

_5Tr

p-rin

g_6 G

IN_6

DALL

1_1

DALL

1_2

DALL

1_3

DALL

1_4

DALL

1_5

DALL

1_6

DALL

1_7

DALL

1_8

Trp-

ring_

7 GIN

_7Tr

p-rin

g_8 G

IN_8

Trp-

ring_

9 GIN

_9Tr

p-rin

g_10 G

IN_1

0Tr

p-rin

g_11 G

IN_1

1

Trp-

ring_

12 GIN

_13

GAN

G_8

FGG

_2G

IN_1

2

GAN

G_9

FGG

_3G

IN_1

4

Ylhe

ad_

2

GAN

G_1

0FG

G_4

GIN

_15

YDD

DALL

3FG

G_5

head

Cap

TM

HIM

1 Hydrophobic core

7-residue repeat 2 helical turn

a and d :hydrophobic residues

SPYlheadNeckFGGGANGGIN

Trp-ringHeadCap (FGG-HANS)HIMDALL (DALL1, YDD, DALL3)

TM

Homotrimer forming multi-domains connected to left-handed coiled coils

AtaA：材料表面への微生物細胞の特異的付着をもたらす

Trimeric autotransporter adhesion (TAA)

YadABadA

422 a.a.

3630a.a. 3082 a.a. N

N

N C

CC

AtaA

TAAの主要な機能

① ECM (コラーゲン, フィブロネクチン) ,細胞表層, 自己細胞への特異的付着

② 非生物表面への非特異的付着によるバイオフィルム形成促進

Acinetobacter trimeric autotransporter Adhesin : AtaA

Ishikawa, et al., J. Biosci. Bioeng. (2012)

Tol 5 WT (AtaA: 3630 aa) Yersinia enterocoliticaWA-314 (YadA: 455 aa)

Bartonella henselaestr. Marseille (BadA: 3036 aa)

10 µm

TAA保有細菌間の材料表面への付着性の差異

9

新技術の特徴・従来技術との比較１

ゲル包括法:

高分子ゲル

•ゲル内部での物質移動律速

•ゲルの脆弱性

•ゲルからの細胞の漏えい

微生物細胞の固定化に最も使われている手法

欠点

AtaAを介した材料表面への直接固定

•簡便

•物質移動律速なし

•機械強度の高い担体選択

•剥離細胞の再付着

固定化担体

新規の方法:

優位性

従来技術 新技術

10

新技術の特徴・従来技術との比較２

• 従来は水中または濡れた状態での接着は困難であったが、AtaAは水中でも接着させることが可能である。

• 材料表面を官能基などで修飾する場合は、表面の活性化処理が必要であったが、そのような前処理は必要なく、既存のバルク材料に直接AtaA分子でコーティング可能である。

• 表面で分子が凝集してしまうと接着を制御できないが、AtaAは単層吸着が可能である。

11

想定される用途

• 微生物細胞の固定化→新規バイオリアクター

• 分子固定による表面の機能化

• 水中での分子固定

医薬品・化成品工業の分離プロセス、再生医療、細胞工学、医用工学、バイオセンサー、表面改質、機能性材料設計

0

2

4

6

8

10

ADP1/pARP3 ADP1/pAtaA

*C

ellc

once

ntra

tion

[g/L

]

Appl. Microb. Biotech. (2015) 99:5025-5032

増殖と同時に固定化可能。担体に細胞を濃縮。

0

2

4

6

8

10

12

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

10

20

30

40

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

0

20

40

60

80

100

120

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

2

4

6

8

10

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

a

c

b

dInitial cell suspension [mg/cm3]

Initial cell suspension [mg/cm3]

Initial cell suspension [mg/cm3]

Initial cell suspension [mg/cm3]

Pack

ed c

ell d

ensi

ty [m

g/cm

3 ]Pa

cked

cel

l den

sity

[mg/

cm3 ]

Pack

ed c

ell d

ensi

ty [m

g/cm

3 ]Pa

cked

cel

l den

sity

[mg/

cm3 ]

Appl. Microb. Biotech. (2015) 99:5025-5032

様々な材料への固定化。固定化量は担体材料のパッキング効率次第

AtaA (-) AtaA (+)

Pack

edce

llde

nsity

[mg/

cm3 ]

0

2

4

6

8

Control ControlLyophilized LyophilizedWet cellsWet cells

乾燥菌体も緩衝液等に再懸濁後に固定化可能

Time [min]

Con

cent

ratio

nof

p-ni

troph

enol

[mM

]

0

0.4

0.2

0.8

0.6

1.0

1.2

1.4

0 60 240120 180 300

(+) AtaA(–) AtaA

0 min 30 min

固定化ADP1 (ataA)細胞によりエステラーゼ反応の繰り返し

ataA遺伝子の導入発現

0.4 g/l インドールを含むリン酸緩衝液（3 ml ）

固定化ST-550 細胞によるインドールからのインディゴ生産

3 h 6 h

Biotechnol. Bioeng. 11, (2014) 16-24, Spotlighted

青色色素（インディゴ）生産菌Acinetobacter sp. ST-550 のAtaAによる固定化

Enterobacter aerogenesによるバイオ水素の連続生産

Catalysts 2018, 8, 159

SNAP-tag is used as model case

SNAP-tag

SNAP-tag

fluorescence substrate

fluorescence substrate

Nhead GCN4pIIGlycine linker

SNAP-tag

SNAP-tag fused with Nhead in C-terminal to avoid steric hindrance of SNAP-tag between two loops of Nhead

New immobilization technology using Nhead

Nhead水中接着タグの開発

Add sample to well and incubate in 1 h, r/t

Add substrate and incubate in 1 h, 37℃, in dark Wash each well with PBS Detect fluorescence

No protein

Nhead-SNAP

PS Ti PTFEGlass

Material

SNAP-tag protein

(control)

Nhead-SNAP can be immobilized on the various materials.

Method

Fluorescence image

Immobilization on the various materialsNhead－SNAP融合タンパク質の固定化

Nhead-SNAPを利用した抗菌表面の作成

Procedure

CAP18 (BG) 固定化により抗菌活性を示した

CAP1

8 (B

G)no

ne

50 μm

有用な機能分子の固定化事例を示した

Result

Observation by CLSM

CAP18 (BG)

Stain biofilm by SYTO9

CAP18GLRKRLRKFRNKIKEKLKKIGQKIQGFVPKLAPRTDYウサギ由来高い抗菌活性

none Nhead-SNAP SNAP

リポソーム表層の修飾

Solid surface

Enzymatic reaction

Adhesion

Decoration

BG

GUS

SNAP-tagged AtaA

SNAP-tag

Bacterial cell-size liposome

JACS. 141 (2019) 19058-19066

AtaA断片修飾リポソームの解析

b)

02468

10121416

0 2000 4000 6000

1281 nma)

1281 nm

1718 nmΔataA mutantTol 5 (WT)

BG-liposome treated withthe cell lysate from BL21 (WT)

825 nm

Inte

nsity

/%

Inte

nsity

/%

BG-liposome treated withthe cell lysate from BL21 (pNhNs)

Size /nmSize /nm

NhNs-AtaA Control

c)

0

5

10

15

20

25

0 2000 4000 6000

JACS. 141 (2019) 19058-19066

PS plate

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Fluo

resc

ence

inte

nsity

/ –

***

***

0.02 0.2 2.0

BG EggPC

0.02 0.2 2.0

Liposome

Cell lysate[mg/ml]

0 0

Glass plate

0200400600800

10001200

Fluo

resc

ence

inte

nsity

/ –

**

***

0.02 0.2 2.0BG EggPC

0.02 0.2 2.0Liposome

Cell lysate[mg/ml] 0 0

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 10 20 30 40

Fluo

resc

ence

Inte

nsity

/ –

Time /min

BG-LUVGUS EggPC-LUV

リポソームの固定化と固定化リポソームによる酵素反応

基質TokyoGreen-βGlu の加水分解反応による蛍光を計測

リポソームに内包した酵素βグルクロニダーゼ（GUS)による反応

JACS. 141 (2019) 19058-19066

24

実用化に向けた課題

• AtaA断片が分子接着剤や表面機能化剤として利用可能であることまでは示された。

• 耐久性や安定性を評価する必要がある。

• 現在、接着メカニズムの完全解明を目指している。

• 実用化に向けては、タンパク質の大量生産技術を構築することが必要。

25

企業への期待

• バイオ生産プロセスの効率化・コストダウンを図りたい企業には、微生物固定化技術の導入は有効

• 低炭素化、温暖化対策にも発展可能

• AtaAの生産技術確立に向けた共同研究

• AtaAの用途開発に向けた共同研究

• 気相反応リアクターなど、新しいバイオリアクターについての共同研究（悪臭除去、芳香生産なども含む）

• 微生物・酵素による物質生産に関する共同研究

• 水処理・浄化、空気浄化に関する共同研究

26

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ： 接着タンパク質

• 出願番号 ： 特願2019-132488• 出願人 ： 名古屋大学

• 発明者 ： 堀 克敏

• 発明の名称 ： 分離ペプチド

• 出願番号 ： 特願2019-132490• 出願人 ： 名古屋大学

• 発明者 ： 堀 克敏

（上記の特許において、2020年7月現在 PCT出願中）

27

国家プロジェクト代表・産学連携の経歴• 2014-2016年 JST A-STEP（起業挑戦ステージ）に採択「油脂分解微生物を利用する低コスト・ハイパフォーマンス排水処理システム」

• 2017年6月 大学発ベンチャー（株）フレンドマイクローブ設立

• 2014-2019年 JST先端的低炭素技術開発事業（ALCA）に採択「気相微生物反応を用いる革新的バイオプロセスによるメタン/メタノール変換」

• 2017-2019年 科研費基盤研究A「細菌固定化蛋白質の水中接着能を利用する固体表面のワンポット自在修飾技術の創出」

• 2020-2023年 科研費基盤研究A「強接着・高伸展性蛋白質のナノ力学特性の解明とメカノケミカル材料の創製」

• 2019-2021年 JST未来社会創造事業「持続可能な社会の実現」に採択「微生物パワーによる次世代閉鎖循環式陸上養殖システムの構築」

これまでの共同研究先企業の例東芝、荏原製作所、島津製作所、マルタカ電器、旭化成、帝人、明電舎、日本ゼオン、東邦ガス

28

お問い合わせ先（必須）

名古屋大学

研究協力部 社会連携課 産学官連携係

ＴＥＬ 052－789－5545

e-mail k-sangakukan@aip.nagoya-u.ac.jp