微生物学实验微生物学实验

指导教师 龙健 Ph D指导教师: 龙健儿 Ph.D.

第三教学实验室

实实 验验 细菌的形态与染色细菌的形态与染色实实 验验 一一 细菌的形态与染色细菌的形态与染色

内容：内容：

1. 1. 实验课总体安排实验课总体安排

22 实验室规则实验室规则 2. 2. 实验室规则实验室规则

3. 3. 录像：生物安全录像：生物安全(part I)(part I) 4. 4. 学生操作：革兰染色法学生操作：革兰染色法（（Gram stain)Gram stain)

55 细菌形态示教细菌形态示教 55、细菌形态示教、细菌形态示教

（示教镜：每实验室一套）（示教镜：每实验室一套）

实验课的总体安排和要求

安排及要求安排及要求

共8次实验课 需交实验报告的部分：革兰染色 粪便标本 需交实验报告的部分：革兰染色、粪便标本

细菌的分离鉴定、肥达试验

成绩评定： 实验报告10分+平时成绩与讨论课成绩10 实验报告10分+平时成绩与讨论课成绩10

分=20分

注：迟到一次扣1分，缺勤一次扣2分

座次固定 不能随意调换 座次固定，不能随意调换

讨论课专题讨论课专题 白喉棒状杆菌 白喉棒状杆菌 流感嗜血杆菌

（实验六） 军团菌

鲍特菌

（实验六）

鲍特菌 炭疽芽胞杆菌 炭疽芽胞杆菌 铜绿假单胞菌 （实验七） 鼠疫耶氏菌

放线菌属/布鲁菌

（实验七）

放线菌属/布鲁菌

分组讨论分组讨论

分组：自由组合，团队合作准备 分组：自由组合，团队合作准备 要求：

1 小组共同准备材料及PPT1.小组共同准备材料及PPT2.PPT简洁、条理清晰3 讲述清楚 表达准确 逻辑清晰3.讲述清楚、表达准确、逻辑清晰4.资料充分

形式 不限（讲课 讨论 演戏 小品等） 形式：不限（讲课、讨论、演戏、小品等） 评分：

1.同学评分为主，教师评分辅助2.小组得分=个人得分

实验室规则介绍（实验室规则介绍（11））实验室规则介绍（实验室规则介绍（11））

一、进实验室必须穿一、进实验室必须穿实验服实验服，书包文具，书包文具应放在实验台下之抽屉里。应放在实验台下之抽屉里。

二 实验室内二 实验室内不准吃东西不准吃东西，天热，天热不要穿不要穿 二、实验室内二、实验室内不准吃东西不准吃东西，天热，天热不要穿不要穿拖鞋拖鞋进实验室，以防实验室感染。进实验室，以防实验室感染。

做实验时要保持安静有序 要爱护做实验时要保持安静有序 要爱护 三、做实验时要保持安静有序，要爱护三、做实验时要保持安静有序，要爱护实验器材。实验器材。

四、四、使用煤气灯时要注意使用煤气灯时要注意，防止灼伤或，防止灼伤或烧坏衣物烧坏衣物烧坏衣物。烧坏衣物。

实验室规则介绍（实验室规则介绍（22））实验室规则介绍（实验室规则介绍（22））

五、实验用过的带有传染性的吸管、玻片等，五、实验用过的带有传染性的吸管、玻片等，分别放进指定的消毒筒内分别放进指定的消毒筒内 待消毒或废弃物待消毒或废弃物分别放进指定的消毒筒内，分别放进指定的消毒筒内，待消毒或废弃物待消毒或废弃物品必须放在指定地点品必须放在指定地点。。

六、如有传染性材料污染桌面、地面、书或六、如有传染性材料污染桌面、地面、书或衣物，应立即报告教师，在教师指导下进行衣物，应立即报告教师，在教师指导下进行消毒处理。消毒处理。

七、如有活菌碰到手上，应将手在七、如有活菌碰到手上，应将手在0.10.1%%新洁新洁如有活菌 到手 应将手在如有活菌 到手 应将手在 新洁新洁尔灭溶液中浸泡清洗，再用自来水冲洗尔灭溶液中浸泡清洗，再用自来水冲洗

实验室规则介绍（实验室规则介绍（33））实验室规则介绍（实验室规则介绍（33））

八、八、实验完毕，各人应做好实验物品整实验完毕，各人应做好实验物品整理工作理工作，将使用过的物品（如接种环、，将使用过的物品（如接种环、染色液、擦镜纸、香柏油、点火枪、标染色液、擦镜纸、香柏油、点火枪、标染色液、擦镜纸、香柏油、点火枪、标染色液、擦镜纸、香柏油、点火枪、标签纸、记号笔等）放归原处，擦镜纸等签纸、记号笔等）放归原处，擦镜纸等

废弃物不要投入水槽内废弃物不要投入水槽内废弃物不要投入水槽内。废弃物不要投入水槽内。

九、微生物九、微生物实验材料（如细菌涂片、细实验材料（如细菌涂片、细菌培养物 不准携带出实验室菌培养物 不准携带出实验室菌培养物）不准携带出实验室菌培养物）不准携带出实验室。。

实验室规则介绍（实验室规则介绍（44））实验室规则介绍（实验室规则介绍（44））

十、实验结束后，用消毒液（十、实验结束后，用消毒液（0.1%0.1%新洁新洁尔灭）或消毒药皂清洗双手尔灭）或消毒药皂清洗双手,,再用自来水再用自来水冲洗，脱去实验服，方可离开实验室。冲洗，脱去实验服，方可离开实验室。冲洗 脱去实验服 方可离开实验室冲洗 脱去实验服 方可离开实验室

十一、十一、每次留一组依次轮流做值日每次留一组依次轮流做值日生，生，将将实验室清扫 实验桌整理清洁 关好实验室清扫 实验桌整理清洁 关好将将实验室清扫、实验桌整理清洁，关好实验室清扫、实验桌整理清洁，关好水、电、煤气水、电、煤气和窗。和窗。

革兰染色实验革兰染色实验革兰染色实验革兰染色实验

学生操作：每人独立操作学生操作：每人独立操作

材料材料 两人 组两人 组 材料：材料：两人一组两人一组

––菌种：白色葡萄球菌及大肠杆菌斜面菌种：白色葡萄球菌及大肠杆菌斜面菌种 葡萄球菌 大 杆菌斜菌种 葡萄球菌 大 杆菌斜各一支各一支

玻片每人玻片每人11 22张张––玻片每人玻片每人11--22张张––革兰染色液一套革兰染色液一套

––接种环每人一支接种环每人一支

染色法（染色法（ t i it i i ））染色法（染色法（stainingstaining）） 正染色法正染色法 （（positivepositive stainstain））：：

菌体着色背景不现色菌体着色背景不现色

–– 单染色法单染色法 （（basicbasic stainingstaining ））：显示菌体形态：显示菌体形态

–– 复染色法复染色法 （（ countercounter stainingstaining ））：区分细菌：区分细菌 革兰染色法革兰染色法（（GramGram stainstain）） 抗酸染色法抗酸染色法（（fastfast--acidacid stainstain ））

负染色法负染色法 （（negativenegative stainstain））：：

菌体不现色背景现色菌体不现色背景现色

革兰染色法（革兰染色法（Gram stainGram stain））革兰染色法（革兰染色法（Gram stainGram stain））

18841884年丹麦科学家年丹麦科学家18841884年丹麦科学家年丹麦科学家

HansHans christianchristian GramGram创建创建

Gram stain Gram stain 原原 理理

等电点等电点 PIPI 2233 PIPI 4455 带负电荷多带负电荷多 带负电荷少带负电荷少

通透性通透性 低低 高高 肽聚糖多肽聚糖多，，脂质少脂质少 肽聚糖少肽聚糖少，，脂质多脂质多 肽聚糖多肽聚糖多，，脂质少脂质少 肽聚糖少肽聚糖少，，脂质多脂质多 酒精不易进入酒精不易进入 酒精易进入酒精易进入

G t iG t i 意义意义Gram stain Gram stain 意义意义

11 .. 鉴别细菌：分成鉴别细菌：分成GG++菌和菌和GG－－菌菌

22 .. 选择药物：选择药物：

GG++菌和菌和GG－－菌对抗菌药物菌对抗菌药物GG 菌和菌和GG 菌对抗菌药物菌对抗菌药物

敏感性不一样敏感性不一样。。

33 .. 与致病性有关：与致病性有关：

GG++菌菌 致病性蛋白致病性蛋白 肽聚糖肽聚糖 磷壁酸磷壁酸GG++菌：菌：致病性蛋白致病性蛋白、、肽聚糖肽聚糖、、磷壁酸磷壁酸

GG－－菌：菌：内毒素内毒素菌菌 内毒素内毒素

革兰染色法革兰染色法 G t iG t i革兰染色法革兰染色法 Gram stainGram stain

制备一张好涂片的基本要素：制备一张好涂片的基本要素：

11、玻片不含油脂、玻片不含油脂((油脂可用卷筒纸蘸油脂可用卷筒纸蘸

95%95%酒精擦干净酒精擦干净))。。

22 生理盐水应尽量少加生理盐水应尽量少加 22、生理盐水应尽量少加。、生理盐水应尽量少加。

33、取菌不宜过多。、取菌不宜过多。 33、取菌不宜过多。、取菌不宜过多。

革兰染色法革兰染色法 G t iG t i革兰染色法革兰染色法 Gram stainGram stain

涂片制备：按下图分别加生理盐水各一滴，再按下图分别加菌研匀下图分别加菌研匀

菌 1 菌 1+ 菌 2 菌 2

烘干，标本面朝上，火焰上来回通过3-5次固定

革兰染色操作步骤：

水洗 G+

水

涂片 结晶紫 碘液

洗

G-

水洗 水洗

涂片固定

结晶紫

初染10 s 碘液

媒染10 s 脱色剂10 20s

番红/沙黄10-20s 复染10s

注意事项注意事项：

1. 在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2. 严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。

3. 在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准，最后油镜观察。

实验日期: 实验人员:

实验名称:

实验目的：实验目的：实验原理：实验材料：实验材料：实验方法与步骤：

1.2.……

实验结果：实验结果：1.2.2.……

讨论分析：

记录人:

细菌形态观察（细菌形态观察（革兰染色革兰染色））细菌形态观察（细菌形态观察（革兰染色革兰染色））

Streptococcus-链 球 菌 Staphylococcus-葡 萄 球 菌

streptococcus 链 球 菌 E.coli-大 肠 杆 菌

细细 菌菌 形形 态态 观观 察察细细 菌菌 形形 态态 观观 察察

美 蓝 染 色 奈 瑟 染 色

脑脊液标本涂片中的脑膜炎双球菌-N iN.meningcoccus

细细 菌菌 形形 态态 观观 察察细细 菌菌 形形 态态 观观 察察

肺 炎 球 菌 荚 膜-capsule

细细菌菌形形态态观观察察细细菌菌形形态态观观察察

光学显微镜下形态 电子显微镜下形态

两 图 匀 显 示 破 伤 风 杆 菌 芽 胞图 匀 示 伤 杆 菌 芽 胞endospore of C.tetani

细细菌菌形形态态观观察察细细菌菌形形态态观观察察

电镜下鞭毛和菌毛的形态 光学显微镜下变形杆菌proteus-周身鞭毛flagellum

注意：注意：

1.实验报告下次实验课上课时上交；1.实验报告下次实验课上课时上交；

2.讨论课的任务和分组安排下次上2.讨论课的任务和分组安排下次上

课时上交；课时上交；

3.值日生打扫卫生，注意关闭水、3.值日生打扫卫生，注意关闭水、

电、煤气。电、煤气。