UE 2 – BiopathologieM. MERLIO

Promo: P2 2016 – 2017 Enseignant: M. MERLIO Ron éistes : MANGON Lola ROBIN Clémence

Facteurs prédictifs

I. Oncogénèse et addiction

II. Pronostic et théranostic

III. Voies de signalisation   : ex RTK

IV. Ciblages de RTK/MAPK les anticorps et les IK1. Cancer colorectaux 2. CBNPC 3. Mélanome

1. Oncogenèse et addiction

3 grandes catégories de gènes liés aux pathologies cancéreuses :- Les oncogènes (proto-oncogènes)

Régulateurs positifs (moteurs) de la prolifération cellulaire Gain de fonction, altération dominante d’une des deux copies suffit

- Les gènes suppresseurs de tumeurs (anti oncogène) Frein à la prolifération cellulaire Altération récessive (les deux allèles doivent être mutés)Rq : Sauf dans le cas de mutations dominantes négatives ou de protéines multimériques ou la mutation d’un seul allèle peut être dominante

- Les gènes de systèmes de réparation de l’ADN (« care-takers ») sont une catégorie particulière de gène suppresseur de tumeur capable de réparer les lésions de l’ADN ;

Modificateurs épigénétiques : méthylation des ilots CpG qui entraine une inactivation génique lorsqu’elle atteint les promoteurs ; modificateur des histones (acétylation, méthylation)On dispose, pour les tumeurs qui présentent ces mécanismes, de drogues qui permettent de combattre ces phénomènes de méthylations (drogues déméthylantes) et des drogues inhibitrices des histones dé-acétylase (= Hdac inhibiteur). Au même titre qu’on utilise des chimiothérapies, on peut utiliser des drogues qui vont cibler ces altérations épigéniques.

Rappel sur le modèle d’oncogenèse multi-étapes   : 1. Anomalie primaire donnant un avantage de survie ou de prolifération responsable de l’initiation 2. Anomalies secondaires, donnant un avantage pour l’acquisition du phénotype cancéreux permettant à la tumeur de grossir, responsable de la transformation

Les Anomalies primaires ou pilote dont les cellules tumorales restent dépendantes (addiction) : - BRAF et mélanome- EGFR et adénocarcinome du poumon- Ces anomalies primaires initient la tumeur mais ne sont pas toujours suffisantes à son

développemento BRAFi/600E non spécifique du mélanome. Il y a des mutations de BRAF dans les mélanomes

mais ce n’est pas spécifique du mélanome : on peut observer des tumeurs bénignes des mélanocytes qui possèdent cette mutation. Donc on peut, encore au stade de tumeur bénigne, avoir des mutations initiatrices mais qui n’ont pas était suffisante à l’acquisition du phénotype malin.

o Translocation t(14 ;18) impliquant BCL2 (lymphome) : des personnes portant la mutation peuvent être porteurs sains

o MYD88 (protéine des lymphocytes qui intervient dans l’immunité innée) et lymphome B à grande cellule

L’introduction de MYD88 L265P ne déclenche pas de tumeur L’inhibition de MYD88 par RNAi inhibe la survie des lignées MYD88L265P

- Modifications épigénétique précoces : méthylation, acétylationo EZH2 (protéine qui intervient sur l’acétylation des histones) et lymphome ou tumeur solide

- Anomalies surajoutées par instabilité génétique : exemple cancer colorectale = CCR o Anomalie chromosomique dans 85% des cas. La succession poly-adénome, dysplasie,

mutation d’APC, de K-RAS, de TP53 jusqu’à carcinome correspond au modèle de Vogelstein de la carcinogenèse colique multi-étapes.

o Instabilités micro-satellitaire (tumeurs à MSI) avec soit des mutations germinales (dans le cas du syndrome de Lynch) soit des mutations sporadique ou somatique qui correspondent à 10% des carcinomes colorectaux qui sont souvent BRAF mutés.

o Phénotype méthylateur  : méthylation des promoteurs qui vont inactiver un certain nombre de gènes comme MNH1

- Activation voies intracellulaire cibles (NFKB, IRF4)

La tumeur devient maligne pas uniquement à cause des anomalies primaires mais elle en reste dépendante : c’est le phénomène d’addiction. La cellule tumorale reste dépendante de cette mutation fondatrice et si on combat cette mutation on va inhiber la croissance de la cellule tumorale. Les anomalies initiatrices de la tumeur représentent des cibles thérapeutiques potentielles.

2. Facteur pronostics et prédictifs

A) Facteurs pronostics

Les facteurs pronostics estiment le potentiel évolutif d’un processus tumoral spécifique.Ils permettant de sélectionner les patients à haut risques évolutif susceptible d’être orientés vers des protocoles thérapeutiques adaptés/renforcés par rapport aux patients qui n’ont pas de hauts risques et qui peuvent avoir un protocole allégé. Ex : Dans le cas du neuroblastome : les patients ayant une amplification de N-MYC doivent avoir une chimiothérapie intensive et une greffe de moelle. Ceux qui n’ont pas d’amplification de N-MYC ont une survie bien meilleure donc il n’est pas nécessaire de leur faire un traitement aussi agressif. Ils sont évalués chez des patients recevant le même protocole standard.

Dans la littérature on a énormément de facteurs pronostics des cancers (ex : âge, indices de prolifération). Pour la santé publique et les statistiques il faut avoir des modèles multivariés pour estimer le poids des différentes données (lié au patient, à la tumeur, au système immunitaire). C’est difficile de prendre une décision thérapeutique uniquement sur des facteurs pronostics.

B) Facteurs prédictifs ou théranostics

Les facteurs prédictifs prédisent une réponse ou non à thérapie donnée.Pour être évalués, on crée 2 groupes de patients de préférence randomisés. Un groupe test le nouveau protocole thérapeutique par opposition, dans l’autre groupe, soit à l’absence de toute thérapie, soit à un protocole standard type.

On va évaluer ces facteurs prédictifs sur des courbes de survies globales (SG ou OS = overall survivor) ou de survie sans progression (PFS = progression free survival).

Etude   : comparaison de l’inhibiteur gefit (inhibiteur de tyrosine kinase) avec une chimiothérapie le carboplatine. (Différents graphiques montrant des courbes de survie sans progression pour le gefitinib et pour la chimiothérapie)

Groupe A (dans la population globale) : Les deux courbes se croisent sans effet significatif d’un traitement par rapport à un autre.

Groupe B (patient qui possèdent une mutation de l’EGFR) : Il y a un avantage de survie pour les patients traité par le Gefitinib par rapport ceux traités par la chimiothérapie standard.

Groupe C (patient qui n’ont pas la mutation EGFR) : Le traitement par gefitnib marche beaucoup moins bien que la chimiothérapie.

Groupe D (patient pour lesquels on a pas le statut EGFR) : les deux courbes se croisent qui suggèrent un effet bimodal/bi-phasique qui montre qu’il y a deux types de patients : répondeur (ceux qui ont EGFR muté) et un non répondeur (ceux qui n’ont pas EGFR muté).

Pour le carboplatine les courbes se ressemblent pour tous les groupes de patients car c’est une chimiothérapie générale qui tue de manière aléatoire les cellules tumorales, indépendamment du statut EGFR. Les facteurs prédictifs de réponse thérapeutique permettent par leur analyse moléculaire de prédire la réponse à un médicament.

Intérêt des facteurs prédictifs de réponse thérapeutique :- Administrer la thérapeutique uniquement à la sous-pop qui va en tirer du bénéfice- Ne pas administer la thérapeutique à la sous population qui ne va pas en tirer profit- Economie car ces traitements sont très cher : les patients doivent bien être sélectionnés.

Rq : Un même biomarqueur peut être pronostic ou théranostic.

Boite à outils pour la détection des anomalies moléculaire   : - Immunohistochimie - FISH

- Exploration de translocation - Biologie moléculaire : exploration des phénomènes de mutations.

Exemple : en IHC on voit une expression très forte de HER2 dans un carcinome gastrique visible également en FISH avec une augmentation des signaux rouges qui montre une amplification du gène HER2 dans les cellules tumorales.

Ces techniques sont réalisées sur des blocs de tissus fixés en paraffine.La qualité de l’analyse va dépendre de la qualité des techniques préparatives (délai de fixation, la durée, la paraffine, le matériel).La demande d’analyse est faite par le clinicien puis l’envoie des blocs vers un laboratoire se fait par le pathologiste. On recherche des mutations sur la zone correspondant à la tumeur en estimant le pourcentage de cellules tumorales et en évitant les zones nécrosées ou non tumorales.

L’IHC et la FISH peuvent être réalisées sur des coupes au microtome de 3 à 4 microns d’épaisseur.

C) Cas clinique   : Le cancer du sein   :

Ce sont des groupes de tumeur hétérogène : 70% sont hormonosensible et 30% non hormonosensible (exprime ou non des récepteurs hormonaux aux œstrogènes RE ou à la progestérone RP). L’interaction hormone-récepteur favorise la croissance tumorale et donc on va combattre cette interaction avec des drogues.

On peut mettre en évidence ce facteur prédictif par technique d’IHC : - Les cellules tumorales hormonosensibles vont exprimer très fortement au niveau nucléaire ces

récepteurs aux hormones stéroïdes.- Les cellules tumorales non-hormonosensibles ne vont pas exprimer du tous ces récepteurs aux

hormones stéroïde.- Les cellules non-tumorales vont être positives (raisonnablement) pour ces récepteurs hormonaux.

Cela va permettre de sélectionner un traitement antihormonal (on parle d’hormonothérapie) chez les patientes présentant des cellules tumorales hormonosensibles. Par exemple, le Tamoxifène qui est un inhibiteur des récepteurs aux œstrogènes ou un anti-aromatase qui est un inhibiteur de la transformation des androgènes surrénaliens en œstrogène. Ces drogues vont réaliser une castration chimique au niveau de la tumeur mais aussi de la patiente. Les effets secondaires sont importants comme la stérilisation ou la perte de certains caractères sexuels. Il est donc important de donner ce traitement uniquement aux patientes qui vont en tirer bénéfice.

Quand on a des récepteurs hormonaux positifs c’est également un facteur pronostic (meilleur pronostic) et c’est également un facteur prédictif (d’une bonne réponse à l’hormonothérapie). A l’inverse les tumeurs RE négatifs répondent mieux à la chimiothérapie.

Amplification du gène dans 10 à 20% des cas des cancers du sein. Cela entraine une surexpression protéique d’HER2 et donc l’activation de la croissance cellulaire, l’augmentation de la synthèse d’ADN et l’augmentation du potentiel métastatique.

HER2 est le deuxième membre de la famille de l’EGFR qui peut être surexprimé au niveau protéique dans les tumeurs et joue un rôle sur la croissance cellulaire.

Pour localiser HER2   : les ARN messager de HER2 ne sont positif que dans les cellules de type mammaire et vont entrainer l’expression d’une glycoprotéine transmembranaire qui est un RTK numéro 2 de la famille de l’EGFR. 2 techniques pour détecter la répartition de de HER2 dans nos cellules :

- Des Ac qui vont détecter la protéine a la surface de la cellule - Une technique de FISH qui va permettre d’évaluer par rapport à une sonde centromérique le nombre

de copie de HER2.

Sonde centrmoérique : vert Sonde HER2 : rouge Plus de rouge que de vert signifie que le gène HER2 a était amplifié.

3) Voies de signalisation   : ex RTK

Que fait-on pour les patient pris en charge   ? On recherche HER2 avec une IHC - Quand on voit la tumeur très positive on dit que c’est 3 croix et la patiente va bénéficier du

traitement par l’anti-HER2 (= Herceptine)- Quand il y a très peu de marquage on dit que c’est une 1 croix et on ne fera pas l’Herceptine

Pour le score 3 croix et pour le score 1 croix, la décision thérapeutique va se faire sur l’IHC.- Quand on a un score 2 croix c’est-à-dire un marquage en cadre de la majorité des cellules mais avec

certaines cellules qui ne sont pas marqué sur tout leur pourtour, on fait la FISH pour décider si Herceptine ou non.

L’intérêt de HER2   : traduit des tumeurs qui sont plus agressives dans le pronostic spontané (courbe de survie dégringole). Les tumeurs HER2 sont des tumeurs moins agressives. On va essayer avec un anti-HER2 de donner un meilleur pronostic aux formes HER2 positives amplifiées.Des tests ont permis de montrer que quand on rajoute à la chimiothérapie des anti-HER2 on a un meilleur taux de réponse avec une survie global augmenté. Le médicament a prouvé son efficacité ce qui lui permet d’être remboursé (important car très cher).

Ce type d’analyse est fait par le réseau des plateformes de génétique somatique des tumeurs. Ces plateformes sont en charge de faire des tests d’intérêt diagnostic, pronostic ou prédictif pour les cancers, avec des outils de biologie moléculaire.

La cellule cancéreuse exprime des récepteurs a sa membrane et notamment l’EGFR2 qui est le premier membre de la famille des HER2. RQ : HER1=EGFR1 et HER2=EGFR2.Ce récepteur est exprimé par les cellules du cancer du côlon et rectum et des adénocarcinomes pulmonaires.

On va essayer de cibler la voie EGFR. La voie EGFR commence par la fixation normale de ligand induisant la dimérisation du récepteur puis ensuite :

- Soit une activation en fonction des adaptateurs GRB2 / SOS1 - Soit une activation de la voie RAS-MAP kinase avec les RAF MEK ERK. - Soit en fonction notamment de P85 une activation de la voie PI3 kinase AKT mTOR ce qu’on

appelle la voie PI3 kinase AKT.

On a en fonction des cancers différent mécanismes oncogénique.Dans le cancer du poumon non à petite cellule vous avez des mutations activatrice de l’EGFR, des phénomènes de surexpression ou d’amplification du gène EGFR.Dans le cancer du côlon ou le mélanome vous avez plutôt des mutations activatrices de RAS et de RAF.Possibilité de mutation activatrice de PI3 kinase, de perte de fonction de PTEN, un gène suppresseur de tumeur qui inhibe la voie des PI3 kinase AKT et puis la possibilité de mutation activatrice de AKT voir de mTOR.Le parallélisme de ces deux voies va dépendre du type de cellules ou de tumeurs et est sous inhibiteur des phénomènes de cross talk induisant des phénomènes de résistance.

4) Ciblage de RTK/MAPK par les anticorps et les IK

De manière simpliste il existe 2 classes de molécule qui cible cet EGFR :- Ac anti-EGFR injecté en IV - Inhibiteurs de tyrosine kinase

Rappel   : Protéine rechercher par IHC Mutation rechercher par séquençage.

Intérêt de rechercher selon le type de cancer soit mutation soit la protéine.

1 er mode d’action   : On utilise 2 Ac (-mab) : le cétuximab et le panitumab. Ces Ac viennent bloquer la partie extra-cellulaire du récepteur, donc empêcher la fixation du ligand et de ce fait bloquer la voie. On va retrouver ce principe d’anticorps dans les thérapeutiques angiogénique. On utilise des anti-VEGF ou VEGFR pour bloquer l’activation des récepteurs qui permettent la vascularisation des tumeurs. Donc il y a à côté des thérapeutique spécifiques de cellules tumorale, des thérapeutiques par anticorps qui vont s’adresser au stroma tumoral.

2 ème mode d’action   : Ce sont les -nib qui sont des inhibiteurs de tyrosine kinase (erlotinib). Ce sont de toute petites molécules capables de rentrer dans la cellule (contrairement au précédent). Ils vont bloquer le site de phosphorylation des récepteur en étant des compétiteurs notamment avec l’ATP. Ces inhibiteurs de tyrosine kinase sont encore plus actifs s’il y a une mutation du site tyrosine kinase de l’EGFR.

Les principes du ciblage thérapeutique c’est que la cible doit être soit au niveau de l’altération génétique soit en aval de l’activation oncogénique : on va couper la voie activée avec les -mab ou les -nib. Les -mab sont plus actifs s’il y a une amplification ou surexpression. Les -nib sont actifs s’il y a une mutation activatrice.

Rq : Toute les thérapeutiques ciblées ne nécessitent pas de test théranostic. Avec notamment les anti-angiogénique : on ne fait pas de test pour mettre les patients sous anti-angiogénique. L’erlotinib on peut l’utiliser en deuxième ligne dans le cancer du poumon avec certaine recommandation

Malgré cet avantage de ces molécules -nib sur les mutations d’EGFR on a des phénomènes de résistance primaire aux thérapeutiques ciblant l’EGFR qui induisent une exclusion de la thérapeutique. C’est le cas de certaines mutations de l’EGFR qui échappent à l’action des inhibiteurs.

Donc quand vous ciblez avec un -nib ou un -mab une altération génétique ou fonctionnel il faut soit cibler la cible directement soit cibler en aval de la cible. Ça permet d’empêcher l’activation par cascades des phénomènes de phosphorylation et des effets sur la survie, la prolifération, l’angiogenèse et la migration.

Par exemple, c’est la base de l’exclusion des cancers colorectaux qui sont très fréquemment muté pour le gène K-RAS (exon 2 et 3, codon 12, 13, 61, 63) dans 30 à 40% des cancers colorectaux. Donc on ne peut pas utiliser de -mab anti EGFR si on a une mutation de K-RAS en aval. La recherche de mutation peut être soit une recherche de mutation positive pour inclure des patients sous -nib soit une recherche de mutation négative : si on est muté K-RAS on ne peut pas donner ni de -nib ni de -mab parce que on a une mutation d’aval : c’est une mutation d’exclusion. Quand vous êtes K-RAS muté vous ne répondez pas aux anti-EGFR alors que quand vous êtes K-RAS sauvage vous répondez aux anti-EGFR.Donc l’AMM des anti-EGFR ce sont les cancers colorectaux métastatique sans mutation K-RAS. Avant de donner le traitement on recherche les mutations de K-RAS (exon 2, 3, 4 ; codon 12, 13, 61 et 63) et maintenant également de N-RAS et B-RAF.Il y a des mutations de résistance aux anti-EGFR dans le cancer colorectal : mutations de RAS ou de B-RAF, des mutations sur la voie des PI3 kinase ou la voie AKT. Ces mutations peuvent avoir un intérêt diagnostique.Il y a des tumeurs avec pertes d’hétérozygotie instabilité chromosomique qui sont des tumeurs avec nombreux déséquilibre chromosomique et altération très fréquentes des suppresseurs de tumeurs. Elles ont fréquemment des oncogènes K-RAS muté en lien avec l’instabilité chromosomique. A l’inverse il existe des tumeurs du déficit de réparation du mismatch (MSI ; deficient mismatch repear ; 15% des tumeurs CCR) qui sont des tumeurs sans grands déséquilibre chromosomiques avec des rares mutations des autres gènes et il y a des altérations des gène du système de réparation des mésappariements de l’ADN : c’est l’instabilité des microsatellites.Donc le statut B-RAF muté est toujours associé au caractère sporadique du cancer colorectale MSI (40% de mutations dans ces cas-là). Le statut BRAF est à déterminé dans les CCR métastasique : mauvais pronostic dans les tumeurs pMMR (MSI-) et impact thérapeutique MSI+. Ce statut B-RAF permet de dire que ce sont des tumeurs MSI et il a un impact thérapeutique dans les tumeurs MSI+ car elles vont répondre à l’immunochimiothérapie.Il existe de rare cas double muté K-RAS et N-RAS lorsqu’on réalise une étude parallèle et non hiérarchisée.

Les cancers du poumon   : Les cancers du poumon ont soit des mutations K-RAS, soit des mutations d’EGFR soit d’autres mutations de gène actionnable. Globalement autrefois on opposait le cancer du poumon avec une mutation K-RAS au cancer des non fumeurs avec des mutations d’EGFR. Là encore les altérations dans le cancer du poumon ne sont pas les mêmes que dans les cancers du colorectal. Adénocarcinomes pulmonaires :

- Inefficacité des Ac anti-EGFR- Efficacité des inhibiteurs de TK EGFR sur population ciblée- Mutation de KRAS = facteur pronostique (mauvais) mais pas facteur prédictif- Mutation activatrice d’EGFR = facteur prédictif de la réponseDepuis 2010, on fait une analyse des exons 18 à 21 du gène de l’EGFR avec couverture de l’ensemble du territoire national.

Alors comment marchent ces inhibiteurs ? Normalement dans le récepteur EGFR vous avez le ligand qui induit une homodimérisation du récepteur avec arrivée d’une autophosphorylation dépendante de l’ATP qui vient se fixer ici dans une poche du domaine tyrosine kinase. Ceci entraine la phosphorylation du récepteur et donc des résidus tyrosines et l’induction de voies de transduction intra cellulaires.

Lorsqu’il existe une mutation activatrice, il va y avoir une modification d’affinité pour l’ATP et une plus grande affinité pour les inhibiteurs de tyrosine kinase. Ce qui fait que l’ATP a moins d’affinité pour les domaines kinases que n’en ont les inhibiteurs que l’on va employer à titre thérapeutique. D’autres études montrent les mêmes résultats avec les patients mutés EGFR qui répondent bcp mieux que les patients non mutés EGFR.

On a donc cherché l’ensemble de ces mutations : mutations de sensibilité mais également mutations de moindres réponses ou de résistance. On a retrouvé des fréquences variables selon les exons avec des exons hot spot de mutation comme le 19 et le 21 qui regroupent globalement plus de 80, 85% des mutations que l’on découvre.

C) Incidence des mutations dans les mélanomes

On a vu trois types de cancers. Ce sont les trois types de cancers très fréquents : cancer du sein chez la femme, cancer du poumon et cancer digestif.

Le mélanome est une tumeur relativement fréquente et en augmentation dans les pays occidentaux. Ce type de tumeur, le mélanome, peut donner des tumeurs qui sont très différentes selon le mécanisme d’apparition de ces mélanomes. Il y a des mélanomes qui se développent au niveau des muqueuses (mucosal), il y a des mélanomes qui se développent au niveau des extrémités : les mélanomes acraux, c’est notamment les mélanomes que l’on a au niveau des ongles. Il y a des mélanomes qui sont des expositions chroniques au soleil, chronic sun damage (CSD). Ces mélanomes liés au soleil ont assez fréquemment des mutations de KIT et NRAS. Les acraux et les muqueux (notamment les muqueux) ont surtout des mutations de KIT. Et puis il y a des mélanomes qui sont liés à des peaux sans dommage solaire, ce qu’on appelle les peaux photo protégées. Normalement les mélanomes qui surviennent au niveau du tronc du dos (zone peu exposée) sont très souvent avec mutations soit de BRAF soit de NRAS.Cela nous permet de comprendre que la mécanique oncogénique du mélanome peut être variable et qu’il n’y a pas un seul type mais plusieurs types de mélanomes selon leur oncogenèse.On constate également que certains mélanomes (chronic sun damage) sont évitables si on ne s’expose pas au soleil. Il faut donc éviter particulièrement de surexposer les jeunes enfants parce qu’on s’aperçoit que la mode de « bronzer » entraine des mélanomes de type CSD dans des zones qui normalement devraient être des zones de type photo protégées.

On pense que la classification moléculaire des mélanomes va venir doubler en quelque sorte la classification histologique. En effet, la classification histologique des mélanomes distingue les mélanomes de type superficiel qui ont plutôt une phase horizontale de croissance, donc qui s’étendent latéralement au niveau de l’épiderme et du derme superficiel. Il y a des mélanomes dits nodulaires qui sont plutôt des mélanomes qui forment des nodules tumoraux profonds avec une croissance verticale. Et puis il y a des mélanomes liés au sujet âgé, les mélanomes de Dubreuil. On voit que la proportion des altérations génétiques n’est pas la même selon qu’on a différent type de mélanome. Le mélanome acral on l’a dit, mutation de KIT et le mélanome des muqueuses, mutation de KIT également. Rem : On s’aperçoit que les mutations de BRAF c’est extrêmement rare dans les mélanomes des muqueuses par rapport aux mutations de KIT. Alors pourquoi c’est important   ? Pour comprendre comment apparaissent ces mélanomes mais aussi parce qu’on a des inhibiteurs de BRAF, on a des inhibiteurs de KIT et donc en fonction de la mutation, on va pouvoir donner des médicaments différents.

Alors là par exemple ici, depuis 5ans on s’est aperçu qu’un inhibiteur de BRAF : le vemurafemibe , un inhibiteur anti BRAF va augmenter la survie sans progression et la survie globale des patients par rapport au traitement standard de référence. On a bien un facteur prédictif. La survie médiane de la population générale qui était de 7,9 mois (à 7,9 mois, on a perdu la moitié des patients avec le traitement global) n’est pas atteinte avec le vermurafenib. On a donc une survie médiane beaucoup plus importante.

Alors comment peut-on faire ce type d’analyse   ? On va disséquer la zone de tumeur, on va faire une quantification d’ADN sur un automate qui va nous permettre de quantifier la mutation de BRAF par rapport à l’allèle sauvage. Etude bordeaux : étude comparative avec un anticorps V600E, le clone VE1 qui reconnaît spécifiquement la protéine V600E mutée par rapport à la protéine sauvage. Donc quand on utilise ce clone VE1 on a pas de marquage dans les tumeurs non mutées par rapport à un marquage dans les tumeurs mutées.

Donc vous avez ici en haut à gauche un HES d’un ganglion qui est envahi par un mélanome avec un phénomène de nécrose au centre de la tumeur. Et vous avez ici le VE1 qui marque spécifiquement les cellules tumorales mélanocytaires que vous voyez très bien en bas à gauche. Alors que les cellules normales ne sont pas marquées puisqu’elles ne possèdent pas la mutation. Donc c’est une approche tout à fait originale que de pouvoir détecter la forme mutée d’une protéine avec cet anticorps. C’est malheureusement pas disponible pour l’ensemble des mutations que l’on a vu. Par exemple on a eu des essais d’Ac anti mutation d’EGRF, anti mutation de KRAS mais on a pas globalement avec l’immunohistochimie la possibilité de tester l’ensemble des mutations existantes puisque on a pas d’Ac spécifiques des protéines mutées. Probablement ici, la mutation V600E introduit un épitope antigénique que reconnaît l’Ac, donc un déterminant antigénique qui est assez spécifique et assez fiable pour ne pas donner de faux positifs avec cet Ac. Ce n’est pas vrai pour la plupart des autres Ac.

Cela nous permet de visualiser directement des cellules malignes mais ce qui va nous intéresser chez un patient qui a un mélanome évolué ca va être avant tout de pouvoir le placer sous inhibiteur de BRAF le fameux vémurafémibe qui inhibe la croissance des tumeurs BRAF mutées. Il y a une bonne corrélation mais ce qui apparaît c’est que ce clone VE1 est négatif pour les autres mutations de BRAF qui peuvent être mises sous anti BRAF et donc on perd globalement 8 à 10 pourcents des patients qui pourraient bénéficier du médicament. Alors on utilise plus cet Ac que dans des cas où on a pas assez de matériel pour faire la biologie moléculaire puisqu’on sait qu’on fera la biologie moléculaire non seulement pour BRAF mais aussi pour NRAS et KIT. Et donc si vous voulez un anticorps tout seul a du mal à nous donner ce spectre de mutations qui sont donné par les techniques moléculaires.

=> Alors voici ici les 28 plateformes de génétique moléculaire des cancers. (3diapos pas importantes)

Les missions :- Faire du diagnostique => détecter des mutations ou translocations qui sont spécifiques d’un type de pathologie donnée (lymphome, leucémie ou d’un sarcome.)- identifications pronostiques (on l’a vu avec les neuroblastomes.)- identifications théranostic ou prédictives avec les mutations qui sont éligibles comme cibles thérapeutiques ou au contraire des mutations qui apparaissent comme mécanisme de résistance.

Les obligations :C’est une couverture régionale non facturée avec des méthodes importantes. Il existe un bon de prescription, le clinicien le remplit avec : l’identité du patient, l’identité du clinicien, quel type de tumeur, ce qu’il demande, la référence du prélèvement, la date de la prescription. Puis date de réception, date de prélèvement, le type de fixateur utilisé, la date d’envoie. Une fois qu’on fait les analyses on renvoie, maintenant par messagerie sécurisée le compte rendu au clinicien qui a demandé l’analyse.

Pour donner un exemple de ce qui est fait : - J1 : on reçoit, on délimite la zone tumorale, on va faire des coupes du forage et on extrait l’ADN. - J2 : on obtient l’ADN.

- J3, vous voyez ici des exemples de cancer du colon sur une lame et puis sur un bloc donc on va choisir la zone qui est riche en cellules tumorales. Ici plus de 75 pourcents. On va pouvoir extraire l’ADN avec une technique dite de forage dans le bloc par carottage comme le montre la diapo.

On repère par rapport à la lame le bloc tumoral et on fait des petits trous dans le bloc pour permettre de faire l’extraction de l’ADN.

Une fois qu’on a cet ADN à J3, on fait de la PCR avec des couples d’amorces qui nous permettent d’obtenir n copies du gène. On peut faire des techniques de PCR quantitative pour mesurer la quantité du gène

sauvage par rapport au gène muté. Et puis on peut faire des techniques de dénaturation, ré hybridation des homoduplex et hétéroduplex qui va nous permettre de discriminer l’ADN normal et l’ADN muté.

Par exemple ici on a une courbe de fusion d’un témoin normal et d’un témoin muté. On peut visualiser le TM qui varie également. On a donc la possibilité d’utiliser plusieurs techniques.

Nouvelles approches, depuis 2015 : on utilise des approches de type NGS du fait de l’augmentation du nombre de cibles à rechercher et de la

nécessité d’utiliser en une seule fois l’adn du patient pour regarder un maximum de cible.

Il remet la liste des tumeurs solides pour lesquelles on a des médicaments qui ont soit une AMM soit en essai clinique. Et donc on voit que cette liste bouge sans arrêt parce que soit les essais clinique sont positifs

et on garde les médicaments soit on doit recommencer. On voit ici tout un tat de gènes pour lesquels il existe des inhibiteurs.

Si vous voulez, non seulement ces techniques vont permettre de sélectionner les malades qui ont une mutation pour leur donner un traitement adapté. Mais elles vont aussi avoir comme possibilité de détecter dans le sang (ADN plasmatique du patient) la réapparition de mutation en cas de progression. Par rapport aux techniques d’imagerie ou par rapport aux autres techniques qui permettent de dépister une progression ou une récidive on est en train d’évaluer ces techniques de biologie moléculaire sur l’adn plasmatique par rapport aux techniques d’imagerie ou au données cliniques pour savoir si elles permettraient un diagnostic

précoce plus fiable. Evidemment on a des porteurs sains de mutations et donc tout le problème va être entre la sensibilité de la technique et son informativité. Ces techniques sur l’adn plasmatique (ou à partir même

des urines du patient) vont peut être permettre de mieux adapter la durée du traitement en fonction du malade qui seront des malades répondeurs (mis en rémission et stabilisés) par rapport à des malades qui sont

en potentiel phase de réapparition de la maladie.