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筋萎縮性側索硬化症（ALS）
脊髄前角
上肢の筋肉
下肢の筋肉
上位運動ニューロン
脳神経の
下位運動ニューロン舌
呼吸に関わる筋肉
下肢への
下位運動ニューロン
後索
側索
前角
封入体に含まれる蛋白質がALS発症を担う
家族性ALS
SOD1、FUS、VCP、ubiquilin・・
変異 SOD1
TDP-43 孤発性ALS
Ling SC, et al.
Neuron 2013（新井、長谷川らNeumannら, 2006）
10%
TDP-43は多くの遺伝性ALSでも異常凝集体系形成している
孤発性ALS
遺伝性ALS
C9ORF72TDP-43
MATR3
UBQLN2
hnRNP1VCP
OPTN
STSTM1
SOD1 (-) FUS (-)
SCA36
(modified from Emma, et al, Neuropharmacol 2015)
異所性局在 凝集体形成
RNA代謝障害
ミスフォールド オリゴマー アグレソーム
タンパク質分解障害
ユビキチン化TDP-43
異常蛋白質は神経細胞の内外で、様々な異常な振る舞いをする
周囲環境の汚染（蛋白伝播、神経炎症）
酸化ストレス ミトコンドリア機能異常 小胞体ストレス
細胞内
細胞外
細胞死へ
細胞死へ
異常な構造変化 オリゴマーから凝集体へ
正常構造
孤発性ALSにおいて治療上重要な観点
TDP-43の病的封入体は毒性を有する
一方、正常なTDP-43は細胞生存に極めて重要な役割を果たしている
正常な構造と異常な構造を見分けることが必要
抗体は正常と異常な構造を見分ける
異常な構造変化 オリゴマーから凝集体へ
正常構造
異常な構造のみを認識して結合する抗体
「鍵と鍵穴の関係」
抗原認識部位
我々は、以前に異常なTDP-43のみと反応する3B12A抗体を開発した
E246, D247
RRM2
RRM1
RRM2
RRM1RRM2
RRM1RRM2
病原構造エピトープ？
核
細胞質
TDP-43の異常構造のみと結合する抗体3B12Aの開発に成功 (2012)
標的蛋白質の存在の場と抗体治療戦略の違い
神経細胞
細胞内で抗体を作らせる
点滴や局部への注射
細胞内抗体
一本鎖抗体(scFv)を作らせる遺伝子カセット（プラスミド）
ハイブリドーマからVH, VLを作る遺伝子を単離
遺伝子導入
研究手法3B12A抗体
抗体の抗原結合部位の遺伝子配列を抽出
3B12A細胞内抗体
CMA
CL1linker
3B12A VH_VL
3B12A VH_VL-CL1(CL1 : プロテアソーム移行信号)
3B12A VH_VL-CMA(CMA : オートファジー移行信号 )
TDP-433B12A
細胞内抗体
DNAプラスミド
培養細胞
培養細胞実験遺伝子導入
動物実験子宮内電気穿孔法
マウス胎仔
分解型細胞内抗体がTDP-43に与える影響を検証した
PEST様配列
野生 (正常) 型 細胞質型 核内凝集体型 細胞質凝集体型
FL
AGタグ
(TD
P-4
3)
Mycタグ
(細胞内抗体
)重ね合わせ
(核は
DA
PI)
10 μm 10 μm 10 μm 10 μm
異常型 (ミスフォールド型) TDP-43H
EK
293A細胞
細胞内抗体は異常なTDP-43のみと結合する
細胞内抗体 (緑色) は正常ではなく異常なTDP-43 (赤色) の信号と一致した。
細胞内抗体は異常なTDP-43のみと反応する
ve
cto
r
VH
_V
L
0 . 0
0 . 2
0 . 4
0 . 6
0 . 8
1 . 0
OD
40
5
nm
(
Re
f
49
0)
v e c t o r
T D P - 4 3W T
T D P - 4 3m N L S
T D P - 4 3C 1 7 3 S / C 1 7 5 S
T D P - 4 3m N L S , C 1 7 3 S / C 1 7 5 S
S O D 1W T
S O D 1G 9 3 A
ve
cto
r
VH
_V
L
0 . 0
0 . 2
0 . 4
0 . 6
0 . 8
1 . 0
OD
40
5
nm
(
Re
f
49
0) v e c t o r
T D P - 4 3W T
T D P - 4 3A 3 1 5 T
T D P - 4 3Q 3 3 1 K
対照ベクター 細胞内抗体 対照ベクター 細胞内抗体
対照ベクター対照ベクター
野生型 (正常型) TDP-43
野生型 (正常型) TDP-43細胞質型TDP-43
核内凝集体型TDP-43
細胞質凝集体型TDP-43
野生型 (正常型) SOD1
G93A変異型SOD1
A315T変異型TDP-43
Q331K変異型TDP-43
サンドイッチELISA法
抗FLAG抗体
抗Myc抗体
HEK293A細胞溶解液
細胞内抗体は異常なTDP-43のみと高い反応性（吸光度 OD 405 nm）を示した。
細胞内抗体により異常なTDP-43は分解される
野生型(正常型)TDP-43
0 12 24
対照
ベクター
VH
_V
LV
H_V
L-C
L1
細胞質凝集体型TDP-43
0 12 24 hrs.
Haloタグによるパルスチェース法（HEK293A細胞）
VH
_V
L-C
MA
0 1 2 2 4
0
5 0
1 0 0
H a l o T a g - T D P 4 3W T
h o u r s .
re
ma
in
in
g T
DP
-4
3 (
%)
v e c t o r
V H _ V L
V H _ V L - C L 1
V H _ V L - C M A
N . S .
N . S .
0 1 2 2 4
0
5 0
1 0 0
H a l o T a g - T D P 4 3m N L S , C 1 7 3 S / C 1 7 5 S
h o u r s .
re
ma
in
in
g T
DP
-4
3 (
%)
v e c t o r
V H _ V L
V H _ V L - C L 1
V H _ V L - C M A
* * *
* * * *
* * * *
* * * ** * * ** * * *
野生型(正常型)TDP-43
細胞質凝集体型TDP-43
TD
P-4
3 残
存率
(％)
TD
P-4
3 残
存率
(％)
対照ベクター
対照ベクター
細胞内抗体は対照ベクターに比べて異常なTDP-43の分解を促進し、その効果はCMAシグナルを付加した分解型細胞内抗体において最も著明に見られた。
+ 対照ベクター + 分解型細胞内抗体
48:00 48:00
TDP-43凝集体 / 生細胞の核
分解型細胞内抗体は異常なTDP-43を分解し、細胞のダメージを減らす
TDP-43凝集体 / 生細胞の核
分解型細胞内抗体はマウス胎仔脳の異常なTDP-43のみ分解する
対照ベクター 分解型細胞内抗体
野生型 (正常型) TDP-43 細胞質凝集体型TDP-43
分解型細胞内抗体対照ベクター
GF
P-T
DP
-43
e m p t y v e c t o r V H _ V L - C M A
0
5 0
1 0 0
T D P - 4 3W T
nu
mb
er
o
f G
FP
-T
DP
-4
3W
T
(
%)
N . S .
野生型 (正常型) TDP-43
対照ベクター 分解型細胞内抗体
野性型
TDP
-43の個数
(％)
e m p t y v e c t o r V H _ V L - C M A
0
5 0
1 0 0
T D P - 4 3m N L S , C 1 7 3 S / C 1 7 5 S
nu
mb
er
o
f
TD
P-
43
a
gg
re
ga
te
s (
%)
* * * *
細胞質凝集体型TDP-43
対照ベクター 分解型細胞内抗体
TDP
-43凝集体の個数
(％)
謝辞
滋賀医科大学 神経内科 ALSチーム
– 玉木良高（scFv開発、in vitro検証）
– 引網亮太 (TDP43 Tgマウス作出、サル安全性試験)
– 南山素三雄
– 小橋修平
– 和田英貴
– 小代明美 (3B12A抗体、凝集体モデル）
– 漆谷 真
滋賀医科大学 神経難病研究センター
– 守村敏史 （In utero electroporation）
京都大学大学院医学研究科臨床神経学
– 高橋良輔
– 綾木 孝 (ヒト病理解析)
– 眞木崇州（OPC実験）
京都大学ウイルス再生研究所
– 朝長啓造 （BDVベクター治療）
自治医科大学神経内科
– 村松慎一（AAVベクター治療）
和歌山県立医科大学 神経内科
– 伊東秀文（3B12A抗体解析）
兵庫医科大学 生化学
– 藤原範子（蛋白HPLC解析）
立命館大学 薬学部
– 北原 亮 （高圧力NMR）
