Ap

plic

atio

n N

ote

C_IC

-06

5

关键词

离子色谱；紫外检测；DNAPac PA100；注射液；脱氧核苷酸钠

Keywords：

Ion Chromatography; UV; DNAPac PA100; injections; deoxynucleotide sodium

离子色谱法-紫外检测注射液中脱氧核苷酸钠

李仁勇

赛默飞世尔科技（中国）有限公司

引言

脱氧核苷酸钠是一种具有遗传特性的化学物质，其在个体的生长、繁殖、遗传、变异等生理生化功能方面起着非常重要的作用。目前常用注射用脱氧核苷酸是用脱氧核糖核酸（DNA）为原料，经生物酶催化水解反应生成脱氧腺苷酸（dAMP），脱氧鸟苷酸（dGMP）、脱氧胞苷酸（dCMP）和脱氧胸苷酸（TMP）等四种脱氧核苷酸，然后经层析分离获得高纯度四种单一脱氧核苷酸产品。医药常使用复方制剂，组分包含脱氧糖胞嘧啶核苷酸、脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸及脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸钠盐。用于急、慢性肝炎，白细胞减少症，血小板减少症及再生障碍性贫血等的辅助治疗。

对于脱氧核苷酸的检测，现有药典方法推荐使用Whatmen Partisil-5 SAX色谱柱分离[1]，分离效果较差，且硅胶基离子交换柱使用寿命短。本文则着重研究了高分子聚合物机制的DNAPac 系列阴离子交换色谱柱用于脱氧核苷酸的分离[2]，并将之应用于多种不同品质的注射用脱氧核苷酸钠制品的测试。

测试条件

仪器：ICS 3000多功能离子色谱仪包含：四元梯度泵， DC模块，VWD3400，AS自动进样器

色谱柱： DNAPac PA100, 13 µm, 4 mm×250 mm（P/N: 043010），DNAPac PA100G，13 µm，4 mm×50 mm（P/N: 043018）

柱温：20 ℃；流速：1.50 mL/min；进样方式：自动进样；定量环：10 µL；

淋洗液：A, 超纯水；

B, 17mmol/L磷酸钠/ 50mmol/L 氢氧化钠；

C, 270mmol/L高氯酸钠；

D, 100mmol/L高氯酸钠；

梯度淋洗表参见下表：

表1. 梯度淋洗液表

时间 (min) A B C D

0 96 4 0 0

6 96 4 0 0

6.01 86 14 0 0

15 72 14 0 14

19 16 14 0 70

19.01 6 14 80 0

19.50 6 14 80 0

19.51 96 4 0 0

25 96 4 0 0

检测方式：紫外检测，波长：260 nm。

2

样品前处理

注射用脱氧核苷酸钠50 mg先以2 mL超纯水溶解，并稀释至200 mg/L ，直接进样。注射液直接用超纯水稀释至200 mg/L，直接进样。

结果和讨论

色谱条件的选择

比较了DNAPac PA100和200对于此类样品的适用能力，相对比防线，PA100色谱柱对相对保留较弱的dCMP和dAMP具有更好的分离效果，而在PA200上则非常难分开这两个主成分后的杂质峰。通过梯度条件的不断改进，最终可保证四种主成分与四个主要杂质，小分子碱基和聚核苷酸的良好分离，色谱柱见图1。且峰形尖锐，柱效高，以组分复杂的脱氧核苷酸注射液为例，选择4个主峰及4个主杂质峰（每个主峰后对应一个峰）为研究对象，其相应分离度和峰数据如下表2。

标准曲线和方法检出限

dCMP、dAMP、 dTMP和dGMP在0.5-500 mg/L浓度范围内都具有良好的线性，标准曲线拟合方程见表3所示，相关系数在0.99991~0.99998。根据3倍信噪比（Signal/Noise=3）可分别计算出四种待测组分的检出限分别为0.3，0.2，0.2 和0.1 mg/L。

方法重现性、回收率及样品测试结果

以注射用脱氧核苷酸钠为研究对象，连续十针进样，重现良好，保留时间的RSD小于1%，而峰高和峰面积则RSD在1~2%之间。样品经处理后直接进样分析，图2为某纯度较差注射液样品及加标谱图对比，加标回收率在101.9～104.8%之间（参见表4），表明样品基体组分对脱氧核苷酸测定不存在明显影响。

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0-40

0

50

100

140

1 200mg/l-injection2 injection+150mg/lmAU

min

2

1

1 - dCMP

2 - dAMP

3 - dTMP

4 - dGMP

WVL:260 nm

图1. 某纯度较差注射液样品及加标谱图对比

（1, 注射液样品; 2, 加标150 mg/L混标）

表2. 梯度条件优化后谱图结果

Peakname Resol.(EP) Asym.(EP) Plates(EP)

dCMP 1.98 0.91 6587

A 2.28 0.94 7701

dAMP 2.40 0.83 9480

B 20.41 1.09 5593

dTMP 4.07 1.15 43500

C 7.18 0.92 38529

dGMP 7.53 0.93 33069

D 7.23 0.92 59617

表3. 标准工作曲线的线性范围、相关系数和检测限

待测物 标准拟合方程 线性范围 (mg/L) 相关系数 (r2) 检测限/ (mg/L)

dCMP y=0.0285x-0.0123 0.5-500 0.99991 0.3

dAMP y= 0.0632x -0.0353 0.5-500 0.99991 0.2

dTMP y= 0.0286x+ 0.0056 0.5-500 0.99996 0.2

dGMP y= 0.0688x -0.0291 0.5-500 0.99998 0.1

表4. 部分样品测定结果及加标回收率

待测组分 样品测得值 (mg/L) 加标量 (mg/L) 加标测得值 (mg/L) 回收率

dCMP 223.07 150.00 377.48 102.9%

dAMP 227.58 150.00 380.42 101.9%

dTMP 177.79 150.00 334.97 104.8%

dGMP 96.67 150.00 252.81 104.1%

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atio

n N

ote

C_IC

-06

5

AN_C_IC-065

结论

采用DNAPac PA100高效阴离子交换核酸分离柱，在梯度淋洗条件下可实现C、A、T、G四种脱氧核苷酸与常见4种主要杂质（怀疑为C、A、T、G四种核苷酸）的良好分离，分离度可达到1.5以上，峰形对称度在0.83-1.15之间，而理论塔板数均能高于5000。此外，方法还具有常规柱无法比拟的优势，能同时分离小分子碱基，单分子核苷酸还有聚核苷酸，参见谱图中3min以前的峰和16 min以后的出峰。离子色谱柱上得到的峰形相比传统液相柱得到的更为尖锐，因此灵敏度相对更高，10 µL进样时即可达到0.5 mg/L以下的检出限。

比较了不同波长对于待测物质的灵敏度，结果发现在260-270区间内四种待测组分灵敏度各有高低，但相差不大，因此最终确认260-270 nm作为可选检测波长范围。

此次条件摸索实验中，共累计进样近200针，并未出现常规液相柱出现的柱效明显下降的问题，表明DNAPac色谱柱对于样品耐受能力要更强。样品中若含有多糖等其它辅料，可能需要经过超滤等前处理步骤处理样品后方可进样分析，以免辅料污染色谱柱。

参考文献

[1] 程速远, 郝苏丽, 杨化新.脱氧核苷酸钠含量测定方法的探讨.中国药品标准,2008,9(5)：368-369

[2] Application Note 162, Determination of Nucleotides by Ion Chromatography with UV Absorbance Detection