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細胞力覚のしくみ細胞力覚のしくみ分子と細胞をつなぐメカニカルシグナル分子と細胞をつなぐメカニカルシグナル

曽我部曽我部 正博正博

1名古屋大学・大学院医学系研究科・細胞生物物理学2JST, ICORP/SORST “細胞力覚”

3生理学研究所・分子生理系・細胞内代謝部門

【理研シンポジウム】VCADシステム研究2007、 2007年10月18,19日、和光市

In vivo

Endothelial cells

Vessel StretchET1

shear stressNO

Flow-indued Dilation

ズリ応力、伸展、静水圧；力の方向や時間モード

Stretch-induced Contraction血流量の局所調節機構

破綻すると疾病（高血圧、硬化）

あらゆる細胞は変形（応力）を感知する

↓

“細胞力覚”↓

メカノセンサー

↓SA（MS) チャネル

（Ca2+透過性）(1984に発見）

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Four Molecular Candidates: * MS channels, MS receptors, Cytoskeleton, Adhesion molecules. They are linked each other via membrane and cytoskeleton in which strain and stress are generated and transmitted to mechanosensors.

*MS channel MS receptor

actin fiber

focal adhesion ECM

tight junction

membrane

４つのメカノセンサー候補分子： MSC, MSR, CSK, ADM

ER

本日のあらすじ

1.1. MSMSチャネルの構造と機能チャネルの構造と機能

a.a. バクテリア（膜張力）、バクテリア（膜張力）、 ｂ．内皮細胞ｂ．内皮細胞

2.2. 機械刺激と細胞の形の関係機械刺激と細胞の形の関係

非イオンチャネル型のメカノセンサー非イオンチャネル型のメカノセンサー

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Methods in MS channel studyMethods in MS channel study: patch-clamp

SuctionMembrane stretch

MembMemb

Na+

Ca2+

Blocked by Gd3+

Giga-seal

Ca2+

On-cell patch

Excised patch

Formation of excised patch

MS channel can be activated without intracellular signaling

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細胞力覚の歴史と課題生命の根幹機能であるが、メカノセンサーの実体が不

明なため、多くは謎のまま推移してきた。

突破口 → MSチャネル(1984)の発見

遺伝子：細菌,1994；酵母,1999；心筋,2003;TRP,2005

まだまだ刺激のモードや時空間特性に対応した

多様なメカノセンサーがあるはずだ !!

１．MSチャネルの構造活性連関a.細菌MscL、b. 心筋、ｃ、血管内皮細胞

2. 新しい型のメカノセンサーの探索内皮細胞の力方向依存的形態リモデリング

力の方向を感知するメカノセンサーの発見

１．MSチャネルの構造機能連関

a. 細菌MscL活性化のナノ機構（膜張力）

b. 内皮細胞MSCの活性化機構

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細菌MSチャネル, MscS と MscL、は低浸透圧刺激（雨）で開口し、細胞破壊を防御する。これ無しには生命進化はあり得なかった!!

Opening of MscS and MscL= Release of cytoplasmic components

H2OH2O

H2O

H2O

H2O

H2O H2O

H2O

MscL(4nS)

MscS(1nS)

Cell swelling= Increase in membrane tension

Rain Hypoosmotic shock

チャネル活動

膜張力

MscL(8)

MscS(20)

PS

PL

MscL threshold = PL / PS = 1.69

100 pA

1 sec

100 mmHg

Wild type MscL

細胞壁を除いた大腸菌をパッチクランプしてパッチ膜を伸展すると、閾値の低いMscSが開口し、引き続いてMscLが開く様子。

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機械受容チャネルMscLの開閉機構の解明

152KDa２回膜貫通ササブユニット（136aa)のホモ５量体

Closed gate

pore

stretch

Top viewTop view

B. チャネル開閉のIRISモデル

C. チャネルオープンの

MDシミュレーション

A. 膜張力感知部位の同定

膜張力感知部位

MD simulation of MscLopening in response to membrane stretch

top view

side view

Pressure profile in POPC membrane

脂質とチャネル蛋白質の相互作用を解析することが重要。これまでにそのような解析はなかった。

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Point:efficient force

transmission across rigid structure of

TM α-helicies

MscLのどの部位（アミノ酸）が張力を感知しているのか？F78

F78-脂質間相互作用が最も安定: 膜伸展で F78（左下の緑色）が脂質に引っ張られて、堅いTM1,2へリックスが引き倒されるようだ。

Interaction energy between each residue in TM2 helices and its surrounding lipids

F78

stretch

水

脂質TM2

TM2の14aa

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１．MSチャネルの構造機能連関

a. 細菌MscL活性化のナノ機構（膜張力）

b. 内皮細胞MSCの活性化機構（骨格張力）

(Sachs,1988,

Sokabe & Sachs, 1991)Tip-link (Hudspeth, 1993)

細菌の細菌のMSMSチャネルは膜張力で直接活性化さチャネルは膜張力で直接活性化されることが分った。れることが分った。では高等生物のでは高等生物のMSMSチャチャネルはどんな仕組みを使っているのか？ネルはどんな仕組みを使っているのか？

細胞骨格（アクチン線維）による力の集中・伝達と方向感知が実現されているのではないか

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TOP

SIDE

Image of stress fibers, focal adhesions & MSC in HUVEC

-C

1s

5pA15min

5min

2min

-C

-C

No P

Low P

High P

35 pS MSCatC

Stress fiber, focal adhesionStress fiber, focal adhesion

骨格を引っ張ってMSチャ

ネルを活性化する

APiezo driven glass pipette

Coverslip

fibronectin coated bead

5μm

B

Mechanical stress can be applied to basal focal adhesions by displacing a fibronectin coated bead that is connected to the

focal adhesions via actin stress fibers

Method for applying localized mechanical stress to basal focal adhesions

Stress fibers

10

A

B

---- 001-053 ms 054-106 ms

107-159 ms 531-583 ms 902-954 ms

C

20μm 90

100

110

120

130

140

0 1 2 3 4t i me (s )

sig

na

l in

te

ns

ity (

%)

0 .15μm

0 .7μm

0 .9μm

Displacement of the FN-bead generates stress in stress fibers leading to a Ca2+ transient in HUVECs

[Ca2+]ext dependent

Gd3+ blockable

Independent of i-store

MS channel

52 msec resolution

B

10 p

A

5 s

trap point displacement

Inward currents

C: inward currents

*

D* *

control stimulated

ストレス線維を引っ張りながらMSチャネルの活性化を全細胞電流記録とCa2+イメージングで同時測定する

A

20-30 channels/fiber/stretch １ｐN/channel

Ca transient

Stress fiber F-coated bead

scan

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TOP VIEW

細胞骨格を引っ張って接着斑（インテグリン）に力を負荷しながらCa2+流入スポット（MSチャネル）を視る

Stress fiber Focal adhesion (Focal adhesion (integrinintegrin))

CaCa2+2+スポットスポット（（SASAチャネル）チャネル）のの 2msec 2msec 分解分解近接場イメージ近接場イメージ

仮説と仮説と実験手法実験手法

高速高速TIRFTIRFイメージングイメージング

tension in the actin cytoskeleton activates SA

channelsSA channels

Ca2+ Ca2+

進行課題進行課題

1.1.内皮内皮SASAチャネチャネルのクローニンルのクローニング：グ：TRPVTRPV２らし２らしい。い。

2.2.光顕と光顕とクライオクライオディープエッチンディープエッチンググEMEMによるによるSASAチャネルチャネル//インテインテグリングリン//細胞骨細胞骨格・ナノ複合体格・ナノ複合体の可視化の可視化。。

SASAチャネルチャネル//インテグリンインテグリン//細胞骨格ナノ複合体に細胞骨格ナノ複合体による細胞力覚よる細胞力覚

SASAチャネルチャネル//インテグインテグリンリン//細胞骨格ナノ複細胞骨格ナノ複合体による細胞力覚合体による細胞力覚

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Evolution of Gating Mechanism

Bacteria

Human

Larger tension can be generated by small deformation

Increased mechano-sensitivity & force direction sensitivity

2．細胞レベルの力感知と応答．細胞レベルの力感知と応答

メカノシグナリングの解析メカノシグナリングの解析

一軸周期伸展刺激による内皮細胞の形態リモデリングのシグナル機構を解析する中で、細胞骨格（アクチン線維）が、全く新しい型のメカノセン

サーであることを発見した。

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2007/9/20 25

Periodic stretch

Smooth muscle

Endothelium(Spindle-shape)

120 min

1 Hz, 20 %

a

b

Diagram of the vessel & Stretch-induced remodeling in EC

Pressure

一軸方向一軸方向周期伸展刺激（１周期伸展刺激（１HzHz、、20%)20%)に対して垂直方向に変形・配列するに対して垂直方向に変形・配列する

３つのキープレイヤー

1. 1. 形の変化を知覚する分子形の変化を知覚する分子 （（MSMSチャネルチャネル ??））

* * 2. 2. 形を決める分子形を決める分子 （接着斑（接着斑: : インテグリン）インテグリン）

3. 3. 両者をインタフェースする分子両者をインタフェースする分子（（CaCa2+ 2+ and /or and /or 細胞骨格細胞骨格 ??））

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TOP

SIDE

The Cell Shape

“ Cell shape is determined by FA distribution”

形を決める分子は接着分子（足場分子）である

αβ

Extracellular matrix

Talin

Integrin

MScaCの活性化は 形態変化に必要である。ではMScaCは形の変化（一方向伸展）を知るセンサーか？

Actin fiber

Cell membrane

MS channel/Ca2+？

stretch

35 pS MS channel

MScaは接着斑近傍に発現しSFの張力で開く

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細胞は力の方向を感知して形態の極性に変換する!!

before 100msec after stretch

内皮細胞にはMScaCが 発現しており、形態変化に必須だが、急速かつ空間的に一様に上昇する。

35 pS MS channel

Stretch-induced [Ca2+]I increases by MS channels

形態変化にMSチャネル/Ca2+は必須だが、力の方向は伝えられない。他の力方向センサーを探さなければいけない。

0 min

120 min

A B1 Hz, 20 %a

b

a

b

a

b

ストレス線維の分布は力の方向を感知するアンストレス線維の分布は力の方向を感知するアンテナとして理想的ではないかテナとして理想的ではないか ??

FA SF

SFsSFs seem to detect force orientationseem to detect force orientation

Question

Which is Which is first, SF first, SF or shape?or shape?

16

０

５

１５

３０

a b

Rearrangement of stress fibers in pre-oriented cells

“SFs sense the stretch axis and convert it into their orientation !!”

(min)

１２０

Break down

reorganization

retractionextension

Stretch axis1. Stress fiber

destruction

~ 5 min

~ 15 min

~ 1 hr

3. Shape Remodeling

stress fibers will be reorganized perpendicular to the stretch axis via temporal disruption

Question: in which phase, stretch or relax?

Relax!!

2. Rearrangement ofStress Fiber/Focal adhesion

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Involvement of cytosolic factor ?Semi-intact cell system

Treat HUVECs in 0.003% digitonin containing buffer for 1 min. (Removal of cytosolic factors)

Stretching HUVECs in cell lysate.

Plate HUVECs on elastic chambers.

Nothing happened!!

ｃofilin (ADF)

Stretch-induced stress fiber disruption =loss of tension in SF + cofilin.

Cytoskeleton as a MechanosensorCofilinStress fiber

Tension in stress fibers prevents cooperative binding of cofilin to actin filaments.

Loss of tension

Cofilin would binds to actin filaments after releasing the tension.

Stress fiber disassembly Cofilin disassembles actin stress fibers.

ストレス（アクチン）線維は力の有無に応じて構造のダイナミクスを変えるメカノセンサーであるらしい？

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In vitro direct evidence showing Tension in a single actin filament inhibits its severing by cofilin

Without tension

With tension

ConclusionConclusion

in vitro assay

bead

Cover slip

Fアクチンは直接張力の減少に応じて分解する全く新しい型の（負の）メカ

ノセンサーである !!

Cofilin

(<50 pN)

Muscle myosin

Actin filament

Stretched

Relaxed

Selective binding of cofilin to relaxed actin fiber

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Muscle myosin

Actin filamentCofilin

(<50 pN)

Muscle myosin

Actin filament

Selective severing of relaxed actin fiber

Cofilin binds to F-actin in a cooperative manner.Cofilin shortens the

pitch of F-actin twist.

Galkin, V. E. et al. (2001) J. Cell. Biol. Vol 153, 1

Galkin, V. E. et al. (2001) J. Cell. Biol. Vol 153, 1

アクチン線維の切断には捻れが必要である。cofilinが結合した線維は捻れている。 cofilinは弛緩して捻れやすい線維に結合する。

伸張刺激は線維を捻れにくくしてcofilinの結合を阻害する？

“Naked”actin filament

Cofilin decorated actin filament

Cofilin decorated

Naked filament

“Naked”Cofilin decorated

McGough, A et al. (1997) J. Cell. Biol. Vol 138, 4

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メカノトランスダクションにおける細胞骨格の役割

ま と め

1) ストレス線維は速いメカノトランスダクションにおいて、効率的な力の伝達集中化デバイス（インタ

フェース）として働き、MSチャネルを活性化する。

2) ストレス線維は遅いメカノトランスダクションにおいて、それ自体が力の方向感知能を備えたメカノ

センサーとして働く。

＊最近インテグリンも遅いtonicな機械刺激のメカノセンサーになることが分った（Sasamoto, et al., 2005)。

ストレス線維が崩壊してFAへの力負

荷が無くなると、あるFA蛋白質が脱燐酸化してFAが

崩壊してインテグリンがCa2+依存的に

細胞内へ取り込まれ、その部分が剥がれて変形が進行する。つまり、“FAは力に応答する分子複合体である”

これが次の課題Ca2+

(1P-328, Kiyoshima, et al.)

③剥がれて縮む

脱燐酸化

②エンドサイトシス

①ストレス線維の崩壊とFAへの力の脱負荷

収縮力