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物性面からみた抗体医薬品
The 2nd Malvern Biosciece Conference
川崎 匡史
製薬技術本部 物性研究所 分析第４研究室（NMTF）
アステラス製薬株式会社
2017. 7.27
医薬品開発の流れ 2
医薬品の研究開発は上市されるまでおおよそ10~20年
アステラス製薬 HPより http://www.astellas.com/jp/corporate/brand/kusurizukuri/
Lipinski's Rule of Five 3
● 水素結合ドナー（すなわち、OHとNH）が5個以下
● 水素結合アクセプター（すなわち、NとOなど）が10個以下
● 分配係数がLogPとして5以下
● 分子量が500 Da以下
経口バイオアベイラビリティー（経口投与された薬物が体内に吸収される程度）
の優れた薬物を予測するための経験則
CA Lipinski, Adv. Drug Del. Rev. 1997, 23, 3
開発抗体の選択 4
免疫
開発抗体キメラ抗体 ヒト抗体
Fc swapping（ヒト化）
Antibody engineering
抗体産生ハイブリドーマ
マウス
大量発現細胞株構築
抗体の物性評価 5
結合活性
エピトープマッピング
糖鎖ヘテロジェネイティー
FcgRs 結合能
C1q 結合能
FcRn 結合能
異性体 メチオニン酸化
アスパラギン脱アミド
N末端ピログルタミン酸
C末端リシン欠損
構造 構造安定性
一次配列
ジスルフィド結合
溶解性
分解
凝集性
等電点
ADCC、ADCP、CDCに関与
PKに関与
ITC
ITC
HPLC
LC/MS
DSC
LC/MS
ITC
ITC
ITC
PAGE
HPLC DLS
LC/MS
LC/MS
LC/MS
LC/MS
その他
その他
LC/MS NMR
HPLC
LC/MS
DSC
Biacore
Biacore
吸光度
その他
PAGE その他
その他
DLS その他
CH2
CH3
Fab
VH
CH1VL
CL
Antigenbinding site
FcgRsbinding site
ProteinAbinding site
開発抗体の選択 6
Potential of a drug candidate to become a successful commercial drug product
- Efficacy
- Safty
- Manufacturability
- Cost
Goals of Developability studies
- Understand the physical and chemical properties of a small number of
final viable candidates obtained from a much larger number of triaged
preliminary candidates that have been generated against an immunogen
- Select the best molecule for clinical development and commercialization
based on the propertied of the leading viable candidates
- Identify development risk early
Developability
開発抗体の選択 7
Stability（安定性）
Important for manufacturability and shelf life
Solubility（溶解性）
Important for product formulation and product quality
Viscosity（粘度）
Important for manufacturability and drug delivery
検討に用いた市販抗体医薬品 8
mAb 12 Fab chimera liquid IV 7.2 2
mAb 15 IgG1 humanized lyophilized IV 6.0 21
mAb 17 IgG1 chimera lyophilized IV 7.2 10
mAb 10 IgG1 chimera lyophilized IV 5.9 4
mAb 11 IgG1 humanized lyophilized IM 6.0 100
mAb 06 IgG1 humanized liquid IV 6.8-7.4 30
mAb 05 IgG1 chimera liquid IV 7.2-7.4 5
mAb 09 IgG1 human liquid SC 5.2 50
mAb 13 IgG1 humanized liquid SC 5.9 125
mAb 01 IgG1 humanized liquid IV 6.2 25
mAb 03 IgG4 humanized liquid IV 6.1 20
mAb 04 IgG2 human liquid IV 5.7 20
mAb 07 IgG1 human liquid IV 5.5 20
mAb 16 IgG1 human liquid SC 5.7-6.3 90
mAb 08 IgG2 human liquid SC 5.2 60
mAb 02 IgG1 human lyophilized IV 6.5 80
mAb 14 IgG1 human liquid IV 7.0 5
Administration
routepH
Conc.
(mg/mL)
Antibody
No.Subclass Type Dosage form
検討に用いた市販抗体医薬品 9
サブクラス IgG1 : 13, IgG2 : 2, IgG4 : 1, Fab : 1
タイプ キメラ : 4, ヒト化 : 6, ヒト : 7
剤形 液剤 : 12, 凍結乾燥 : 5
投与経路 静注 : 11, 皮下注 : 4, 筋注 : 1
抗体濃度 2 ~ 125 mg/mL
pH 5.2 ~ 7.4
構造安定性 10
20 30 40 50 60 70 80 90 100-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14 Tm : 変性中点温度
半分のタンパク質がアンフォールディングする温度
ΔH : エンタルピー変化吸熱量を示す
熱の吸収
ΔCp : 熱容量変化疎水面の露出に由来
温度（℃）
熱容
量変
化（mcal/
℃）
DSCの測定原理
Tmとは
温度を上昇させ、タンパク質のアンフォー
ルディングに伴うの熱の吸収を検出。
Tmが高いほど安定な構造。
Fab、CH2、CH3のドメインごとに測定が
可能。
From Wikipedia
構造安定性 11
抗体の測定例
各ドメインのアンフォールディングに伴い、吸熱ピークが検出される。より高温であるほど安定と判定。
✔ Fab、CH2、CH3ドメインに
分けて評価が可能
Biochemical and Biophysical Research Communications 355 (2007) 751–757
CH2
CH3
Fab
VH
CH1VL
CL
構造安定性（Fab domain） 12
50
60
70
80
90
pH5 pH6 pH7
Herceptin
Synagis
Campath
Xolair
Avastin
Tysabri
HumanizedT
m (
℃)
50
60
70
80
90
pH5 pH6 pH7
Herceptin
Synagis
Campath
Xolair
Avastin
Tysabri
Humanized
Tm
(℃
)
50
60
70
80
90
pH5 pH6 pH7
Humira
Vectivix
Benlysta
Yervoy
Arzerra
Prolia
Stelara
Human
Tm
(℃
)
50
60
70
80
90
pH5 pH6 pH7
Humira
Vectivix
Benlysta
Yervoy
Arzerra
Prolia
Stelara
Human
Tm
(℃
)
50
60
70
80
90
pH5 pH6 pH7
Reopro
Remicade
Simulect
Erbitux
Chimera
Tm
(℃
)
50
60
70
80
90
pH5 pH6 pH7
Reopro
Remicade
Simulect
Erbitux
Chimera
Tm
(℃
)
Chimera Humanized Human
★ 破線は凍乾注（FS
ab.ではVマウス由来でな
いAb.）を示す。
FS Ab.
50
60
70
80
90
pH5 pH6 pH7
CUE-1
NBA-2
CSF-8
ILR-1
MCY-1
ASK8007
FS Ab.
Tm
(℃
)
50
60
70
80
90
pH5 pH6 pH7
CUE-1
NBA-2
CSF-8
ILR-1
MCY-1
ASK8007
FS Ab.
Tm
(℃
)
☆ Tm < 70℃とな
るものは3/17品目（う
ち2品目は凍乾注）
☆ FS抗体のTmは市
販抗体（緩衝液）と
同程度
Non-human V region Non-human CDR
mAb 12mAb 17mAb 10mAb 05
mAb 15mAb 11mAb 06mAb 13mAb 01mAb 03
mAb 09mAb 04mAb 02mAb 14mAb 07mAb 08mAb 16
mAb AmAb BmAb CmAb DmAb EmAb F
構造安定性（Fab domain） 13
☆ 製剤化で期待出来るTmの上
昇は2℃程度
☆ 緩衝液中で構造安定性の良
好な抗体を選択することは有用
60.0
70.0
80.0
90.0
Buffer F1 FF
Synagis
Xolair
Vectivix
Herceptin
Tysabri
Campath
Yervoy
Simulect
Prolia
Stelara
Avastin
Erbitux
Reopro
Humira
Arzerra
Remicade
Benlysta
Fab
Tm (℃
)
Ly
Ly
Ly
Ly
Ly
Buffer = 製剤処方に近い緩衝液pHLy = 凍乾注
mAb 11
mAb 13
mAb 04
mAb 15
mAb 03
mAb 06
mAb 14
mAb 10
mAb 08
mAb 16
mAb 01
mAb 05
mAb 12
mAb 09
mAb 07
mAb 17
mAb 02
1450℃/2W 安定性試験における分解（％）
①dimer of HC、 ②degradated HC、 ③aggregation、 ④degradated whole antibody
mAb 01 mAb 02 mAb 17
Most antibodies
showed similar
degradation /
aggregation pattern.
Remicade
FF Reduced Non-reduced
Ab. conc.(ug/mL)
200
40
8
1.6
0.32
0.06
100
20
4
0.8
0.16
0.03
MW(kDa)
200
97
14.4
21.5
31
45
66
116
6.5
Ab
H
L
Avastin
pH5 Reduced Non-reduced
Ab. conc.
(ug/mL)
200
40
8
1.6
0.32
0.06
100
20
4
0.8
0.16
0.03
MW
(kDa)
200
97
14.4
21.5
31
45
66
116
6.5
Ab
H
L
Yervoy
pH6Reduced Non-reduced
Ab. conc.(ug/mL)
200
40
8
1.6
0.32
0.06
100
20
4
0.8
0.16
0.03
MW(kDa)
200
97
14.4
21.5
31
45
66
116
6.5
Ab
H
L
Reduced Non-reduced
Ab. conc.(ug/mL)
200
40
8
1.6
0.32
0.06
100
20
4
0.8
0.16
0.03
MW(kDa)
200
97
14.4
21.5
31
45
66
116
6.5
Ab
H
L
Benlysta
pH7.4
・Ordinary inpurities①dimer of HC②degradated HC
③aggregation
④degradated whole antibody※HC: heavy chain
Most antibodies
showed similar
degradation /
aggregation pattern.
Remicade
FF Reduced Non-reduced
Ab. conc.(ug/mL)
200
40
8
1.6
0.32
0.06
100
20
4
0.8
0.16
0.03
MW(kDa)
200
97
14.4
21.5
31
45
66
116
6.5
Ab
H
L
Avastin
pH5 Reduced Non-reduced
Ab. conc.
(ug/mL)
200
40
8
1.6
0.32
0.06
100
20
4
0.8
0.16
0.03
MW
(kDa)
200
97
14.4
21.5
31
45
66
116
6.5
Ab
H
L
Yervoy
pH6Reduced Non-reduced
Ab. conc.(ug/mL)
200
40
8
1.6
0.32
0.06
100
20
4
0.8
0.16
0.03
MW(kDa)
200
97
14.4
21.5
31
45
66
116
6.5
Ab
H
L
Reduced Non-reduced
Ab. conc.(ug/mL)
200
40
8
1.6
0.32
0.06
100
20
4
0.8
0.16
0.03
MW(kDa)
200
97
14.4
21.5
31
45
66
116
6.5
Ab
H
L
Benlysta
pH7.4
・Ordinary inpurities①dimer of HC②degradated HC
③aggregation
④degradated whole antibody※HC: heavy chain
15
凍乾注
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Initial
pH5
pH6
pH7
FF
Impu
rity (
%)
SDS-PAGE Non-Reduced
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Initial
pH5
pH6
pH7
FF
Impu
rity (
%)
SDS-PAGE Reduced
分解物量の平均は、
Initial 約2%
最適pH 約4%
FF 約2%
であった。増加量はわ
ずかで、製剤化で改善
の傾向がみられた。
50℃/2W 安定性試験における分解（％）
mAb 02 17 12 01 07 09 08 06 14 15 1116 05 13 10 04 03
IgG4
IgG2IgG2
50℃/2W 安定性試験におけるDimer量（％） 16
0
1
2
3
4
5
Initial
pH5
pH6
pH7
F1
FF
Dim
er (
%)
IgG2
IgG2
IgG4
沈殿(pH5, F1, FF)
ca.18%
0
1
2
3
4
5
Initial
pH5
pH6
pH7
F1
FF
Dim
er (
%)
凍結乾燥製剤
☆ 最安定pH（1mg/mL）においては、16/17品目でDimer < 1%。
☆ IgG2、IgG4は、IgG1と比較して、酸性条件下で凝集性が高い傾向がみられた。
50℃/2W 安定性試験における Polymer量（％） 17
0
1
2
3
4
5
Initial
pH5
pH6
pH7
F1
FF
Po
lym
er (
%)
IgG2
IgG2IgG4
沈殿(pH5, F1, FF)
0
1
2
3
4
5
Initial
pH5
pH6
pH7
F1
FF
Dim
er (
%)
凍結乾燥製剤
☆ 最安定pH（1mg/mL）においては、17/17品目でPolymer < 1%。
☆ IgG2、IgG4は、IgG1と比較して、酸性条件下で凝集性が高い傾向がみられた。
50℃/2W 安定性試験における凝集性（濃度依存性） 18
製剤濃度（mg/mL）: mAb 02（80）> mAb 09（50）> mAb 06（30）> mAb 07（20）
mAb 06
mAb 09
mAb 07
mAb 02
☆ 高濃度でも凝集体の増加は数%
であり、市販抗体医薬品の凝集性は
低い。
☆ mAb 02では製剤化により凝集
性が改善されている。
19
Test item Result
SEC [Dimer]
・average : 0.51%
・min : 0.20%
・max : 1.76%
[Polymer]
・average : 0.04%
・min : 0.00%
・max : 0.32%
DLS 11品目とも変化なし
Visual
inspection
No precipitation
★ 市販品の凝集性（液剤11品目、最適pH）
0
1
2
3
4
5
avr. 0.51%
criteria
Dim
er (
%)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
avr. 0.04%
criteria
Po
lym
er (%
)
図．市販品（液剤、11品目）の凝集体増加量
50℃/2W 安定性試験における凝集性
安定性予測 20
安定性評価スキーム
タンパク質は構造変化、凝集、分解、アミノ酸側鎖の異性化等の変化を伴うため、
安定性評価は複雑なものとなる。
抗体の安定性においては凝集性評価が量、抗原性の点から重要なファクターのひと
つである。
加速試験保存条件での安定性（5℃ / 3年等）
安定性予測
凝集性、分解等を評価し安定性プロ
ファイルを把握
凝集性データを用い安定性予測
凝集体評価 21
● Visible Particles
・ ガイドラインあり（ 注射剤の不溶性微粒子試験法）
ICHQ4B（日本薬局方6.07）、EP2.9.19、USP<788>
● Invisible Particles
・ ガイドラインあり
・ 定量性の高い測定法がある
100nm10nm1nm 1mm10mm1mm 100mm 1cm
● Subvisible Particles
・ 抗原性に懸念も、意見分かれる
・ FDAがP-2、3で、モニタリングを推奨
・ ガイドラインなし
・ 定量性の高い測定法がない
粒径
図. 各種測定法の測定範囲
DLS
目視
SEC
抗体
Size Exclusion Chromatographyによる凝集体評価 22
Dim
er
Mo
no
mer
Po
lym
er
Dim
er
Mo
no
mer
Po
lym
er
Initial
50℃
Initial
50℃
①
②
① 複雑な凝集過程で、Polymer以上の変
化を予測できない。
② 下のようなシンプルな凝集過程も考えられ、
定量性の高いSECでのモニタリングから
Polymer以上の増加の予測、コントロール
もしやすい。
Mono Di Poly ・・・
一部分 一部分 一部分
図. SECのクロマトグラム
②のような抗体を選択することで、抗原性を含
めた凝集性リスクを下げる。
②のような抗体を選択することで、抗原性を含めた凝集性リスクを下げる
二量体生成予測 23
dM/dt= -M2k1+(M0-M)k2
monomer dimerk1
k2
安定性予測のパラメータとしては凝集体増加量を
用い、反応速度式は実測値から上式を設定した。
M : 単量体濃度
M0 : 初期単量体濃度
各温度での安定性試験における二量体生成量からk を算出
Fig. Simulated % aggregate at 5 ºC.
反応モデル
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
0 1 2 3 4
% D
imer
Time (year)
5℃での増加量を予測
安定性予測 24
T1
T2
T3
T4
活性化エネルギー: E
エネルギー
存在
確率
T1 < T2 < T3 < T4
温度（K）
気体定数
活性化エネルギー（kcal/mol）速度定数
頻度因子
アレニウスの式
ボルツマン分布
化学反応速度が温度に依存する場合の速度定数kと絶対温度Tとの関係式
“E”以上のエネルギーを持つ
分子が“A”の頻度で反応。
各温度で、5℃/3年と同等の
反応が進行するためにかかる
時間は“E”と相関。
40℃30℃
5℃50℃
Eを左記plotより算出
各温度での安定性試験から算出されたk を用いて、A、Eを求める。A、Eを元にアレニウスの式から5℃での
kを求め、5℃での安定性を予測する。
25
50℃ 40℃ 30℃
● 各温度で凝集体生成量を経時観察
50℃、40℃、30℃
SECで定量
カーブフィッティングでk1、k2を算出
ex1) mAb R 100mg/mL@pH5
26ex1) mAb R 100mg/mL@pH5
アレニウスプロット 5℃実測値と予測値の比較
5℃予測 kk1 = 1.0 x 10-6
k2 = 2.8 x 10-3
● 各温度で凝集体生成量を経時観察
50℃、40℃、30℃
SECで定量
カーブフィッティングでk1、k2を算出
27
アレニウスプロット
k2が収束しないケース
不可逆的な二量体生成がメインであることを示唆
5℃実測値と予測値の比較
5℃予測 kk1 = 3.7 x 10-7
(k2 = 1.0 x 10-8)
ex2) mAb S 20mg/mL@pH6
28
アレニウスプロット
30，40，50℃の結果からの予測が実測と一致しないケース
5℃実測値と予測値の比較
5℃予測 kk1 = 2.8 x 10-6
k2 = 1.3 x 10-3
ex3) mAb T 50mg/mL@pH6
29
アレニウスプロット
50℃の結果を除いて予測
5℃実測値と予測値の比較
5℃予測 kk1 = 9.3 x 10-6
k2 = 6.6 x 10-3
ex3) mAb T 50mg/mL@pH6
予測と実測の比較 30
Antibody Buffer conc(mg/mL) storage ΔDimer(%)実測-予測
R pH5 100 5℃1年 -0.2
S pH6 20 5℃1年 0.2
T pH6 50 5℃1年 0.2
U ー 50 5℃1年 0.0
V pH6 100 5℃1年 -0.2
W pH6 50 5℃半年 0.0
X pH6 100 5℃半年 0.0
まとめ 31
● 市販抗体医薬品の物性評価から、市販抗体医薬品に求められ
る物性を示すことができた。また製剤化の影響を示すことができた。
● 単量体-二量体反応モデルにより良好な凝集体生成予測が可
能であった。
