Chromatografia Chromatografia –– podstawa podstawa metod analizy laboratoryjnejmetod analizy laboratoryjnejmetod analizy laboratoryjnejmetod analizy laboratoryjnej

GraŜyna ChwatkoZakład Chemii Środowiska

Chromatografia

gr. chromatos = barwa grapho = pisze

2

Michaił Siemionowicz Cwiet

Chromatografiajest metodą rozdzielania mieszanin, w którejrozdzielane składniki ulegają podziałowi pomiędzydwie fazy, z których jedna jest fazą nieruchomą(stacjonarną), a druga fazą ruchomą (mobilną)układu chromatograficznego.

3

układu chromatograficznego.

Faza stacjonarna:�ciało stałe,�ciecz na nośniku,�Ŝel.

Faza ruchoma:�gaz,�ciecz,�gaz w stanie nadkrytycznym

(fluid).

Faza stacjonarna i faza ruchoma

Faza stacjonarna:substancja umieszczona w kolumnie chromatograficznej (chromatografia kolumnowa) lub na płaszczyźnie (chromatografia cienkowarstwowa), oddziaływanie z którą

4

cienkowarstwowa), oddziaływanie z którą umoŜliwia rozdzielanie składników mieszanin.

Faza ruchomasubstancja przechodząca w sposób ciągły przez fazę stacjonarną, oddziałująca z nią oraz ze składnikami rozdzielanej mieszaniny.

Podział ze względu na stan skupienia fazy ruchomej

� Chromatografia gazowa

� Chromatografia cieczowa

5

� Chromatografia cieczowa

� Chromatografia fluidalna

Fazaruchoma

Fazastacjonarna

Gaz – ciecz (ang. Gas-Liquid Chromatography – GLC)

Podział ze względu na stan skupienia fazy stacjonarnej

6

Ciecz – ciecz (ang. Liquid-Liquid Chromatography – LLC)

Gaz – ciało stałe (ang. Gas-Solid Chromatography – GSC)

Ciecz – ciało stałe (ang. Liquid-Solid Chromatography – LSC)

6

Podział ze względu na naturę zjawisk będących podstawą procesu

chromatograficznego

� Chromatografia adsorpcyjna

� Chromatografia podziałowa

7

� Chromatografia podziałowa

� Chromatografia jonowymienna

� Chromatografia Ŝelowa (sitowa lub sączenie molekularne).

Techniki eksperymentalne

� Chromatografia planarna

8

� Chromatografia kolumnowa

9

Chromatografia planarna

dwuwymiarowa

Chromatografia kolumnowa(klasyczna)

10

Rodzaje chromatografii i techniki chromatograficzne

11

Wysokosprawna chromatografia Wysokosprawna chromatografia cieczowacieczowa

12

(HPLC (HPLC -- ang. ang. HHigh igh PPerformance erformance LLiquid iquid CChromatographyhromatography))

12

Próbka

Oddziaływania między cząsteczkowe w chromatografii cieczowej

13

Faza stacjonarna Faza ruchoma

Schemat rozdzielania chromatograficznego mieszaniny składającej się z dwóch składników

r

s

A

AA C

CK =

14

rA

r

s

B

BB C

CK =

151515

Krzywa elucji - chromatogram

16

Pik chromatograficzny

17

degazer

pompa

autosampler /zawór dozujący

zbiorniki z rozpuszczalnikami

Schemat

18

autosampler /zawór dozujący

termostat z kolumną

detektor

rejestrator i integrator18

Schemat blokowy chromatografu cieczowego

19

Symulacje separacji chromatograficznej

20

chromatograficznej

Rozpuszczalniki stosowane jako fazy ruchome w HPLC powinny:

• wykazywać odpowiednią zdolność rozpuszczania próbki,

• umoŜliwiać detekcję próbki,• charakteryzować się wysokim stopniem

czystości,

21

czystości,• nie reagować chemicznie ani z fazą stacjonarną,

ani z rozdzielaną próbką,• charakteryzować się trwałością w warunkach

chromatografowania,• być tanie.

21

Chromatografia w normalnym i odwróconym układzie faz

Normalny układ faz (ang. normal phase – NP) to taki układ, w którym faza stacjonarna jest bardziej polarna niŜ faza ruchoma

22

Odwrócony układ faz (ang. reversed phase – RP) to układ, w którym faza stacjonarna jest mniej polarna niŜ faza ruchoma

22

Eluenty stosowane w normalnym (NP) i odwróconym (RP) układzie faz:

Normalny układ faz

• Heksan

Odwrócony układ faz

• Metanol

23

• Heksan• Izooktan• Chloroform • Chlorek metylenu• Octan etylu

• Metanol • Acetonitryl• Izopropanol• Tetrahydrofuran• Woda (wodne

roztwory buforowe)23

Podział kolumn stosowanych w HPLC

� Mikrokolumny� Kolumny analityczne

2424

� Kolumny analityczne� Kolumny preparatywne

Fazy chemicznie związane na bazie krzemionki

� Z grupami niepolarnymi� Z grupami polarnymi

2525

� Z grupami polarnymi� Z grupami jonowymiennymi� Z grupami optycznie czynnymi

Schemat Ŝelu krzemionkowego z chemicznie związaną grupą n-oktylodimetylosililową

2626

C-8

Powierzchnia ziarna fazy stacjonarnej C18

2727

Dobór fazy stacjonarnej i ruchomej

2828

Techniki chromatograficzne stosowane są do:

�jakościowej i ilościowej analizy mieszanin związków nieorganicznych i organicznych,�kontroli procesów przemysłowych,

29

�kontroli procesów przemysłowych,�kontroli zanieczyszczeń środowiska,� analiz klinicznych,

�badań fizykochemicznych,�badań strukturalnych związków

organicznych.

Chromatogram próbki osocza

195

235

275

315

355 p

iku

[mA

U]

CSH

10 GSH HCSH

30

-5

35

75

115

155

195

-1 1 3 5 7 9 11 13

Czas [min]

Wys

okość p

iku

[mA

U]

CGSH

00 1 2 3 4 5 6 7 8

Chromatogram próbki moczu

455565758595

Abs

orba

nce

(mA

U)

31

-55

15253545

0 2 4 6 8

Time (min)

Abs

orba

nce

(mA

U)

Dziękuję za uwagę

32