KOLUMNOWA ELUCYJNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA w skali PREPRATYWNEJ PROCESOWEJZasady ogoacutelne zasady doboru optymalnych warunkoacutew rozdzielaniabdquotechnikardquo i bdquotechnologiardquo ndash operacje okresowe bdquopoacuteł-ciagłerdquo ciągłe

prof dr hab inż Marian Kamiński (prof zw PG)prof dr hab inż Marian Kamiński (prof zw PG)

Politechnika Gdańska Wydział Chemiczny Katedra

Inżynierii Chemicznej i ProcesowejTR - TCh II II ndash prezentacja wykładowa ndash r ak 2013-14

Preparative and Process Scale High Performance Liquid Chromatography ndash often the best and the most effective

separation technique for obtaining of pure metabolites or group of metabolites and other comopunds

--- Some times the P-SFC is more effective ---

The main problems on optimization of separation conditions and maximization of productivitybull The column selectivity should be the highest as possiblebull The column selectivity should be the highest as possiblebull The particle diameter should be low but very low dp value causes high pressure drop in column - the optimum dp is required

bull The high bed stability and the bdquopistonrdquo flow profile in preparative column ensures the sufficient column efficiency and long time bed stability

bull The optimal dp Lc u w Ci Vi and fraction collection points should be used

At

Q

Q

Q

c

i

i

r 2 mh

kg

Wydajność kolumny Rh = Qr tc [kg godz ]

Produktywność kolumny

Pt

Pt - wydajność wyrażona jako masa substancji otrzymana w ciągu jednostki czasu ijednostki powierzchni przekroju kolumnyQi - masa substancji bdquoirdquo wprowadzona do kolumny

Definicje pojęcia wielkości ndash wydajność produktywność kolumny

i

r

Q

Q

Qi - masa substancji bdquoirdquo wprowadzona do kolumnyQr - masa substancji bdquoirdquo o czystości (p) otrzymana z kolumnytc - czas trwania procesu rozdzielania (w warunkach repetycyjnego dozowania ndash czas

jednego etapu rozdzielania)A - powierzchnia przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny A = Πdc

24

Wyrażenie nazwane jest stopniem odzysku

Masa dozowanej substancji (mi) określona jest iloczynemobjętości (Vi) i stężenia izolowanej substancji (Ci)

mi = Vi Ci

Chromatogram rozdzielania składnikoacutew mieszaniny A+B+C w warunkach elucyjnych

Najprostszy sposoacuteb obserwacji przeładowania kolumny (sorbentu)

Przeładowanie kolumny

- Brak

- Objętościowe

- Masowe (stężeniowe)

- Stężeniowo ndashobjętościowe

Izotermy sorpcji ndash objętość (Vi) i stężenie (Ci) wsadu ndash przeładowanie kolumny

GPCSECGPCSEC

M (A)

P

Doboacuter dp Lc uw Ci Vi p-ty kolekcji czas cyklu rozdzielania żądana czystość produktu (oacutew)

Produkcja

M

Zasady powiększania skali rozdzielania w Zasady powiększania skali rozdzielania w kolumnowej elucyjnej chromatografii kolumnowej elucyjnej chromatografii (nie tylko cieczowej ale także P-GC P-SFC)

Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej M-skala modelowa rozdzielania P ndash skala preparatywna procesowa rozdzielania

GPCSECGPCSEC

RP HICRP HIC

NP NPNP NP--w HILICw HILIC

IEC IPCIEC IPC

Przygotowane bdquowsadurdquo fragmentacja suszenie rozdrabnianie homogenizacja roztwarzanie ekstrakcja ługowanie filtracja dekantacja wirowanie NF UF MF LE CC-LE CCC FFF CC-LE i inne techniki hellip

NPNP--ww

NPNP-- BB

NPNP--CCRPRP--BB

Poroacutewnanie roacuteżnych warunkoacutew rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny (powierzchni sorbentu)

RPRP--CCczas

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Preparative and Process Scale High Performance Liquid Chromatography ndash often the best and the most effective

separation technique for obtaining of pure metabolites or group of metabolites and other comopunds

--- Some times the P-SFC is more effective ---

The main problems on optimization of separation conditions and maximization of productivitybull The column selectivity should be the highest as possiblebull The column selectivity should be the highest as possiblebull The particle diameter should be low but very low dp value causes high pressure drop in column - the optimum dp is required

bull The high bed stability and the bdquopistonrdquo flow profile in preparative column ensures the sufficient column efficiency and long time bed stability

bull The optimal dp Lc u w Ci Vi and fraction collection points should be used

At

Q

Q

Q

c

i

i

r 2 mh

kg

Wydajność kolumny Rh = Qr tc [kg godz ]

Produktywność kolumny

Pt

Pt - wydajność wyrażona jako masa substancji otrzymana w ciągu jednostki czasu ijednostki powierzchni przekroju kolumnyQi - masa substancji bdquoirdquo wprowadzona do kolumny

Definicje pojęcia wielkości ndash wydajność produktywność kolumny

i

r

Q

Q

Qi - masa substancji bdquoirdquo wprowadzona do kolumnyQr - masa substancji bdquoirdquo o czystości (p) otrzymana z kolumnytc - czas trwania procesu rozdzielania (w warunkach repetycyjnego dozowania ndash czas

jednego etapu rozdzielania)A - powierzchnia przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny A = Πdc

24

Wyrażenie nazwane jest stopniem odzysku

Masa dozowanej substancji (mi) określona jest iloczynemobjętości (Vi) i stężenia izolowanej substancji (Ci)

mi = Vi Ci

Chromatogram rozdzielania składnikoacutew mieszaniny A+B+C w warunkach elucyjnych

Najprostszy sposoacuteb obserwacji przeładowania kolumny (sorbentu)

Przeładowanie kolumny

- Brak

- Objętościowe

- Masowe (stężeniowe)

- Stężeniowo ndashobjętościowe

Izotermy sorpcji ndash objętość (Vi) i stężenie (Ci) wsadu ndash przeładowanie kolumny

GPCSECGPCSEC

M (A)

P

Doboacuter dp Lc uw Ci Vi p-ty kolekcji czas cyklu rozdzielania żądana czystość produktu (oacutew)

Produkcja

M

Zasady powiększania skali rozdzielania w Zasady powiększania skali rozdzielania w kolumnowej elucyjnej chromatografii kolumnowej elucyjnej chromatografii (nie tylko cieczowej ale także P-GC P-SFC)

Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej M-skala modelowa rozdzielania P ndash skala preparatywna procesowa rozdzielania

GPCSECGPCSEC

RP HICRP HIC

NP NPNP NP--w HILICw HILIC

IEC IPCIEC IPC

Przygotowane bdquowsadurdquo fragmentacja suszenie rozdrabnianie homogenizacja roztwarzanie ekstrakcja ługowanie filtracja dekantacja wirowanie NF UF MF LE CC-LE CCC FFF CC-LE i inne techniki hellip

NPNP--ww

NPNP-- BB

NPNP--CCRPRP--BB

Poroacutewnanie roacuteżnych warunkoacutew rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny (powierzchni sorbentu)

RPRP--CCczas

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

At

Q

Q

Q

c

i

i

r 2 mh

kg

Wydajność kolumny Rh = Qr tc [kg godz ]

Produktywność kolumny

Pt

Pt - wydajność wyrażona jako masa substancji otrzymana w ciągu jednostki czasu ijednostki powierzchni przekroju kolumnyQi - masa substancji bdquoirdquo wprowadzona do kolumny

Definicje pojęcia wielkości ndash wydajność produktywność kolumny

i

r

Q

Q

Qi - masa substancji bdquoirdquo wprowadzona do kolumnyQr - masa substancji bdquoirdquo o czystości (p) otrzymana z kolumnytc - czas trwania procesu rozdzielania (w warunkach repetycyjnego dozowania ndash czas

jednego etapu rozdzielania)A - powierzchnia przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny A = Πdc

24

Wyrażenie nazwane jest stopniem odzysku

Masa dozowanej substancji (mi) określona jest iloczynemobjętości (Vi) i stężenia izolowanej substancji (Ci)

mi = Vi Ci

Chromatogram rozdzielania składnikoacutew mieszaniny A+B+C w warunkach elucyjnych

Najprostszy sposoacuteb obserwacji przeładowania kolumny (sorbentu)

Przeładowanie kolumny

- Brak

- Objętościowe

- Masowe (stężeniowe)

- Stężeniowo ndashobjętościowe

Izotermy sorpcji ndash objętość (Vi) i stężenie (Ci) wsadu ndash przeładowanie kolumny

GPCSECGPCSEC

M (A)

P

Doboacuter dp Lc uw Ci Vi p-ty kolekcji czas cyklu rozdzielania żądana czystość produktu (oacutew)

Produkcja

M

Zasady powiększania skali rozdzielania w Zasady powiększania skali rozdzielania w kolumnowej elucyjnej chromatografii kolumnowej elucyjnej chromatografii (nie tylko cieczowej ale także P-GC P-SFC)

Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej M-skala modelowa rozdzielania P ndash skala preparatywna procesowa rozdzielania

GPCSECGPCSEC

RP HICRP HIC

NP NPNP NP--w HILICw HILIC

IEC IPCIEC IPC

Przygotowane bdquowsadurdquo fragmentacja suszenie rozdrabnianie homogenizacja roztwarzanie ekstrakcja ługowanie filtracja dekantacja wirowanie NF UF MF LE CC-LE CCC FFF CC-LE i inne techniki hellip

NPNP--ww

NPNP-- BB

NPNP--CCRPRP--BB

Poroacutewnanie roacuteżnych warunkoacutew rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny (powierzchni sorbentu)

RPRP--CCczas

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Chromatogram rozdzielania składnikoacutew mieszaniny A+B+C w warunkach elucyjnych

Najprostszy sposoacuteb obserwacji przeładowania kolumny (sorbentu)

Przeładowanie kolumny

- Brak

- Objętościowe

- Masowe (stężeniowe)

- Stężeniowo ndashobjętościowe

Izotermy sorpcji ndash objętość (Vi) i stężenie (Ci) wsadu ndash przeładowanie kolumny

GPCSECGPCSEC

M (A)

P

Doboacuter dp Lc uw Ci Vi p-ty kolekcji czas cyklu rozdzielania żądana czystość produktu (oacutew)

Produkcja

M

Zasady powiększania skali rozdzielania w Zasady powiększania skali rozdzielania w kolumnowej elucyjnej chromatografii kolumnowej elucyjnej chromatografii (nie tylko cieczowej ale także P-GC P-SFC)

Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej M-skala modelowa rozdzielania P ndash skala preparatywna procesowa rozdzielania

GPCSECGPCSEC

RP HICRP HIC

NP NPNP NP--w HILICw HILIC

IEC IPCIEC IPC

Przygotowane bdquowsadurdquo fragmentacja suszenie rozdrabnianie homogenizacja roztwarzanie ekstrakcja ługowanie filtracja dekantacja wirowanie NF UF MF LE CC-LE CCC FFF CC-LE i inne techniki hellip

NPNP--ww

NPNP-- BB

NPNP--CCRPRP--BB

Poroacutewnanie roacuteżnych warunkoacutew rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny (powierzchni sorbentu)

RPRP--CCczas

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Najprostszy sposoacuteb obserwacji przeładowania kolumny (sorbentu)

Przeładowanie kolumny

- Brak

- Objętościowe

- Masowe (stężeniowe)

- Stężeniowo ndashobjętościowe

Izotermy sorpcji ndash objętość (Vi) i stężenie (Ci) wsadu ndash przeładowanie kolumny

GPCSECGPCSEC

M (A)

P

Doboacuter dp Lc uw Ci Vi p-ty kolekcji czas cyklu rozdzielania żądana czystość produktu (oacutew)

Produkcja

M

Zasady powiększania skali rozdzielania w Zasady powiększania skali rozdzielania w kolumnowej elucyjnej chromatografii kolumnowej elucyjnej chromatografii (nie tylko cieczowej ale także P-GC P-SFC)

Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej M-skala modelowa rozdzielania P ndash skala preparatywna procesowa rozdzielania

GPCSECGPCSEC

RP HICRP HIC

NP NPNP NP--w HILICw HILIC

IEC IPCIEC IPC

Przygotowane bdquowsadurdquo fragmentacja suszenie rozdrabnianie homogenizacja roztwarzanie ekstrakcja ługowanie filtracja dekantacja wirowanie NF UF MF LE CC-LE CCC FFF CC-LE i inne techniki hellip

NPNP--ww

NPNP-- BB

NPNP--CCRPRP--BB

Poroacutewnanie roacuteżnych warunkoacutew rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny (powierzchni sorbentu)

RPRP--CCczas

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Przeładowanie kolumny

- Brak

- Objętościowe

- Masowe (stężeniowe)

- Stężeniowo ndashobjętościowe

Izotermy sorpcji ndash objętość (Vi) i stężenie (Ci) wsadu ndash przeładowanie kolumny

GPCSECGPCSEC

M (A)

P

Doboacuter dp Lc uw Ci Vi p-ty kolekcji czas cyklu rozdzielania żądana czystość produktu (oacutew)

Produkcja

M

Zasady powiększania skali rozdzielania w Zasady powiększania skali rozdzielania w kolumnowej elucyjnej chromatografii kolumnowej elucyjnej chromatografii (nie tylko cieczowej ale także P-GC P-SFC)

Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej M-skala modelowa rozdzielania P ndash skala preparatywna procesowa rozdzielania

GPCSECGPCSEC

RP HICRP HIC

NP NPNP NP--w HILICw HILIC

IEC IPCIEC IPC

Przygotowane bdquowsadurdquo fragmentacja suszenie rozdrabnianie homogenizacja roztwarzanie ekstrakcja ługowanie filtracja dekantacja wirowanie NF UF MF LE CC-LE CCC FFF CC-LE i inne techniki hellip

NPNP--ww

NPNP-- BB

NPNP--CCRPRP--BB

Poroacutewnanie roacuteżnych warunkoacutew rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny (powierzchni sorbentu)

RPRP--CCczas

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Izotermy sorpcji ndash objętość (Vi) i stężenie (Ci) wsadu ndash przeładowanie kolumny

GPCSECGPCSEC

M (A)

P

Doboacuter dp Lc uw Ci Vi p-ty kolekcji czas cyklu rozdzielania żądana czystość produktu (oacutew)

Produkcja

M

Zasady powiększania skali rozdzielania w Zasady powiększania skali rozdzielania w kolumnowej elucyjnej chromatografii kolumnowej elucyjnej chromatografii (nie tylko cieczowej ale także P-GC P-SFC)

Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej M-skala modelowa rozdzielania P ndash skala preparatywna procesowa rozdzielania

GPCSECGPCSEC

RP HICRP HIC

NP NPNP NP--w HILICw HILIC

IEC IPCIEC IPC

Przygotowane bdquowsadurdquo fragmentacja suszenie rozdrabnianie homogenizacja roztwarzanie ekstrakcja ługowanie filtracja dekantacja wirowanie NF UF MF LE CC-LE CCC FFF CC-LE i inne techniki hellip

NPNP--ww

NPNP-- BB

NPNP--CCRPRP--BB

Poroacutewnanie roacuteżnych warunkoacutew rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny (powierzchni sorbentu)

RPRP--CCczas

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

GPCSECGPCSEC

M (A)

P

Doboacuter dp Lc uw Ci Vi p-ty kolekcji czas cyklu rozdzielania żądana czystość produktu (oacutew)

Produkcja

M

Zasady powiększania skali rozdzielania w Zasady powiększania skali rozdzielania w kolumnowej elucyjnej chromatografii kolumnowej elucyjnej chromatografii (nie tylko cieczowej ale także P-GC P-SFC)

Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej M-skala modelowa rozdzielania P ndash skala preparatywna procesowa rozdzielania

GPCSECGPCSEC

RP HICRP HIC

NP NPNP NP--w HILICw HILIC

IEC IPCIEC IPC

Przygotowane bdquowsadurdquo fragmentacja suszenie rozdrabnianie homogenizacja roztwarzanie ekstrakcja ługowanie filtracja dekantacja wirowanie NF UF MF LE CC-LE CCC FFF CC-LE i inne techniki hellip

NPNP--ww

NPNP-- BB

NPNP--CCRPRP--BB

Poroacutewnanie roacuteżnych warunkoacutew rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny (powierzchni sorbentu)

RPRP--CCczas

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

NPNP--ww

NPNP-- BB

NPNP--CCRPRP--BB

Poroacutewnanie roacuteżnych warunkoacutew rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny (powierzchni sorbentu)

RPRP--CCczas

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Przykład badań w skali modelowej z zastosowaniem kolumny HPLC oraz bdquoprzenoszeniardquo skali rozdzielania

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

The examples of chromatograms obtained during research on optimization of process scale HPLC separation and obtaining of cardiac glycosides using NP-HPLC and bdquomodel scalerdquo columnsImportant separation parameters should be chosen using bdquomodel scalerdquo column and after them recalculated for and after them recalculated for preparative or process scale columnThe important parameters to should be optimized dp Lc u (w) Ci Vi bdquosamplerdquo (feed) solvent fraction collection points

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Problem nieliniowości odpowiedzi detektora w warunkach przeładowania kolumny i sposoby rozwiązaniabdquoobejściardquo problemu ndash b kroacutetka droga optyczna kuwety detektora UV-VIS wyboacuter długości fali o niskiej absorpcji w zakresie widma zbieranych substancji (programowanie długości fali detekcji wyboacuter detektora o bardzo szerokim zakresie dynamiki odpowiedzi i programowanie czułości odpowiedzi hellip

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Wyboacuter optymalnych p-toacutew kolekcji frakcji w elucyjnej kolumnowej PLC

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Najważniejsze znaczenie ma

-- optymalna konstrukcja kolumny i poprawny sposoacuteb jej wypełnieniajej wypełnienia

-- poprawny profil przepływu eluentu w przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Zniekształcenia pikoacutew spowodowane nadmierną roacuteżnicą lepkości i napięcia powierzchniowego między eluentem i roztworem wsadu

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

The uniformity of flow profile in the large scale column and bed structure stability is very much important in

preparative or process chromatography

Wet packed columns

Dry packed columns

dpgt25 umdplt25 um

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Results using two collored particle fractionsof with different particle diameter

-the segregation of different particle in dry packed PLC columns is possible

- the peak tailing in wet packed (bdquoslurry or DAC) preparative or

Flow profiles in the column and peak shapes ndash comparison

A -- dry packed

B -- wet packed DAC) preparative or process scale columns is very often the main problem found if a very high purity of separation product needed

B -- wet packed

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

If peak tailing occure the bdquoinfinite diameterrdquo column mode for very pure substances obtaining is needed

-- if purity can be lower than 995 normal column operation is sufficient

The Infinite diameter column mode gives better purity but loweres column sufficient

-- if purity should be higher than 999 infinite diameter column mode is needed

loweres column productivity

S - tzn także stopień obniżenia produktywności kolumny

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

The simple construction of preparative HPLC column for-a ndash normal column operation- b ndashinfinite diameter column

operation

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Problem bdquoogonowaniardquo pikoacutew w przypadku kolumn P-HPLC wypełnionych na mokro

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Mass overloading of the column is the most effective operation manner on maximization of preparative HPLC

Normal operation of the PLC column Infinite diameter -

PLC column

RP-P-HPLCdc=32 mm idLc=250 mmdp=10 um

preparative HPLC column productivity

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

-The number of theoretical plate of preparative column should be graeter than bdquocriticalrdquo (base line separation without column overloading) but not to high

-The surface of the sorbent should be high in PLC

For this study the column efficiency should be For this study the column efficiency should be measured without overloading

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej prędkości optymalnej prędkości

Hupe Lauer hellip

optymalnej prędkości optymalnej prędkości przepływu eluentuprzepływu eluentu

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

The optimal low rate in a preparative LC column is much higher than optimal value for minimum HETP and as higher as lower is particle diameter of the packing

The normal phase partition chromatography with dynamic genaration of hydrophylic stationary phase is the most effective separation system of column preparative or separation system of column preparative or process scale chromatography of glycosides or alkaloides ndash more effective than RP-HPLC or NP-HPLC or HILIC

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Wyniki badań Wyniki badań poszukiwania poszukiwania optymalnej długości optymalnej długości kolumnykolumny

ndashndash maksymalizacja Ptmaksymalizacja Pt

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

Hupe Lauer hellip

M Kamiński B Śledzińska M Kamiński B Śledzińska

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

The maximal column productivity can be grater productivity can be grater than 20 kg of separated mixture m2 hour

by pressure drop approximately 20 bar

NP-w

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego ndash sterowanegokomputerem ndash gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z1

Z24) z możliwością recyrkulacji części eluentu oraz z podwoacutejnym systemem automatycznie kontrolowanego dozowania roztworusubstancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lubdozowanie dużych objętości poprzez zawory Z2 i Z3) oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekoacuteweluentu Znaczenie symboli (ktoacutere nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej) P ndash pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej Z ndashzawory (A ndash D programowanie składu eluenta 1 ndash 10 sterowania przebiegiem procesu separacji 11 ndash 24 kolekcji frakcji) MSP ndash modułsterowania pompą MSWE ndash moduł sterowania bdquoniskociśnieniowymrdquo systemem gradientowym MSZ ndash moduł sterowania zaworami MK ndash modułkomunikacji z użytkownikiem i wzajemnej koordynacji programoacutew obsługi awarii oraz kontroli warunkoacutew pracy kolumn (moduł o nadrzędnychpriorytetach może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu a w przyszłościewentualne wyeliminowanie konieczności stosowania komputera) ndash obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu komputerowi

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Etapy procesu technologicznego produkcji czystych substancji z zastosowaniem chromatografii kolumnowej (cieczowej)

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Schema of process scale HPLC apparatus bdquoSCrdquo ndash separating column - 800x150 mm id bdquoPCrdquo ndash bdquosample pre-purifficaingrdquo column ndash 1000 x 200 mm id P1 ndash eluent pump P2 ndash bdquosamplerdquo (feed) pump V ndash 4-way valve PD ndash pulse damper D- UV or RI ndashdetektor situated on the by-passe Vrsquo 1- Vrsquo6 ndash fraction collection valves R ndash recorder or collection valves R ndash recorder or data system ST ndash control system

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

A B C

Wybrane konstrukcje kolumn preparatywnych procesowych do chromatografii

D E F

chromatografii

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Typ Opis SchematKształty impulsustężeniowego

DOZOWANIEDOZOWANIE WSADUWSADU (bdquoproacutebkirdquo)(bdquoproacutebkirdquo)

Vi Skala Uwagi

Zaw

oacuterz

pętl

icow

ymza

sobn

ikie

mpr

oacutebki

Najczęściejsześciodrogowydwupołożeniowyzawoacuter dozujący zzasobnikiem w formiepętli wykonanej zrurki Możliwie roacuteżnekształty pętli

apę

tla

bdquozw

ykła

rdquo 0-5 ml(do 50ml)

Skala analitycznamodelowapreparatywna

v2 = Vi

2B121 Relt2100Im większe natężenieprzepływu cieczywymywającej im mniejszaśrednica rurki zasobnikaoraz im bardziej zbliżonelepkości i napięciapowierzchniowe cieczywymywanej iwymywającej tym bardziejkorzystny profil dozowania

bpę

tla

om

ałym

prom

kr

zyw

izny

jw jw

cpę

tla

typu

bdquo8rdquo jw jw

inny

m

Skala modelowa do Rzadko używany w

Zaw

oacuterdw

up

oło

żeni

owy

zin

nym

zaso

bn

ikie

mn

iżpę

tla

Zasobnik w postacikolumny z warstwąporowatą

01 mldo1000 ml

Skala modelowa do procesowej

praktyce ze względu nakonieczne nadciśnieniepodczas napełnianiapojemnika

Zasobnik w postacibdquopseudo-strzykawkirdquo

05 mldo 500 ml(do 5000ml)

jw

Oferowany przezAmicon Bardzokorzystny profildozowania

Doz

owan

iepo

mpą

6a Dodatkowa pompadozująca

od05 ml

jw

Rozwiązanie kosztownegwarantujące bardzokorzystny profildozowania

6b Dozowanie pompątłoczącą eluent

od10 ml

jwTylko z pompą o bniskiej objętościskokowej

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Example of chromatogram obtained Example of chromatogram obtained during production of cardiac during production of cardiac glucisidesglucisidesusing HPLC process column (800 mm using HPLC process column (800 mm ((LcLc) x 200 mm ) x 200 mm iidd (dc) (dc) (broken lines ndashfraction collection points)

NPNP--w w chromatographicchromatographic systemsystem

---- processprocess LCLC--chromatographychromatography -------- processprocess LCLC--chromatographychromatography ----

Time Warunki NP-w-- szczegoacutelnie korzystna produktywność rozdzielania w warunkach P-LC

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Fig 3 UV ndash 254 nm chromatogram of chloroform extract from Drosera aliciae obtainedin preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1)

Rośliny owadożerne -naftochinony ndash plumbagina ramantaceon

NP- EBF RP

in preparative scale A - NP-PLC conditions B - RP-PLC conditions (see Tab 1) Symbols R-ramentaceone BF-backflush point of the eluent flow direction in the column

Warunki NP-PLC RP-PLC

Column Lichrosorb Si 60 (silica gel 6 nm porediameter) dp=10microm 200 x 168 mm

Lichroprep RP-18 (10 nm) dp=12microm 250 x 168 mm

Eluent n-hexanemethyl t-butyl ether 91 (vv) methanolwater 82 (vv)

Mobile phase flow rate 7mLmin 5mLmin

Sample concentration 100mgml 100mgml

Sample volume 500microl 150microl

Detector UV 254 UV 254

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Recycling chromatography with bdquopeak shavingldquo

Recycling of components until sufficient separation is achieved

Simulation of a long column

Advisable for a low separation factor

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 38

Recycle fraction

factor

Substances with a high separation factor (to the target) are withdrawn in the first cycle

Improved performance by withdrawal of the product fractions (peak shaving)

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Extraction- Solvent extraction Sohxlet

- SFE (Supercritical CO2)

Herbal or animal material

Herbal or animal material

crude extractcrude extract

Pre-PurificationPre-Purification

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

848 1019 1131

1411

1525

1661

1723

1803

1893

1957

1992

2072

2139

2224

2304

2424

2488

2512

2600

2725

2805

2904

2941

2973

3037

3131

3280

3408

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

000

002

004

006

008

Intensity (AU)

2800

12

14

2800

12

14

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 39

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

Pre-Purification- liquidliquid-partitioning solid

phase extraction silica chromatography

purified extractpurified extract

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

Polishing- chromatography in batch-

recycling- or SMB-mode

pure productpure product

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2699

2725

2776

2925

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

01

02

03

04

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

2069

2421

2456

2501

2579

2720

2747

2875

2901

2952

2981

3029

3288

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

00

02

04

06

08

10

12

Intensity (AU)

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

analytical chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 40

stationary phase LiChrospher RP18 5 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase MeOHwater

6040Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

Paclitaxel

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mm

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 41

dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

too short retention time for sufficient resolution

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Chromatographic conditions

stationary phase LiChroprep RP18 15-25 microm

column dimension 200 50 mmmobile phase MeOHwater

7030

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 42

7030Flow rate 1500 mlminDetection UV 210 nm

Maximum fraction purity 76

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Chromatographic conditions

stationary phase LiChrospher Si60 15 microm

column dimension 250 4 mmmobile phase HeptaneDioxane

6535

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 43

6535Flow rate 10 mlminDetection UV 220 nm

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

recycling chromatogram of a pre-purified Taxus extract

Chromatographic conditions

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm

waste recycle w rec w rec w fraction w

Recycling chromatographyExample (Paclitaxel purification)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 44

Stationary phase LiChrospher Si 60 10 microm Column type Selfpacker NW 50Column dimension 220 50 mmMobile phase EtAtn-heptane 6040Flow rate 80 mlminDetection UV 280 nmFeed concentration 220 gl (in Etat)Injection 20 mlCycle time 75 minRun time with eluentconsumption 424 min

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

In ideal conditions transposition from TLC to Flash Chromatography

Transposition example 1Flush Chromatography

Merck Chimie SAS 25112005

Page 45

Chromatography should give such results

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Particle size comparisons

250000

300000

Test silice Si60 40-63 micromTest silice Si60 63-200 micromTest silice Si60 15-40 microm

Merck Chimie SAS 25112005

Page 46

0

50000

100000

150000

200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Przedmiot opracowania w Przedmiot opracowania w PG w zakresie PG w zakresie aparatury aparatury bdquoprofesjonalnejrdquo bdquoprofesjonalnejrdquo

-- Pompowy gradientowy Pompowy gradientowy moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny

-- Komputerowy system Komputerowy system sterownia rejestracji i sterownia rejestracji i przetwarzania danych do przetwarzania danych do HPLC HPLC

POMPOWY APARAT GRADIENTOWYPOMPOWY APARAT GRADIENTOWY

moduł zasilania kolumny moduł zasilania kolumny HPLC z HPLC z oprogramowaniem oprogramowaniem sterownia programem sterownia programem elucji i przepływu eluentuelucji i przepływu eluentu

-- Projekt układu Projekt układu wielowymiarowego wielowymiarowego modułu przełączania modułu przełączania kolumn i przepływu kolumn i przepływu zwrotnego eluentu w zwrotnego eluentu w kolumniekolumnie

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny HPLC zasilania kolumny HPLC do pracy w warunkach do pracy w warunkach izokratycznychizokratycznych

BezBez--pompowy moduł pompowy moduł zasilania kolumny zasilania kolumny HPLC z HPLC z programowaniem programowaniem składu eluentu składu eluentu -- do do pracy w warunkach pracy w warunkach elucji gradientowejelucji gradientowej

Aparaty Aparaty bezpompowebezpompowe do dydaktyki i nietrudnej analityki do dydaktyki i nietrudnej analityki -- do pracy w do pracy w warunkach izokratycznych warunkach izokratycznych (po prawej) (po prawej) warunkach gradientowych warunkach gradientowych (po (po lewej) lewej)

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Pilotowa stacja rozdzielania techniką chromatografii cieczowej w skali procesowej

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Procesowa instalacja PLC ndashschemat ideowy

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Chromatografia jako proces ciągły (MB SMB)

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Batch Chromatography salad

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 53

True Moving Bed (TMB) salad

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

extract (A) raffinate (B)feed

SMB-Chromatographybasic principle

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 54

solid

fluid

counter-current flow of solid and liquid

feed is injected in the centre of the process

stronger retained component is carried with the solid stream

less retained component is carried with the fluid stream

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

SMBSimulated Moving Bed

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

SMB-Chromatographyrunning processes (enantioseparation)

Name Levetiracetam Tetralon Escitalopram DOLEKepprareg Zoloftreg Cipralexreg

Indication antiepileptic antidepressant antidepressant CSE-inhibitCN

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 56

SMB-size 100 + 45 60 2 80 30

Prodamount 145 toa 45 toa 160 toa 10 toa

Sales 417 meuro (2004) 789 m$ (2003) 163 meuro (1-92004)

NHH

HCl

Cl

O

N

F

CN

N

F

OH OH

CO2Et

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

CyclosporinesCyclosporines

SP SilicaMP ETAT

New ProcessBatch separation + two SMB-separations

Isolation of Cyclosporine Anew process

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

CyclosporinesAULBC

Cyclosporines DGA

Liquid

RAFFINATE

ELUENT

FEED

EXTRACT

Raffinate

Cyclosporine A

Raffinate

CyclosporineA

RP Sielutionorder

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

SMB-Chromatographyequipment (lab scale)

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 58

NOVASEPFrance

BTS Germany

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

SMB-Chromatographyequipment (production scale)

Industrial SMB-systems5 to 8 columns up to 1m diameter

Chromatography Workshop 0306 (Poland)

copy Merck KGaA DarmstadtGermany Page 59

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Techniki i metody przygotowania Techniki i metody przygotowania wsadu do rozdzielania techniką wsadu do rozdzielania techniką

elucyjnej elucyjnej PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Sonication in ultrasonic bath

Sonification in ultrasonic dezintegrator

PP--HPLCHPLC PP--SFCSFC PP--GCGC

Mixing high shear rotary homogenizer

Microwave Assisted Extraction

Accelerated Solvent Extraction

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

DAC

bdquoDynamicAxiallyCompressedrdquo

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Techniki i technologie wypełniania kolumn P-HPLC P-GC P-SFC

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

Wnioski końcowe

bull Ustalenie optymalnych warunkoacutew rozdzielania w skali procesowej jest trudne i bardzo pracochłonne Istnieją oprogramowania

bull Najważniejsze - dobranie najwyższej selektywności rozdzielania

bull Następnie doboacuter w skali modelowej - Ci Vi dp Lc u (w) punktoacutew kolekcji frakcji Pt nawet do 20 kg m2 godz

bull Kolumna modelowa i procesowa powinny być tej samej długości wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność wypełnione tym samym sorbentem posiadać tę samą sprawność -- co szczegoacutelnie ważne

bull kolumny ndash modelowa i preparatywna powinny mieć taki sam profil przepływu eluentu (tłokowy) ndash identyczne wartości N

bull wtedy przenoszenie skali rozdzielania jest proste a odpowiedni wskaźnik zmiany skali wynosi dcP

2 dcM2

bull otrzymywanie sprawnych i stabilnych wypełnień kolumn preparatywnych nie jest łatwe ale bdquowykonalnerdquo

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę

bull Odmiany techniczne kolumnowej chromatografii elucyjnej -bdquoklasycznardquo bdquoflush chromatographyrdquo bdquorecycling chromatographyrdquo bdquoSMBrdquo

bull Każdy rodzaj układu chromatograficznego może być wykorzystywany do oczyszczania mieszanin otrzymywania czystych substancji grup składnikoacutew jednak układy bdquoNP-wrdquo szczegoacutelnie wydajne

bull Technika SMB - szczegoacutelnie przydatna w rozdzielaniu izomeroacutew optycznych optycznych

bull Opisane tu goacutelne zasady optymalizacji warunkoacutew rozdzielania obowiązują dla każdej odmiany technicznej PLC a większość z nich także dla P-GC i P- SFC

Dziękuję za uwagę