Click here to load reader

Cíle studia p řenosu gen ů do živo čišných bun ěk · PDF fileXantin (+ kys. mykofenolová) Připravena řada linií lidských a hlodav čích tk-bun ěk Postup p ři izolaci

  • View
    218

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Cíle studia p řenosu gen ů do živo čišných bun ěk · PDF fileXantin...

1. Penos gen do ivo inch bun k vyhledvn gen, poznn jejich funkce a regulace, studium proces diferenciace a jejich poruch heterologn exprese, tvorba cizorodch protein

2. Pprava transgennch ivo ich studium fungovn gen v rmci celho organismu pprava ivoich (savc) s clen upravenmi geny

modely pro studium genetickch chorob pprava zvat s lepmi uitkovmi vlastnostmi, vytven cizorodch protein (animal farming) hledn monost pro genovou terapii

Cle studia p enosu gen do ivo inch bun k

transfekce (Ca-precipitace, kotransfekce) elektroporace infekce (virov vektory) lipofekce mikroinjekce fze bunk (savch, bakterilnch protoplast)Exprese transgenu: transientn (pechodn) stabiln

Zpsoby p enosu DNA do bun k ivo ich(voln DNA nebo DNA klonovan ve vektorech)

Zpsoby p enosu cizch gen do sav ch bun k

Transgenn zv e (+/- mozaikov)

Buky ve tkovch kulturch

DNA klonovanve vektoru, nebo infekce virovm vektorem

Sledovn exprese mRNA v abch oocytech

Projdro

asnembryo

infekce rekombinantnmretrovirem

Selekce a penos do blastocyst

Zalenn DNA homolognrekombinac

reportrov geny

Enzym Selekn ltka Mechanismus selekceAminoglykozidfosfotransferza(APH) neo

G418 (inhibice syntzy protein) (kanamycin, neomycin)

APH inaktivuje G418

Dihydrofoltreduktza (DHFR) Metotrext (Mtx) (inhibuje DHFR)varianta DHFR rezistentnk Mtx, poet kopi

Hygromycin-B-fosfotransferza(HPH) (Hyg)

Hygromycin-B (inhibuje syntzu protein)

HPH inaktivujehygromycin B

Tymidinkinza (TK)Aminopterin (inhibuje syntzu purinde novo a syntzu tymidyltu)

TK syntetizuje tymidylt

Xantin-guanin-fosforibozyltransferza(XGPRT) (Ecogpt)

Mykofenolov kyselina (inhibuje syntzu GMP de novo)

XGPRT syntetizuje GMP z xantinu

Chloramfenikoltransferza(CAT) Reportrov gen

Chloramfenikol (Clm) (inhibice biosyntzy mt protein) CAT inaktivuje Clm

Hypoxantinguaninfosforibozyl-transferza (HGPRT)

Aminopterin (inhibuje syntzu purinde novo)

HGPRT syntetizuje purinyz hypoxantinu

LuciferzaGFPbeta-glukozidza

Selekn markery pro penos gen do eukaryot

Selective marker gene systems for mammalian cellsSelective agent Action of selective agent Marker gene

Action of markergene protein

Xyl-ABlasticidin SBleomycinG-418 (Geneticin)Histidinol

Hygromycin B

MSX

MTX

PALA

Puromycin

MSX, methionine sulfoximine; MTX, methotrexate; PALA, N-(phosphoacetyl)-L-aspartate; Xyl-A, 9--D-xylofuranosyl adenine

Metabolismus pyrimidin

Metabolismus purin

Selekn systmy Tk, HGPRT, XGPRT

Selekn media pro enzymy Tk, HGPRT a XGPRT

Medium XAT

Xantin (+ kys. mykofenolov)

Pipravena ada lini lidskch a hlodavch tk-bunk

Postup p i izolaci mutant tk -.Buky s funknm enzymem thymidinkinasou fosforylujbromdeoxyuridin (BrU-dr) na BrUMP, kter je potom inkorporovn do bunnDNA. Bromovan DNA je extrmn citliv na ozen UV svtlem, po kterm buky hynou. Vzcn mutanty tk -ozen pevaj .

Transientn a stabiln exprese gen v ivo inch bukch

Selekce G418

DNA, kter se do genomu neintegrovala, se z bunk postupnvyed

Selekce klon s DNA stabiln integrovanou do genomu (vzcn)

Stabiln bun n linie (transformovan bu ky: HeLa, CHO aj. po infekci onkogennmi retroviry)Analza exprese gen.

Studium regulanch oblast, sestihu; pprava velkch mnostv mRNAnebo protein

1. Transfekce cizorod + nosiov DNA = vytven konkatemer transgenom (selektovateln marker, neselektovan gen-nosiov

DNA) zalenn v jedn kopii v libovolnm seku genomu. Pozdji asto dochz k sten nebo pln deleci transgenomu

2. Transfekce (Ca-P) ist plazmidov DNA bez nosiov DNA = plazmidyjsou stabiln integrovny do jednoho a pti rznch mst genomu, kde se nachzej pevn v jedn kopii.

3. Elektroporace ist plazmidov DNA = nzk poet integrovanch plazmidovch molekul

4. Mikroinjekce plazmidu do bunnho jdra a) pi vysok koncentraci DNA dochz k inkorporaci dlouhch

konkatemer (hlava-pata),b) pi malm mnostv DNA se zalen jednotliv.

Osud p enen plazmidov DNA v recipientn bu ce

Po linearizaci plazmidu pibv pravdpodobnost tvorby konkatemera zalenn do genomu, piem nehraje roli, kterou metodou byla DNA plazmidu vnesena.

transgenom

Kotransfekce n kolika druhy molekul DNAKotransformace bhem penosu gen. Pi tranfekcitk do eukaryontnch bunk pomoc precipitace Ca2+ je st nosiov DNA a jakkoliv dal DNA ptomn v precipittu spojena dohromady do velkch struktur (800 a 1000 kb) a vlenna do chromozmu.

Izolace genu pro tk z ku ecch bun k plasmid rescue

monost izolovat kad gen, kter je v kultue na zklad svch fenotypovch vlastnostselektovateln nebo njak poznateln.

dal monosti zna en: supF, pBR322, alu

genomovfragmenty po t penHindIII

vysokomolekulrn celkovDNA z ku ecch bun k

transfekce tk kuecch bun k

HAT-Selection

primrn tk + transfektanti

1. pprava DNA z tk+ transfektant 2. selekce v mediu HAT

sekundrn tk+ transfektanti

pprava DNA

kuec DNA

1. tpen EcoRI2. cirkularizace, ligace

1. Transformace E.coli2. Selekce Ap R

na rekombinantnm plazmidu senachz gen tk + spole n s Ap R

Vyed se plazmidys neselektovanmi znaky (tj. plazmidynevzan s tk+)

Gen tk+ je oznaengenem ApR

Ca-koprecipitace

Selekce spntransfektovanch bunk na zklad zmny jejich fenotypu

Penos lidskch onkogen do mych bunk. Po transfekcimych bunk DNA zskanou z lidskch ndor se za nkolik tdn objev malohniska transformovanch mych bunk. Vsledkeminjikace takovch bunkmym jsou pevn ndory.

Vektory pro p enos gen do ivo inch bun k1. Plazmidov vektory (neiv): plazmid se nereplikuje, vzcn se

zaleuje do genomu buky prokaryotick plazmid + eukaryotick transkripn jednotka +

selekn markerVyuvaj se k selekci transfektovanch bunk pi kotransfekci a sledovn transientn exprese gen

2. Virov vektory (iv): kyvadlov vektory, replikujc se v hostitelskch bukch st bakterilnho vektoru + sekvence eukaryotickch vir +

selekn marker vektory odvozen z SV40, bovinnho papilomaviru, EBV,

retrovir, bakulovir, viru vakcinie, adenovir aj.Vyuvaj se ke sledovn stabiln nebo transientn exprese gen a k zskvn rekombinantnch protein ve velkm mnostv

Plazmidy pSVTranskripn regulansekvence z viru SV40 Kyvadlov vektor

Konstrukce pSV vektor

Vyuit pSV: nesou dominantn selekn markery pi kotransfekci, nebo pro doclen exprese cizch gen, protoe v bukch petrvvaj ur itou dobu (i kdy se nereplikuj)

Expresn vektor pro sav buky

pcDNA3.1/myc-HIS

Pcmv promotor cytomegaloviru

BGHpA = polyadenylansekvence BGH

Neo = rezistence k G418

6 x HIS = purifikace proteinu (tag)

myc epitop = detekce proteinu protiltkou

T7 sekvenovn inzertu

Sekvence aktivn v E. coli:AmpR, pUC ori, f1 ori

Siln promotory: CMV, RSV, SV40, LTR MoMULV, * Monost inducibility expresnho systmu.Bv volen metalothioneinov promotor, kdy je transkripce docleno po pidn tkch kov (Cd, Zn). A 200nsobn indukce. promotory reagujc na steroidn hormony. Dexametazonna glukokortikoidov receptor vede k indukci transkripce z MMTV LTR.

Sledovn transientnexprese klonovanch gen, studium jejich regulace

Expresn vektor pro sav buky

(z genu pro globin)

Mutageneze in vitro

Sekvence na vektoru zaji ujc translaci

Vznik sekundrn struktury v 5nepekldn oblasti mRNA zabrauje inn translaci

pravidla Kozakov sekvence v oblasti AUG: CC(A/U)CCAUGG Inician kodony uvnit 5nepekldan oblasti sniuj innost iniciace

translace od sprvnho inicianho kodonu, zvlt pokud po upstreamAUG nensleduje ve tecm rmci stop kodon asto je douc zkrtit 5netranslatovanou oblast mRNA.

Sekvence bohat na AU v 3netranslatovan oblasti mRNA mohou sniovat jej stabilitu

Kodony lze upravit pro dan hostitelsk organismus

K = Kozak-sekvence; S = signln sekvence; T = tag purifikace proteinu; P = msto t pen proteinu odd len tag od zralho proteinu; SC = stop kodon

Kozak SequenceMost eukaryotic mRNAs contain a short recognition sequence that greatly facilitate the initial binding of mRNA to th e smallsubunit of the ribosome. The consensus sequence for initiation of translation in vertebrates (also called Kozak sequence) is:ACCATGGMore general it is:(GCC)RCCATGGwhere R is a purine (A or G).To improve expression levels, it may be advantageous to design the cloned insert according to Kozak's rules.

Sav expresn vektor obecn struktura

Hostitelsk buky: Pro transientn expresi: Cos, BHK (baby hamster kidney), HEK (human

embryonic kidney)

Pro stabiln expresi CHO (chinese hamster ovary)

virov

Hybridn intron (D a A msta z rznch gen)

P, pa, TT = virov n. sav

bakteriln

Selekn marker

heterodimery: human thyroid-stimulating hormone, tetramery: hemoglobin, protiltky

Pprava protein tvoench podjednotkami: 1. klonovn gen pro podjednotky samostatn a pak jejich spojen

in vitro nzk innost2. klonovn gen ve dvou vektorech v jedn buce sestaven

proteinu in vivo vysok innostMon komplikace: Ztrta jednoho z vektor, aktivn protein se nevytvo Rzn poet kopi vektor, jedna z podjednotek je v nadbytku,

vslednho produktu je mlo3. een: Klonovn gen v bicistronickm expresnm vektoru

ada komer n vznamnch protein je tvo ena vce podjednotkami:

Dvouvektorov expresn systm v jedn bu ce

dimern protein

Ztrta jednoho z vektor, aktivn protein se nevytvoRzn poet kopi vektor, jedna z podjednotek

Search related