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Cinética Enzimática e Inhibición
Dr. José Luis Cárdenas LópezEnzimas de Productos Marinos
Semestre 2014-1
¿Qué medimos en una rx enzimática?
E + S ES E+P
enzimática?
[Producto] vs tiempo
O… desaparición de reactante
El steady state (eq. dinámico)E + S ES E+P
Equilibrio dinámico
0][][ =−=
dt
ESd
dt
ESd
En términos de tiempo…
Usando el enfoque de steady state
][][ ESdESd
E+ S ES E+Pk1
k-1
k2
0][][ =−=
dt
ESd
dt
ESd
0=[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)
Requisitos:
1) Cantidades catalíticas de E ( [S]>>[E] )
2) Solo la velocidad inicial (t casi 0), por lo
que P es casi nulo, k-2 es despreciable
3) Steady state (equilibrio dinámico)
0 =[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)
ET= [E]+[ES]
[E]=ET-[ES]
0 =[ET-[ES]][S]k1 -[ES](k-1+k2)
[ET-[ES]][S]k1 =[ES](k-1+k2)
ET [S]k1 -[ES][S]k1 =[ES](k-1+k2)
ET [S]k1 =[ES](k-1+k2)+ [ES][S]k1
E [S]k =[ES](k +k +[S]k )ET [S]k1 =[ES](k-1+k2+[S]k1)
ET [S]k1 =[ES]
(k-1+k2+k1[S])
])[(
][][
121
1
Skkk
kSEES T
++=
−
][][
21 kk
SEES T
++
=− ][)(
1
21 Sk
kk+
+−
][)(
][][
1
21
22
Sk
kk
SEkESk T
++
=−
][)(
][][
1
21
22
Sk
kk
SEkESk T
++
=−
k2 ET= Vmax
k [ES]= vk2[ES]= v
][
]max[
SKm
SVv
+=
1
21
k
kkKm
+= −
][
]max[
SKm
SVv
+=
ecuación Henri -Michaelis- Menten
1][
max
+=
S
Km
Vv
1][
1
max +=
S
KmV
v
Victor Henri , francés de padres rusos(6 Junio 1872 – 21 Junio 1940)
1903
Leonor Michaelis , alemán(Enero 16, 1875 – Octubre 8, 1949)
Maud Leonora Menten , canadiense (Marzo 20, 1879 – Julio 26, 1960)
Biochemische Zeitschrift (1913;49:333–369)
Michaelis-MentenV
eloc
idad
(mm
ol/m
l/seg
)
60
80
100 Velocidad maxima (Vmax)
[Substrato] mmol/ml
0 50 100 150 200 250
Vel
ocid
ad(m
mol
/ml/s
eg)
0
20
40
Km=1/2 Vmax
Transformación de Lineweaver Burk
][
]max[
SKm
SVv
+=
Invirtiendo:Invirtiendo:
max
1
][
1*
max
1
VSV
Km
v+=
Lineweaver-Burk
1/V
eloc
idad
(m
mol
/ml/s
ec)
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
1/Vmax
1/[Substrato] mmol/ml
-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
1/V
eloc
idad
(m
mol
/ml/s
ec)
0.1
0.2
-1/Km
1/Vmax
Gráfica Eddie Hoffste
][
]max[
SKm
SVv
+=
]max[])[( SVvSKm =+ ]max[])[( SVvSKm =+
][max
]max[][
S
vKmVv
KmvSVSv
−=
−=
Vmax1
Vmax2-Km1
2 enzimas?
Vo/[S]o
Vo-Km2
Parámetros importantes
• Vmax= velocidad máxima• Km= Constante de Michaelis Menten
(afinidad con el sustrato)• Vmax/Km=eficiencia fisiológica• Vmax/Km=eficiencia fisiológica• Turnover number (o kcat)= “numero de
recambio” es la cantidad en mol de sustrato (S) que seran convertidos a producto (P) por segundo
• Velocidad = conc de enzima (inicio de la rx)
Molecularidad
• Cúantas moléculas hay en ambos lados de la reacción
• A� P 1 reactante, 1 producto (UNI-UNI)• A+B� P BI-UNI• A+B� P BI-UNI• A+B+C� P+Q TRI-BI • Etc.
Velocidad (Tasa)
• Cantidad (en concentración en un momento dado)
• A+B � 2P
dt
Bd
dt
Adv
][][ −≅−≅
dt
Pdv
][≅
Desaparición de reactivo
aparición de producto
En: concentración/tiempo = M seg -1
Orden de la reacciónMichaelis-Menten
Vel
ocid
ad(m
mol
/ml/s
eg)
60
80
100 Orden “cero”
[Substrato] mmol/ml
0 50 100 150 200 250
Vel
ocid
ad(m
mol
/ml/s
eg)
0
20
40
60
1er orden
Orden mixto
Orden de la reacción
• Relación entre velocidad y concentración• A+B� P
nAv ][∝ nAv ][∝mBv ][∝
mn BAv ][][∝mn BAkv ][][= k= constante de la tasa (rate constant)
Representa la proporcionalidad
Orden de la reacción
• Indican la relación de la velocidad de aparición de producto o desaparición de reactantes y las concentraciones de reactantes a un tiempo determinadoreactantes a un tiempo determinado
• Integrando ecuaciones diferenciales se llega a ecuaciones que nos pueden decir la relación a cualquier tiempo de la reacción
Orden 0
• La aparición de producto o desaparición de reactantes (según se mida la actividad) es independiente de la [reactantes]
dPdAPA
k
→dt
dPk
dt
dA ==−
Gráficamente
[pro
du
cto
] (M
)
Tiempo (seg)
Pendiente = k = 0.22 M seg-1
1 er Orden
• La aparición de producto o desaparición de reactantes (según se mida la actividad) depende de la [reactantes]
PAk
→dt
dPkA
dt
dA ==−
Integrando: ktPA
A =− )()(
)(log3.2
0
0
Donde Ao es la concentración inicial de reactante y P es la concentración de producto a tiempo t
Para calcular kTiempo (seg) So-P = S (mM) P (mM) So/S ln So/S
0 9.00 0 -
300 8.55 0.45 1.052 0.0506600 8.12 0.88 1.108 0.1025900 7.71 1.29 1.167 0.1544900 7.71 1.29 1.167 0.1544
1200 7.32 1.68 1.229 0.20621500 6.95 2.05 1.294 0.25771800 6.60 2.40 1.363 0.3096
Gráficamente
Ln (
So/
S) 0.10
0.12
0.14
0.16
Tiempo (seg)
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
Ln (
So/
S)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
Pendiente = k= 1.7 x 10-4 seg-1
OJO: Unidades
Reacciones multisustrato
• Nomenclatura Cleland (U Wisconsin)
E + S ES E+P
E
S P
EES EP
2 sustratos 2 productosE+A+B E+P+Q
VARIAS POSIBILIDADES
1)primera
E
A P
EEAB EPQ
Q
EA EQ
B
Dos entran, dos salen, 2 sustratos, 2 productos (Bi-Bi)A entra primero, P sale primero “BI-BI ORDENADO”
E
A
EEAB EPQ
EA
B
EB
P
EQ
Q
EP
2)
B A Q P
El orden de entrar salir es aleatorioBI-BI ALEATORIO
E
A P
EFP F FB
Q
EA EQ
B
3) Tercera posibilidad
E EFP F FBEA EQ
La Enzima se convierte (F) durante la rxLos sustratos no se unen al mismo tiempo, un producto sale antes de que el segundo entreBI-BI PING-PONG
¿Cómo distinguirlas?
• Union secuencial – Ordenada– Aleatoria– Ping-Pong– Ping-Pong
• Graficar 1/v vs 1/A a varios niveles de B
Secuenciales
1/vB
1/[A]
1/v B
Ping-Pong
1/[A]
Inhibición
• Irreversible• Reversible
– Competitiva– No competitiva– No competitiva– Acompetitiva– Parcial
• Competitiva• No competitiva
– Mezclada• 3 Tipos (β=0, β=0 y α=β)
Inhibición Competitiva
Et = E+ES+EI
)][
1(´
Ki
I
Km
Km +=
max
1
][
1*)
][1(
max
1
VSKi
I
V
Km
v++=
Inhibición no competitiva
Et = E+ES+EI+EIS
)][
1(_
_
Ki
I
opendiente
inhpendiente +=
Grafica Dixon
)][
1(max
1
][
1*)
][1(
max
1
Ki
I
VSKi
I
V
Km
v+++=
Grafica Dixon
Inhibición acompetitiva
E + S ES E+P
+ I
Et = E+ES+ESI
ESI
1/Vo
control
[I]1
[I]2
>[I]1/Vmax (1+[I]/Ki)
1/[S]
1/Vmax
-1/Km
)][
1(max
1
][
1*
max
1
Ki
I
VSV
Km
v++=
Inhibición parcial
• Competitiva
E + S ES E+P
+ I+ I
Ks][
]][[
ES
SEKs =
]][[ IEKi =
Et=E+EI+ES+ESI
ESI
+ I+ I
EI +S EI+PαKs
Ki αKi
][
]][[
ESI
SEIKs =α
][
]][[
ESI
IESKi =α
][
]][[
EI
IEKi =
Parcial competitiva
• El sustrato y el inhibidor se unen en diferentes sitios activos, ES, EI y ESI
• El sustrato se une mejor a la enzima sola que a la EIque a la EI
• Tanto ES como ESI van a producto…
Gráfica diagnóstica
1/vI
[I]=∞ pendiente α Ks/Vmax
[I]=Ki
1/[S]
[I]=0 pendiente Ks/Vmax
[I]=Ki
-1/Ks
-1/αKs
Ki
I
Ks
SKsKi
IS
Ks
S
V
v
][][1
]][[][
max ++
+= α
][
][
max I
S
V
v =
][
)][
1(
)][
1(max
S
Ki
IKi
I
Ks
V
++
+=
α][
][
max SKs
S
V
v
aparente +=
Inhibición parcial
• No Competitiva
E + S ES E+P
+ I+ I
Ks
Et=E+EI+ES+ESI
kp
ESI
+ I+ I
EI +S EI+PKs
Ki Ki
βkp
Parcial no competitiva
• El sustrato y el inhibidor se unen en diferentes sitios activos, ES, EI y ESI
• El ESI va a producto pero no tan efectivamente como ESefectivamente como ES
Gráfica diagnóstica
1/vI
[I]=∞ pendiente Ks/βVmax
[I]=Ki
1/[S]
[I]=0 pendiente Ks/Vmax
[I]=Ki
-1/Ks
)][
1(
)][
1(
][
)][
1(
)][
1(
][
max
Ki
IKi
I
S
Ki
IKi
I
Ks
S
V
v
ββ +
++
+
+=
KiKi
][
][
max SKs
S
V
v
+=
El resto
• No es tan complicado…como parece…• Consultar capítulo 4 del libro
– Enzyme Kinetics. Segel, I (1975) Wiley Int.
• Si alguien gusta consultarla, yo tengo una • Si alguien gusta consultarla, yo tengo una copia del libro, o buscarla en la biblioteca
Inhibición irreversible
Inhibición irreversible
• No específicos– Modificación química, son importantes para detectar
los grupos que están presentes en el sitio activo:– Lys DNFB (dinitrofluorobenceno), Cys iodoacetato,
bromo, MMTS (sulfonato de metilmetanotiol)• Etiquetadores de “afinidad” o reactivos dirigidos • Etiquetadores de “afinidad” o reactivos dirigidos
al sitio activo– Reactivos que tienen afinidad por el sitio activo– TPCK, glicidolfosfato, FSBA (benzoil-adenosina de
fluorosulfonilo)
• Etiquetadores de fotoafinidad (activados con UV)– 8 azida ATP, 5 azida UTP
• Reactivos suicidas (se activan con la catálisis)• Reactivos suicidas (se activan con la catálisis)– Anhidrido isatoico, ciclopropil benzilamina– También se les llama “basados en el mecanismo”
Algunos ejemplos de modificaciones químicas
Clase/grupo Rx reactivo Propósito
nucleófilonucleófilo
Lys –NH2 Sustitución nucleofílica
O-metilsoureaDinitrofluorobenceno(DTNB)
Bloquear -NH2
(DTNB)
Cys-SH alquilación IodoacetatoIodoacetamidabromo
No específicas para Cys, sino para nuc:
His imidazol acilación dietilpirocarbonato Lys, Tyr
Arg guanidino Adición a carbonilos 2,3 butano diona
electrófiloelectrófilo
Asp, Glu Formación de amida Amina + carbodiimida
aromáticos Yodinación I2, I3-, ICl His, SH,
Algunos ejemplos de etiquetas de afinidad
Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada
Tosilfenilalaninaclorocetona(TPCK)
Serinaproteasas
Serina del sitio activo
Glicidol fosfato Triosafosfatoisomerasa,
Etiqueta nucleófilos o bases generales en el sitio activoisomerasa,
enolasagenerales en el sitio activo
Fluorosulfonilboenzoiladenosina(FSBA)
deshidrogenasas
NAD(P)H del sitio activo
Algunos ejemplos de etiquetas de foto-afinidad
Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada
8 azido ATP recA proteina tirosina
8 azido cAMP Ribonucleasa A pancreática bovina
treonina
bovina
5 azido UTP UTP glucosa pirofosforilasa
Algunos ejemplos de reactivos suicidas
Reactivo suicida Enzima Cadena lateral modificada
Anhidrido isatoico quimiotripsina Serina del sitio activo
Ciclopropil benzilamina Monoamina oxidasa flavina
Adenosina 2,3, riboepóxido5 trifosfato
β galactosidasa metionina
Cooperatividad y alosterismo
Alostería
Bajo [S] Alto [S]Cambio de conformación
Se presenta en enzimas multisubunidades los sitios activos se comunicanLas enzimas cambian de forma, cambian su reactividad
Alo (otro) Steria (forma)
Kd1Kd2
Kd1 > Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen mejorpor lo que sera cooperatividad positiva
Kd1 < Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen peorpor lo que será cooperatividad negativa
¿Como medirla?
max1.0_][
max9.0_][
VVaqueproduzcS
VVaqueproduzcSRs
===
Rs = Factor de cooperatividad
max1.0_][ VVaqueproduzcS =
Cooperatividad positiva Rs < 81Cooperatividad negativa Rs > 81Comportamiento MMenten Rs 81
Demostrar esto
Ejercicio:
Michaelis Menten
][
][9.0
max
max9.0
SKm
S
V
v
Vv
=++
==
=
][1.0][1.0
][
][1.0
max
max1.0
SKmS
SKm
S
V
v
Vv
=++
==
=
][9
][1.09.0
][9.0][9.0
SKm
SKm
SKmS
==
=+
][9
1
][9.01.0
][1.0][1.0
SKm
SKm
SKmS
=
==+
81
9
1
9 ==Km
KmRs
Otra forma de determinar el Ki
• El Ki es sumamente importante• Es análogo al Km, concentración de
inhibidor tal que da la mitad de la inhibición (mitad de la velocidad máxima)inhibición (mitad de la velocidad máxima)
• Si es una droga nueva ¿qué se buscará con respecto al Ki?
• Ki>Km…?• Dixon buscó maneras gráficas de
determinarla
Inhibición competitivaVariar la [I], manteniendo fijas las [S] (en varios niveles)
Inhibición no competitiva
IC50
• El IC50 es una medida muy usada en diseño de drogas
• Corresponde a capacidad inhibitoria al 50% (mide potencia del inhibidor)50% (mide potencia del inhibidor)
• que tanta cantidad del inhibidor es necesaria para reducir a la mitad el proceso (Rx enzimática, aunque es más amplia su aplicación)
• Tiene relación con el Ki
Para los diferentes casos de inhibición
competitiva
No competitiva
acompetitiva
pIC50
• A veces se usa un valor p análogo al pH o al pKa, es:
• pIC50 = -log10 (IC50)• Se usa para expresar la potencia de la • Se usa para expresar la potencia de la
droga en valores exponenciales y generalmente es en M (molar)
Inhibición por sustrato
• A [S] altas se inhibe la rx enzimática• La gráfica de HMM, no da una hipérbola
sino una campana• La gráfica de LB por lo tanto no da una • La gráfica de LB por lo tanto no da una
recta
v
[S]
1/v
1/[S]
Explicaciones posibles
1. La Enzima puede tener 2 sitios de unión para el mismo S– El sitio catalítico y el sitio de inhibición
2. Hay dos configuraciones reversibles 2. Hay dos configuraciones reversibles entre sí– Activa (Ea) e Inactiva (Ei)
Mecanismo
Ea Ei+ +
< S > S
EaS EiS XEa + P
ejemplo
Glucosa 6 fosfato +ADP Glucosa +ATPhexoquinasa
Si la G6P está en alta concentración, se inhibe la rx