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CITOGENETICACONVENZIONALE
EMOLECOLARE
CITOGENETICA CONVENZIONALE
La citogenetica convenzionale è una tecnica che permette lo studio del numero e dellastruttura dei cromosomi (studio del cariotipo)
I cromosomi vengono esaminati “bloccati” inmetafase.
Step: •prelievo del campione (SP, BM o tessuto linf.)•allestimento delle colture cellulari•allestimento dei preparati•bandeggio dei cromosomi
Allestimento delle colture e dei preparati
Tecniche di coltura
•Diretta: terreno di coltura+colchicina 4-6 ore•Medio termine: terreno + colchicina 24-48 ore•Sincronizzata: blocco in fase S (MTX) rimozione del blocco colchicina
Allestimentopreparati
•post-incubazione: centrifugazione•soluzione ipotonica per distensione dei cromosomi•centrifugazione → fissativo (alcol metilico o
acido acetico)
Tecniche di bandeggio dei cromosomi
Tecniche generali(intero cromosoma)
Bandeggio QBandeggio GBandeggio R
BANDEGGIOSTATICO
Tecniche speciali(porzioni cromosoma)
Bandeggio CBandeggio Cd (fuso)
Bandeggio NOR geni RNA ribosomi
BANDEGGIODINAMICO
Informazioni sul tipo di replica di ogni cromosoma durante la fase S(uso raro in onco-ematologia)
Bandeggio Q
•mostarda di chinacrina (intercala tra copppie dibasi)
•contrasto tra bande: scarso
• non colora telomeri
•colora eterocromatina
Bandeggio R
•soluzione salina + Giemsa
•complementari a bande Q e G(soluzione salina)
•contrasto < a bandeggio G
•colora telomeri eucromatina
•colora poco eterocromatina
Cromosomi normali
Cromosomametacentrico
Cromosomasubmetacentrico
Cromosomaacrocentrico
Cariotipo normale
46 cromosomi(n. diploide)
22 coppie (omologhi)autosomi (1-22)
2 cromosomi sessualiXY (M) e XX (F)
Anomalie cromosomiche
Anomalie del numero
•quasi aploidi (n +/-)•ipodiploidi (2n-)•iperdiploidi (2n+)•pseudodiploidi•monosomie •trisomie
Anomalie strutturali
•traslocazioni (reciproche e non)•delezioni (intersiziali o terminali)•duplicazioni•inversioni
Traslocazioni
T (2;15) (p11.2;q11.2)
bilanciata sbilanciata
T (13;14) (p11.2;p11.2)
Delezioni cromosomiche
Del (7)(q11.23 q21.2)
delezione interstiziale
braccio lungo (q)cromosoma 7
CITOGENETICA MOLECOLARE (FISH)
La Fluorescent In Situ Hybridization(FISH) è una tecnologia che utilizzasonde nucleotidiche marcate (DNAprobes) per identificare specifiche regioni di un cromosoma ovverodeterminate sequenze del DNA.
Step:•denaturazione del DNA•incubazione sonda + DNA denaturato (“annealing”)•rilevazione del segnale della sonda con microscopio a fluorescenza
Tipi di sonde (DNA probe)
Sonde
Nucleotidi + biotina o digossigenina(fluorocromo + streptavidina)(fluorocromo + Ac anti-digossigenina)
nucleotidi coniugati a fluorocromi
Sonde
•Alfoidi: per sequenze ripetitive dei satelliti (anomalie numeriche)•Painting: specifiche per un cromosoma (cromosomi molto riarrangiati)•Locus singolo: sequenze specifiche DNA (es. geni di fusione)
FISH: tappe della metodica
Campioni DNA:
cromosomi inmetafase
onuclei in interfase
FISH in interfase
FISH inmetafase
probe per parteterminale del cr.
4q
FISH: vantaggi e limiti
Vantaggi
•Esamina elevato n. di cellule in tempi brevi•Metodica semplice•Elevata efficienza di ibridizzazione•Elevata sensibilità e specificità•Non necessità cellule in mitosi•Correla dato citogenetico con morfologico
Limiti
•Informazioni su singolo cromosoma/gene•Esame simultaneo di pochi DNA bersaglio•Soglia di positività da calcolare per ogni sonda•Possibili artefatti nell’analisi di inclusi in paraffina
Citogenetica nelle leucemie acute
Classificazione delle leucemie acute (entità cliniche all’interno di un citotipo FAB)
Definizione del rischio citogenetico (significato prognostico)
Monitoraggio della malattia minima residua: sensibilità citogenetica convenzionale < sensibilità FISH
TECNICHE DI
BIOLOGIA MOLECOLARE
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Tecnica che si basa sulla capacità di una DNA polimerasidi amplificare in modo esponenziale una regione di DNA asequenza sconosciuta (templato) posta tra due porzioni di DNA a sequenza nota.
Step:•Estrazione di DNA (o RNA)•Cicli di amplificazione: denaturazione “annealing” estensione dei primers•Analisi degli amplificati
PCR: estrazione di DNA (o RNA)
DNA
RNA
Proteinasi + fenolo-cloroformio-alcool isoamilicotime: 2 giorni
Guanidio isotiocianato + mercaptoetanolocloroformio ( a 4 °C)time: 2 giorni
DNA/RNA KIT commerciali/ strumenti per automazione
ConcentrazioneQualità spettrofotometria
260 nm (DNA)
280 nm (proteine)
A 260
A 280
PCR: cicli di amplificazione
Miscela di amplificazione
•DNA templato•DNA polimerasi termostabile•Buffer di reazione (TrisHCl e KCl)•Ione magnesio•Desossinucleotidi trifosfato•Primers: brevi sequenze di DNA a singolo complementari a sequenze note poste a monte e a valle del templato
PCR: cicli di amplificazione
Denaturazione(~ 1 min 95°C)
Raffreddamento e“annealing” dei primers(~ 1 min 45-60°C)
Estensione dei primersda DNA polimerasi(~ 1 min 72°C)
PCR: cicli di amplificazione
Cicli ripetuti 25-45 volte
Amplificazione: crescita esponenziale ed efficienza di reazione
Xn = X0 x (1 + Ex)n
Efficienza della reazione
Qualità e concentrazione del DNA/RNA Qualità e concentrazione del cDNAConcentrazione dei vari reagentiCondizioni di temperatura della reazioneNumero di cicli plateau
PCR qualitativa: analisi dei risultati
Elettroforesi in gel di agarosio
Corsa: 1/2 ora a 150 V
Colorazione con etidio bromuro
UV transilluminazione
Fotografia
Fig. 4
Roccaro et al.
GAPDH
Ang2
ddH
2O
0 n
M
5 n
M
7.5
nM
0
50
100
150
neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]
Inte
rio
r ar
ea (
pix
el)
Ang1
GAPDH
ddH
2O
0 n
M
5 n
M
7.5
nM
0
20
80100
neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]
Inte
rio
r ar
ea (
pix
el)
60
40
IGF-1
GAPDH
ddH
2O
0 n
M
5 n
M
7.5
nM
0
60
120
180
neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]
Inte
rio
r ar
ea (
pix
el)
IL-6
GAPDH
ddH
2O
0 n
M
5 n
M
7.5
nM
GAPDH
ddH
2O
0 n
M
5 n
M
7.5
nM
VEGF
0
50
100
150
neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]
Inte
rio
r ar
ea (
pix
el)
0
30
120
150
neg ctrl 0 5 7.5Bortezomib [nM]
Inte
rio
r ar
ea (
pix
el)
90
60
PCR qualitativa: vantaggi e limiti
Vantaggi
•Elevata sensibilità•Elevata specificità•Identificazione di traslocazioni non dimostrate dalla citogenetica•Possibilità di analisi simultanea delle traslocazioni più frequenti•Possibilità dell’esecuzione dell’analisi da campioni bioptici
Limiti
•Possibilità di contaminazioni•Efficienza di amplificazione variabile e dipendente da vari fattori•Impossibilità di stabilire la q di sequenza bersaglio•Presente all’inizio nel campione
PCR quantitativa real-time
Thermal-cycler (amplificazione)
Sistema ottico per rilievo dellafluorescenza
Software per raccolta ed analisidei dati
Analisi dei prodotti non alla finedella reazione, ma durante la fase di crescita lineare dellemolecole di amplificato
Real-time PCR: metodo Taqman
Sonda specifica per targetQ = fluorocromo quencher (rosso, onda lunga)
R = fluorocromo reporter (verde, onda corta)
Sonda Taqman si lega aDNA target
I primer si legano a 3’ e 5’del DNA templato
Real-time PCR: metodo Taqman
Real-time PCR: metodo Taqman
Real-time PCR: metodo Taqman
PCR quantitativa: vantaggi e limiti
Vantaggi
Limiti
VelocitàSensibilità (10-4 – 10-6)Specificità Standards commutabilità confrontabilità accuratezza
Variabilità nella determinazione quantitativaComplessità sperimentaleMancanza di standardsValutazione critica dei risultati
TECNOLOGIA DEI
MICROARRAY E
LEUCEMIE ACUTE
DNA-microarray
Metodica che consente di analizzare il profilo di espressione genica delle cellule.
Procedura di base: •Sequenze di DNA sono schierate in ordine su supporto solido.•Dal campione viene estratto mRNA e retrotrascritto in cDNA. •cDNA, marcato con tracciante fluorescente, ibridizza con sequenze su array.•Il livello di espressione di un gene è direttamente proporzionale all’intensità di segnale derivato dalle immagini digitali acquisite.
Principali tipi di microarray: 1. membrane based cDNA microarray 2. glass slide-based cDNA microarrays 3. oligonucleotide microarray o DNA chip
DNA-microarray e leucemie acute: possibili sviluppi
Riclassificare le leucemie
Individuare profili di espressione genica in relazione alla prognosi
Individuare profili di espressione genica in relazione a vie di trasduzione del segnale per definire terapie molecolari target
Individuare profili di espressione genica in relazione alla sensibilità o resistenza ad un dato farmaco