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O que é a Citometria de Fluxo?
Cito-metria: Medição de propriedades físico-químicas das células.
Citometria de Fluxo: Caracterização dessas propriedades num fluxo.
Fluídica Células em suspensão fluem em fila indiana
Óptica através de um volume iluminado onde refletem a luz e emitem fluorescência, que é filtrada, processada e
Electrónica digitalizada para ser analisada num computador
Citómetros de Fluxo
Lasers
Detetores
LSR Fortessa/FACSAria
LSR Fortessa MoFlo
MoFlo
UV/514 nm
561 nm
488 nm
633nm 561 nm
442 nm
488 nm
Porquê a Citometria de Fluxo?
• Poder estatístico • Medição de milhares de células/partículas por segundo • Medição simultânea de múltiplos parâmetros.
• Deteção e separação de eventos raros.
• Separação Celular • Pureza, Rendimento e velocidade.
0.02%
Marcadores Fluorescentes
Célula expressa proteína A
Anticorpo anti-A conjugado com
fluorocromo VERMELHO
Célula expressa proteína B
Anticorpo anti-B conjugado com
fluorocromo Verde
Análise: Histograma
100 101 102 103 104
FL1 Log
0
2393
4787
7180
9574
Counts
Fluorescência total da célula - VERMELHO
Nú
mer
o d
e c
élu
las
100 101 102 103 104
FL1 Log
0
2393
4787
7180
9574
Counts
Análise: Histograma Bidimensional
Fluorescência - VERMELHO
Fluo
rescência - V
ERD
E Flu
ore
scên
cia
- V
ERD
E Fluorescência - VERMELHO
Imunofenotipagem
CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD4+ CD25-
CD3+ CD4+ CD25+
CD3+
CD4+ CD25- CD25+
anti
-CD
3 -
Ver
de
anti
-CD
4 -
Lar
anja
anti
-CD
4 -
Lar
anja
anti-B220 - Azul anti-B220 - Amarelo anti-CD25 - Vermelho
Separação Celular
Câmara de fluxo
Ponto de quebra
cuvete
Carga
Placas eléctricas de alta voltagem
6000V
Lixo
Tubo de coleção
Gota contendo partícula de interesse é carregada Gotas são geradas
Vibração quebra fluxo formando gotas (30-70,000 gotas/sec)
Gota carregada é defletida
Separação física de uma célula (ou partícula) de interesse presente numa suspensão heterogénea de células (ou partículas).
Separador celular separa gotas, não células!
Imunofenotipagem
CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD4+ CD25-
CD3+ CD4+ CD25+
CD3+
CD4+ CD25- CD25+
Transcritómica(RNA) Genómica (DNA) Metabolómica (metabolitos)
Microscopia de Fluorescência FISH – Hibridização in situ Estudos funcionais
Etc.
anti
-CD
3 -
Ver
de
anti
-CD
4 -
Lar
anja
anti
-CD
4 -
Lar
anja
anti-B220 - Azul anti-B220 - Amarelo anti-CD25 - Vermelho
Depois de separar:
Proteínas Fluorescentes
Promotor Proteína A
A proteína GFP (Green Fluorescent Protein) foi inicialmente descoberta por Shimomura et al., na medusa Aequorea victoria em1962, mas apenas clonada 30 anos mais tarde.
Proteínas fluorescentes derivadas de GFP e mRFP
Wang et. al (2004) PNAS
GFP
Int J Med Sci 2007; 4(5):267-277. doi:10.7150/ijms.4.267
Proteínas Fluorescentes
http://www.glofish.com/
http://www.nichd.nih.gov/news/releases/green_brown_mice.cfm
http://www.biostatus.com
http://www4.utsouthwestern.edu/olsonlab/
http://john.maloney.org
Sondas Fluorescentes
Cálcio Membrana pH Cell Tracker DNA Mitocôndria
Fura 2 FM 1-43 SNAFLE CMRA DAPI Nonyl Acridine O
Indo 1 FM 4-64 SNARF CMTPX HOECHST MitoSox
Bapta/dye DiO BCECF BMQC TOPRO3 Mitotracker
Calcium Green ANNINE 6 pHRodo DMFDA PI Rhodamine 123
Fluo 4 Di4ANNEPS hq lysosensor CMTMR DRAQ5 MitoProbe
Sondas que medem funções celulares específicas ou que quantificam propriedades funcionais das células
Ciclo celular
G2
M
G1
S
G0
G0/G1
Fase S
G2/M
G1
1
Fase S
M
G1
G2
2
1 Conteúdo de DNA
Agentes intercalantes
DNA Iodeto Propídio (PI)
DRAQ5 Hoechst DAPI
Fluorescência
Nú
mer
o c
élu
las
Proliferação celular
Marcação com CFSE
Célula
Diluição de CFSE
Divisões celulares
www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry
CFSE - Verde
An
ti-B
22
0 -
Azu
l
CFSE - Verde
Nú
mer
o d
e cé
lula
s