Cl Asistensi

8/10/2019 Cl Asistensi

1/9

(10)

(10)

JAWABAN TM ELEKTROFORESIS SDS-PAGE

A. Pre-lab ........................................................................................................................... (100)

1.Apa yang dimaksud elektroforesis ?

Elektroforesis merupakan teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan perbedaantingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Teknik pemisahan makromolekul

(Protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan bentuk, ukuran dan muatan denganmenggunakan matriks penyangga poliakrilamid dan agarosa yang dialiri arus listrik

sehingga makromolekul akan bergerak dari kutub negatif ke positif.

2.Ada berapa jenis elektroforesis ? Jelaskan masing-masing!

1)Elektroforesis Kertas yaitu terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel

bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak. Teknik pemisahan ini terjadi akibat

adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahannya.2)Elektroforesis gel agarosa merupakan teknik memurnikan DNA dari komponen-

komponen lainnya dengan menggunakan matriks penyangga gel agarosa.

3)

Mouving Boundari Elektroforesis4)Zone Electroforesis

5)SDS Disk Elektroforesi

6)SDS- PAGE merupakan teknik pemisahan makromolekul yaitu Protein dengan

menggunakan matriks penyangga poliakrilamid.

3.Apa fungsi SDS pada metode SDS-PAGE ?

SDS (Sodium Dodesil Sulfat) merupakan detergen ionik yang berfungsi memberikanmuatan negative pada protein yang akan dianalisa.

4.Apa fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE?

Akrilamid berfungsimencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik

yang digunakan pada elektroforesis SDS-PAGE. Fungsi lainnya gel poliakrilamid

merupakan matriks penyangga yang berperan sebagai penyaring yang memisahkanmolekul berdasarkan ukuran, bentuk molekul, kekuatan medan listrik .

5.Apa tujuan analisis protein dengan metode elektroforesis?

Tujuannya yaitu untuk memisahkan atau memurnikan protein berdasarkan ukuran,

muatan dan bentuk molekulnya, dimana protein yang memiliki muatan positif dan

muatan negatif dari asam amino penyusunnya akan bergerak ke elektroda melewati gelpoliakrilamid.

6.Mengapa protein-protein tersebut dapat terpisah?Karena protein-protein tersebut memiliki muatan positif dan muatan negatif dari asam

amino penyusunnya yang jika dialiri arus listrik akan bergerak ke elektroda melewati

gel poliakrilamid sehingga protein akan terpisah berdasarkan ukuran, bentuk dan

muatan.7.Bagaimana cara mengatur ukuran pori gel ?Caranya dengan mengatur konsentrasi atau volume akrilamid yang ditambahkan.

Semakin rendah konsentrasi akrilamid yang ditambahkan maka ukuran pori-pori gel

akan semakin besar sehingga menyebabkan gel semakin lunak dan mudah patah.

8. Apa yang dimaksud denganstacking gel? Mengapastacking geldiperlukan?

stacking gel adalah gel yang mengandung ion klorida yang bermigrasi bermigrasi lebihcepat melalui gel dari sampel protein yang berguna dalam elektroforessis SDS-PAGE

(10)

(15)

(10)

(10)

(10)

(15)


2/9

Stacking gel diperlukan untuk mencetak sumuran dan sebagai gel pemisah dalam

penempatan sampel

9.Apa fungsi pewarnaan gel pada metode elektroforesis ?

Fungsi pewarnaan pada metode ini yaitu untuk mempermudah dalam mengamatipergerakan molekul protein ketika berlangsungnya proses pemisahan molekul protein

berdasarkan berat molekulnya.

(10)


3/9

C. Hasil dan Pembahasan ................................................................................................ (50)

Gambar Gel SDS-PAGE

Tempelkan Photo

1. Ada berapa pita yang terbentuk ? Jelaskan !

2. Apakah kepekatan warna pita berkaitan dengan konsentrasi protein ?Iya Berpengaruh, Karena kepekatan warna pita sebanding dengan konsentrasi protein.Semakin tinggi konsentrasi protein maka kemampuan dalam menyerap warna brillian bluemenjadi semakin besar sehingga warna pita menjadi semakin tajam.

3.Bagaimana cara mengidentifikasi jenis protein yang membentuk pita pada gel elektroforesis ?Jenis protein yang membentuk pita pada gel elektroforesis dapat diidentifikasi berdasarkanberat molekulnya dimana setiap marker memiliki berat molekul tertentu lalu dibandingkankisaran berat molekul dengan yang melewati berat molekul ptotein marker kemudiandiukur pita yang terbentuk dan dihitung nilai RF dan BM dengan menggunakan persamaan

protein marker.

4. Apakah fungsi penambahan merkaptoetanol pada persiapan sampel ?Markaptoetanol berfungsi mendenaturasi protein dengan memecah ikatan disulfida sehinggastruktur protein yang awalnya sekunder, tersier dan quartener menjadi struktur primerakibatnya sub unit protein lebih mudah dianalisa.

5. Apakah fungsi pemanasan sampel protein ?Berfungsi untuk mendenaturasi protein sehingga protein yang struktrunya sekunder, tersierdan kuartener dapat menjadi struktur primer (tunggal) sehingga lebih mudah diberi muatannegatif dan pergerakannya lebih cepat saat elektroforesis berlangsung.

6.

Mengapa pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein ?Karena pH dapat mempengaruhi titik isoelektrik protein sehingga protein dapat mengendap,akibatnya dapat mempengaruhi tingkat dan arah pergerakan protein dalam separating gel.

7. Reagen apa yang berfungsi untuk mempolimerisasi gel ?TEMED dan APS 10%. TEMED berfungsi sebagai katalisator untuk mempercepat polimerisasiakrilamid menjadi gel poliakrilamid sedangkan APS 10% berfungsi sebagai inisiator yangmengaktifkan akrilamid agar bereaksi dengan molekul akrilamid lainnya sehinggamembentuk rantai polimer yang panjang.

(5)

(4)

(2)

(8)

(5)

(5)

(5)

(8)


4/9

8. Faktor-faktor apa yang mempengaruhi pergerakan protein dalam gel elektroforesis ?1) Ukuran dan bentuk molekul

Semakin besar ukuran molekul, semakin lambat pergerakannya dibandingkan jika ukuranmolekul yang kecil. Bentuk molekul tersier/sekunder akan lebih lambat dari primer

2) Konsentrasi gelPergerakan protein pada gel dengan konsentrasi yang lebih kecil, akan lebih cepat dari geldengan konsentrasi tinggih.

3) pHmempengaruhi titik isoelektrik protein, sehingga mempengaruhi tingkat dan arahpergerakan protein.

4)VoltaseSemakin tinggi voltase, maka pergerakan protein semakin cepat, namun hasilnya akanburuk. Sedangkan voltase sedang, maka pergerakan protein akan lambat, namun hasilnyabagus.

5)SuhuSuhu mempengaruhi denaturasi protein, dimana protein dg struktur primer akan lebihcepat pergerakannya.

Penilaian

Komponen Nilai

Pre-test

Aktivitas

Hasil dan Pembahasan

(8)


5/9

C. Pembahasan Elektroforesis SDS PAGE (32)

1 Analisis Prosedur Pembuatan geladalah sebagai berikut : ...................................... (5,5)

1) Diagram alir dibuat kalimat

2) Disebutkan Alat dan Bahan

Alat Bahan

Mikropipet Tip

Seperangkat alat elektroforesis

Gelas beaker 100 ml

30% akrilamidLGB 1300l

APS 10%

TEMED

Aquades

3) Disebutkan Fungsi Perlakuan

30% akrilamid = untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus

listrik yang digunakan

LGB 1300l = didalamnya terdapat SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) yang memberikan

muatan negative pada protein yang akan dianalisis Pengadukan bahan = Agar homogen

APS 10% = Sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamid agar bereaksi dengan

molekul akrilamid lainnya sehingga membentuk rantai polimer yang panjang.

TEMED = sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel poliakrilamid

sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein.

Penambahan APS dan TEMED harus Bersamaan = agar gel tidak mudah terbentuk

dengan cepat

Ditambahkan aquades pada gel yang sudah dituang dicetakan = untuk meratakan atau

meluruskan permukaan gel

Dibiarkan selama 15-30 menit = agar gel mengeras2 Analisis Prosedur Persiapan Sampel ...........................................................................(5,5)



Alat Bahan

Timbangan Analitik Sampel Enzim pepsin masing 0,005 ;

0,0075 ; 0,01 ; 0,0125 dan 0,015 gram

mikrotube sample buffer

Kompor listrik (pemanas)

Gelas beaker

Termometer

3)

Fungsi perlakuan

Sampel Buffer = Mengandung beta markaptoetanol yang berfungsi untuk mereduksi

ikatan disulfide pada protein.

Pemanasan = untuk mendenaturasi protein sehingga protein yang muatannya

sekunder,tersier maupun quartener dapat menjadi muatan tunggal (primer) sehingga

mudah dianalisis


6/9

3 Analisis Prosedur Pembuatan stacking geladalah sebagai berikut : ........................... (5,5)



Alat Bahan

MikropipetTip


Gelas beaker 100 ml

30% akrilamidLGB 1300l

APS 10%

TEMED

Aquades

3) Fungsi Perlakuan

30% Akrilamid = untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus

listrik yang digunakan

UGB = didalamnya terdapat SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) yang memberikan muatan

negative pada protein yang akan dianalisis

Pengadukan bahan = Agar homogeny APS 10% = Sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamid agar bereaksi dengan

molekul akrilamid lainnya sehingga membentuk rantai polimer yang panjang.

TEMED = sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel poliakrilamid

sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein.

Penambahan APS dan TEMED harus Bersamaan = agar gel tidak mudah terbentuk

dengan cepat

Meletakkan sisir pada stacking gel = untuk membuat sumuran

Dibiarkan selama 15-30 menit = agar gel mengeras

4 Analisis Prosedur Pemisahan Proteindengan elektroforesis ....................................... (5,5)

1)

Diagram Alir dibuat kalimat2) Disebutkan Alat dan Bahan

Alat Bahan


Mikropipet

Tube

Marker

Sampel Enzim pepsin masing 0,005 ;

0,0075 ; 0,01 ; 0,0125 dan 0,015 gram

3) Fungsi Perlakuan

Running Buffer = didalamnya terdapat SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) yang

memberikan muatan negative pada protein yang akan dianalisis

- Dijalanakan pada Voltase 200V = Untuk pemisahan protein, semakin tinggi voltase,

maka pergerakan protein semakin cepat, namun hasilnya akan buruk. Sedangkan

voltase sedang, maka pergerakan protein akan lambat, namun hasilnya bagus.

5. Analisis Prosedur Pewarnaan ........................................................................................(5,5)

1) Diagram Alir dibuat kalimat



7/9

Alat Bahan

- Shieve Shaker

- Wadah plastic

- Bromophenol Blue

- penghilang warna

- aquades

- Potongan kertas saring

3)

Fungsi Perlakuan Bromophenol blue = untuk memberikan pewarnaan pada gel

Pengunaan shieve shaker = untuk mengoptimalkan pewarnaan

Penghilang warna = untuk melunturkan pewarna bromophenol blue

Pengunaan shieve shaker = untuk mengoptimalkan pelunturan warna

Dibilas dengan aquades = untuk melarutkan sisa pewarna

Potongan kertas saring = menyerap sisa-sisa zat pewarna

6. DHP elektroforesis..(1,5)

7 Kurva Standart Elektroforesis ............................................................................................(1)

8 Bandingkan dengan Literatur .............................................................................................(2)

Nb : Literatur tetang Berat molekul enzim pepsin = 35 KDE.KESIMPULAN ........................................................................................................... (3)

Prinsip : Memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks

penyangga akrilamid. Protein terseparasi dalam medan listrik dan melanjutkan denganpewarnaan, penghilangan warna, dan pembilasan gel. Pembacaan berat molekul dilakukan

dengan melihat pita yang terbentuk oleh marker.

Rumus Retension Factor (RF)

RF =

Kurva standar :

X=RF y = Ax + B

BMy = log BMBM = anti log y

Faktor-faktor pengaruh :

- Ukuran dan bentuk molekulSemakin besar ukuran molekul, semakin lambat pergerakannya dibandingkan jika ukuran

molekul yang kecil. Bentuk molekul tersier/sekunder akan lebih lambat dari primer

- Konsentrasi gelPergerakan protein pada gel dengan konsentrasi yang lebih kecil, akan lebih cepat dari gel

dengan konsentrasi tinggi

- pHmempengaruhi titik isoelektrik protein, sehingga mempengaruhi tingkat dan arah pergerakan

protein.- VoltaseSemakin tinggi voltase, maka pergerakan protein semakin cepat, namun hasilnya akan buruk.

Sedangkan voltase sedang, maka pergerakan protein akan lambat, namun hasilnya bagus.

- SuhuSuhu mempengaruhi denaturasi protein, dimana protein dg struktur primer akan lebih

mempercepat pergerakannya.


8/9

F.DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................................(1)

Nb : Minimal 4 Daftar Pustaka, Bahasa inggris 1, Bahasa Indonesia 3.

Campbell, N.A., J.B. Reece, L.G. Mitchell. 2002. Biologi. Terj. dari Biology; oleh Lestari, R. dkk.

Erlangga, Jakarta:Davidson. 2001. SDS PAGE. Diakses tanggal 9 April 2014.

http://www.bio.davidson.edu/COURSES/GENOMICS/method/SDSPAGE/SDSPAGE.h

tml.

Williams. 2001. SDS PAGE Gel Elektrophoresis. Diakses tanggal 9 April 2014. http://web.

Chemistry.gatech.edu/~williams/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/

page_protein.html.
http://www.bio.davidson.edu/http://web/http://web/http://www.bio.davidson.edu/


9/9

Documents

Cl Asistensi