Dec. 18,1922 - Nov. 11, 2006

Esther Miriam Zimmer Lederberg

Stanford University laboratory

Estructura del fago λ

Adsorción de fagos lambdaa la membrana externa de E. coli

- pstM – proteína de membrana interna- involucrada en transporte de fosfato

Cambios contráctiles en fago T4

Ciclo vital del fago lambda

El fago lambda contiene un DNA lineal de 48.502 pares de bases, con una extensión 5’ de cadena simple de 12 bases en ambos extremos; estas extensiones llamadas extremos cohesivos o cos son complementarias entre sí. Durante la infección, la extensión 5’ derecha (cosR), seguida por el genoma entero, entra en la célulahospedadora. Ambos cos son ligados por la DNA ligasa de E. coli, formando un DNA circular covalentemente cerrado, el cual, por acción de la DNA girasa de la bacteria,se convierte en una estructura superenrollada.

El DNA de lambda puede entrar en un estado durmiente (profago) integrándose en el genoma bacteriano en un lugar específico por recombinación específica de sitio, siendo propagado junto con el hospedador en la progenie subsiguiente. Este estado es llamado lisogenia. Diferentes condiciones de estrés (como la irradiación UV) pueden activar al profago y desencadenar un ciclo lítico. attP (por attachment, unión) es la secuencia del fago que se recombina con la correspondiente secuencia, attB, en el genoma bacteriano.

Placas de lisis formadas por el fago lambda

En el ciclo lítico, el genoma de lambda presenta dos modos de replicación

Una vez dentro de la bacteria, el DNA del fago se circulariza y es replicado bidireccionalmente (modo theta). Más tarde, cambia a un modo de círculo rodante (síntesis de DNA concatemérico lineal unido por extremos cos). La molécula lineal es luego empaquetada en la cabeza después del corte de cada extremo cos por la terminasa (proteína A) del fago.

Morfogénesis del fago lambda

host ligase

Mapa del genoma del fago lambda

Lysis and lysogeny are controlled by the proteins encoded by cro and cI genes. The lambda phage will remain in the lysogenic state if cI proteins predominate,but will be transformed into the lytic cycle if Cro proteins predominate

cI genes transcription and translation regulate lysis/lysogeny

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Morfogénesis de lambda

Vectores lambda• Para la producción de fagos viables, el tamaño del genoma de lambda

debe estar entre un mínimo de 38 kb (78%) y 53 kb (105%).

• El tercio central del genoma no es esencial para el crecimiento lítico.

• Los vectores lambda pueden ser de dos tipos:

• Vectores de sustitución o de reemplazo: en ellos el fragmento central es removido y sustituído por un fragmento de DNA extraño. Aceptan fragmentos de 9 a 23 kb.

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• Vectores de inserción: aceptan fragmentos de DNA pequeños (5-11 kb), que son introducidos sin la remoción del fragmento central no esencial.

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• Vectores de sustitución o de reemplazo: en ellos el fragmento central es removido y sustituído por un fragmento de DNA extraño. Aceptan fragmentos de 9 a 23 kb.

• Vectores de inserción: aceptan fragmentos de DNA pequeños (5-11 kb), que son introducidos sin la remoción del fragmento central no esencial.

Clonado en un vector lambda de sustitución

Los vectores lambda de sustitución contienen sitios de restricción flanqueandoel fragmento central.

Clonado con un vector lambda de inserción

Vectores de inserción

Contienen sitio único para clonado de DNADiseñados para ser empa- quetados con o sin DNA insertado.

Vector lambda de sustitución EMBL3A

En este tipo de vectores se puede impedir la religación del fragmento central y de los brazos digiriendo el fago con dos enzimas de restricción diferentes en cada uno de los dos sitios de múltiple clonado que flanquean el fragmento central. A su vez, la ligaciónde los brazos entre sí puede evitarse tratándolos con fosfatasa alcalina.

Los sitios de múltiple clonadopueden ser separados de los brazos por precipitación diferencialcon isopropanol (son pequeños y permanecen en el sobrenadante).

Ligación selectiva de insertos de DNA digeridos con SalI

Digestión del vector

Digestión parcial de un fragmento de DNA con una endonucleasa de restricción de tipo II. Las digestiones parciales son realizadas usualmente variando ya sea el tiempo o la cantidad de enzima usada para la digestión. En algunas de las moléculas de DNA la enzima ha cortado en todos los sitios (marcados como RE1). En otras moléculas ha ocurrido un menor número de rupturas. El resultado deseado es una muestra con moléculas de DNA de todas las longitudes posibles.

Producción de fragmentos de restricción que se solapan mediante digestión parcial de DNA genómico con Sau3A. El uso de estos fragmentos superpuestos aumenta la probabilidad de que todas las secuencias en el DNA genómico estarán representadas en una biblioteca de lambda.

Construcción de una bibliotecagenómica usando un vector lambdade sustitución y digestión parcial conEcoRI

Construcción de una bibliotecagenómica usando un vector lambdade sustitución y digestión parcial conSau3A

El empaquetamiento in vitro en la cápside del fago lambda puede realizarse usando una mezcla de lisados de doslisógenos mutantes. Ninguno de los lisógenos aislados es capaz de empaquetar el DNA del fago. La proteína E es el componente principal de la cabeza del fago, y en su ausencia todos los componentes de la cápside se acumulan. La proteína D está involucrada en dos procesos acoplados: inserción del DNA en la precabeza precursora y en la subsiguiente maduración de la cabeza. Cuando los extractos se mezclan, partículas de fago maduras son producidaspor complementación.

Empaquetamiento in vitro

Otro método de empaquetamiento in vitro

El fago lisógeno del extracto 1presenta una mutación en el gen E. Este extracto contiene colas y la proteína A. Para formar cabezas, le falta E.

El fago lisógeno del extracto 2tiene una mutación en el gen A.Este extracto contiene cabezasvacías (no pueden ser llenadasen ausencia de A).

Selección de fagos recombinantes

En el caso de los vectores de sustitución, los dos brazos purificadosno pueden ser empaquetados aunque se liguen entre sí (están pordebajo de la longitud mínima para el empaquetamiento). Esto provee unaselección positiva de los recombinantes. Si no se purifican previamente los brazos, se debe emplear un método que seleccione sólo los fagosrecombinantes, eliminando los fagos no recombinantes (salvajes) reconstituídos (por ejemplo, infección de una cepa de E. coli lisogénica para el bacteriófago P2). Otro método de selección: gen lacZ en el fragmentocentral (selección azul-blanco).

En los vectores de inserción, para la distinción entre fagos recombinantesy no recombinantes generalmente se explota la inactivación insercional de alguna función biológica (gen cI del represor de lambda, gen lacZ, etc.)

El reemplazo del fragmento central de relleno conteniendo los genes red (formación de multímero) y gam (switch de replicación bidireccional a círculo rodante) en el vector de sustitución lambda EMBL3 con insertos que tengan extremos BamHI compatibles de ~10-20 kb permite el crecimiento lítico de los fagos recombinantes en cepas de E. coli lisogénicas para el bacteriófago P2 (fenotipo Spi– , not sensitive to P2 inhibition). Para empaquetamiento necesitan bacteria recA+

y sitios chi en el vector.

Un método de selección de fagos recombinantes

Este vector de inserción puede aceptar insertos de DNA de ~1-5 kb. Los fagos recombinantes pueden ser seleccionados en cepas mutantes hfl (high frequency of lysogeny) de E. coli. En mutantes hflA, la expresión del gen cII de lambda es elevada, lo que resulta en la inducción transcripcional del gen cI para el represor, promoviendo la vía lisogénica. La interrupción de la secuencia codificante de cI por inserción de DNA en el sitio EcoRI único del vector bloquea el camino lisogénico, lo que lleva a lisis celular y formación de placas.

Selección por clonado insercional en el gen cI del vector de clonado lambda-gt10

a) Inactivación por inserción del gen Lac Z´Agar + x-gal + IPTGPlacas claras = recombinantesPlacas azules = no recombinantes

b) Selección usando el fenotipo SpiProfago P2Solo los fago recombinantepuede infectarfago no recombinante no

Physical Mapping SystemsPhysical Mapping Systems

Yeast Artificial Chromosomes (YACs) 200-2000 kb

Bacteriophage P1 90 kb

Cosmids 40 kb

Bacteriophage 9-23 kb

Clonación del DNA

Cósmido

Clonado en cósmidos

El cósmido es cortado en el sitio BglII cercano al sitio cos. El DNA genómicodonante es cortado usando Sau3A, lo cual da extremos cohesivos compatiblescon BglII. La mezcla de DNA vector y donante resulta en concatémeros.

Luego de un empaquetamiento in vitro e infección con los fagos resultantes,los cósmidos se recircularizan dentro de la célula bacteriana y se comportancomo plásmidos.

Clonado en cósmidos (continuación)

Clonado en cósmidos

Concatémero de cósmidos recombinantes

Segmentos de DNA extraño ligados entre sí

Concatémero de cósmidos no recombinantes

Vectores BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

Derivados del factor F, un plásmido monocopiade E. coli de alrededor de 100 kb.En el vector se conservaron sólo los genesque controlan el número de copias (parA y parB), y la replicación (oriS y repE). Se agregaron un gen de resistencia a antibiótico (para seleccionar las bacterias que reciben BAC), y un gen lacZ con un sitio de clonado en su interior. Esto permite una selección azul-blanco (los plásmidos recombinantes son blancos en placas con X-Gal.Los BAC pueden aceptar insertos de hasta 300 kb y se introducen en las bacterias por electroporación.

Clonado en BAC: los BACrecombinantes pueden serdistinguidos de los vectoresligados entre sí o de los fragmentos de DNA extrañoligados entre sí (éstos notienen resistencia antibióticay mueren).

El vector derivado del fago P1 permite el clonado de fragmentos de hasta 100 kb. Aquí se esquematiza el plásmido vector Ad10 que incorpora varios elementos del genoma de P1: pac, el sitio de empaquetamiento de P1, y los dos sitios loxP, reconocidos por la recombinasa del fago, producto del gen cre. El vector es digerido y se generan dos brazos, uno corto y otro largo. Fragmentos de DNA extraño, seleccionados por tamaño, son ligados. Empaquetamiento in vitro, con extractos conteniendo pacasa (rompe en el pac e inserta el DNA en la cabeza, hasta que ésta se llena. Se une la cola. En una cepa de E. coli con el gen cre, el producto de este gen actúa en los sitios loxP produciendo un plásmido circular de bajo número de copias, pero que puede ser amplificado induciendo el replicón lítico de P1.

Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas

•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs):

Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura)Puede incorporar más de 500 kb de DNA

Vectores eucarióticos

Origen de replicación del DNA de levadura

(ARS)

Región centromérica (CEN)

Resistencia a antibiótico (p.e., ampr)

Origen de replicación bacteriano (ori)

CEN ARSampr ori TelómeroTelómero

Linealización (con endonucleasas) y

adición de extremos teloméricos

CEN, centrómero; TEL, telómeros; ARS1, secuencia de replicación autónoma; Amp, gen de resistencia a ampicilina; ori, origen de replicación que funciona en E. coli. Levadura hospedadora: AB1380, es roja (mutación en ade-2, metabolismo de adenina, acumulación pigmento rojo). Vector lleva gen SUP4, supresor ocre, restaura la actividad de Ade-2, dando colonias incoloras. Célula hospedadora tiene además mutaciones recesivas trp1 y ura3, complementadas por el vector (selección células con el vector YAC).

Construcción de un YAC(Yeast Artificial Chromosome)

SUP4

Electroforesis de campo pulsátil (PFGE, Pulsed-Field Gel Electrophoresis)

El principio de la electroforesis de campo pulsátil es que los fragmentos grandes de DNA requieren más tiempo para reorientarse y cambiar de dirección en un campo eléctrico quelos fragmentos pequeños. Alternando la dirección de la corriente durante la electroforesises posible resolver fragmentos de 100 a 1000 kb.

Sistema de PFGE que usa una caja hexagonal que altera el ángulo de los campos eléctricosrelativo al gel de agarosa.

Cromosomas artificiales deLevadura (YAC, Yeast Artificial Chromosome) como vectores

La electroforesis de campo pulsante (PFE) permite separar fragmentos de restricción de varios cientos de kilobases

La electroforesis de campo pulsante (PFE) puede ser usada para fraccionar por tamañocromosomas enteros. Las bandas representan cromosomas separados de S. cerevisiae.Las flechas señalan YACs con insertos del cromosoma humano 10.

Tamaños de DNA insertado comúnmente obtenidos con diferentes vectores de clonado

Vector de clonado Tamaño del inserto

Vectores plasmídicos de alto número de copia 0-10 kb

Bacteriófago l vectores de inserción 0-10 kb

Bacteriófago l vectores de reemplazo 9- 23 kb

Vectores cósmidos 30- 44 kb

Bacteriófago P1 70- 100 kb

Vectores PAC (P1 artificial chromosome) 130- 150 kb

Vectores BAC (bacterial artificial chromosome) up to 300 kb

Vectores YAC (yeast artificial chromosome) 0.2  2.0 Mb