Herramientas básicas de clonación molecularHerramientas básicas de clonación molecular

Estirpes de Estirpes de Escherichia coliEscherichia coli para propagar el DNApara propagar el DNA

Plasmidos como vectores de clonaciónPlasmidos como vectores de clonación

Métodos de transformación de bacteriaMétodos de transformación de bacteria

Bacteriófagos para clonaciónBacteriófagos para clonación

Estirpes de Estirpes de Escherichia coliEscherichia coli para propagar el DNApara propagar el DNA

E. coliE. coli K12K12Bacteria GramBacteria Gram--negativa con flagelosnegativa con flagelosHabitat natural: intestinoHabitat natural: intestinoMembrana interna y externaMembrana interna y externaCromosoma circular con un unico origen de replicaciónCromosoma circular con un unico origen de replicaciónSe replica cada 20 minutos en condiciones aeróbicasSe replica cada 20 minutos en condiciones aeróbicasPueden ser congeladas en glicerolPueden ser congeladas en glicerol

Crecen bien en condiciones de laboratorioCrecen bien en condiciones de laboratorioNo son patógenasNo son patógenasSe conoce bien su genética y su bioquímicaSe conoce bien su genética y su bioquímicaNo vive fuera de condiciones de laboratorioNo vive fuera de condiciones de laboratorio

El operon lac de El operon lac de E. coliE. coli consiste en un promotor, un operador (o), un consiste en un promotor, un operador (o), un lugar de unión de la proteína activadora de catabolito CAP (c), lugar de unión de la proteína activadora de catabolito CAP (c), 3 genes 3 genes estructurales en un mRNA policistronico (lacZ, lac Y, lac A) y uestructurales en un mRNA policistronico (lacZ, lac Y, lac A) y un gen n gen estructural que produce la proteína represora Lacestructural que produce la proteína represora Lac

Sistema de Sistema de inducción de la inducción de la expresión por IPTG expresión por IPTG usando usando componentes del componentes del operon operon laclac..

Se requiere que la Se requiere que la cepa de cepa de E. coli E. coli contenga la contenga la mutación de mutación de sobreexpresión en el sobreexpresión en el receptor receptor lacIlacIqq

La actividad La actividad ßß--galactosidasa galactosidasa como indicador de la como indicador de la función génicafunción génica

Los plasmidos que Los plasmidos que expresan el Nexpresan el N--terminal de la enzima terminal de la enzima pueden ser usados pueden ser usados en cepas de en cepas de E. coliE. colique expresan el Cque expresan el C--terminal del enzima terminal del enzima en el plasmido F’.en el plasmido F’.

Varios tipos de sistemas de modificación y restricción deben serVarios tipos de sistemas de modificación y restricción deben sereliminados de las cepas de eliminados de las cepas de E. coliE. coli K12 para que puedan ser usadas en K12 para que puedan ser usadas en clonación.clonación.

(a)(a) DNA no metilado se DNA no metilado se degrada por la nucleasa degrada por la nucleasa hsdR y por tanto para hsdR y por tanto para clonar DNA no metilado clonar DNA no metilado debe emplearse debe emplearse estirpes hsrRestirpes hsrR––..

(b)(b) DNA metilado en DNA metilado en posiciones distintas del posiciones distintas del de de E.coliE.coli se degrada se degrada por las proteínas por las proteínas mdrA/mcrB por tanto mdrA/mcrB por tanto para clonar DNA de para clonar DNA de mamifero y plantas mamifero y plantas deben emplearse deben emplearse estirpes con estirpes con mutaciones en mutaciones en mdrA/mcrB.mdrA/mcrB.

PLÁSMIDOS: los modelos pBR322 y pUC18PLÁSMIDOS: los modelos pBR322 y pUC18

pBluescript SK+pBluescript SK+

Bacteriofago Bacteriofago λλ

Infección por fagos es muy Infección por fagos es muy eficiente en comparación eficiente en comparación con métodos químicos de con métodos químicos de transformacióntransformación

Ciclo del fago Ciclo del fago λλ

Lisogenia Lisogenia vs.vs.

LisisLisis

Infección por fago Infección por fago λλ Lisogenia Lisogenia vs.vs. LisisLisis

El gen El gen cIcI inhibe la transcripción de los genes tempranos de la ruta líticinhibe la transcripción de los genes tempranos de la ruta lítica: a: genes estructurales de cabeza, cola y de lisis de pared bacteriagenes estructurales de cabeza, cola y de lisis de pared bacterianana

Genoma del fago Genoma del fago λλ: 48502 pb : 48502 pb (18 kpb necesarios para lisis)(18 kpb necesarios para lisis)

Genoteca en Genoteca en fago fago λλ

Genoteca en fago Genoteca en fago λ:λ: Sitios Sitios coscos

CapacidadCapacidad: : empaqueta entre 38 y 52 kb (clona hasta 25 kb de DNA)empaqueta entre 38 y 52 kb (clona hasta 25 kb de DNA)

Genoteca en Genoteca en fago fago λλ ::

Ensayo de Ensayo de formación de formación de placas de lisisplacas de lisis

Screening de genoteca en fago lambdaScreening de genoteca en fago lambda

Fagemidos y fagos Fagemidos y fagos auxiliares para auxiliares para producción de cadenas producción de cadenas sencillas de DNAsencillas de DNA

λ λ ZAP: clonación de cDNAZAP: clonación de cDNA

Contiene elementos Contiene elementos reguladores reguladores eucarioticos eucarioticos (promotores y (promotores y poliadenilación) poliadenilación) que permiten que permiten expresión en expresión en células eucarióticas células eucarióticas y selección de la y selección de la integración estable integración estable de DNAde DNA

Rescate de fagémidosRescate de fagémidos

Infección secuencial Infección secuencial con 2 cepas con 2 cepas diferentes de diferentes de E.coliE.colique permite o que permite o restringe la restringe la producción de fagos producción de fagos y que resulta en el y que resulta en el rescate de colonias rescate de colonias resistentes a kan resistentes a kan (con el fagemido)(con el fagemido)

Expresión Expresión heteróloga en heteróloga en E.coliE.coli con el con el vector pETvector pET

Producción de Producción de anticuerpos anticuerpos utilizando utilizando proteína proteína recombinanterecombinante

Screening por anticuerposScreening por anticuerpos

Screening por oligonucleótidos degeneradosScreening por oligonucleótidos degenerados

Hibridación substractivaHibridación substractiva

Utilización de clones Utilización de clones de cDNA como sonda:de cDNA como sonda:

Para detectar Para detectar expresión diferencial expresión diferencial de genes de genes (“nuclear run(“nuclear run--on”):on”):marcaje marcaje in vivoin vivo e e hibridaciónhibridación

Sistema de dos Sistema de dos híbridos en híbridos en levaduraslevaduras3 elementos para 3 elementos para detectar detectar interacciones entre interacciones entre dos proteínas:dos proteínas:

-- Proteína de fusión Proteína de fusión GAL4GAL4--DBD con DBD con proteina “cebo”proteina “cebo”

-- Genoteca de cDNA Genoteca de cDNA con insertos de con insertos de fusión en el gen fusión en el gen GAL4GAL4--AD.AD.

-- Gen indicador Gen indicador seleccionable seleccionable activable por el activable por el complejo complejo GAL4GAL4--DBDDBD--ADAD

Protocolos de Protocolos de transfección transfección transitoriatransitoria

Optimización de la Optimización de la eficiencia para cada tipo eficiencia para cada tipo celular y para celular y para construcción.construcción.

Control de la Control de la expresión en lineas expresión en lineas celulares de celulares de mamíferosmamíferos

El receptor de la El receptor de la tetraciclina puede ser tetraciclina puede ser utilizado para dos utilizado para dos sistemas: apagado y sistemas: apagado y activado. activado.

La presencia o ausencia La presencia o ausencia de doxiciclina inhibe o de doxiciclina inhibe o activa la expresiónactiva la expresión

VP es un dominio de VP es un dominio de activación de la activación de la transcripcióntranscripción

Mutaciones en rTetR Mutaciones en rTetR evitan la unión a DNA en evitan la unión a DNA en ausencia de Tet.ausencia de Tet.

Expresión de proteínas de Expresión de proteínas de fusión en fusión en E. coliE. coli (e.g. (e.g. ThiofusiónThiofusión))

Expresión es inducida por la Expresión es inducida por la derepresión del gen derepresión del gen λλcI cI mediada por triptofano.mediada por triptofano.

En En E.coliE.coli las proteínas de fusión las proteínas de fusión con actividad tioredoxina se con actividad tioredoxina se localizan en las proximidades localizan en las proximidades de la membrana: por shock de la membrana: por shock osmotico pueden liberarse al osmotico pueden liberarse al medio (purificación).medio (purificación).

Mediante una proteasa Mediante una proteasa (enteroquinasa) puede (enteroquinasa) puede eliminarse la zona de la eliminarse la zona de la tioredoxina dentro de una tioredoxina dentro de una columna de afinidad.columna de afinidad.

Expresión de proteínas con Expresión de proteínas con modificaciones postmodificaciones post--traduccionalestraduccionales ((Baculovirus Baculovirus y células eucariotas)y células eucariotas)Fosforilación, glicosilación y Fosforilación, glicosilación y procesamiento proteolítico no procesamiento proteolítico no sucede en sucede en E.coliE.coli..

Vectores de expresión de Vectores de expresión de baculovirus se producen in vivo baculovirus se producen in vivo seleccionado eventos de seleccionado eventos de recombinación específicos recombinación específicos (complementación de lacZ)(complementación de lacZ)

VentajasVentajas::-- Proteinas activas y solublesProteinas activas y solubles-- Genoma viral acomoda tamaños Genoma viral acomoda tamaños grandes (hasta 15kb)grandes (hasta 15kb)-- Acoplamiento de heterodimerosAcoplamiento de heterodimeros--Virus de hospedador restringidoVirus de hospedador restringido-- Altas producciones de proteínaAltas producciones de proteína

Genes indicadores permiten mapear Genes indicadores permiten mapear in vivoin vivo secuenciassecuenciasreguladoras.reguladoras.

Fragmentos genomicos Fragmentos genomicos amplios pueden delimitarse amplios pueden delimitarse por su funcíon reguladora por su funcíon reguladora de la expresión.de la expresión.

Mutagénesis de deleción Mutagénesis de deleción secuencial permite ir secuencial permite ir identificando zonas identificando zonas necesarias para la expresión necesarias para la expresión del gen indicador del gen indicador (luciferasa).(luciferasa).

El análisis de los datos El análisis de los datos permite la localización de permite la localización de diferentes elementos diferentes elementos (potenciadores, promotores, (potenciadores, promotores, etc…)etc…)

Las secuencias reguladores de Las secuencias reguladores de unión a DNA pueden ser unión a DNA pueden ser identificadas mediante analisis identificadas mediante analisis por protección (por protección (footprintingfootprinting)

Proteínas que se unen con alta Proteínas que se unen con alta afinidad a DNA se pueden incubar afinidad a DNA se pueden incubar con fragmentos de DNA con fragmentos de DNA reguladores y la secuencia de DNA reguladores y la secuencia de DNA que une la proteína es identificada.que une la proteína es identificada.

(a) En una primera aproximación se (a) En una primera aproximación se puede observar la presencia de puede observar la presencia de diferentes tamaños en una diferentes tamaños en una digestión limitada con Dnase Idigestión limitada con Dnase I

(b) En una segunda aproximación (b) En una segunda aproximación se puede identificar con precisión la se puede identificar con precisión la secuencia de unión.

)

secuencia de unión.

Genes indicadores Genes indicadores permiten identificar permiten identificar regiones reguladoras regiones reguladoras específicas de tipos específicas de tipos celulares.celulares.

CAT: gen de cloranfenicol CAT: gen de cloranfenicol acetil transferasa.acetil transferasa.

3 tipos de plasmidos 3 tipos de plasmidos permitiran saber si la zona permitiran saber si la zona clonada de un gen codifica clonada de un gen codifica un promotor especifico de un promotor especifico de un tipo celular.un tipo celular.

La actividad de CAT se mide La actividad de CAT se mide mediante CCF con mediante CCF con cloranfenicol marcado.cloranfenicol marcado.

El fragmento clonado dirige El fragmento clonado dirige selectivamente la selectivamente la transcripción en el tipo Btranscripción en el tipo B

MUTACIÓNMUTACIÓN

Cambio en la Cambio en la secuencia de DNAsecuencia de DNA

Efecto fenotípico:Efecto fenotípico:disfunción clínica endisfunción clínica en

individuos, individuos, familias y/o poblacionesfamilias y/o poblaciones

DetecciónDetección

DisfunciónDisfunciónMOLECULARMOLECULAR

TERAPIATERAPIA

Detección de mutaciones en fragmentos de PCRDetección de mutaciones en fragmentos de PCR

SSCP: SSCP: ““single strand single strand conformation conformation polymorphismpolymorphism””

Mutaciones en DNA Mutaciones en DNA genomico pueden ser genomico pueden ser identificadas mediante identificadas mediante desnaturalización de desnaturalización de fragmentos de PCR y fragmentos de PCR y analisis de su analisis de su movilidad en geles de movilidad en geles de electroforesis.electroforesis.

Clonación de Clonación de fragmentos de PCRfragmentos de PCR

Los productos de PCR Los productos de PCR pueden ser clonados de pueden ser clonados de diferentes formas diferentes formas dependiendo de la dependiendo de la secuencia terminal del secuencia terminal del fragmento.fragmento.

El sistema de elección El sistema de elección depende del uso posterior depende del uso posterior del clon.del clon.

Mutagenesis por PCRMutagenesis por PCR

La mutagenesis dirigida es muy La mutagenesis dirigida es muy frecuentemente necesaria para frecuentemente necesaria para crear fusion de fragmentos, crear fusion de fragmentos, imitar mutaciones naturales, y imitar mutaciones naturales, y elaborar construcciones elaborar construcciones recombinantes.recombinantes.

El solapamiento de segmentos El solapamiento de segmentos puede servir de puente para una puede servir de puente para una segunda amplificación por PCR. segunda amplificación por PCR. El resultado es un nuevo El resultado es un nuevo fragmento con las dianas de fragmento con las dianas de restriccion necesarias para la restriccion necesarias para la clonaciónclonación