CLEIDJANE GOMES FAUSTINO ESTUDO QUÍMICO E DA …ƒO-FINAL-DISSERTAÇÃO.pdfAO Aedes (stegomyia)aegypti Linneu Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAPÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DEPARTAMENTO

DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

CLEIDJANE GOMES FAUSTINO

ESTUDO QUÍMICO E DA ATIVIDADE LARVICIDA E

REPELENTE DO ÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE

Protium heptaphyllum (Aubl.) Marchand FRENTE AO Aedes

(stegomyia) aegypti (Linneu 1762)

MACAPÁ

2018

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CLEIDJANE GOMES FAUSTINO

ESTUDO QUÍMICO E DA ATIVIDADE LARVICIDA E REPELENTE DO ÓLEO

ESSENCIAL DA RESINA DE Protium heptaphyllum (Aubl.) Marchand FRENTE

AO Aedes (stegomyia)aegypti Linneu

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências da

Saúde da Universidade Federal do

Amapá-UNIFAP, como requisito para

obtenção do título de mestre em

ciências da saúde.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Antônio de Medeiros

MACAPÁ

2018

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5

DEDICATÓRIAS

“Dedico este trabalho a Deus e

aos meus pais e irmãos, a

minha tia Socorro Faustino, e

ao meu namorado e

companheiro Fernando

Medeiros por tudo que fizeram

e fazem por mim”.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por ter me dado à sabedoria e paciência

para esperar o tempo certo. Pois sem o discernimento do senhor não teria chegado

aonde cheguei. Só tenho a agradecer pelos obstáculos que venci no decorrer desse

caminho que suportei graças à força obtida na fé.

Aos meus pais e irmãos que me deram força e palavras amigas no decorrer

da vida. Agradeço em especial a minha mãe uma guerreira que nunca mediu

esforços para me ajudar, uma amiga e conselheira incansável que sempre acreditou

no meu potencial. E a todos meus familiares por tudo de bom que me

proporcionaram no decorrer dessa jornada. Agradeço em especial a minha tia e mãe

Socorro Faustino pelo apoio e conselhos proferidos no momento certo.

Minha gratidão ao meu orientador e namorado Fernando Antônio de

Medeiros, pela orientação deste trabalho de dissertação pelo profissional exemplar

que é. Obrigada por sua dedicação, por muitas vezes deixou de aproveitar os seus

finais de semana para me orientar.

Aos meus amigos de mestrado por tudo de bom que me ensinaram e pela

oportunidade de conhecê-los. Agradeço em especial a César, Caroline, Helison. A

técnica do laboratório ARTROLAB Karen pela sua dedicação e paciência em

transmitir seus conhecimentos. Aos voluntários que participaram do teste de

repelência o meu muito obrigada.

Aos meus professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências da

Saúde PPGCS pelo os ensinamentos passados.

A todos dos Laboratórios de Absorção Atômica e Bioprospecção e do

Arthropoda (ARTHROLAB) da Universidade do Federal do Amapá-Unifap. Em

especial aos professores Raimundo Nonato e Roberto Messias Bezerra por terem

me acolhido tão bem e pela ajuda tanto experimental quanto teórica durante esse

período.

A CAPES, pela concessão de bolsa de estudo durante o curso.

E aqueles que não foram citados, mas estiveram presentes nas horas em que

mais precisei, seja para brindar, seja para rir, para abraçar, ou apenas compartilhar

um silêncio.

7

Enfim, agradeço a todos que tiveram paciência comigo ao longo dessa jornada,

que por vezes é estressante em seu percurso, porém é tão gratificante ao seu final.

8

EPÍGRAFE

Desistir nunca... O caminho é longo, mas a vitória é certa (Raphael Gouveia

Monteiro).

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LISTA DE FIGURAS, GRÁFICOS, QUADROS E TABELAS

Figura 1- Ciclo de desenvolvimento do mosquito Ae. aegypti................. 26

Figura 2- Mapa georeferenciado do local da coleta do material vegetal (resina e exsicata) da espécie P. heptaphyllum, localizado no município de Macapá, Amapá, Brasil.......................................

33

Figura 3- Espectros de massas dos óleos essenciais da resina de P. heptaphyllum obtidos por CG-EM para: a) p-cimeno; b) α-pineno; c) α-felandreno e d) α-terpineno.................................

45

Gráfico 1- Valores médios do número de picadas avaliados em função do tempo de exposição em minutos usando a dose de 250 ppm do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum e do controle negativo (veículo), frente aos mosquitos de Ae. aegypti....................................................................................

50


51


52

Gráfico 4- Valores médios do número de picadas ao longo do tempo (30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos) nas concentrações de 250, 500 e 1000 ppm do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum frente ao mosquito Ae. aegypti.....................

53

Gráfico 5- Valores médios e desvio padrão do percentual de picadas ao longo do tempo (30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos) nas concentrações de 250, 500 e 1000 ppm do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum frente a mosquito Ae. aegypti.................................................................................

54

Quadro 1- Composição química de P. heptaphyllum............................... 23

Quadro 2- Rendimento do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum obtido através da técnica de arraste a vapor........................

40

Quadro 3- Apresenta os principais componentes químicos identificados Por CG-MS do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum Tempo de retenção e % de rendimento...................................

43

Tabela 1- Rendimento do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum obtido através da técnica de arraste a vapor.......................................................................................

41

Tabela 2- Valores médios e desvio padrão do índice mortalidade de larvas de Ae. aegypti para o controle negativo e as concentrações de 20, 40, 80, 100 e 160 ppm de óleo essencial da resina do P. heptaphyllum e aplicação dos testes Anova e Tukey..........................................................

46

10

Tabela 3- Valores médios e desvio padrão frente ao Ae. aegypti nas

concentrações de 250, 500 e 1000 ppm e controle negativo do óleo essencial da resina do P. heptaphyllum......................

49

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LISTA DE ABREVIATURA ESIGLAS

Ae. aegypti Aedes aegypti

ANOVA Análise de Variância

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BM Biomassa Vegetal (resina)

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade

Federal do Amapá

0C Graus Celsius

CL50 Concentração Letal para Matar 50 % de Individuos de uma

Determinada População

CL90 Concentração Letal para Matar 90 % de Individuos de uma

Determinada População

DEET N-N-Dimetil-meta-toluamida

DMSO Dimetilsufóxido

EUA Estados Unidos da América

g Grama

CG-MS Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometro de Massa

h Hora

HAMAB Herbário Amapaense

IARC Agência Internacional de Pesquisa em Câncer

IEPA Instituto de Pesquisa Científicas e Tecnológicas do Estado do

Amapá

Mg Miligramas

mL Militro

MS Ministério da Saúde

N0 Número

OMS Organização Mundial de Saúde

P heptaphyllum Protium heptaphyllum

ppm partes por milhão

TCLE Termo de Consentimento Livre Esclarecido

TO Teor de Óleo Essencial

UNIFAP Universidade Federal do Amapá

VO Volume de Óleo Essencial

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RESUMO

As plantas medicinais são utilizadas desde os primórdios da humanidade, sendo inseridas no tratamento de diversas patologias. Os óleos essencias são constituídos de substâncias voláteis oriundos do metabolismo secundário vegetal de plantas aromáticas. São formados em células especiais encontradas em diversas partes das plantas tais como: folhas, flores, sementes, caules e raízes. Há uma diversidade de plantas que são utilizadas na fabricação de produtos larvicidas e repelentes, sendo estes utilizados na prevenção de doenças transmitidas pelo vetor Aedes aegypti tais como: dengue, zika, chikungunya e febre amarela. O objetivo deste trabalho é obter e caracterizar quimicamente o óleo essencial da resina de Protium heptaphyllum e avaliar sua atividade larvicida e de repelência frente ao Ae. aegypti. A resina coletada foi de espécimes de P. heptaphlyllum foram coletadas no município de Macapá-Amapá-Brasil. O óleo essencial foi extraído pela técnica de arraste a vapor em aparelho de Clevenger. A caracterização química do óleo essencial foi realizada por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometro de Massa (CG-MS) e sua atividade larvicida e de repelência foram realizadas frente ao Ae. aegypti através de técnicas preconizadas pelo Ministério da Saúde. Os bioensaios realizados ofereceram excelentes resultados. O rendimento do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum obteve um percentual de 3,1%. A cromatografia gasosa acoplada aos espectrômetros de massas teve como constituintes majoritários o p-cimeno (60,59%), α-pineno (12,99%) e biciclo-heptano (10,05%), representando os três juntos 83,63% da composição do óleo essencial. Para a ação larvicida do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum nas 24 horas foi encontrada uma mortalidade de 100 % nas concentrações de 100 e 160 ppm e 96 % na concentração de 80 ppm. Nas primeiras 4 horas de teste foi possível observar uma mortalidade de 98 % nas concentrações de 100 e 160 ppm. Através dos resultados do ensaio larvicida foi possível estabelecer uma CL50 de 28,66 ppm e CL90 de 82,0 ppm para o tempo de 48 horas após aplicação deste. Com relação à atividade repelente do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum, foi possível obter nos tempos de 150 e 180 minutos uma proteção maior, mostrando que com o passar do tempo o produto não perde seu efeito.

Palavras-chave: Plantas medicinais. Prevenção. Dengue.

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ABSTRACT

Medicinal plants have been used since the beginning of mankind, being inserted in the treatment of various pathologies. Essential oils are constituted of volatile substances originating from the secondary metabolism of aromatic plants. They are formed in special cells found in various parts of plants such as leaves, flowers, seeds, stems and roots. There are a variety of plants that are used in the manufacture of larvicidal products and repellents, which are used to prevent diseases transmitted by Aedes aegypti vector such as dengue, zika, chikungunya and yellow fever. The objective of this work is to obtain and characterize the essential oil of Protium heptaphyllum resin and to evaluate its larvicidal and repellency activity against Ae. aegypti. The resin collected from specimens of P. heptaphlyllum were collected in the municipality of Macapá-Amapá-Brazil. The essential oil was extracted by the steam entrainment technique in a Clevenger apparatus. The chemical characterization of the essential oil was performed by Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometer (CG-MS) and its larvicidal and repellency activity were performed against Ae. aegypti by techniques recommended by the Ministry of Health. The bioassays performed offered excellent results. The yield of the essential oil of the P. heptaphyllum resin obtained a percentage of 3.1%. The gas chromatography coupled to mass spectrometers had as main constituents p-cymene (60.59%), α-pinene (12.99%) and bicycloheptane (10.05%), all three of which together represented 83.63 % of the composition of the essential oil. For the larvicidal action of P. heptaphyllum resin essential oil at 24 hours a 100% mortality was found at concentrations of 100 and 160 ppm and 96% at the concentration of 80 ppm. In the first 4 hours of the test it was possible to observe a mortality of 98% in concentrations of 100 and 160 ppm. Through the results of the larvicidal assay it was possible to establish a LC50 of 28.66 ppm and LC90 of 82.0 ppm for the time of 48 hours after application of this. With respect to the repellent activity of the essential oil of P. heptaphyllum resin, it was possible to obtain a greater protection in the times of 150 and 180 minutes, showing that with the passage of time the product does not lose its effect.

Keywords: Medicinal plants. Prevention. Dengue.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 15 1.1.1 Plantas Medicinais e Óleos Essenciais 18 1.1.2 Considerações sobre a Família Burseraceae e Descrição

Botânica..................................................................................................... 20

1.1.3 Gênero Protium........................................................................................ 20

1.1.4 Considerações Botânicas e Químicas de Protium heptaphyllum.............................................................................................

22

1.1.5 Mosquito do Gênero Aedes..................................................................... 25 1.1.6 Doenças Transmitidas por Mosquito Hematófago: Aedes aegypti.... 27 1.1.7 Atividade Larvicida e de Repelência...................................................... 29 5 OBJETIVOS.............................................................................................. 32 5.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................. 32 5.2 OBJETIVO ESPECÍFICOS....................................................................... 32 6 METODOLOGIA...................................................................................... 33 6.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL.......................................................... 33 6.2 EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL E DETERMINAÇÃO DO

PERCENTUAL DE RENDIMENTO..........................................................

34

6.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE Protium heptaphyllum................................................................................

35

6.4 ENSAISO BIOLÓGICOS............................................................................ 36 6.4.1 Obtenção das Larvas do Aedes aegypti............................................... 36 6.4.2 Avaliação da Atividade Larvicida Frente ao Aedes aegypti................. 36 6.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE REPELENTE FRENTE AO MOSQUITO

Aedes aegypti............................................................................................ 37

6.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................. 39 7 RESULTADO E DISCUSSÂO................................................................... 41 7.1 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE RENDIMENTO DA EXTRAÇÃO DO

ÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE P. heptaphyllum............................... 41

7.2 PERFIL CROMATOGRÁFICO DO ÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE P. heptaphyllum E PRINCIPAIS CONSTITUINTES...................................

42

7.3 ATIVIDADE LARVICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE P.heptaphyllum FRENTE ÀS LARVAS DE Aedes aegypti

46

7.4 DETERMINAÇÃO DA CL50 E CL90 DO ÓLEO ESSENCIAL DE Protium heptaphyllum FRENTE ÀS LARVAS DO Aedes aegypti...........................

47

7.5 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE REPELÊNCIA DO ÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE Protium heptaphyllum................................

48

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................... 56 REFERÊNCIAS......................................................................................... 58 APÊNDICE................................................................................................ 72 ANEXOS.................................................................................................... 74

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1 INTRODUÇÃO

Desde os tempos remotos o ser humano busca nos recursos naturais meios

para melhorar sua qualidade de vida e consequentemente ampliar as chances de

sobrevivência. As civilizações primitivas observando as plantas utilizadas na

alimentação foram experimentando-as no combate às doenças, as quais muitas

apresentaram eficácia curativa, ainda que empiricamente. Essas informações foram

sendo passadas para as gerações seguintes (CUNHA, 2007).

O uso de plantas medicinais foi uma das primeiras manifestações da

humanidade em relação à busca de meios que pudessem aliviar suas dores e

enfermidades. A explicação para os bons resultados nas ações: analgésica,

antiinflamatório, antifúngica entre outras se dá pelo fato da farmacologia ter como

uma das principais fontes de princípios ativos as plantas. O trabalho com plantas

medicinais inicia-se na identificação da espécie, coleta adequada, pré-tratamento e

armazenamento correto, passando pelos estudos químicos, farmacológicos (pré-

clínicos e clínicos, desenvolvimento tecnológicos, controle de qualidade, entre

outros) e termina com a utilização, que também devem ser adequados para que os

resultados sejam satisfatórios (HAMILTON, 2003).

Dentre as diversas práticas de utilização das plantas medicinais o uso de

óleos essenciais como agentes terapêuticos é evidenciado desde a antiguidade, é o

que relatam os registros históricos de mais de seis mil anos atrás, que traz desde

práticas religiosas entre os Egípcios, integradas à cura de males, às unções da

realeza e à busca de bem-estar físico (TYRREL, 1990).

Historicamente os produtos naturais têm um papel importantíssimo no

desenvolvimento de agentes inseticidas, sendo conhecida como inseticidas

botânicos e, juntamente como os inseticidas inorgânicos (arsenicais, fluorados, entre

outros), fizeram parte da chamada Primeira Geração de inseticidas, tendo como

principais representantes, piretro, rotenona e nicotina (CASIDA; QUISTAD, 1998;

FARIA, 2009). Essas substâncias fizeram do Brasil, em meados do século XX, um

dos maiores produtores e exportadores de inseticida botânico do mundo

(MENEZES, 2005). O uso desses inseticidas se manteve até início da década de 40

quando o entomologista suíço Paul Müller, em 1939, descobriu as propriedades

inseticidas do diclorodifeniltricloroetano (DDT) no combate ao mosquito transmissor

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da malária, descoberta esta que lhe rendeu o prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina

(FARIA, 2009), e surgindo a chamada Segunda Geração de inseticida.

O uso exagerado do DDT levou ao surgimento de resistência ao inseticida, ao

aparecimento de problemas ambientais, devido à alta toxicidade desses produtos

sintéticos, e sua proibição na década de 70 em muitos países (D’AMATO, et al.,

2002).

Atualmente a crescente preocupação da sociedade por produtos cada vez

mais seguros ao meio ambiente e ao homem, que não causem efeitos nocivos a

organismos não-alvos, fez ressurgir à busca por inseticidas botânicos

(VENDRAMIM; CASTIGLIONI, 2000). Dentre os produtos naturais para fins

inseticidas, os óleos essenciais são considerados os mais importantes (COSIMI, et

al., 2009), devido a sua alta lipofilicidade, propriedade esta que proporciona um

maior poder de penetração no tegumento do inseto (KIM et al., 2003). Podendo agir

desde enzimas digestivas até as neurológicas (ISMAN, 2006).

Outras linhas de interesse dos óleos essenciais são suas propriedades

larvicida e repelente de insetos. Estudos têm demonstrado que diversos óleos

essenciais apresentam um excelente efeito larvicida e repelente para as mais

diversas espécies de insetos (ISMAN, 2000). Assim sendo, a comunidade científica

vêm cada vez mais realizando estudos que empregam os óleos essenciais no

combate a mosquitos transmissores de endemias, a exemplo do Aedes e

Anopheles, haja visto o grande número de casos de doenças transmitidas por estes.

Segundo dados do Ministério da Saúde, o Brasil registrou mais de 1.600.000

casos de dengue em 2015, com 863 óbitos confirmados, e mais de 20.000 casos da

febre chikungunya, com previsão de 3 a 4 milhões de casos de Zika em 2016 no

continente americano (BRASIL, 2015). O crescente número de novos casos de

dengue, chikungunya e mais recentemente da Zika no Brasil, assim como em outros

países, caracterizam essas endemias como um grande problema de saúde pública

mundial, fazendo-se necessário e urgente à busca de alternativas que possam fazer

o controle do vetor dessas doenças.

A utilização de plantas medicinais, sobre tudo as produtoras de óleos

essenciais, com propriedades capaz de atuar em diversas fases de desenvolvimento

do vetor, se apresenta como uma das formas mais promissoras de controle dessas

endemias (ROEL, 2001). Neste sentido este trabalho se propõe a avaliar atividade

17

larvicida e de repelência do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum, conhecida

popularmente por breu branco frente ao mosquito Ae. aegypti.

18

1.1 REFERENCIAL TEÓRICO

1.1.1 Plantas Medicinais e Óleos Essenciais

Os produtos do metabolismo vegetal que são sintetizados e degradados por

várias reações anabólicas e catabólicas estão divididos em dois grandes grupos: o

dos metabólitos primários, oriundos dos processos fotossintéticos que incluem

carboidratos, óleos, gorduras e proteínas, que estão envolvidas nas reações

bioquímicas comuns para todas as plantas e dos metabólitos secundários que

apresentam estruturas complexas, baixo peso molecular e marcantes atividades

biológicas (VON POSER, 2004).

Alguns autores acreditam que a sobrevivência de uma determinada espécie

não está assegurada unicamente pelo fato dela garantir sua reprodução e defende-

se de predadores, mas a qualquer intempérie que haja sobre sua sobrevivência. Os

metabolitos secundários são substâncias químicas que tem por função atuar como

mecanismos de defesa contra ataque de predadores e as eventuais mudanças

ambientais que estão presentes nos vegetais em concentrações distintas e variam

de acordo com a parte da planta (DEWICK, 2009; CARVALHO, 2004; GARCEZ et

al., 2013).

A presença de metabólitos secundários nas plantas também varia de acordo

com o local e exposição que esta sofre por diversos fatores ambientais externos e

internos. A estes constituintes são referidas ações farmacológicas seja isoladamente

ou em conjunto com outros compostos o que chamamos de fitocomplexo

(CAPASSO; GRAHDOLINI; MASCOLO, 2000).

Em relação às interferências externas, a temperatura e a luminosidade

apresentam um papel relevante na fotossíntese, pois a interação destes fatores

garante um ambiente ideal para o processo fisiológico. Porém, quando em excesso

a essas variações ocorrem alterações na produção de metabólitos secundários.

Entretanto, algumas espécies se adaptam ao seu habitat natural e são capazes de

resistir a essas mudanças de temperatura. Observa-se esse fenômeno quando

plantas produtoras de óleo essencial em períodos em que a temperatura elevada

provoca a perda excessiva dessas substâncias voláteis, mesmo que esta espécie

vegetal seja de clima semiárido (SOUZA et al., 2008).

19

A prática de uso dos produtos naturais, particularmente da flora com fins

medicinais teve, inicio praticamente com a humanidade. Os vestígios do uso de

plantas medicinais foram encontrados nas civilizações mais antigas considerando-se

uma das práticas mais remota que o homem utilizava para cura, prevenção e

tratamento de doenças servindo como importante fonte de compostos

biologicamente ativos (ANDRADE; CARDOSO; BASTOS, 2007).

O uso de plantas para fins curativos é favorecido devido a pouca quantidade

de espécies que demonstram toxicidade e a fácil obtenção e aceitação pela

população, somado à eficácia de seus constituintes comprovados em estudos

experimentais, e a viabilidade econômica de se produzir a partir de produtos

oriundos de origem vegetal. Aumentando o interesse em desenvolver pesquisas

para comprovação e efetivação de suas respectivas atividades biológicas (VIEGAS

JÚNIOR, 2003).

A fitoterapia baseia-se na cura de doenças através das plantas ou partes

destas. Dentre as diversas formas utilizadas com as plantas o uso dos óleos

essenciais é uma das práticas mais comuns pelos adéquo desta terapia. Os óleos

essenciais são constituídos de diversas substâncias voláteis encontradas em

minúsculas glândulas nos mais diversos locais da planta tais como: partes externas

e centrais das raízes, caule, folhas, flores ou frutos (PRICE, 1999).

Mesmo utilizando o termo “óleo”, não são obrigatoriamente gordurosos e

diferenciam-se dos óleos fixos por serem altamente voláteis. Os óleos essenciais

são substâncias orgânicas com aromas fortes ou perfumadas, frequentemente a sua

consistência é aquosa e límpida pode se firmar em temperaturas menores. São

solúveis em álcool, éter e em alguns compostos graxos, podendo ser incolores ou

demonstrar alguns tons claros ou inclusive fortes e opacos. Os óleos essenciais são

chamados de voláteis porque quando, expostos ao ar em temperaturas ambiente

evaporam, podem ser chamados nas mais diversas formas refringentes ou etéreos,

porém o termo mais empregado é o de óleo essencial, pois o mesmo representa as

essenciais ou os compostos odoríferos das plantas (ANDREI; COMUNE, 2005).

Os óleos essenciais são compostos de elementos orgânicos tais como:

carbono, oxigênio e hidrogênio, produzindo então moléculas de alcoóis, aldeídos,

ésteres, óxidos, cetonas, fenóis, hidrocarbonetos, ácidos orgânicos, compostos

orgânicos nitrogenados e sulforados e terpenos. Demonstram composição

complexa, com exceção do sândalo, que contém 95% do mesmo componente

20

(santalol) e os outros 5% de composição diversa. A relevante importância econômica

e ecológica é relacionada aos terpenos, que são incolores, amarelados (se

associados aos carotenóides) ou esverdeados (se associados às clorofilas)

(ANDREI; COMUNE, 2005).

As principais atividades relatadas a óleos essenciais são atividade

antimicrobiana, anti-inflamatória, antioxidante, anticolinesterásica, antiparasitária,

analgésica, sedativa, antitumoral, entre outras (PURNHAGEN, 2010). Nos últimos

anos as pesquisas envolvendo substâncias com potencial ação repelente e

inseticida estão voltadas a espécies que produzem óleos essenciais que, devido à

sua volatilidade e baixa persistência se, degradam rapidamente no meio ambiente,

além de serem capazes de agir nas funções fisiológicas e bioquímicas dos insetos

(ARIDOGAN et al., 2002; ISMAN, 2000; SANTOS et al., 2010; COITINHO et al.,

2011).

1.1.2 Considerações Sobre a Família Burseraceae e Descrição Botânica

Segundo um estudo realizado por Maia et al., (1998), as famílias mais

predominantes na produção de óleos essenciais na Amazônia são: Annonaceae,

Aristolochiacea, Asteraceae, Bignoniaceae, Burseraceae, Caesalpiniaceae,

Cyperaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Gramineae, Lamiaceae, Lauraceae,

Mimosaceae, Monimiaceae, Myristicaceae, Myrtaceae, Phytolaceae, Piperaceae,

Rutaceae, Scrophulariaceae, Verbeneceae, e a família da Zingibaraceae.

A Burseraceae é uma família de plantas angiospérmicas distribuídas entre

20 gêneros com mais de 800 espécies. Espécies, tendo uma característica marcante

à resina aromática e estando presente na maior parte das espécies. Sua distribuição

ocorre em qualquer um dos trópicos, mas apresenta uma vasta riqueza na América

do Sul. Espécies de Burseraceae são endêmicas na região amazônica sendo,

relatado no Brasil sete gêneros: Bursera, Commiphora, Crepidospermum,

Dacryodes, Protium, Tetragastris eTrattinnickia (DALY, 1987; ANDRADE; HIGUCHI,

2009; RÜDIGER et. al., 2007; MARQUES et al., 2010).

As espécies desta família podem alcançar até 25 metros de altura,

apresentam tronco espesso de 50 a 60 cm de diâmetro na sua base a, casca da

21

árvore com coloração vermelho-escura, o caule possui ductos verticais

esquizógenos proeminentes, apresenta folhas opostas, com flores miúdas em

panículas terminais, suas flores são avermelhadas dispostas em inflorescências

fasciculadas axilares, actinomorfas, diclamídeas com corola dialipétala e ovário

súpero, seus frutos do tipo cápsula são coriáceos e deiscentes e possuem pericarpo

avermelhado quando maduro, e os frutos são drupas avermelhadas possuindo

quatro sementes (CARLQUIST, 1992; MATOS, 1997).

As espécies da família Burseraceae são atrativas para comercialização e

exploração sustentável da região amazônica através de manejo florestal e, são

bastante exploradas economicamente como fonte de matéria prima para perfumes

devido à produção de uma seiva oleosa rica em óleo essencial e triterpenos

(LANGENHEIM, 2003). Muitos ribeirinhos e indígenas utilizam o P. heptaphyllum o

breu branco como é conhecido popularmente, para calafetar canoas e embarcações

aumentando a resistência das madeiras de baixa densidade ao ataque de

organismos xilófagos e decompositores (LORENZI, 1998).

1.1.3 Gênero Protium

A floresta Amazônica apresenta uma grande diversidade de espécies vegetais

das quais muitas nem foram descobertas. O gênero Protium é encontrado em

abundância nesta região com 73 plantas, sendo 42 endêmicas, representando uma

concentração mais de 60% de todas as espécies (FINE et al., 2005).

O gênero mais estudado da família Burseraceae é o Protium encontrado,

extensamente na floresta amazônica com, 146 espécies. As espécies que

constituem o gênero de ocorrência no Brasil são Tetragastris panamesis, P. nitidum,

Trattinickia rhoifolia e P. subsserratum (BATISTA, CARVALHO, 2006). Na medicina

popular, é empregado como repelentes de insetos, expectorantes e no tratamento

de distintas patologias, tendo comprovações para atividade anti-inflamatória,

antinociceptiva, imunoestimulante e antineoplásica (MIRANDA et al., 2000; FINE et

al., 2005; MELO et al., 2007).

O gênero Protium produz uma resina de alto valor comercial e uso extensivo

pela população em geral. Ela é secretada de maneira natural ou por lesões feitas no

tronco das árvores e em determinados casos é, possível encontrar pequenas

22

quantidades de resina aderida ao tronco. Conforme a resina entra em contato com o

ar inicia-se o processo de endurecimento formando pelotas que se desprendem com

relativa facilidade por vezes se acumulando no solo e em volta do tronco

(PLOWDEN, 2001).

Quanto aos gêneros da família o Bursera apresenta forte potencial

farmacológico, entre as espécies estudadas com atividades comprovadas estão B.

Graveolens com ação antimicrobiana e anti-inflamatória (ROBLES et al., 2005). O

extrato etanólico de B. odorata, que inibiu linhagens celulares HCT-116 (células do

câncer do colo retal humano) (MURILLO-ÁLVAREZ et al., 2001). Já o B. tokinensis

apresentou atividade citotóxica contra as linhas celulares de KB (carcinoma humano

oral), (câncer do colón humano) e LNCAP (câncer de próstata humano)

(JUTIVIBOONSUK et al., 2005).

No estudo realizado por Vitor et al.,(2009), com a resina de P. Kleinii, foram

isolados dois terpenos: α e -amirina ainda no mesmo trabalho foi demonstrado a

atividade anti-inflamatória da espécie através de modelo de colite ulcerativa

suprimindo a interleucina1 e a COX-2 ocorrendo o aumento de interleucina 10. P.

kleinii, destaca-se a atividade antinociceptiva do triterpeno isolado breína (OTUKI et

al., 2001). Há ainda a espécie P. bahianum, onde a resina envelhecida demonstrou

atividade repelente (PONTES et al., 2007)

1.1.4 Considerações Botânicas e Químicas de Protium heptaphyllum

A espécie P. heptaphyllum é conhecido popularmente como almecegueira,

breu-branco-verdadeiro, almecegueira cheirosa, goma limão, almécega do Brasil,

breu, incenso, breu branco verdadeiro, pau de breu, árvore de incenso, ibiracica

entre outras denominações, Ocorre em todo Brasil sendo largamente encontrada na

região amazônica. A resina é constituída por substâncias terpênicas, sendo o óleo

essencial rico em monoterpenóides (VIEIRA JÚNIOR; SOUZA; CHAVES, 2005;

VIEIRA JÚNIOR et al., 2007). Alguns constituintes químicos relatados para P.

heptaphyllum estão descridos no Quadro 1 com suas respectivas estruturas

químicas.

23

Quadro 1- Composição química de P. heptaphyllum

Substância Referência

(p-ment-3-eno-1, 2,8-triol)

Bandeira et al., 2002

α-amirina

Vieira Júnior; Souza; Chaves, 2005.; Vieira Júnior et al., 2007.

Leupenona

Vieira Júnior; Souza; Chaves, 2005.;

Continua

24

Breina

Vieira Júnior et al., (2005)

-amirenonda

Vieira Júnior et al.,(2005)

Maniladiol

Vieira Júnior et al.,(2005)

Conclusão

Entre as atividades farmacológicas descritas na literatura de P. heptaphyllum

estão, à atividade ansiolítica e antidepressiva (ARAGÃO et al., 2006);

hepatoproteção (OLIVEIRA et al., 2005); gastroprotetora (ARAUJO et al., 2011);

antidermatofitica (HOUËL et al., 2015) e citostática contra células tumorais (TAYLOR

et al., 2013).

25

1.1.5 Mosquito do Gênero Aedes

O Ae. aegypti é proveniente da África ocorrendo sua inserção nas Américas

durante o período da colonização é prevalente em áreas tropicais e subtropicais

(BRAGA; VALLE, 2007). O mosquito Ae. aegypti pertence à família Culicidae, filo

Arthropoda, classe Hexapoda e ordem Díptera, e destaca-se como vetor de doenças

como: dengue, zika, chikungunya e febre amarela. O gênero Aedes só foi descrito

em 1818 logo verificou-se que a espécie Ae.aegypti descrita anos antes apresenta,

características morfológicas e biológicas semelhantes às de espécies do gênero

Aedes não às do já conhecido gênero Culex então foi estabelecido o nome Ae

aegypti (BRASIL, 2001).

O desenvolvimento urbano associado à falta de controle sanitário e coleta de

lixo inadequado favoreceu, a proliferação deste mosquito hematófago através de

criadouros naturais e domiciliares. Mais presentes em áreas urbanas e regiões com

alta densidade populacional, onde as fêmeas do mosquito possuem maior

disponibilidade de alimentos e locais para desova. Outro fator que favorece a

presença destes insetos é o clima a elevação da temperatura propicia a eclosão de

ovos até alcançar a fase adulta do mosquito Ae. aegypti (BARRET et. al., 2006).

Outro fator que também atrai o mosquito Ae. aegypti é o suor humano, o qual

apresenta um cheiro forte produzindo e liberando substâncias atrativas aos

mosquitos, e dependendo da raça se torna mais concentrado e atrativo para várias

espécies de mosquitos. Entre essas substâncias duas merecem uma atenção

especial: o acido lático e dióxido de carbono (CO2), que em diferentes quantidades

no organismo atraem mosquitos hematófagos (MUKANANA et al., 2004). Na pele

humana o ácido láctico é o produto final da glicólise durante o metabolismo

anaeróbico das células mioepiteliais das glândulas sudoríparas ecrinas, que estão

presentes em todo o corpo em grande quantidade e desempenham um papel

importante na termorregulação (TORRES-ESTRADA; RODRIGUEZ, 2003).

O sucesso das fêmeas em realizar o repasto sanguíneo depende da

localização do hospedeiro. Sendo assim, estímulos internos e externos combinados

desencadeiam alguns eventos com a finalidade de facilitar o seu encontro com os

mosquitos. Os mosquitos fêmeas sugam sangue para produzir ovos. Se o mosquito

da dengue estiver infectivo poderá transmitir o vírus da dengue neste processo. Em

geral, os mosquitos sugam uma só pessoa a cada lote de ovos, entretanto o

26

mosquito Ae. aegypti tem uma peculiaridade que se chama “discordância

gonotrófica” que significa capacidade de picar mais de uma pessoa para um mesmo

lote de ovos que se produz (TORRES-ESTRADA; RODRIGUEZ, 2003).

Nas condições adequadas após, a alimentação da fêmea ocorre a postura

dos ovos, que inicialmente apresentam uma coloração branca e com o passar do

tempo adquirem uma cor negra devido ao contato com o oxigênio e, medem

aproximadamente 0,4mm de comprimento. Os ovos apresentam uma resistência ao

ressecamento e com isso permanecem no ambiente por até 450 dias o que constitue

uma grande vantagem, pois sobrevivem por vários meses em ambientes secos se

tornando viáveis e propícios a eclosão após um período chuvoso (BRASIL, 2012).

A fase de larva do Ae. aegypti é o período onde ocorre a alimentação e

crescimento do mosquito. Sendo dividido em quatro fases estágios: L1, L2, L3 e o L4

que pode perdurar por várias semanas antes de se transformar em pupa. Quando a

quantidade de larvas existentes é proporcional à disponibilidade de alimento e água

no criadouro o seu desenvolvimento é rápido para a fase adulta. Se o espaço e a

alimentação forem insuficientes ocorre uma competição entre as larvas criando um

obstáculo ao amadurecimento do inseto para a fase adulta (BRASIL, 2001).

Figura 1 – Ciclo de desenvolvimento do mosquito Ae. aegypti

Fonte: (BRASIL, 2015)

27

Enquanto que na fase de larva ocorre à alimentação e crescimento, na fase

de pupa não há alimentação. Há apenas a transformação para o inseto adulto esta

fase do ciclo tem a duração de dois a três dias. Geralmente mantêm-se inativas

flutuantes um par de tubos respiratórios ou "trompetas" garante a sua respiração

(BRASIL, 2001).

O mosquito na fase adulta apresenta-se com faixas brancas nas bases dos

segmentos tarsais e um desenho em forma de lira no mesonoto, o mosquito adulto

procura pousar sobre superfícies verticais, após ele emergir da fase de pupa

permanece durante várias horas para amadurecimento do exoesqueleto das asas e

no caso dos machos a rotação da genitália em 180° (BRASIL, 2001).

O acasalamento ocorre após poucos dias da fase adulta geralmente, durante

o vôo e, uma única cópula é suficiente para que a produção de ovos da fêmea

perdure durante toda a sua vida já que estes ficam armazenadas na espermateca

(BRASIL, 2001).

Após a cópula as fêmeas alimentam-se de sangue necessário para o

desenvolvimento dos ovos e sua maturação podendo ocorrer, mais de um repasto

quando este não for o suficiente para atender as demandas nutricionais (BRASIL,

2001).

1.1.6 Doenças Transmitidas por Mosquito Hematófago: Aedes aegypti

Os mosquitos são insetos pequenos hematófagos disseminados

mundialmente e causam muita preocupação para as autoridades sanitárias por

serem vetores de doenças infecciosas que causam milhares de mortes em todo o

mundo. Todos os anos o Ae. aegypti vem acometendo crianças e idosos de forma

mais agressiva, principalmente em países em desenvolvimento. Com mais de 3000

espécies de mosquitos quatro gêneros são transmissores de doenças em humanos:

Culex, Anopheles e Mansonia e o Ae. aegypti (BRASIL, 2013; MISNI; NOR; AHMAD,

2017).

O principal vetor da dengue no Brasil e nas Américas são as fêmeas do

mosquito Ae. aegypti. O agente causador é um arbovírus do gênero Flavivírus,

família Flaviviridae e apresenta quatro sorotipos: DEN-1, DEN-2, DEN-3, e DEN-4.

Todos os sorotipos podem levar a quadros graves da doença. A fêmea do mosquito

28

tem atividade diurna e a transmissão da doença ocorre após o repasto sanguíneo

em um hospedeiro contaminado pelo arbovírus. O período de transmissibilidade da

doença ocorre tanto no mosquito quanto no homem através de dois ciclos: período

de incubação extrínseco e período de incubação intrínseco que dura de 3 a 15 dias

(BRASIL, 2008).

A dengue manifesta-se clinicamente através de sinais e sintomas

inespecíficos: febre súbita que pode durar de dois a sete dias, dor de cabeça frontal

e retro-orbital, dores no corpo, mialgia, náusea e vômito, fraqueza e erupção

cutânea, alguns pacientes ainda apresentam anorexia, alteração da sensação de

gosto e dor de garganta (RIBEIRO et al., 2006; OMS, 2010; BRASIL, 2013).

O Zika é um vírus de RNA e fita simples transmitido pelo mosquito Ae. aegypti

que, causa uma doença febril aguda leve semelhante à dengue. A transmissão

normalmente ocorre durante o repasto do mosquito, mas há evidencias de

transmissão do vírus por via congênita. O diagnóstico diferencial é feito

principalmente para dengue e chikungunya, após o descarte das mesmas é incluído

um teste para zika. Muitas pessoas infectadas com o ZIKV não manifestam sintomas

ou apresentam uma forma branda da doença, seus sintomas mais comuns são:

febre, exantemas, artralgias, conjuntivite, mialgia e dor cefaléias com duração

máxima de uma semana. Em geral os sintomas não incomodam o suficiente para se

buscar atendimento médico (OLIVEIRA MELO et al., 2016).

A infecção pelo vírus Zika na gravidez vem provocando danos a saúde e

desenvolvimento do bebê tais como: aumento dos casos de microcefalia congênita e

outras complicações neurológicas. O vírus da Zika tem atração pelo sistema

nervoso e já se sabe que se multiplica no cérebro do feto quando atravessam à via

placentária, as lesões neurológicas que ocorrem ainda estão sendo investigadas

para identificar o mecanismo de ação do vírus (SCHULER-FACCINI, 2015).

A chikungunya é uma doença causada pelo vírus membro da família

Togaviridae, gênero Alphavirus. A doença causada pelo CHIKV conhecida como

febre chikungunya é caracterizada clinicamente por: febre, cefaléia, mialgias,

exantema e artralgia. Em algumas pessoas a sintomatologia pode persistir por

meses ou anos e às vezes evolui para artropatia crônica incapacitante. O impacto da

infecção pelo CHIKV na gravidez vem sendo amplamente estudado com evidências

de alto risco para abortamento no primeiro trimestre e transmissão materno fetal no

último trimestre (GÉRARDIN et al., 2008).

29

O vírus da febre amarela pertence ao gênero Flavivírus da família Flaviviridae

(do latim flavus = amarelo), ele pertence ao mesmo gênero e família de outros vírus

responsáveis por doença ao ser humano entre as quais a dengue. A febre amarela é

uma doença infecciosa aguda, febril, não contagiosa de curta duração (no máximo

de 12 dias) e de gravidade variável. As manifestações clínicas podem ser

representadas pelas fases evolutivas da doença e à forma mais grave pode levar à

morte por insuficiência hepática e renal (LOPES, 2009).

A febre amarela é transmitida ao homem pela picada do mosquito fêmea

infectada possui caráter sazonal sendo mais frequente entre os meses de janeiro e

abril, quando fatores ambientais propiciam o aumento da densidade vetorial.

Atualmente são reconhecidos dois ciclos básicos de circulação do vírus da febre

amarela: um urbano simples do tipo homem-mosquito-homem em que o Ae. aegypti

é o principal vetor. E outro ciclo é o silvestre envolvendo diferentes espécies de

mosquitos (TAUIL, 2010).

Atualmente medidas estão sendo empregadas para o controle e erradicação

das doenças transmitidas pelo mosquito Ae. aegypti, através de incentivos a

pesquisas para produção de vacinas e novos produtos capazes de agir nas funções

fisiológicas e bioquímicas deste vetor (BRASIL, 2009).

1.1.7 Atividade Larvicida e de Repelência

Para a realização do controle do mosquito Ae. aegypti, estão sendo

realizadas intervenções nas áreas: de saneamento do meio ambiente, atividades de

educação que visam à diminuição dos criadouros que são fontes potenciais de

disseminação deste mosquito e o seu combate direto por meio de agentes químicos,

físicos e biológicos (TEIXEIRA et al., 2002).

Vários métodos estão sendo utilizados no combate do Ae. aegypti, tem sido

utilizado a aplicação de substâncias químicas para o controle de mosquitos vetores

de doenças. Para as formas imaturas são utilizados os larvicidas para larvas e

ovicida para ovos, e inseticidas para os mosquitos na fase adulta (FORATTINI,

2002). As estratégias utilizadas para o controle do Ae. aegypti no Brasil são

30

principalmente os inseticidas químicos onde se destacam os organofosforados e

piretróides (LUNA et al., 2004).

Para a fase larval utiliza-se outra forma de atuação como medida preventiva a

ação contra larvas geralmente ocorre através de contato ou ingestão da substância

tóxica. A ação de contato ocorre quando a substância é liberada no meio ambiente e

atinge a superfície corpórea das larvas ou suas vias respiratórias causando a morte

(KATHRINA; ANTONIO, 2004; MENEZES, 2005).

Quando atuam por ingestão a penetração da substância por via oral vai

danificar o sistema digestório e a biossíntese de hormônios da ecdise ou a formação

da camada de quitina da cutícula do inseto provocando uma diminuição do

peristaltismo (movimentos intestinais). Resultando numa acentuada perda de apetite

o que pode resultar na morte do inseto por inanição (KATHRINA; ANTONIO, 2004;

MENEZES, 2005).

Essas medidas de contenção do vetor são vantajosas e promissoras visto que

o desenvolvimento até a forma adulta pode levar até 10 dias para completar-se, por

isso a eliminação deste estádio de vida do mosquito é fundamental (BRASIL, 2009).

Os repelentes são substâncias químicas que efetuam sobre os mosquitos

adultos uma ação de inibir o comportamento de busca pelo hospedeiro. Os

repelentes sintéticos como o N, N-dietil-3-metilbenzamida (DEET), utilizados

principalmente em áreas endêmicas de forma extensiva para proteção contra

picadas de mosquitos. Apresentam como desvantagem reações cutâneas como:

alergia, sensibilidade, toxicidade etc. A resistência aos mosquitos se dá ao fato

destes deixarem resíduos no meio ambiente (CHOU et al., 1997; NENTWIG, 2003;

CANEPPELE et al., 2010; RIBAS; CARREÑO, 2010).

Entretanto, assim como ocorre com os repelentes sintéticos os larvicidas

comercializados deixam resíduos no meio ambiente causando danos e degradação

ambiental. O controle químico do vetor ainda é uma das formas mais utilizadas

principalmente por meio de aplicações de inseticidas organofosforados e piretróides

(BRASIL, 2009). Porém, o uso frequente e descontrolado desses produtos têm

evidenciado o aparecimento de populações resistentes de mosquitos causando

danos ambientais provocados por seu uso intensivo (LUNA et al., 2004;

CARVALHO; SILVA, 2000; POLANCZYK et al., 2003).

O fumacê que vem sendo utilizado no combate aos mosquitos do Ae. aegypti,

causa muitos malefícios a saúde humana. Pois, o mesmo tem em sua composição

31

Malathion considerado pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC)

como potencialmente cancerígeno para os seres humanos (VALLE, PIMENTA,

CUNHA, 2015).

Nesse contexto a procura por alternativas seguras ao controle dos vetores é

de extrema importância para a saúde pública. Com a descoberta de novas

substâncias que sejam efetivas na prevenção de pragas e ofereçam segurança e

viabilidade econômica aplicáveis aos programas integrados de controle de insetos

para eliminação de doenças provocadas por estes além de possuir baixo impacto

ambiental (VIEGAS JÚNIOR, 2003).

32

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Extrair e caracterizar quimicamente o óleo essencial da resina de P.

heptaphyllum e avaliar sua atividade larvicida e de repelência frente ao Ae. aegypti.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Realizar a extração e caracterização química do óleo essencial da resina de P.

heptaphyllum;

- Avaliar a ação larvicida do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum frente

às larvas do Ae. aegypti;

-Avaliar a ação repelente do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum frente

ao mosquito do Ae. aegypti.

33

6 METODOLOGIA

6.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL

Os materiais vegetais, resina e exsicatas, foram coletados de espécimes de P.

heptaphyllum, no mês de outubro de 2016, em uma área urbana preservada

denominada de Sitioca São Benedito localizada a rua Manoel Francisco de Souza

n0414, Bairro de São Lázaro, município de Macapá, estado do Amapá – Brasil, com

coordenadas Latitude 0°4’1”N e Longitude 51°3’10’’W. (Figura 2). A resina foi

utilizada para a obtenção do óleo essencial e a exsicata coletada e preparada foi

encaminhada ao Herbário Amapaense HAMAB do Instituto de Pesquisas Científicas

e Tecnológicas do Estado do Amapá -IEPA, a qual foi utilizada para identificação por

técnicos botânicos, através de análise morfológica e por comparação com exsicatas

já depositadas no herbário, obtendo a numeração 019059 e para compor a coleção

botânica daquele herbário.

Figura 2 – Mapa georeferenciado do local da coleta do material vegetal (resina e

exsicata) da espécie P. heptaphyllum, localizado no município de Macapá, Amapá, Brasil.

34

Sistema de Coordenadas Geográficas: SIRGAS 2000

Fonte: IEPA, IMAP e IBGE 2017 Elaborador: Rosiney Ferreira

A coleta do material vegetal (resina) foi realizada nas primeiras horas da

manhã, pois neste período se encontra uma maior concentração de óleo essencial e

diminui a perda do mesmo (BLANK et al., 2005). Posteriormente o material vegetal

foi encaminhado ao Laboratório de Absorção Atômica e Bioprospecção da

Universidade Federal do Amapá (UNIFAP), onde se realizou a trituração, seguida à

extração do óleo essencial.

6.2 EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL E DETERMINAÇÃO DO PERCENTUAL DE

RENDIMENTO

A resina coletada foi lavada em água corrente para remoção da sujeira, e

posteriormente triturada através de ficção em grau de porcelana até obtenção de

partículas pequenas. Uma amostra de 100g do material triturado foi pesada em

balança de precisão e submetida extração do óleo essencial através da técnica

tradicional de arraste a vapor em aparelho de Clevenger, prosseguindo da seguinte

forma:

A biomassa da resina seca e triturado, 100 g foi inserida num erlemayer de

1000 mL, adicionada 700 mL de água destilada até completar imersão da biomassa

de resina. Em seguida, foi adaptado ao erlemayer um extrator de Clevenger e levado

a aquecimento em uma chapa aquecedora.

Antes do início da operação de destilação, o extrator foi aferido com água

destilada, através do tubo de retorno, com objetivo de manter o sistema operando

dentro de equilíbrio hidrodinâmico. Ao condensador, foi conectado o sistema de

refrigeração e colocada à tampa do tubo de retorno. Em seguida, foi ligada a chapa

aquecedora, regulada à temperatura de ebulição da água, em mistura com a

biomassa, dando início ao processo de extração de óleo essencial.

Quando a mistura de água e biomassa da resina entrou em ebulição os

vapores de água e os voláteis foram conduzidos em direção ao condensador onde

foi realizada a troca de calor condensando os vapores com a água de refrigeração

35

em operação denominada de destilação. Nessa etapa, pôde-se observar no tubo

separador do extrator as formas líquidas do óleo essencial sobrenadando a água.

Transcorrido três horas de extração a leitura do volume de óleo essencial

extraído foi determinada diretamente na escala volumétrica do tubo separador.

Para o cálculo do rendimento de extração de óleo essencial o processo foi

repetido por cinco vezes, conforme descrito por Santos et al., (1998):

a) Pesaram-se cinco alíquotas de 100g da resina de P. heptaphyllum;

b) Procedeu-se a extração pela técnica de arraste de vapor, conforme descrito

acima, por um período de 3h para cada amostra;

c) Determinou-se o volume do óleo essencial extraído diretamente na escala do

tubo separador do aparelho de Clevenger;

d) Posteriormente removeu o óleo essencial sobrenadante com o auxílio de uma

pipeta de Pasteur, transferindo para um recipiente hermeticamente fechado e

acondicionou em refrigerado a 5°C, protegendo-o da luz.

Para determinação do teor de rendimento utilizou-se a seguinte equação, usando o

volume do óleo como a média do volume obtido nas cinco extrações:

TO = Vo x 100 x Bm-1

Onde:

TO = teor de óleo essencial em porcentagem (mL de óleo essencial em 100 g de

biomassa úmida);

Vo = volume de óleo essencial lido diretamente na escala do tubo separador;

Bm = biomassa vegetal (resina);

100 = fator de conversão para porcentagem

6.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE Protium

heptaphyllum

O óleo essencial obtido a partir da resina de P. heptaphyllum foi analisado no

Laboratório Multiusuário de Produtos Naturais da Universidade Federal da Paraíba

em Cromatógrafo Gasoso acoplada a Espectrômetro de Massas da Shimadzu,

36

modelo CGMS-QP2010 Ultra, equipado com uma coluna capilar RTX-5MS (30 mm x

0,25 mm, espessura de película 0,25 μm), tendo como fase estacionaria o 5% difenil

-95% dimetil-polissiloxano. A temperatura do forno foi programada de 60-250 ºC a

uma taxa de aquecimento de 3ºC/min. A fonte de íons foi ajustada a 200°C e a

ionização eletrônica a 0,84 kV. Usou-se como gás transportador o hélio, a uma taxa

de fluxo de 1,0 mL/min e pressão de entrada de 57,0KPa.

Uma amostra do óleo essencial foi diluído em hexano e 10µL desta foi

injetado no GC/MS. As concentrações relativas (%) correspondentes aos

componentes do óleo essencial foram calculadas utilizando o software da Shimadzu.

A identificação dos picos foi realizada por comparação dos índices de retenção

calculados a partir de uma série n-alcanos (C9 a C17) e pelo padrão de

fragmentação do espectro de massas e comparados com dados da biblioteca do

equipamento.

6.4 ENSAIOS BIOLÓGICOS

6.4.1 Obtenção das Larvas do Aedes aegypti

As larvas de Ae. aegypti foram obtidas no Laboratório de Arthropoda

(ARTHROLAB) da Universidade do Federal do Amapá, de uma colônia da cepa

Rockfeller e para geração de larvas, todas em estádio L3 para que não atingissem o

estádio de pupa durante os experimentos. Foram mantidas em condição climáticas

padronizadas em uma sala medindo 12 m2 (3m x 4m), com temperatura e umidade

controladas (26°C a 28°C e uma 80 % respectivamente) fotoperíodo de 12 horas

como preconiza a OMS.

6.4.2 Avaliação da Atividade Larvicida Frente ao Aedes aegypti

Para realização da atividade larvicida foi preparada uma solução mãe a 1000

partes por milhão (ppm), utilizando 1 mL (0,9 g) do óleo essencial da resina de P.

heptaphyllum, solubilizado em 4 mL de DMSO e completado o volume com água

destilada para 1000 mL de solução. A partir desta foram preparadas soluções de

óleo essencial nas concentrações de 20, 40, 80, 100 e 160 ppm. Os bioensaios

37

foram realizados em quintuplicata, em becker de vidro com capacidade de 100 mL,

ao qual adicionou-se inicialmente 80 mL de água destilada, seguida da adição da

solução mãe do óleo essencial, na quantidade correspondente a concentração a ser

testada e homogeneizada a mistura. Posteriormente foram adicionadas as larvas de

Ae. aegypti completando-se o volume para 100 mL de solução. Foram preparados

dois grupos controles negativos um com os veículos água destilada e o DMSO, na

proporção usada para dissolução do óleo essencial e o outro usando somente água

destilada.

Foram utilizadas 10 larvas por grupos testes, sendo a leitura da mortalidade

realizada nos períodos de 1, 2, 4,8, 24 e 48 horas após as larvas serem expostas às

soluções. As larvas foram consideradas mortas quando observadas ausência total

de movimentos voluntário ou por estimulação exaustiva externa do recipiente com

pipetas Pasteur.

Para obter o índice de mortalidade para cada tratamento, calculado através

da formula:

Índice de mortalidade = No. de larvas mortas

No. de larvas expostas

6.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE REPELENTE FRENTE AO MOSQUITO Aedes

aegypti

Por tratar-se de pesquisas envolvendo tanto seres humanos como animais o

projeto foi submetido à plataforma Brasil obtendo-se o número do CAAE

62616416.0.0000.0003. Para utilização das codornas o projeto foi submetido à

Comissão de Ética de Uso de Animais (CEUA), da Universidade Federal do Amapá

com protocolo no. 011/2017 emitido em 26 de abril de 2017 com o parecer de

Isenção.

Os mosquitos utilizados no ensaio de repelência foram fêmeas de Ae. aegypti

adultas com idade variando entre 4 a 15 dias obtidas do insetário do Laboratório de

Arthropoda da Universidade Federal do Amapá, composto de dois cômodos um para

manutenção de imaturos e outro de adultos todos climatizados com temperatura

variando entre 26°C a 28ºC e a umidade relativa do ar entre 70 a 80%, com uma

38

fotofase de 12 horas (claro/escuro). Os mosquitos utilizados nos experimentos foram

todos saudáveis, não havendo nenhum risco de transmissão de doenças.

A dieta dos indivíduos adultos foi constituída de solução açucarada a 10%

(machos e fêmeas) e sangue de Coturnix coturnix (codornas) para realização da

postura.

Para a criação da colônia foi utilizada Cubas plásticas contendo meio litro de

água e adicionado os ovos do Ae. aegypti. As larvas foram alimentadas a cada três

dias com ração industrializada para gatos. Foram realizados todos os dias a

manutenção da colônia após a eclosão das larvas fazendo a retirada das pupas e

inserindo-as em uma gaiola.

Para o desenvolvimento do ensaio foi utilizado o protocolo padrão de

avaliação de repelentes em humanos recomendado pela Organização Mundial da

Saúde (OMS, 2009).

A partir da solução mãe a 1000 ppm do óleo essencial da resina de P.

heptaphyllum foram obtidos mais duas soluções: 500 e 250 ppm, sendo utilizadas no

ensaio de repelência as concentrações: 250, 500 e 1000 ppm.

Para participação do experimento foram selecionados 20 voluntários com

idades entre 18 e 45 anos sem antecedentes de reações alérgicas a picada de

mosquitos e sem enfermidades dermatológicas aparentes. Foram excluídos da

pesquisa os participantes com reações alérgicas a picadas de mosquitos e

enfermidades dermatológicas. Todos os voluntários que participaram foram

informados sobre os objetivos da pesquisa, a metodologia e os possíveis efeitos

adversos dos produtos antes de assinar o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido (TCLE).

Antes da realização dos bioensaios de repelência foi solicitado a cada

participante a abstinência de produtos hidratantes no corpo por 12 horas antes do

ensaio. No dia do experimento cada participante procedeu com lavagem dos

antebraços e mãos com água e sabão neutro. Posteriormente, os antebraços foram

higienizados com álcool 70% e deixando secar completamente. No momento do

ensaio as mãos foram protegidas por luvas de látex e o antebraço foi protegido com

plástico filme para evitar o contato com os mosquitos. Uma área de 3cmX10cm foi

marcada no antebraço direito de cada voluntário, região esta destinada à aplicação

de até 1 mL de cada produto em estudo, incluindo os controles negativos (veículos)

39

e positivo, neste caso foi usado um repelente comercial a base DEET (Diethyl

Toluamide).

O bioensaio foi realizado no intervalo das 09:00 ás 13:00h, em uma sala com

temperatura de 26°C à 28ºC e umidade relativa de 70% à 80 %. Para a realização

do experimento 50 mosquitos fêmeas foram acondicionados em gaiola de tamanho

40cmX40cmX40cm e mantidos em jejum por 24 horas de antecedência do teste.

Para dar início aos ensaios os produtos testes e controles foram aplicados 30

minutos antes do início da exposição, posteriormente o braço foi introduzido na

gaiola com a presença dos mosquitos deixando a área do antebraço exposta por um

período de 3 minutos sendo contado o número de pousos e permanência do

mosquito que normalmente ocorre em 15 segundos e/ou picadas. Todos os testes

foram realizados em quatroplicata para cada concentração e controles.

Os dados obtidos neste bioensaio foram usados para calcular o tempo

completo de proteção e o percentual de inibição contra picadas conferidas em cada

tratamento.

O tempo completo de proteção, expresso em minutos, para cada teste foi

aquele transcorrido entre o tempo de aplicação da substância na pele do voluntário e

a confirmação da primeira picada e/ou pouso do mosquito por um período de 15

segundos.

O percentual de proteção contra picadas foi determinado através da formula

proposta por Rutledge et al., (1985):

(%) de proteção = Nº de picadas no controle negativo – Nº picadas com óleo X 100 Nº de picadas no controle negativo

6.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

O delineamento experimental utilizado no ensaio larvicida foi inteiramente

casualizado com cinco tratamentos e cinco repetições. Os dados obtidos na

mortalidade foram analisados pelo programa prisma 5.03. em análise Probit foi

possível determinar a Concentração Letal que causa mortalidade de 50% e 90% da

população (CL50 e CL90). A porcentagem de mortalidade foi determinada por média e

desvio padrão e submetidos à análise de variância (ANOVA ONE WAY). A

40

comparação entre médias dos tratamentos foram realizadas pelo teste de Tukey

sendo considerado estatisticamente significante quanto P<0,05, as analises foram

realizadas no programa prisma 5.03.

O desenho amostral do ensaio de repelência foi inteiramente casualizado em

relação ao tipo de concentrações do óleo essencial (250, 500 e 1000 ppm). As

proporções de inibição de picadas determinadas foram transformadas em média e

desvio padrão. A comparação entre médias dos tratamentos foram realizadas pelo

teste de Anova e Tukey, sendo considerado estatisticamente significante quanto

P<0,05, as analises foram realizadas no programa prisma 5.03.

41

7 RESULTADO E DISCUSSÂO

7.1 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE RENDIMENTO DA EXTRAÇÃO DO ÓLEO

ESSENCIAL DA RESINA DE P. heptaphyllum

A tabela abaixo apresenta os valores em mL de óleo essencial extraído da

resina de P. heptaphyllum obtidos pela técnica de arraste de vapor em aparelho de

Clevenger, cujo experimento foi montado para determinação do percentual de

rendimento do mesmo.

Tabela 1 - Rendimento do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum obtido através da técnica de arraste a vapor.

No. de Extração Biomassa da Resina (g) Volume de óleo obtido (mL)

1° 100 3,1 2° 100 3,2 3° 100 3,0 4° 100 3,0 5° 100 3.2

Média de volume (mL) 3,1±0,1

Para realização do cálculo utilizou a média dos volumes de óleo

essencial extraído, ou seja, Vo = 3,1mL, como a biomassa utilizada foi de 100 g,

temos que o Teor de Rendimento (TO) é igual à média do volume obtido, ou seja,

TO = 3,1, isto implica dizer que o TO = 3,1%, ou seja, o percentual de rendimento do

óleo essencial extraído da resina de P. heptaphyllum, nas condições do experimento

utilizado, foi de 3,1%.

O percentual de rendimento do óleo essencial da resina do P. heptaphyllum

obtido neste trabalho, de forma geral, pode ser considerado como um bom

rendimento uma vez que na maioria dos trabalhos descrito na literatura para óleos

essenciais os valores de rendimentos não ultrapassam 2%, porém em se tratando

do óleo essencial da resina do P. heptaphyllum, o resultado obtido está dentro da

média de valores descritos na literatura espécies do gênero Protium (SOUZA SILVA,

2006).

Vários fatores podem interferir no rendimento dos óleos essências entre estes

pode-se citar época do ano que foi realizada a coleta, as partes das plantas que

foram utilizadas, o horário que foi realizada a coleta, tempo de extração,

42

procedimento utilizado, entre outros. Todos esses fatores devem ser observados

pelo pesquisador em prol de um bom rendimento assim como podem está

relacionado diretamente com a qualidade e viabilidade do óleo essencial (BLANK et

al., 2005).

7.2 PERFIL CROMATOGRÁFICO DO ÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE P.

heptaphyllum E PRINCIPAIS CONSTITUINTES

A composição química do óleo essencial de P. heptaphyllum foi analisada e

os seus compostos foram identificados através da técnica de cromatografia gasosa

acoplada a espectrometria de massas. No Quadro 3 são apresentados os principais

constituintes químicos identificados no óleo essencial extraído da resina de P.

heptaphyllum, e seus percentuais de rendimento. O p-cimeno apresentou-se como o

composto majoritário, com um rendimento de 60,59% em comparação aos demais

constituintes do óleo essencial da resina do P. heptaphyllum, corroborando com os

dados encontrados na literatura acerca da composição química da espécie descrita

por SIANE et. al., (2004). Outro dado que chama atenção é que os oito constituintes

majoritários formam mais de 96% do rendimento do óleo essencial.

43

Quadro 3- Apresenta os Principais componentes químicos identificados por CG-

MS do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum, tempo de retenção e % de rendimento.

No. Picos

Tempo de Retenção

% da área do Pico

Nome Químico Estrutura Química

25 8,77 60,59 P-Cimeno

10 5,92 12,99 α-Pineno

26 8,89 10,05 Biciclo-Heptano

35 13,42 3,73 Ciclohexanometanol

20 7,80 3,15 α-Felandreno

CONTINUA

44

Quadro 3 – Apresenta os componentes químicos majoritários identificados na

cromatografia gasosa.

No. Picos

Tempo de Retenção

% da área do Pico

Nome Químico Estrutura Química

23 8,41 1,19 α-Terpineno

16 7,05 1,12 Ciclohexano

18 7,32 0,89 P-Menteno-3

96,43%

Conclusão

45

Figura 3- Espectros de massas dos óleos essenciais da resina de P.

heptaphyllum obtidos por CG-EM para: a) p-cimeno; b) α-pineno; c) α-felandreno e d) α-terpineno.

Dados encontrados por Marques et al., (2010), apontam p-cimeno como um

dos componentes majoritários do óleo essencial de duas subespécies,o P.

heptaphyllum (Aubl.) Marchand subespécie ulei (Swat) Daly (PHU) e P.

heptaphyllum (Aubl.) foram quantificados o p-cimeno (39.93%) e terpinoleno

(42.31%), no entanto divergindo no percentual de rendimento destes em relação aos

demais componentes.

A análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa e

os índices de retenção das resinas e folhas de Protium para avaliação anti-

inflamatória in vivo, caracterizou quimicamente a presença de constituintes

monoterpenos e fenilpropanóides: alfa-terpinoleno (22%), p-cimeno (11%), p-

cimeno-8-ol (11%), limoneno (5%) e dillapiol (16%) para a resina, enquanto nas

folhas foram encontrados os sesquiterpenos (SIANI et al., 1999).

B

C

D

A

46

Albino et al., (2017), ao avaliar a influencia da oxidação no oleorresina de P.

heptaphyllum por GC-FID e GC-MS, encontrou para o oleorresina da planta fresca o

terpinoleno na concentração de 28,2-69,7%, enquanto que o oleorresina

amadurecido apresentou o p-cimeno variando entre 18,7 e 43,0% e p-cymen-8-ol

(8,2-31,8%).

As analises realizadas por cromatografia gasosas acopladas a espectrometria

de massa do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum demonstrou um excelente

resultado com componente majoritário p-cimeno 60,59%.

7.3 ATIVIDADE LARVICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE P.heptaphyllum

FRENTE ÀS LARVAS DE Aedes aegypti

A Tabela 1 apresenta os resultados da avaliação da atividade larvicida do

óleo essencial da resina de P. heptaphyllum frente às larvas do Ae. aegypti, com

valores de concentração do óleo essencial em ppm calculados através do índece de

mortalidade.

Tabela 2 – Valores médios e desvio padrão do índice mortalidade de larvas de Ae. aegypti para o controle negativo e as concentrações de 20, 40, 80, 100 e 160 ppm de óleo essencial da resina do P. heptaphyllum e aplicação dos testes Anova e Tukey

Tempo (horas)

Grupos

Controle Negativo

20 ppm 40 ppm 80 ppm 100 ppm 160 ppm

1

0±0 0.2 ±0.44 0±0 0.8±0.83 2±1.41** 5.2±3.34***

2

0±0 0.2±0.44 0.6±0.54 0.8±0.83*** 4.6±2.30*** 8±2.50***

4

0±0 0.6±0.89 0.6±0.54* 9±1*** 9.8±0.44*** 9.8±0.44***

8

0±0 3.2±1.78 7.2±1.30*** 9.4±0.54*** 9.8±0.44*** 10±0***

24

0±0 3.4±1.67***

7.2±1.30***

9.6±0.54*** 10±0*** 10±0***

48

0±0 3.4±1.63*** 7.8±1.30*** 9.6±0.54*** 10±0*** 10±0***

* p < 0,05 segundo teste ANOVA com pós teste de Tukey. ** p < 0,01 segundo teste ANOVA com pós teste de Tukey. *** p < 0,001 segundo teste ANOVA com pós teste de Tukey

47

O óleo essencial da resina de P. heptaphyllum testado apresentou uma excelente

atividade larvicida contra ao Ae. aegypti, demonstrado através dos índices de

mortalidade apresentados na tabela acima, cujos valores extrapolados para

percentual apresentaram mortalidade de 100% a partir da concentração de 100 ppm

(µg/mL) e de 96% para concentração de 80 ppm (µg/mL) no tempo de 24 horas.

Para as concentrações de 100 e 160 ppm o resultado nas primeiras quatro horas

mostrou uma atividade de 98% de morte das larvas, demonstrando uma potente

ação larvicida para o produto testado.

Resultado semelhante foi encontrado por Santana et al., (2009) em trabalho com

o óleo essencial da casca do caule de Protium confusum frente a larvas de Ae.

aegypti, o qual apresentou uma CL100 = 125 µg/mL, valor muito aproximado do

encontrado para o óleo essencial da resina de P. heptaphyllum, demonstrando ação

muito próxima, embora as partes da planta e composição tenham sido diferentes.

7.4 DETERMINAÇÃO DA CL50 E CL90 DO ÓLEO ESSENCIAL DE Protium

heptaphyllum FRENTE ÀS LARVAS DO Aedes aegypti

Por meio da analise Probit com valores obtidos do ensaio larvicida foi possível

determinar a CL50 e CL90, ou seja, determinar as concentrações capazes de causar

mortalidade em 50% e 90% das larvas respectivamente. Foi obtido a CL50 = 28.66

ppm e CL90 = 82 ppm evidenciando a efetividade potencial larvicida desse produto.

Segundo Cheng et al., (2003), substância com valores de CL50 abaixo de 100

µg/mL é tido como um bom agente larvicida. O óleo essencial da resina de P.

heptaphyllum apresentou uma CL50 de 28.66 ppm (µg/mL), valor bem abaixo do

descrito na literatura para ser conciderado como de boa atividade, demonstrando

que este é viável para a utilização como larvicida. Outro fator positivo para uso deste

é que a resina de P. heptaphyllum encontrado em abundância na região Amazônica

e a extração do óleo da resina possui um bom rendimento.

Com estes resultados pode-se afirmar que o óleo essencial da resina de P.

heptaphyllum apresenta-se como um grande promissor de agente larvicida natural

para uso em locais de crescimento de larvas do Ae. aegypti, necessitando para isso

48

de estudos de bases tecnológicas para desenvolvimento de produtos acabados e

avaliação de toxicidade ao ser humano.

Devido o p-cimeno ser o composto majoritário do óleo essencial da resina do

P. heptaphyllum, com um teor de aproximadamente 60% em relação aos demais

componentes, pode-se pensar em tal atividade ser atribuída a este monoterpeno,

uma vez que a concentração desse composto é muito superior a dos demais

componentes do óleo, no entanto é necessário que ensaios com a substância

isolada sejam realizados para confirma esta hipótese.

Também é possível pensar no sinergismo desse como outros componentes

encontrados em quantidades variáveis em óleos essenciais. A literatura descreve a

ação antimicrobiana do p-cimeno potencializada pelo efeito sinérgico com outras

substâncias, a exemplo do carvacrol (OLIVEIRA et al., 2009; SILVA et al., 2010).

Uma vez que o α-pineno é o segundo constituite majoritário, com aproximadamente

13%, e a soma dos dois corresponde a aproximadamente 73% do percentual do

óleo, e sabendo que a literatura descreve algumas atividades para este ultimo, a

exemplo da atividade antifúngica (GARCIA et al., 2008) e antimicrobiana (YANG et

al., 2011), bem como da sua ação inseticida e repelente (MENEZES, 2005). Porque

não pensar em atribuir a ação sinérgica desses constituintes?

Embora sabe-se que muitos monoterpenos são encontrados em oleos

essenciais como componentes marjoritários, no entanto é difícil associar apenas a

uma única substância determinada atividade biológica, pois sabe-se que devido à

diversidade de compostos presentes nos óleos essenciais muitas vezes a ação

biológica ocorre devido a uma ação sinérgica dos constituintes presentes em

espécies vegetais. Portanto, para afirmar que ação possa ser oriunda de apenas

uma substância é necessários estudos que avaliem ação da substância

isoladamente (KUMAR et al., 2011; LIMA et al., 2013).

7.5 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE REPELÊNCIA DO ÓLEO ESSENCIAL DA

RESINA DE Protium heptaphyllum

A atividade repelente do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum frente a

mosquitos de Ae. aegypti testado nas concentrações de 250, 500 e 1000 ppm e

controle negativo estão apresentados na tabela abaixo e nos respectivos gráficos 2,

49

3 e 4, expressos através da média do número picadas, mais ou menos desvio

padrão.

Tabela 3 – Valores médios e desvio padrão frente ao Ae. aegypti nas concentrações

de 250, 500 e 1000 ppm e controle negativo do óleo essencial da resina do P. heptaphyllum

GRUPOS TRATADOS

Tempo (min. e horas)

Controle Negativo 250 ppm 500 ppm 1000 ppm

30 58,33±2,88

24,5 ± 15,19

21,5±8,34

31±17,60

60 75±26,45

21,25 ±14,97

32,25±13,37

31,25±14,31

90 72±19,46

20,5 ± 5, 91

31±16,43

22,25±8,30

120 71,66±25,65

25 ± 6,87

27,5±13,07

12±4,76

150 77,66±39,57

27,25± 13,72

19±10,42

7,5±2,88

180 57,33±25,00

17,25±6,94

15,75±9,91

7,75±6,94

50

Gráfico 1-Valores médios do número de picadas avaliados em função do tempo de

exposição em minutos usando a dose de 250 ppm do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum e do controle negativo(veículo), frente aos mosquitos de Ae. aegypti.

30 60 90 120

150

180

0

50

100

150controle negativo

250 ppm

*** *** *** *** ******

Tempo (min)

Nú

mero

de P

icad

as


O gráfico acima apresenta as menores médias do número de picadas nos

tempos de exposição de 90 e 180 minutos. Estes valores são extremamente

significativos ao serem comparados ao controle negativo, apresentando uma

significância menor que p<0.01.

No entanto, mesmo sendo estes os menores números de picadas, quando os

tempos analisados comparados entre si, percebe-se claramente que não houve

diferença significante entre estes, demonstrando não haver uma relação direta entre

de tempo exposição e percentual de proteção do produto em análise. Também

percebe-se uma ligeira queda no número de picadas no tempo de 180 minutos, o

que implica em uma boa proteção do óleo essencial ao longo do tempo.

Em um estudo realizado por Fradin (1998), com plantas e seus derivados

demonstrou uma ação repelente inferior a 2 horas, reforçando que o óleo essencial

da resina de P. heptaphyllum na concentração de 250 ppm apresenta um bom

potencial para utilização de repelente.

51

Muitos estudos vêm detectando a atividade dos óleos essenciais como bons

agentes repelentes, sendo menos tóxicos para o ser humano (KATHRINA;

ANTÔNIO, 2004).

Gráfico 2 - Valores médios do número de picadas avaliados em função do tempo de

exposição em minutos usando a dose de 500 ppm do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum e do controle negativo (veículo), frente aos mosquitos de Ae. aegypti.

30 60 90 120

150

180

0

50

100


500 ppm

****** *** ***

*** ***

Tempo (min)

Nú

mero

de P

icad

as


O óleo essencial da resina de P. heptaphyllum na concentração de 500 ppm

apresentou uma ação repelente significante quando comparados ao controle

negativo com p<0.01. quando comparados os tempos de exposição ao mosquito Ae.

aegypti observa-se um aumento inicial do número de picadas dos 30 aos 60 minutos

após aplicação do produto, a partir daí ocorre uma estabilização com ligeira queda

no número de picadas ao longo do tempo. Este resultado é semelhante ao

encontrado para a concentração de 250 ppm, o qual demonstrou maior proteção no

tempo de 180 min. mostrando assim que este produto é eficaz ao longo do tempo.

Diversos produtos à base de plantas apresentam um efeito repelente

comprovado e compostos ativos, que agem sinergicamente, possuindo

52

características que poderiam ser empregadas como alternativas dirigidas para o

controle e monitoramento das populações de mosquitos (ISMAN, 2006; NAVARRO

et al., 2009).

Um fator positivo para utilização de óleos essenciais é que são obtidos de

recursos renováveis, rapidamente degradáveis, com baixo potencial de resistência,

fácil acesso e baixo custo de produção (ROEL, 2001). Sendo a região Amazônica

uma área que se encontra uma flora rica e diversa, este tipo de estudo vem se

desenvolvendo de maneira ampla e apresentando bons resultados.

Gráfico 3- Valores médios do número de picadas avaliados em função do tempo de exposição em minutos usando a dose de 1000 ppm do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum e do controle negativo(veículo), frente aos mosquitos de Ae. aegypti.

30 60 90 120

150

180

0

50

100


1000 ppm

*** ******

*** *** ***

Tempo (min)

Nú

mero

de P

icad

as


O óleo essencial da resina de P. heptaphyllum na concentração de 1000 ppm

apresentou uma excelente proteção contra picadas do mosquito Ae. aegypti, quando

comparado ao controle negativo, com p<0.01. Nesta concentração observou-se uma

estabilização no percentual de proteção nos tempos de 30 e 60 minutos e aumento

da proteção ao passar do tempo, antigindo o pecentual máximo de proteção de 90%

no tempo de 150 minutos, mantendo-se estável aos 180 minutos após aplicação do

53

produto. Este resultado demonstra uma forte ação repelente do óleo essencial da

resina de P. heptaphyllum frente ao mosquito do Ae. aegypti, tornando este um forte

candidato para desenvolvimento de um produto com ação repelente.

A atividade repelente do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum pode

estar associada à presença dos constituintes majoritários p-cimeno (~60%), o qual já

foi descrito na literatura que o mesmo possui atividade inseticida (MORAIS, 2009)

e/ou a associação deste com o α-pineno (~13%), uma vez que os dois juntos

representam aproximadamente 73% da composição do óleo em estudo e para os

quais já foram demonstrados ação repelente frente ao de Ae. aegypti. No entanto

estudos complementares com as substâncias isoladas deve ser explorados para que

se confirmem esta hipótese.

Os gráficos 5 e 6 representam os índices de proteção de picadas do óleo

essencial da resina de P. heptaphyllum frente a mosquitos de Ae. aegypti, sendo

que no gráfico 5 os valores estão apresentados em função das médias de picadas

versus tempo de aplicação do produto e no gráfico 6 os valores estão apresentados

em função do percentual de proteção versus tempo de aplicação, sendo que ambos

representam a mesmas coisa, apenas de forma diferentes.

Gráfico 4- Valores médios do número de picadas ao longo do tempo (30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos) nas concentrações de 250, 500 e 1000 ppm do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum frente a mosquitos de Ae. aegypti.

30 60 90 120 150 1800

30

60

90

120250

500

1000

Controle Negativo

****** *** ***

***

***

***

***

******

Tempo (min)

Nú

mero

de P

icad

as

54


Gráfico 5- Valores médios e desvio padrão do percentual de proteção de picadas ao

longo do tempo (30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos) nas concentrações de 250, 500 e 1000 ppm do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum frente a mosquitos de Ae. aegypti.

3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

P H 2 5 0

P H 5 0 0

P H 1 0 0 0

# C

# C

# b ,c# b

# b

# a , b

# b

# a , b

# a , b

T e m p o (m in )

ind

ice

de

pro

teç

ão

(%

)

***

Onde: Significancia *p<0.05, p**<0.01, p#<0.001, sendo a comparado com PH250, b

comparado PH500 e c comparado com grupo pH1000.

O gráfico acima apresenta uma comparação entre as diferentes

concentrações do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum testado e o controle

negativo, comparando entre si os valores obtidos em função do tempo de aplicação.

No tempo de 30 minutos após aplicação do produto nas diferentes concentrações

não foi demonstrado nenhuma significância entre os números de picadas e/ou

percentual de proteção, ao passo que no tempo de 60 minutos os resultados de 500

e 1000 ppm foram semelhantes e divergindo significativamente para maior número

de picadas quando comparados a concentração de 250 ppm (p<0.01),

demonstrando esta ser mais eficiente neste tempo de exposição.

Já no tempo de 90 minutos, a concentração de 500 ppm manteve-se

semelhante ao valor de 60 minutos e divergindo significativamente (p<0.01) para

maior número de picadas quando comparados as concentrações de 250 e 1000

ppm, demonstrando maior atividade para essas duas concentrações. No tempo de

120 minutos o número de picadas foi maior para as concentrações de 250 e 500

55

ppm, com valores semelhantes para as duas e divergindo significativamente

(p<0.01) quando comparado com 1000 ppm, sendo este mais eficiente. De acordo

com esses resultados, em uma análise das concentrações testadas do produto (250,

500 e 1000 ppm) em função do tempos (30, 60, 90 e 120) não foi possível

estabelecer uma relação direta entre estas.

Dando continuidade as análises do número de picada em função das

concentrações versus tempo, observou-se que em 120 minutos houve diminuição do

número de picadas à medida que se aumentou a concentração de óleo essencial

utilizado, sendo significantemente diferentes (p<0.01) quando comparados entre si.

Já quando se analisou as diferentes concentrações no tempo de 180 minutos

observou-se também uma diminuição no número de picadas à medida que a

concentração foi aumentada, no entanto as concentrações de 250 e 500 ppm não

foram estatisticamente significante quando comparadas entre si, porém foram

significantes (p<0.01) quando comparadas a concentração de 1000 ppm, sendo este

ultimo o menor número de picadas para todas a concentrações e tempos testados.

Este resultado mostra que nos tempo de 150 e 180 minutos após aplicação do óleo

essencial da resina de P. heptaphyllum, pode-se estabelecer uma relação direta, ou

seja, à medida que se aumenta a concentração este torna-se mais eficiente no que

se refere a repelência do mosquito do Ae. aegypti.

O efeito repelente de algumas plantas tem sido apontado como uma forma

eficaz em evitar a infestação de mosquitos causadores de doença. Levando

consequentemente à redução da permanência dos mosquitos, com isso, diminuindo

a oviposição e que se complete seu ciclo de desenvolvimento trazendo benefícios à

população (ANDRADE et al., 2013).

Esses resultados indicam que o óleo testado, apresenta-se com um potencial

muito bom para repelência frente ao Ae. aegypti, principalmente nas concentrações

mais elevadas e sendo mais eficiente nos tempos de 150 e 180 minutos após

aplicação do produto, evidenciando que este não perde seu efeito ao longo do

tempo, fato extremamente importante para o desenvolvimento de produtos a base

de óleo essencial uma vez que os mesmo são extremamente voláteis.

56

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS

No presente trabalho o óleo essencial obtido a partir da resina de P.

heptaphyllum apresentou um percentual de rendimento de 3,1% e tendo como

constituintes majoritários o p-cimeno (60,59%), α-pineno (12,99%) e biciclo-heptano

(10,05%), representando os três juntos 83,63% da composição do óleo essencial;

No que tange aos bioensaios realizados para as atividades larvicida e

repelente foi possível observar que o óleo essencial da resina de P. heptaphyllum

apresenta uma excelente atividade tanto larvicida quanto de repelente frente a larvas

e mosquitos do Ae. aegypti, respectivamente sendo:

Para a ação larvicida do óleo essencial da resina de P. heptaphyllum, foi

encontrado uma CL50 de 28,66 ppm e CL90 de 82,0ppm para tempo de 48

horas após aplicação deste. Para a atividade repelente foi observado que nas

concentrações de 250, 500 e 1000 ppm o óleo essencial da resina de P.

heptaphyllum foi eficaz quando comparado ao controle negativo,

apresentando um percentual de repelência que variou de 46% a 90% de

proteção, sendo este ultimo encontrado para 1000 ppm;

Ainda em relação à atividade repelente, foi possível observar que nos tempos

de 30, 60, 90 e 120 minutos após aplicação do produto não foi possível

estabelecer uma relação de efeito versus tempo de aplicação do produto, no

entanto nos tempo de 150 e 180 minutos pode-se observa que a medida em

que se aumentou a concentração do produto seu efeito foi potencializado,

assim como esse efeito também foi aumentado a medida que se aumentou o

tempo de aplicação do óleo essencial sobre a pele;

Apesar dos resultados obtidos terem confirmado um efeito repelente, é

necessário estudos adicionais que visem determinar o tempo de duração da

ação repelente do óleo essencial, bem como para testá-lo contra outras

espécies de mosquitos.

Assim sendo, o óleo essencial da resina de P. heptaphyllum apresenta-se

como um potente produto a ser utilizado, seja como agente larvicida e/ou repelente

frente a larvas e mosquitos de Ae. eagypti, respectivamente. No entanto, estudos

complementares no que se refere à determinação de toxicidade, desenvolvimento

57

tecnológico, entre outros, são necessários para que se possa pensa em um produto

para uso em humano ou uso por estes.

A descoberta de novas drogas eficazes para o controle de vetor transmissor

de doenças como Dengue, Zika vírus, Chikungunya e febre amarela são de grande

importância para a saúde pública, uma vez que o combate a larvas e a mosquitos

vetores é essencial na prevenção de novos casos, sobre tudo para a população

carente que é a mais prejudicada com a transmissão destas doenças.

58

REFERÊNCIAS

ARIDOGAN, B. C. et al., Antimicrobial activity and chemical composition of some

essential oils. Archives of Pharmacal Research, v. 25, n. 6, p. 860-864, 2002.

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APÊNDICE I

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Resolução nº 466/12 – Conselho Nacional de Saúde Sr (a) foi selecionado (a) e está sendo convidado (a) para participar da pesquisa intitulada: estudo químico e da atividade larvicida e repelente do óleo essencial da resina de protiumheptaphyllum frente ao Aedesaegypti. Objetivos: Avaliar a atividade

repelente das amostras contendo o óleo da resina de protiumheptaphyllum, e comparar a ação de repelente com um repelente comercial contendo DEET. O óleoserá extraído da resina, sua participação nesta etapa da pesquisa consistirá na aplicação das amostras em seu antebraço direito e exposição desta área tratada dentro de uma gaiola de tamanho 40 cm³ contendo 50 femêas sadias do mosquito Aedes aegypti, por no máximo 30 segundos. Antes de iniciar o experimento os braços dos voluntários serão lavados com água e sabão, enxugados e depois serão introduzidos na gaiola com o braço tratado, você deverá colocar o braço não tratado na caixa por até 3 minutos ou até que os mosquitos pousem para iniciar a picada. Os mosquitos serão provenientes de uma colônia mantida no insetário do Laboratório de Arthropoda da Universidade Federal do Amapá, e são isentos de doenças, não havendo nenhum risco de transmissão de doenças. Os riscos antecipáveis em decorrência da participação na pesquisa restringem-se ao aparecimento de vermelhidão no local da aplicação e eventuais reações alérgicas devido à sensibilidade ao óleo ou a picada. Neste caso o voluntário que apresentar reações de sensibilidade será afastado do ensaio. A pesquisa terá como benefício descobrir se as amostras com os óleos de protiumheptaphyllum possuem ação repelente frente à Aedes aegypti, ao mosquito transmissor da dengue e febre amarela, possibilitando o uso das amostras desenvolvidas como medida auxiliar na prevenção destas doenças. Para participação nesta pesquisa os voluntários devem ser maiores de 18 anos, não possuírem histórico de alergia a picadas de insetos, ou a produtos repelentes, sem enfermidades dermatológicas aparentes. As informações obtidas através desta pesquisa serão confidenciais e asseguramos o sigilo sobre sua participação. Você receberá uma cópia deste termo onde constam os telefones do pesquisador, podendo tirar suas dúvidas sobre o projeto e sua participação nesta pesquisa pode ser interrompida em qualquer momento. Os dados coletados serão utilizados apenas NESTA pesquisa e os resultados divulgados em eventos e/ou revistas científicas. Sua participação é voluntária, isto é, a qualquer momento você poderá recusar-se a responder qualquer pergunta ou desistir de participar e retirar seu consentimento. Sua recusa não trará nenhum prejuízo em sua relação com o(s) pesquisador (a) ou com a instituição que forneceu os seus dados, como também na que trabalha. Toda pesquisa possui riscos potenciais, maiores ou menores, de acordo com o objeto de pesquisa, seus objetivos e a metodologia escolhida. O pesquisador deverá identificar os riscos, esclarecer e justificá-los aos sujeitos da pesquisa, bem como, as medidas para minimizá-los.

Desde já agradecemos!

_________________________________________________________

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Nome do (a) Orientador (a): Prof. Dr. Fernando Antônio de Medeiros

_________________________________________________________ Pesquisador Principal: Cleidjane Gomes Faustino. Mestranda do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde PPGCS da Universidade Federal do Amapá UNIFAP E-mail: [email protected] Cel: 04196 – 981272268.

“O Comitê de Ética é o setor responsável pela permissão da

pesquisa e avaliação dos seus aspectos éticos. Caso você tenha dificuldade em entrar em contato com o pesquisador responsável, comunique-se com o Comitê de Ética da Escola pelo telefone supracitado.”

Declaro estar ciente do inteiro teor deste TERMO DE CONSENTIMENTO

e estou de acordo em participar do estudo proposto, sabendo que dele poderei desistir a qualquer momento, sem sofrer qualquer punição ou constrangimento. Recebi uma cópia assinada deste formulário de consentimento.

_________________________ de _____________ 2017.

Participante da Pesquisa: ____________________________________________ (Assinatura)

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ANEXOS

ANEXO-I FOLHA DE ROSTO PARA PESQUISA ENVOLVENDO SERES HUMANOS

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ANEXO-II CROMATOGRAFIA DO ÓLEO ESSENCIAL DA RESINA DE PROTIUM

HEPTAPHYLLUM

Documents

CLEIDJANE GOMES FAUSTINO ESTUDO QUÍMICO E DA …ƒO-FINAL-DISSERTAÇÃO.pdfAO Aedes (stegomyia)aegypti Linneu Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências