Clonación Electroforesis Pcr

TCNICAS DE MANIPULACIN

GENTICA

1. La clonacin molecular

2. Las enzimas de restriccin. Aislamiento de ADN forneo.

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

4. Hospedadores. Introduccin del vector/ADN forneo

5. Mtodos de seleccin

6. Obtencin de genotecas

7. Electroforesis en geles de agarosa

8. PCR

1. Introduccin: la clonacin molecular

- Amplificacin de molculas de ADN por clonacin clular

-Amplificacin de molculas de ADN por clonacin acelular (PCR)

- Manipulacin gentica y clonacin de organismos pluricelulares (animales y plantas)

La clonacin consiste en la obtencin de un clon, entendido como un conjunto de elementos genticamente iguales entre si e iguales a su precursor.


... Dios mo, me han clonado... !!


Estrategia general del proceso de clonacin

1. Aislamiento del ADN forneo

2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector

3.Introduccin del vector-DNA forneo en la clula hospedadora

4. Seleccin de los transformantes

5. Estabilidad de la informacin gentica



Extraer el gen de inters

insulina

. Stanley Cohen , Boyer, Berg (Universidad de Stanford)

Plsmidos bacterianos

Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans 1979

Enzimas restriccin

Aislamiento y digestin del ADN

Insercin en molculas vectores

con capacidad autnoma de replicacin en la clula hospedadora


Tipo I y Tipo III

Actividad restriccin y modificacin

Precisan Mg 2+, ATP y S-adenosil-metionina

Reconocen una secuencia especfica

Recorren un cierto nmero de bases y cortan

Cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)

Tipo II

Rompen por la secuencia de reconocimiento

Precisan Mg 2+, pero no ATP

Cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palndromes.

2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas

Enzimas de restriccin -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA especficas y lo cortan por el esqueleto azcar-fosfato (enlace fosfoester).

2. Las enzimas de restriccin

Los cidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas

Ejemplos de endonucleasa

GA A T T C

C T T A AG

5

5

3

3

C C G G

G G C C

extremos romos

extremos cohesivos

EcoR 1 de E.coli

G A A T T C

C T T A A G

Secuencias Palindrmicas

A A G C T T Hind III de

T T C G A A Haemophilus influenza


Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN

EcoR 1 de E.coli

G A A T T C

C T T A A G

Secuencias Palindrmicas


Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN

Extremos cohesivos

EcoR 1 de E.coli G A A T T C

C T T A A G

A A T T C

C T T A A

G

G

Extremos pegajosos


EcoRI actuando sobre una

secuencia de ADN

2. Las enzimas de restriccin


Extremos cohesivos

Extremos romos

3. Vectores de clonacin y unin del framento de ADN

Enzimas de restriccin

Vector ADN



1. Aislamiento del ADN forneo y del ADN vector


3.Introduccin del vector-ADN forneo en la clula hospedadora



Cortar el ADN forneo y el vector con las mismas enzimas de restriccin

Vector de clonacin

Formacin de ADN recombinante: unin ADN forneo-vector

3. Vectores de clonacin y unin del framento de ADN

Indice


2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas


4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo


6. Genotecas


8. PCR

Vectores de clonacin


Son vehculos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN forneo y replicarlo.

Caractersticas principales

Se replican de forma autnoma (origen de replicacin)

Contienen regiones no esenciales para su multiplicacin y estabilidad

Tipos de vectores: Plsmidos Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son ms

eficaces con insertos ms pequeos (

Tipos de vectores de clonacin


Plsmidos

Virus

Csmidos (laboratorio)

YACs (levaduras)

Plsmidos


pBR322

-Control relajado -Fenotipo seleccionable -Cierto N de sitios de restriccin -Bajo PM (4 363 bp) (transformacin con plsmidos 10000bp es poco eficiente

ADN Plasmdico

ADN

ADN Plasmdico


Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 Para plantas: CaMV

Para mamferos: SV40

Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad

que poseen para introducir el ADN forneo en la

clula hospedadora

Virus


-El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cpsida puede hacerse in vitro. La cpsida admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l). -Se introduce en la bacteria hospedadora por transduccin

Fago l

Adsorcin de partculas virales a una bacteria

Tipos de vectores de clonacin

Plsmidos

Virus

Csmidos (laboratorio) Mezcla plsmido y virus

YACs (levaduras), contienes sitios caractersticos de la funcionalidad de los cromosomas

V


Indice






6. Genotecas


8. PCR





3.Introduccin del vector-ADN forneo en

la clula hospedadora




MTODOS DE SELECCIN

Resistencia a antibiticos

Genes marcadores (gen b-galactosidasa)

GFP (green fluorescent protein)


Resistencia a antibiticos La resistencia la confieren genes que porta el vector,

en este caso a ampicilina y a tetraciclina

Plsmido pBR322

El ADN

forneo se

inserta en el

gen de

resistencia a

Ampicilina

Sin plsmido

Sin inserto



La resistencia la confieren genes que porta el vector

Con ampicilina

y tetraciclina

Con plsmido

Sin inserto

Con plsmido

Con inserto

Con

tetraciclina


MTODOS DE SELECCIN





Genes marcadores (ej: gen b-galactosidasa)

5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactsido Br-Cl-indol + galactosa

(X-gal) (Azul)

Inactivacin insercional

(introducir el DNA foraneo en el medio del marcador)

Insercin gnica positiva

(Unir el gen marcador al DNA foraneo)

Amp

Gal

Ori

pUC19



Plasmido pUC19

Amp

Gal

Ori

Plasmido pUC19

Amp

Gal + inserto

Ori


b-galactosidasa b-galactosidasa

+ ADN forneo

pUC19 = plsmido

X


510 488 Tubulina GFP-TUB

530 515 Retculo endoplsmico

YFP-ER

510 488 Peroxisomas GFP-PEROXI

530 515 Ncleo YFP-NUC

475 420 Mitocondria CFP-MITO

600 550 Mitocondria RFP-MITO

510 488 Membrana M-GFP

510 488 Endosomas GFP-ENDO

475 420 Ap. De Golgi CFP-GOLGI

510 488 Actina GFP-ACTIN

Emisin (nm)

Excitacin (nm)

Localizacin Vector


Indice






6. Genotecas


8. PCR

Genotecas

Genoteca: coleccin de clones que contiene todo el genoma de un organismo. Tipos de genotecas: Genmicas Parciales ADNc. Coleccin de ARNm Tipos de vectores: Plsmidos (Genotecas parciales) Fagos (Genotecas genmicas pequeas y de ADNc) Csmidos, BAC (genotecas genmicas complejas)

6. Obtencin de genotecas

Utilizando un virus

Utilizando un plsmido


Hibridacin de colonias

Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hidridacin in situ con sondas marcadas Obtencin de la sonda marcada:

marcaje radioactivo: (32P) marcaje desoxinucletidos fluorescentes

Indice






6. Genotecas


8. PCR

TCNICAS ELECTROFORTICAS

Se basan en la migracin diferencial de las molculas a separar en un campo elctrico.

En la electroforesis en gel la fuerza que provoca la migracin de las molculas es el campo electrico, pero el gel acta como filtro molecular, relentizando la migracin su migracin en funcin de su tamao

Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA)

ELECTROFORESIS. SOPORTES

CH2CH

O

CNHCH2NH

O

CCH2 CH

NH2

O

C

CH2 CH

Acrilamida N,N`-Metilenbisacrilamida

- Geles de acrilamida (protenas, geles de secuenciacin de ADN)

- Geles de agarosa (los ms usuales para ADN)

Gelificacin

qumica

Gelificacin

trmica

ELECTROFORESIS DE ADN

Disolver la agarosa a la concentracin deseada en una solucin

salina TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBS mediante calentamiento

Dejar enfriar hasta unos 50C y aadir Bromuro de Etidio

N+

C2H5

Bromuro de Etidio


La agarosa es el polmero usado para la separacin.


La agarosa se mezcla con un tampn.


La agarosa se disuelve en el microondas.


Se preparan la cubeta y el peine.


Se aade el polmero disuelto a la cubeta y se espera hasta su gelificacin.

El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solucin TAE

Se procede a cargar los pocillos con las muestras

Se procede a conectar a una fuente de electroforesis



Formados los pocillos, se coloca en ellos cada muestra, incluidos los patrones.


Cada muestra forma una banda azul que correr en la agarosa dependiendo de su tamao.

El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solucin TAE



El gel se retira y el bromuro de etidio ligado al ADN se visualiza con transiluminador de UV, apareciendo bandas fluorescentes.

Se coloca el gel en un

transiluminador de luz UV

Se visualizan las bandas de ADN

teidas con el bromuro de etidio.

La movilidad electrofortica del ADN en los geles de agarosa es

inversa a su tamao

2.02.01.61.6

1Kb1Kb AA

3.03.0

BB

1.01.0

0.50.5

BKTBKT--O de O de H. H. pluvialispluvialis2.02.01.61.6

1Kb1Kb AA

3.03.0

BB

1.01.0

0.50.5

BKTBKT--O de O de H. H. pluvialispluvialis


Indice






6. Genotecas


8. PCR

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)


Kary Mullis. Premio Nobel de Qumica en 1993

Descrubri la PCR en 1985, cuando trabajaba para Cetus Corp.

Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an

afternoon


PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del DNA.

PCR

amplificacin

DNA

(molcula sencilla)

Muchas moleculas

del mismo ADN


PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del DNA.

DNA

(doble hlice)

Controlando la temperatura

Sntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G -T

Primers cortos de DNA especficos que hibridan con la cadena que tiene que ser copiada los dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

5 3

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9

Sntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G T -T 5 3


A C G T A


Despus del primer periodo de sntesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA

Primer 1 Extensin de la cadena

Cadena original de DNA

Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?


Primero, la desnaturalizacin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100C)


Primero, desnaturalizacin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100C)

Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa

Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1

2

1

Ahora tenemos dos copias de la molcula original

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9

Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

Desnaturalizacin 95C

Hibridizacin 50-60C

Extensin de La cadena

75C

Primer Ciclo

2do Ciclo 95C

50 - 60C 75C

Mltiples ciclos darn un incremento exponencial de copias


ADN-polimerasa de Thermus aquaticus (Taq polimerasa)

Hey, Boo Boo pescamos lasTap para amplificar los

sandwiches?

Ok Yogy

Parque Nacional de Yellowstone


Pelo humano

TCNICAS DE MANIPULACIN

GENTICA

GRACIAS!!!!!!!!!!!

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