産業医科大学産業医科大学 医学部医学部 生体物質化学生体物質化学

准教授准教授 森井森井 宏幸宏幸

結核結核：： 世界で世界で 人口の約人口の約33分の分の11が感染が感染新規結核患者数は年間約新規結核患者数は年間約900900万人万人

死亡者数は年間約死亡者数は年間約180180万人万人

日本で日本で 毎年約毎年約22万万55千人の新規感染患者が発生千人の新規感染患者が発生

治療治療：： イソニアジド、リファンピシン、ストレプトマイシンイソニアジド、リファンピシン、ストレプトマイシン などのなどの

少数の抗結核薬が用いられる。少数の抗結核薬が用いられる。

問題点問題点：： 近年、既存の抗結核薬に対する多剤耐性菌が増加近年、既存の抗結核薬に対する多剤耐性菌が増加

非結核性抗酸菌症の増加非結核性抗酸菌症の増加

P O(H)POO

OH=

OCH2 P

P

O(O)R

O(O)R

PiCMP

Pi

CMP

イノ シト ール

P

CDP

O(O)R

O(O)RP

O(O)R

O(O)RP

PIP / AIP

PI / AIイノ シト ール１ リ ン酸

グルコース

６ リ ン酸

抗酸菌／古細菌

真核生物（ヒト）

CDP-DAG / CDP-ArOH

A

BA, PIP合成酵素(抗酸菌)；B, PI合成酵素(ヒト).

P O(H)POO

OH=

OCH2 P

P

O(O)R

O(O)R

PiCMP

Pi

CMP

Inositol

23

4

5

P

CDP

O(O)R

O(O)RP

O(O)R

O(O)RP

1

ATP6

Exogenous InositolPIP / AIP

PI / AI

Ino-1-PGlc-6-P

Bacteria / Archaea

Eucarya

CDP-DAG / CDP-ArOH

Inositol

70％

古細菌のイノシトールリン脂質の生合成経路を古細菌のイノシトールリン脂質の生合成経路を[[33H]InoH]Inoを基質にしたを基質にした抗酸菌の抗酸菌のPIPI合成活性測定法で調べた。合成活性測定法で調べた。

•• ２つの２つの[[33H]H]ラベルの生成物ラベルの生成物(AI, AIP)(AI, AIP)を確認した。を確認した。

•• AIPAIPからからAIAIが生成した。が生成した。

•• ATPATP濃度を上げると活性が上がった。濃度を上げると活性が上がった。

•• [[3232P]ATPP]ATPを用いると、を用いると、AIPAIPにのみラベルが入った。にのみラベルが入った。

Ino + ATP Ino + ATP →→ Ino 1PIno 1P

CDPCDP--ArOH + Ino 1P ArOH + Ino 1P →→ AIP AIP →→ AIAI

Assay was performed with CDP-DAG(dioleoyl) and various enzyme fractions using

M. smegmatis cell wall, membrane and cytosol fractions or crude cell wall.

PIP合成活性 イノシトールの取り込み活性 [14C]Inositol 1-phosphate [3H]Inositol Fraction Total activity % Specific activity Total activity % Specific activity (nmol/h) (nmol/h/mg) (nmol/h) (nmol/h/mg)

Cell wall 42 85 6.3 0.11 90 0.017 Membrane 4.4 9 0.6 0.0080 7 0.001 Cytosol 3.3 7 0.1 0.0049 4 0.000 Crude cell wall - - 2.7 - - 0.078

0.1 mM [14C]イノシトール 1 リン酸

0.2 mM CDP-ジアシルグリセロール

50 mM MOPS buffer (pH 7.9)

10 mM MgCl2

5 μM 2-mercapto-EtOH

0.4% CHAPS Enzyme (M. smegmatis cell walls etc.)

37℃, 1 h

0.1 M HCl/MeOH,1 M MgCl2, CHCl3

CHCl3 H2O/MeOH

[14C]Count or TLC

in 0.2 ml

1 2 3 4

AI

AIP

PI

PIP

s.f.

酵 素: E.coli-pET21a-

MTH1691M.smegma.cell walls

E.coli-pET21a-

abs-PIPS

基 質:CDP-ArOH CDP-DAG

1 2 3 4

PI

PIP

s.f.

精製[14C]PIP

-酵素 + 酵素 -酵素 + 酵素

精製[14C]PI

酵素： M. smegmatis細胞壁

OHPHOO

O OPOO

OH123

O

O

CO

CO

PIP (ホスファチジルイノシトールリン酸)

M=942

699

TUB MSKLPFLSRAAFARITT-PIARGLLRVGLTPDVVTILGTTASVAGALTLFBCG MSKLPFLSRAAFARITT-PIARGLLRVGLTPDVVTILGTTASVAGALTLF MAR MSKAPFLSRAAFARVTN-PLARGLLRIGLTPDAVTIIGTTASVAGALVLF SME MSNVYLMTRAAYVKLSR-PVAKAALRAGLTPDIVTLAGTAAAVIGALTLF ABS MSG--LLSRETFAKITN-PLASALLRAGFTPDTVTIFGTAASVVAALTLF MTH MPDINESMLNQFRPVIRRFIDPIADRIALPADYITLTGFLVACAASAG-Y PFU ----MLSNLRPLAKKPLEKIAEPFSKLGITPNQLTMVGFFLSLLASYEYY --- -------------------:-----:-.:..:-:*:-*---:---.:--: TUB PMGKLFAGACVVWFFVLFDMLDGAMARERGGGTRFGAVLDATCDRISDGA BCG PMGKLFAGACVVWFFVLFDMLDGAMARERGGGTRFGAVLDATCDRISDGA MAR PMGKLFPGACVVWFFVLFDMLDGAMARERGGGTRFGAVLDAACDRISDGA SME PIGQLWWGAVVVSFFVLADMLDGAMAREQGGGTRFGAVLDATCDRLGDGA ABS PTGHLFWGGMAVWLFAMFDMLDGAMARARGGGTRFGAVLDATCDRVADGA MTH ASGSLITGAALLAASGFIDVLDGAVARRRFRPTAFGGFLDSTLDRLSDGI PFU LNNQVFG-SLILLLGAFLDALDGSLARLTGRVTKFGGFLDSTMDRLSDAA --- --.-:---.--:----:-*-***::**-----*-**..**::-**:.*. TUB VFCGLLWWIAFHMRDRPLVIATLICLVTSQVISYIKARAEASG-LRGDGG BCG VFCGLLWWIAFHMRDRPLVIATLICLVTSQVISYIKARAEASG-LRGDGG MAR VFGGLLWWVAFGMRDRLLVVATLICLVTSQVISYIKARAEASG-LRGDGG SME VFAGLTWWAAFGLDSPSLVVATLICLVTSQVISYIKARAEASG-LRGDGG ABS VFAGLVWWAAFGWGSTSLVVATLICMITSQVISYVKARAEASG-LRADGG MTH IIIGITAGGFTGLLTG------LLALHSGLMVSYVRARAESLG-IECAVG PFU IIFGIALGELVNWKVA------FLALIGSYMVSYTRCRAELAGSGTLAVG --- ::-*:-----------------::.:--.-::**-:.***--*------* TUB FIERPERLIIVLTGAGVSDFPFVPWPPALSVGMWLLAVASVITCVQRLHT BCG FIERPERLIIVLTGAGVSDFPFVPWPPALSVGMWLLAVASVITCVQRLHT MAR IIERPERLIIVLAGAGVSDFPFIAWPPALPVAMWLLAVTSVITCGQRLYT SME IIERPERLVIVLIGAGLSDLPFFPLPWTLHVAMWVLAVASVVTLLQRVHA ABS LIERPERLIIVLAGAIFSGGFGVQWP--LHTAMWVLAVASLVTVAQRMHA MTH IAERAERIIIILAGSLAG---YLIHPWFMDAAIIVLAALGYFTMIQRMIY PFU IAERGERLLILVIAGLFG---------IIDIGVYLVAILSWITFLQRVYE --- :-**-**::*::-..--.----------:--.:-::*--.-.*--**: TUB VWTSPGAID-----------------RMAIPGKGDR BCG VWTSPGAID-----------------RMAIPGKGDR MAR VWTSPGATDLLVPSAPVRDDDAQGHPRSGDPGKTQR SME VRTSPGAMEPLHP------------ANGEKPETSEP ABS VRTSPGALDLLPNS----------DAGQDTAETNQP MTH VWQRLK------------------------------ PFU AKKRLEK----------------------------- --- .

TUB, Mycobacterium tuberculosis (CAE55505.1)BCG, Mycobacterium bovis BCG (CAL72625.1)MAR, Mycobacterium marinum (ACC40540.1)SME, Mycobacterium smegmatis (ABK73364.1)ABS, Mycobacterium abscessus (CAM62975.1)MTH, Methanothermobacter thermautotrophicus(MTH1691)PFU, Pyrococcus furiosus(PF0462)

CDP-alcohol phosphatidyltransferase motif.

R: アルギニン（正電荷性）Ino-1Pのリン酸と静電結合

真正細菌、古細菌に共通motifがある。

P O(H)POO

OH=

OCH2 P

P

O(O)R

O(O)R

PiCMP

Pi

CMP

イノ シト ール

P

CDP

O(O)R

O(O)RP

O(O)R

O(O)RP

PIP / AIP

PI / AIイノ シト ール１ リ ン酸

グルコース

６ リ ン酸

抗酸菌／古細菌

真核生物（ヒト）

CDP-DAG / CDP-ArOH

A

BA, PIP合成酵素(抗酸菌)；B, PI合成酵素(ヒト).

阻害剤Xの濃度(mM)

PIP合成酵素活性(%)

阻害

（％）

0 100 －

0.1 76 24

0.5 45 55

阻害剤：有機合成したX

結核の治療にはリファンピシン、ストレプトマイシン結核の治療にはリファンピシン、ストレプトマイシン等の抗生物質が抗結核薬として使用されている。しかし、等の抗生物質が抗結核薬として使用されている。しかし、副作用や耐性菌等の問題があり、結核菌にのみ特異的な副作用や耐性菌等の問題があり、結核菌にのみ特異的な活性を示す作用機序をもつ物が求められている。活性を示す作用機序をもつ物が求められている。

抗酸菌に対する抗菌剤のスクリーニング法として、細抗酸菌に対する抗菌剤のスクリーニング法として、細胞壁構成成分のマンノース転移酵素を発現させてその酵胞壁構成成分のマンノース転移酵素を発現させてその酵素活性を低下させる物質を選別する方法が提案されてい素活性を低下させる物質を選別する方法が提案されている。しかし、この方法では特定の反応に限定していないる。しかし、この方法では特定の反応に限定していないので効率が低く、人にも悪影響を及ぼす化合物がスクので効率が低く、人にも悪影響を及ぼす化合物がスクリーニングされる可能性がある。リーニングされる可能性がある。

従来の抗結核薬と標的部位が異なる。従来の抗結核薬と標的部位が異なる。

通常のスクリーニング法と異なり、通常のスクリーニング法と異なり、阻害剤の構阻害剤の構

造を推定して合成し造を推定して合成し、その化合物の阻害効果を、その化合物の阻害効果を

PIPPIP合成酵素の活性測定により行う。合成酵素の活性測定により行う。

阻害剤を有機合成するので、通常のスクリーニ阻害剤を有機合成するので、通常のスクリーニ

ングでは得られないングでは得られない天然にはない阻害物質天然にはない阻害物質を発を発

見できる可能性が高い。見できる可能性が高い。

結核の治療薬。結核の治療薬。

非結核性抗酸菌の治療薬。非結核性抗酸菌の治療薬。

抗酸菌による家畜の病気の治療。抗酸菌による家畜の病気の治療。

医薬品製造メーカー医薬品製造メーカー

感染研究所等感染研究所等

現在、阻害剤候補化合物を合成し、その酵素活性阻害効果を確現在、阻害剤候補化合物を合成し、その酵素活性阻害効果を確

認済み。抗酸菌の生育阻害効果を検証中である。認済み。抗酸菌の生育阻害効果を検証中である。

今後、阻害剤候補化合物をさらに合成し、酵素活性阻害と生育今後、阻害剤候補化合物をさらに合成し、酵素活性阻害と生育

阻害の検証を行っていく。阻害の検証を行っていく。

実用化に向けて、酵素活性阻害効果は確認されたが生育阻害効実用化に向けて、酵素活性阻害効果は確認されたが生育阻害効

果がない場合、保護基を付けて阻害剤の極性を下げるなどの技果がない場合、保護基を付けて阻害剤の極性を下げるなどの技

術を確立する必要がある。術を確立する必要がある。

幅広い有機合成の技術を持つ企業との共同幅広い有機合成の技術を持つ企業との共同

研究を希望。研究を希望。

新薬を開発中の企業、抗酸菌全般に関係が新薬を開発中の企業、抗酸菌全般に関係が

ある企業には、本技術の導入が有効と思われある企業には、本技術の導入が有効と思われ

る。る。

発明の名称：発明の名称：

抗酸菌生育阻害剤の候補化合物のスクリーニング方法抗酸菌生育阻害剤の候補化合物のスクリーニング方法

および該方法により得られる抗酸菌生育阻害剤および該方法により得られる抗酸菌生育阻害剤

出願番号出願番号 ：特願：特願20092009--272247272247

出願人出願人 ：産業医科大学：産業医科大学

発明者発明者 ：森井宏幸：森井宏幸

産業医科大学産業医科大学

生体物質化学生体物質化学 森井森井 宏幸宏幸

ＴＥＬＴＥＬ 093093－－603 603 －－ 16111611（内線（内線4610)4610)

ＦＡＸＦＡＸ 093093－－693 693 －－ 99219921

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