1. COFACTORI ENZIMATICI • CARACTERISTICI GENERALE Multe enzime, la hidroliza, dau numai aminoacizi. Prin urmare, proprietatile lor catalitice vor depinde numai de secventa resturilor de aminoacizi. Alte enzime contin, pe langa lantul sau lanturile polipeptidice, molecule mai mici care sunt indispensabile pentru activitatea catalitica. Aceste molecule mici, numite cofactori, variaza de la complexa structura a coenzimei B12 la simplitatea ionilor metalici. Cofactorii se impart in trei mari grupe: coenzime, grupari prostetice si ioni anorganici.

• Caracteristicile principale ale coenzimelor si gruparilor prostetice. In general, gruparile prostetice sunt mai strans legate de partea proteica a enzimei fata de coenzyme. Desi exista aceasta deosebire, modul de legare al acestor doua tipuri de cofactori la apoenzima este asemanator. De aceea, apartenenta cofactorilor la grupa coenzimelor sau la cea a gruparilor prostetice se face pe baza mecanismului implicat in turnoverul repetitiv din sistemul functional. Pentru turnoverul repetitiv al coenzimelor sunt necesare doua substrate (pe langa coenzima) si doua enzime. Daca sunt prezenti numai o enzima si un singur substrat, coenzima va fi folosita doar pentru un singur ciclu. Pentru exemplificare, consideram enzima alcool dehidrogenaza (ADH), implicate in oxidarea etanolului la acetaldehida: CH3 ― CH2 ― OH + NAD ↔ CH3 ― CHO + NADH + H

Nicotinamidadenin dinucleotidul (NAD) este o coenzima importanta pentru oxidarea etanolului la acetaldehida. In timpul procesului, NAD se reduce la NADH dar forma redusa nu poate servi reactiei prezentata mai sus, in sensul ei direct. Pentru ca sistemul sa functioneze continuu in vivo, NADH trebuie disociat de enzima alcool dehidrogenaza, reasociat cu o a doua enzima, care il va folosi la reducerea celui de-al doilea substrat. Reactiile generale sunt:

1

Succesiunea reactiilor este specifica enzimei alcool dehidrogenaza. Nu toate reactiile care implica coenzime sunt astfel ordonate. Caracteristic este faptul ca in ciclul complet NAD → NADH → NAD sunt implicate 2 enzime diferite, E1 si E2 si doua substrate diferite, AH2 si B. In cazul gruparilor prostetice, turnoverul implica o enzima si 2 substrate. Acest mechanism respecta reactia generala:

Gruparea prostetica, flavinadenindinucleotidul (FAD), este atasata strans enzimei. Vitaminele si oligoelementele fac parte integranta din cofactori. Necesitatea organismului privind vitaminele si oligoelementele era cunoscuta inainte de descoperirea rolului lor in vivo drept componente ale enzimelor. De asemenea, fosfatul, riboza si bazele azotate purinice si pirimidinice joaca un rol central intr-o serie de cofactori.

Importanta vitaminelor, fosfatului, ribozei si bazelor azotate in alcatuirea unor cofactori (dupa Whitaker, 1994)

COFACTOR VITAMINA FOSFAT RIBOZA BAZA

AZONATANAD Niacina (PP) + + AdeninaNADP Niacina (PP) + + AdeninaATP ― + + AdeninaUTP ― + + UridinaCTP ― + + CitidinaCoA Acid

pantotenic(B3) + + Adenina

Acetilfosfat ― + ― ―FMN Riboflavina(B2) + + ―FAD Riboflavina(B2) + + AdeninaPiridoxalfosfat Piridoxina (B6) + ― ―TPP Tiamina (B1) + ― ―

2

1. ROLUL ALTOR COMPUSI ORGANICI • Vitamina A Intervine in procesul vederii. Proteina conjugate fotoabsorbanta, rodopsina, din retina este formata din proteina opsina strans legata de 11-cis-retinal, aldehida vitamina A. 11-cis-Retinalul contine in catena laterala 4 duble legaturi: 3 in forma trans iar a patra, din pozitia 11-12, in forma de cis. Expus la lumina, 11-cis-retinalul este transformat in trans-retinal, printr-un proces neenzimatic. Dupa o serie de transformari enzimatice, prezentate mai jos, 11-cis-retinalul se poate recombine cu opsina libera formand rodopsina si completand, astfel, ciclul vizual:

trans-retinal + NADH + H → trans-retinol + NAD trans-retinol → 11-cis-retinol 11-cis-retinol + NAD → 11-cis-retinal + NADH + H

• Tetrahidrobiopterina Este un cofactor pentru hidroxilarea fenilalaninei, dupa urmatorul mechanism:

tetrahidrobiopterina + fenilalanina +O2→ dihidrobiopterina + tirozina +H2O

Biopterina este redusa la tetrahidrobiopterina de catre o enzima specifica NADPH-dependenta.

3

• Vitamina K Vitamina K2 este cofactor pentru o serie de dehidrogenaze bacteriene si este implicate in procesul coagularii sangelui la animale.

Modul de actiune al vitaminei K in calitate de cofactor nu este pe deplin elucidat.

3.IONII ANORGANICI Ionii anorganici indeplinesc roluri foarte importante in organism. Pe langa faptul ca intra in structura scheletului, ca intervin in reglarea echilibrului acido-bazic al fluidelor corpului, ca participa la contractia musculara si la excitabilitatea nervoasa, ei intra si in alcatuirea enzimelor, in calitate de cofactori. • Rolul cationilor Majoritatea oligoelementelor indeplinesc un rol in reactiile catalizate enzimatic. Este vorba despre Zn², Fe², Fe³, Cu², Mo , Mg², Mn², Ni², la care se adauga si ionul CO². Mai mult de 150 de enzime contin Zn² . In general, cationii au un rol specific in desfasurarea acestor reactii, in timp ce anionii intervin in reglarea activitatii enzimelor. Rolul catinonilor in sistemele enzimatice poate fi unul dintre cele enumerate mai jos: ― un cation poate functiona ca un component indispensabil al centrului activ al enzimei. In aceasta calitate, cationul poate fi implicat in legarea substratului, in transformarea acestuia in produsi de reasctie sau poate interveni in ambele situatii. Zn² este indispensabil pentru activitatea carboxipeptidazei A, participand la transformarea substratului. Tot Zn² functioneaza drept cofactor pentru fosfataza alcalina dar ajuta, totodata, si la legarea celor doua

4

subunitati impreuna. Fosfataza alcalina din E.coli este un dimmer, ambele subunitati sunt identice si contin fiecare cate 2 atomi de Zn² .

Xantin oxidaza din lapte contine 8 atomi de fier si 2 atomi de molibden per molecula. Acestia sunt implicati in transferal electronilor de pe substrat pe O2. ― un cation poate reprezenta o parte dintr-un cofactor, cum este cazul clorofilei, hemului sau coenzimei B12. ― un cation poate fi indispensabil pentru mentinerea conformatiei centrului active al enzimei.

Alcooldehidrogenaza din drojdie este alcatuita din 4 lanturi polipeptidice identice si contine 4 atomi de Zn² per molecula, fiecare asociat unuia din cei 4 centri active ai moleculei de enzima. Zn² indeplineste doua roluri in enzima: mentine structura cuaternara a proteinei si, de asemenea, participa la transportul unui hydrogen in transformarea substratului la produs final.

α-Amilaza contine un atom de Ca² per molecula, care serveste doar la mentinerea integritatii conformationale a centrului activ al enzimei.

― un cation poate constitui o parte a substratului. Exista cazuri in care este necesar un ion metallic pentru formarea unuia dintre substrate, in cazul enzimelor care functioneaza cu 2 substrate. De exemplu, toate kinazele necesita Mg² , care reactioneaza cu ATP-ul pentru a forma complexul Mg-ATP²‾ , al doilea substrat pentru enzima:

Mg² + ATP → Mg ATP²‾ → E • Mg ATP²‾ → Produsi de reactie + E

• Rolul anionilor Anionii pot indepli mai multe roluri in functionarea unei enzime: ― in unele cazuri, stabilizeaza structura enzimei ― in alte cazuri, s-ar parea ca mascheaza influenta unei grupari de pe enzima sau substrat , in legarea sau transformarea substratului.

α-Amilazele prezente la mamifere si unele bacterii necesita Cl‾ pentru activitatea lor. Totusi, aceste enzime nu prezinta specificitate pentru Cl‾, fiind activate si de alti anioni monovalenti, darn u si divalenti. Exista o diferenta intre anioni cu privire la capacitatea lor de a activa α-amilaza, efectul cel mai semnificativ avandu-l ionul clorura.

5

pH-ul optim al enzimei se modifica in prezenta anionilor monovalenti de la aproximativ 6 la aproape 7.

Activitatea fumarazei creste de 2-3 ori in prezenta anionilor di- si trivalenti si este inhibata de anionii monovalenti. Asemanator α-amilazei, se produce o modificare a pH-ului optim de la aproximativ 7, in absenta anionilor activatori, la aproape 8, in prezenta lor.

Efectele ionilor asupra pH-ului optim al unei enzime nu se refera exclusiv la anioni. β-Galactoridaza, de exemplu, este activate de ionii de Na. pH-ul optim al β-galactoridazei este 7,7 in lipsa NaCl si 6,6 in prezenta unei solutii de NaCl 0,05 N.

Efectul ionilor asupra activitatii α-amilazei, fumarazei si β-galactozidazei s-ar parea ca se datoreaza mascarii gruparilor nedorite, prezente in centrul activ al enzimei. Nu au efect asupra legarii substratului la enzima. De exemlu, in cazul β-galactozidazei, Na reduce interactiunea electrostatica dintre gruparile incarcate negativ ale centrului active sau din apropierea lui si una sau mai multe grupari prototropice implicate in transformarea substratului.

2. ASOCIERILE APOENZIMA-COFACTOR

Exista deosebiri importante intre cofactori in ceea ce priveste stabilitatea complexului apoenzima-cofactor. In unele cazuri, natura exacta a interactiunii dintre partea proteica a enzimei si cofactor nu este cunoscuta dar ea se poate studia prin cristalografie cu raze X. Multi cofactori contin adenina (sau alta baza azotata), riboza si fosfat. In multe cazuri aceste componente nu participa direct la functionarea cofactorului, avand numai rol in legarea cofactorului la proteina. Acidul lipoic si biotina sunt legate covalent de proteina printr-o legatura amidica, formata prin interactiunea gruparii carboxil a cofactorului cu o grupare ε-amino a unui rest lizil de pe enzima. In aproape toate cazurile, piridoxalfosfatul se leaga de apoenzima prin formarea unei baze Schiff, care implica gruparea carbonil a cofactorului si o grupare ε-amino a unui rest de lizina. La tratare cu NaBH4, baza Schiff este transformata intr-un compus stabil care poate fi izolat dupa degradarea proteinei.

6

Legarea hemului in catalaza si peroxidaza implica coordinarea atomului de fier cu una sau doua grupari imidazol din proteina, interactiunea electrostatica a celor 2 grupari carboxil ale acidului propionic din lanturile laterale ale pirolilor cu grupari incarcate pozitiv din proteina si interactiunea hidrofoba a altor lanturi laterale cu resturi de aminoacizi aromatici din proteina. In citocromul c, hemul este atasat prin 2 legaturi tioleter de apoenzima.

7