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Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas ysus mezclas con ß-lactoglobulina en solución,
interfases y emulsionesCamino, Nerina Andrea
2010
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. LuisFederico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de lafuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir.It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.
Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Universidad de Buenos Aires
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Industrias
COMPORTAMIENTO DE
HIDROXIPROPILMETILCELULOSAS Y SUS MEZCLAS
CON -LACTOGLOBULINA EN SOLUCIÓN,
INTERFASES Y EMULSIONES.
Tesis para optar al título de
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Industrial
Ing. Nerina Andrea Camino
Director de tesis: Dra. Ana M.R. Pilosof
Buenos Aires, 2010
Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas y sus mezclas con -lactoglobulina en
solución, interfases y emulsiones.
Resumen
El objetivo del presente trabajo fue estudiar la funcionalidad de
hidroxipropilmetilcelulosas y sus mezclas con lactoglobulina en coloides alimentarios.
Los estudios realizados muestran que estos polisacáridos en solución presentan un
comportamiento complejo que se manifiesta en la asociación/autoensamblaje mediado por
interacciones hidrofóbicas y modulado fuertemente por el pH, como también por la
concentración y la temperatura.
A pH3 la asociación/autoensamblaje de hidroxipropilmetilcelulosas se ve impedida en
solución. El grado de asociación/autoensamblaje también puede modificarse por la
aplicación de ultrasonidos de lata intensidad, impactando en algunas propiedades físico-
químicas de las celulosas. En la interfase aceite/ agua, las hidroxipropilmetilcelulosas,
especialmente las de bajo peso molecular, presentan una importante actividad, la cual está
modulada también por el pH.
Las hidroxipropilmetilcelulosas presentan buenas propiedades emulsificantes a ambos
pH.
En las mezclas con lactoglobulina se observa la misma tendencia con la variación del
pH y la concentración de los biopolímeros en las mezclas. Existe distinta interacción entre
ellos lo cual afecta su comportamiento en solución y en los coloides estudiados.
Así, el conocimiento y la caracterización de estos biopolímeros permitirán la
manipulación de propiedades macroscópicas de productos alimenticios, controlando las
interacciones de un modo deseable, logrando así la optimización en el uso de los
ingredientes.
Palabras claves: hidroxipropilmetilcelulosa, -lactoglobulina, interacción, interfases,
emulsiones.
Behaviour of hydroxypropylmethylcelluloses and its mixtures with -lactoglobulin
in solution, interfaces and emulsions.
Abstract
The objective of the present work was to study the hydroxypropylmethylcelluloses and
their mixtures with lactoglobulin in food colloids. The studies showed that these
polysaccharides have a complex behavior in solution, leading to self-assembled
structures by hydrophobic interactions, strongly modulated by pH, but also by
polysaccharide concentration and temperature.
Particularly at pH3, the hydroxypropylmethylcelluloses self-assembly would be
impeded. The self- assembly degree could also be modified by the application of high-
intensity ultrasound that impacted in some physico-chemical properties. At the oil-water
interface, the hydroxypropylmethylcelluloses, especially those with low molecular
weight, showed a high interfacial activity also modulated by pH.
Good emulsifying activity was observed for all the hydroxypropylmethylcelluloses at
both pH.
The same was observed in the mixtures with -lactoglobulin as affected by pH and
concentration of componenets. The different interactions observed affected their
behavior in solution and in food colloids (interfaces and emulsions).
Thus, the knowledge and the characterization of these biopolymers would allow the
manipulation of the macroscopic properties of food products and optimizing the use of
these ingredients.
Keywords: hydroxypropylmethylcellulose, -lactoglobulin, interactions, interfaces,
emulsions.
Agradecimientos
A la Dra Ana Pilosof por su constante guía y apoyo, por enseñarme a investigar, por su
invaluable aporte durante el trabajo de investigación y escritura de mi tesis, por
demostrarme su confianza y por los buenos consejos que necesité en muchas
oportunidades. Valoro mucho el poder trabajar junto a ella día a día.
A mis padres por su amor infinito, por su presencia incondicional, por enseñarme tantas
cosas en la vida, por su apoyo constante y porque son mi ejemplo en todo. A mis
hermanos porque los adoro con el corazón, por todos los momentos compartidos y por
su apoyo en todas las decisiones de mi vida.
A Augusto por su constante presencia y apoyo durante estos años, y porque junto a el
conocí el verdadero amor.
A mis amigas de toda la vida, Mari, Andre, Sabi, Sil, por la hermosa amistad que
compartimos, por sus valiosos consejos y porque siempre están conmigo.
A mis compañeros, con quienes comparto mi trabajo diario en el laboratorio, por el
aporte de cada uno en la realización de mi tesis. A Kari, con quien comparto tantas
charlas, por sus consejos y presencia en todo momento y porque en ella encontré una
amiga. A Caro, porque me escuchó, me acompañó y me brindó su amistad en un
momento muy difícil de mi vida. A Oscar por su orientación y predisposición constante
y por ayudarme en muchas mediciones. A Edith, Federico, Julia, Mariana, Paula, Victor
y Rosa por tantos momentos vividos.
A todos los integrantes del grupo de Pilar Buera, por los cumpleaños, congresos,
despedidas compartidos. En especial a Lidia por su inmensa ayuda y colaboración en
este trabajo.
Al Dr Juan Miguel Rodríguez Patino por recibirme en su laboratorio en Sevilla para
realizar mis estudios de interfase, por la orientación en la interpretación de los
resultados y por solucionar rápidamente el problema en el funcionamiento del Tracker
para que pueda terminar mis ensayos. A Cecilio Carrera Sánchez por su guía en el uso
de los equipos, análisis e interpretación de los resultados.
Al CONICET y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por haber
financiado mi doctorado con las becas que me otorgaron.
Al Programa Iberoamericano CYTED por haber financiado mi estancia en la
Universidad de Sevilla.
A la Universidad de Buenos Aires, que junto a la Agencia Nacional de Promoción
Científica y Tecnológica brindaron el financiamiento para la realización del trabajo de
investigación.
A todos los integrantes del Departamento de Industrias, que durante estos años de mi
doctorado han participado en mi formación académica y en la docencia que actualmente
realizo.
De corazón, muchas gracias a todos.
A mis padres,
a mis hermanos,
a Augusto
i
Índice Introducción
1. Propiedades funcionales de proteínas y polisacáridos..………………………………….… 1
2. Características de Hidroxipropilmetilcelulosa…………………………………………….. 4
2.1 Celulosa y derivados de celulosa…………………………………………………. 4
2.2 Estructura química ……………………………………………………………….. 4
2.3 Propiedades físicas y químicas……………………………………………………. 5
2.4 Caracterización de los éteres de celulosa………………………………………….. 7
2.5 Hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) ……………………………………………… 7
2.5.1 Antecedentes del empleo de las HPMC en sistemas dispersos………….. 9
3. Características de く-lactoglobulina…………………………………………………………. 11
3.1 Estructura primaria de la く –lactoglobulina…………………………………………12
3.2 Estructura secundaria de la く –lactoglobulina………………………………………12
3.3 Conformación de la く -lactoglobulina ………………………………………………12
3.4 Asociación entre moléculas de く –lactoglobulina………………………………….14
4. Caracterización del estado de asociación de proteínas y polisacáridos en solución…………14
4.1 Dispersión dinámica de luz………………………………………………………...14
5. Propiedades interfaciales de proteínas y polisacáridos……………………………………..16
5.1 Termodinámica de adsorción de biopolímeros…………………………………….16
5.2 Cinética de adsorción en interfases………………………………………………...18
5.2.1 Conformación de los polímeros tensioactivos en la interfase……………19
5.3 Propiedades de las películas poliméricas …………………………………………..22
6. Emulsiones aceite-agua………………………………………………………………………26
6.1 Procesos de formación de emulsiones……………………………………………...27
6.1.1 Homogeneización primaria y homogeneización secundaria……………..27
6.1.2 Procesos críticos durante la formación de emulsiones…………………...28
6.1.3 Fuerzas de ruptura en el proceso de homogeneización…………………..29
6.1.4 Equipos de homogeneización…………………………………………….31
6.2 Evaluación de la eficiencia de los procesos de homogeneización…………………34
6.2.1. Métodos basados en la dispersión de luz ……………………………….34
6.2.2. Distribuciones de tamaño de partículas…………………………………35
6.3 Estabilidad de emulsiones: estabilidad termodinámica y estabilidad cinética…….42
ii
6.4 Mecanismos físicos de desestabilización de emulsiones…………………………46
6.4.1. Cremado…………………………………………………………………49
6.4.2. Floculación………………………………………………………………51
6.4.3. Coalescencia…………………………………………………………….53
6.5 Evaluación de la estabilidad global de una emulsión por medidas de dispersión
múltiple de luz…………………………………………………………………………55
Objetivos
Objetivo general……………………………………………………………………………….57
Objetivos específicos………………………………………………………………….57
Materiales y métodos.
1. Materiales………………………………………………………………………………....59
1.1 Hidroxipropilmetilcelulosa……………………………………………………….59
1.2 く –lactoglobulina………………………………………………………………….60
1.3 Aceite vegetal……………………………………………………………………..60
2. Métodos…………………………………………………………………………………….60
2.1 Preparación de las soluciones de polisacárido y proteína………………………..60
2.2 Determinación de la viscosidad de las soluciones………………………………..61
2.3 Tratamiento de ultrasonido de alta intensidad……………………………………62
2.4 Evaluación visual de la gelificación. Ensayos de inclinación o tilting test………63
2.5 Determinación de la distribución y tamaño de partícula de las soluciones………63
2.6 Determinación de la carga superficial de las partículas en solución……………. 66
2.6.1 Principio de funcionamiento…………………………………………… 67
2.7 Calorimetría diferencial de barrido (DSC)………………………………………..70
2.8 Resonancia magnética nuclear (NMR)……………………………………………71
2.9 Reología dinámica ………………………………………………………………..71
2.10 Emulsiones………………………………………………………………………73
2.10.1 Preparación de las emulsiones……………………………………….. 73
2.10.2 Determinación de la distribución y tamaño de partícula…………….. 74
2.10.2 Determinación de la carga superficial de las emulsiones……………..75
2.10.3 Determinación de la estabilidad de las emulsiones…………………...75
2.10.4 Determinación de la microestructura de las emulsiones.
Microscopia confocal…….……………………………………………76
iii
2.10.5 Determinación la viscosidad de las emulsione…………………………77
2.11 Propiedades interfaciales…………………………………………………78
2.11.1 Determinación de la tensión interfacial/superficial…………… 78
2.11.1.1Tensiómetro tipo Wilhelmy (determinación de isotermas
vs concentración)…………………………………………... 78
2.11.1.2 Tensiómetro de Gota……………………………….. 82
2.11.2 Determinación de la reología de las películas interfaciales…… 89
Resultados
Sección I. Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosa en solución, interfases y
emulsiones.
Capítulo 1. Caracterización del estado de asociación de hidroxipropilmetilcelulosas en solución
por dispersión dinámica de luz.
1.1 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de HPMC a pH3 y pH 6………..92
1.2 Efecto de la temperatura en la distribución de tamaño de partícula en las
soluciones de HPMC apH6………………………………………………………….101
1.3 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de mezclas de HPMC
y agentes disociantes a pH 6 y temperatura ambiente……………………………. . 107
1.4 Conclusión…………………………………………………………………………..110
Capítulo 2. Efectos de ultrasonidos de alta intensidad en el estado de asociación de
hidroxipropilmetilcelulosas y su impacto en las propiedades funcionales.
2.1 Usos de ultrasonidos de alta intensidad……………………………………….…..111
2.2 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de HPMC a pH3 y
pH6 después del tratamiento de ultrasonido……………………..……………….113
2.3 Evolución del tamaño de partícula de las soluciones de HPMC después
del tratamiento de ultrasonido…………………………………………………….117
2.4 Impacto del tratamiento de ultrasonido en la emulsificación y gelificación
de las HPMCs…………………………………………………………………….119
2.5 Impacto del tratamiento de ultrasonido en la viscosidad y movilidad
del agua de soluciones de HPMC………………………………………………….122
2.6 Conclusión…………………………………………………………………………126
iv
Capítulo 3.Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas en la interfase aceite-agua y
comparación con la interfase aire-agua.
3.1 Comportamiento comparativo de HPMCs en interfases A/W y O/W…………...127
3.1.1 Isotermas de adsorción en la interfase A/W y O/W……………………128
3.1.2 Dinámica de adsorción en la interfase A/W y O/W……………………133
3.1.3 Cinética de adsorción en la interfase A/W y O/W……………………..136
3.1.4 Características viscoelásticas de las películas en la interfase
A/W y O/W………………………………………………………………140
3.2 Efecto del pH en las propiedades interfaciales de HPMC en interfases O/W…..146
3.2.1 Efecto del pH en la dinámica de adsorción de HPMC…………………146
3.2.2 Efecto del pH en la cinética de adsorción de HPMC…………………..150
3.2.3 Efecto del pH en las características viscoelásticas de las películas
de HPMCs……………………………………………………………….152
3.3 Conclusión……………………………………………………………………….160
Capítulo 4.Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas en emulsiones O/W.
4.1 Características iniciales de las emulsiones……………………………………..161
4.1.1 Distribución de tamaño de gota en emulsiones preparadas con
Ultraturrax (UT)……..………………………………………………..161
4.1.2 Distribución de tamaño de gota en emulsiones preparadas con
ultrasonidos de alta intensidad (USAI)………………………………167
4.2 Estabilidad de las emulsiones preparadas con UT y USAI frente al
almacenamiento estacionario a temperatura ambiente………………………..173
4.2.1 Microscopía óptica de las emulsiones iniciales………………….....177
4.2.2 Estabilidad frente al cremado-floculación…………………………...179
4.2.3 Estabilidad frente a la coalescencia………………………………….183
4.3 Conclusión……………………………………………………………………...188
Conclusión general Sección I……………………………………………………………..190
v
Sección II. Comportamiento de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosa y -lactoglobulina en
solución, interfases O/W y emulsiones.
Introducción……………………………………………………………………………...191
Capítulo 1. Caracterización de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosa y -lactoglobulina en
solución y en la interfase O/W.
1.1 Comportamiento de soluciones mixtas de HPMCs y lg a pH3 y pH6……..198
1.2 Comportamiento de mezclas de HPMCs y lg en la interfase O/W………….206 1.2.1 Dinámica de adsorción y características viscoelásticas de
las películas a pH6……………………………………………….206 1.2.2 Dinámica de adsorción y características viscoelásticas
de las películas a pH3………………………………………..…212
1.3 Conclusión……………………………………………………………………215
Capítulo 2. Comportamiento de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosas y -lactoglobulina en
emulsiones O/W.
2.1 Características iniciales de las emulsiones de mezclas de E5LV y lg………218
2.2 Estabilidad de las emulsiones frente al almacenamiento
estacionario a temperatura ambiente……………………………………….222
2.2.1 Estabilidad frente al cremado-floculación…………………………222
2.2.1 Estabilidad frente a la coalescencia………………………………..223
Conclusión general Sección II…………………………………………………………..226
Bibliografía……………………………………………………………………………....227
Introducción
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
1
1. Propiedades funcionales de proteínas y polisacáridos
Las proteínas y polisacáridos son biopolímeros complejos que desempeñan un rol
fundamental en las características organolépticas y estructurales de los alimentos, las cuales
inciden en la aceptabilidad por parte de los consumidores. Ambos son componentes muy
versátiles que cumplen funciones como espesantes, gelificantes, emulsionantes y espumantes
en los alimentos.
Se entiende por propiedades funcionales a las propiedades físico-químicas de
polisacáridos y proteínas que afectan su comportamiento en los productos alimentarios ya sea
durante la preparación, el procesado almacenamiento o consumo de los mismos, es decir,
cualquier propiedad (con excepción de las nutricionales) que afecta su utilización (Hall,
1996).
Las proteínas son las más susceptibles a cambios en su funcionalidad de acuerdo a la
condiciones del medio o procesamiento, debido a su compleja estructura molecular.
Las propiedades funcionales pueden categorizarse en tres grandes grupos (Cheftel y col,
1989):
Propiedades de hidratación: dependientes de las interacciones de la proteína o
polisacárido con el agua. Entre ellas se encuentran la adsorción y retención de
agua, dispersibilidad, solubilidad y viscosidad.
Propiedades dependientes de las interacciones intermoleculares: precipitación,
floculación y gelificación.
Propiedades superficiales: emulsificación y espumado.
La evaluación de la funcionalidad de una proteína o un polisacárido se realiza mediante
la determinación de propiedades fisicoquímicas bien definidas como la viscosidad o tensión
superficial o mediante ensayos sobre su aplicación, como son la medida de la pérdida de agua
de un producto, el volumen de espuma formado a partir de una solución de proteína o el
volumen de pan después de la cocción.
Las propiedades funcionales se pueden evaluar en principio en sistemas modelo que
contienen a una única proteína o polisacárido. A partir del conocimiento del comportamiento
y propiedades de los sistemas modelos se puede avanzar hacia el estudio de sistemas más
complejos y finalmente lograr la formulación de productos que sean viables para su
producción industrial.
Introducción
2
En este trabajo se estudiaron diferentes hidroxipropilmetilcelulosas (HPMC) y como
proteína se seleccionó la く-lactoglobulina (lg).
¿Por qué resulta interesante estudiar las propiedades en solución, interfases y
emulsionantes de HPMC y sus interacciones con lg?
i) Las hidroxipropilmetilcelulosas son derivados de la celulosa, la sustancia orgánica
más abundante en la naturaleza. Posee sustituyentes hidrofóbicos que le permiten
comportarse como surfactante en la interfase aire-agua y aceite-agua, característica
que presentan muy pocos polisacáridos. Se ha encontrado que la HPMC es más
activa superficialmente que las proteínas lácteas (Arboleya y Wilde, 2005; Mezdour
y col, 2007; Pérez, y col., 2007) pero existe en la bibliografía muy pocos estudios de
su comportamiento en la interfase aceite-agua. Ha sido ampliamente utilizada en la
industria farmacéutica como adsorbente de drogas y en su liberación controlada. En
la industria de alimentos la hidroxipropilmetilcelulosa es empleada en una gran gama
de productos alimenticios. Los productos basados en proteínas frecuentemente
necesitan estabilizantes para prolongar su vida útil durante el almacenamiento a
temperatura ambiente o en refrigeración, estos polisacáridos pueden ser agregados
para lograr este objetivo (Coffey y col, 1995). Actualmente existe una fuerte
tendencia en la industria hacia la producción de alimentos reducidos en calorías, esto
resulta en una nueva aplicación de HPMC ya que este polisacárido imparte buenas
características de textura (Mälkki y col, 1993). En particular las HPMC, que son
interfacialmente activas, ofrecen la posibilidad de imitar la textura de los lípidos en
estos productos. También se ha empleado HPMC en la formulación de productos
panificados sin harina de trigo para celíacos (Kobylañsky y col, 2003). Pueden
proveer además estabilidad contra la coalescencia de gotas en emulsiones durante el
almacenamiento.
ii) La -lactoglobulina es la proteína mayoritaria del suero lácteo, de gran valor
biológico y amplia funcionalidad. Es la proteína mayoritaria del suero lácteo,
subproducto de la industria quesera producto de la industria quesera. Por diferentes
técnicas (membranas de ultrafiltración, secado spray, nanofiltración) se obtienen,
suero en polvo por medio de secado spray, concentrados de proteínas, aislados de
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
3
proteínas y proteínas aisladas como la lg y -lactalbúmina. Estos productos
encuentran gran aplicación en la industria de alimentos.
iii) Generalmente las proteínas y los polisacáridos se encuentran en forma simultánea en
un alimento. Las interacciones proteína – polisacárido juegan un rol significativo en
la estructura y estabilidad de muchos alimentos procesados. El control o la
manipulación de estas interacciones macromoleculares, son un factor clave para el
desarrollo de nuevas texturas y estructuras en los alimentos así como la obtención de
nano y micro estructuras para diferentes aplicaciones (Tolstoguzov, 1997,
McClements, 2006).
Introducción
4
2. Características de Hidroxipropilmetilcelulosas.
2.1 Celulosa y derivados de celulosa
La celulosa es la sustancia orgánica más abundante en la naturaleza, se ha estimado que
anualmente las plantas sintetizan aproximadamente 1011 toneladas (Bovey y Winslow,
1981). Por lo tanto no sorprende que la humanidad haya hecho uso de la celulosa desde
tiempos inmemoriales con distintos fines, para obtener papel, en la minería, en la
construcción e industrias relacionadas y últimamente como una fuente de bioenergía.
Estas aplicaciones conciernen tanto a la celulosa en su estado natural o modificada física o
químicamente.
La celulosa es el principal componente de las paredes celulares de plantas y algas
verdes. Este polímero se presenta en la madera en un 40 – 50%, 80% en fibras de lino y
90% en las fibras de algodón (Marchessault y Sundararajan, 1983). La purificación
comercial de la celulosa se realiza a partir de las fibras de algodón y de la pulpa de
madera, en el primer caso por el alto contenido en este polisacárido y en el segundo por la
accesibilidad de este recurso. En su estado natural la celulosa es difícil de purificar ya que
es insoluble en los solventes comerciales. Así, el aislamiento de la celulosa en su forma
pura incluye tratamiento alcalino para la remoción de ceras, proteínas y ligninas. Las
pulpas destinadas a la obtención de éteres de celulosa sufren pasos de extracción alcalina
adicionales para remover polisacáridos de bajo peso molecular llamados hemicelulosas y
aumentar la fracción de la celulosa pura o alfa (Coffey y col, 1995).
2.2 Estructura química
Químicamente difiere del almidón simplemente por tener uniones く-1,4 en lugar de α-
1,4 con la glucosa. Sin embargo, este pequeño cambio se traduce en una gran diferencia
en sus propiedades funcionales. La celulosa es un poliacetal く-1,4 de 4-O-く-D-
glucopiranosil-D-glucosa (celobiosa) ya que la unidad básica consiste de dos unidades de
glucosa unidas por unión く-1,4 (Coffey y col, 1995). La configuración く-1,4 da como
resultado una estructura lineal y rígida para el polímero (Figura 1). La relativa
abundancia de grupos hidroxilo y la tendencia a formar puentes hidrógeno tanto intra
como intercatenarios es la causa de la formación de agregados lineales los cuales
contribuyen a la rigidez de las paredes celulares y a la relativa insolubilidad de la celulosa
en los solventes comunes, particularmente el agua.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
5
Figura 1. Estructura química del polímero lineal de celulosa.
El tamaño molecular puede ser apropiadamente descripto en términos del grado de
polimerización (DP), el cual representa el valor promedio del número de unidades
monoméricas. En estado sólido la celulosa posee zonas cristalinas distribuidas entre
zonas menos ordenadas, amorfas, que constituyen regiones donde los grupos hidroxilo
están más expuestos para participar en una reacción. La reactividad de la celulosa
dependerá de su origen y de las condiciones de aislamiento y purificación.
Distintas técnicas demostraron que las moléculas de celulosa se presentan unidas por
puentes hidrógeno y fuerzas electrostáticas en microfibrillas, las cuales en ciertas áreas
tienen las cadenas en capas apiladas. Estas son las áreas organizadas en forma regular que
constituyen regiones cristalinas discretas conocidas como cristalitos (Coffey y col, 1995).
2.3 Propiedades físicas y químicas
La celulosa es un material higroscópico, insoluble pero capaz de absorber agua, ácidos
diluídos y muchos solventes. Las reacciones químicas en las que participa la celulosa
están determinadas por su naturaleza polimórfica. Las regiones amorfas, menos
ordenadas, son los puntos donde todas las reacciones químicas se inician. Por su parte,
poca o ninguna participación incumbe a las regiones cristalinas más ordenadas (Rorrer y
Hawley, 1993).
Las soluciones alcalinas concentradas penetran la celulosa por absorción y por
subsecuente atracción capilar entran en las regiones cristalinas provocando la disrupción
de las mismas. Este proceso denominado mercerización, es usado para activar a la
celulosa en la producción de éteres de celulosa.
Introducción
6
Es posible mejorar las propiedades de la celulosa a través de modificaciones que
pueden ser físicas o químicas. Una de las modificaciones físicas más comunes consiste en
hacer atravesar una pasta de celulosa por tamices de pequeños orificios bajo condiciones
de gran esfuerzo de corte y altas presiones diferenciales (Coffey y col, 1995). Así se
obtienen las celulosas microfibriladas las cuales tienen mayor capacidad de retención de
agua y son menos propensas a la precipitación. Por modificaciones físicas también se
obtiene la celulosa microcristalina que es producida tratando a la celulosa natural con
ácido clorhídrico para disolver las regiones amorfas del polisacárido, persistiendo
solamente las regiones cristalinas. Estas celulosas generan soluciones donde la viscosidad
no varía con el pH o la temperatura (Brownsey y Redout, 1985).
Si bien existen numerosos derivados obtenidos por modificaciones químicas de la
celulosa natural, sólo unos pocos éteres de celulosa han encontrado aplicación en la
industria alimentaria. Los derivados más comúnmente usados son la
carboximetilcelulosa, metilcelulosa, e hidroxipropilmetilcelulosa. Estos dos últimos son
empleados debido a la capacidad de formar geles termorreversibles y por sus propiedades
interfaciales (Kobashashi y col, 1999; Sarkar y Walker, 1995).
Aunque la variedad de éteres de celulosa es amplia, todos ellos son obtenidos
esencialmente de igual forma (Kondo, 1993). El proceso de producción puede ser
dividido en tres etapas:
I. Obtención del álcali de celulosa. Para ello, se trata a la pulpa de celulosa con
soluciones concentradas de hidróxido de sodio (35 – 60%, p/v). Esta mezcla se deja
reposar durante un tiempo y a una temperatura y presión determinadas para asegurar la
reacción completa. La viscosidad del producto final se controla con el tiempo de reposo.
II. Alquilación o hidroxialquilación. La alquilación se da cuando el producto buscado
es metilcelulosa. El álcali de celulosa reacciona con cloruro de metilo para generar la
metilcelulosa y cloruro de sodio. En cambio durante la hidroxialquilación, el álcali de
celulosa reacciona con óxido de propileno generando hidroxipropilcelulosa. Para obtener
la hidroxipropilmetilcelulosa, se somete a la hidroxipropilcelulosa a alquilación.
III. Purificación final del producto. Debido a que los derivados de celulosa gelifican
durante el calentamiento y los subproductos generados durante las etapas anteriores
tienden a precipitar, el lavado de la pasta conteniendo los derivados en agua a altas
temperaturas constituye un medio eficiente para lograr la separación buscada.
El peso molecular de estos polímeros se manifiesta en la viscosidad de sus soluciones,
así a medida que el peso molecular disminuye, la viscosidad disminuye. Para estos
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
7
derivados de celulosa la propiedad más importante es entonces la viscosidad (Coffey y
col, 1995).
2.4 Caracterización de los éteres de celulosa
Además de los sustituyentes presentes en el esqueleto carbonado de celulosa y la
viscosidad de sus soluciones, normalmente medidas a concentraciones de 1 o 2% p/v, estos
productos se caracterizan por el grado de sustitución (DS) y la sustitución molar (MS).
Cada unidad de anhidroglucosa en la molécula de celulosa tiene tres grupos hidroxilo
disponibles para la derivatización. De esta manera, si los tres grupos fueran sustituidos el
producto tendría un DS igual a 3. Si un número promedio de dos sobre tres hidroxilos totales
hubieran reaccionado, entonces el DS sería 2 y así sucesivamente. El término DS se relaciona
con aquellos sustituyentes que bloquean los grupos hidroxilo reactivos. Los sustituyentes que
permiten el crecimiento posterior de la cadena son caracterizados por la sustitución molar
(MS). Es decir, el DS define el número de grupos hidroxilos por unidad de glucosa anhidra en
donde el átomo de hidrógeno es reemplazado. MS representa el número promedio de grupos
de oxido de propileno por unidad de glucosa anhidra (Nahringbauer, 1995).
La derivatización de los grupos hidroxilo reactivos con óxido de propileno genera a su
vez sitios hidroxilo disponibles para posteriores reacciones. De esta manera la reacción
continúa con la extensión de la cadena. La proporción de MS/DS da la longitud promedio
de las cadenas de los sustituyentes laterales.
2.5 HIDROXIPROPILMETILCELULOSA (HPMC)
La hidroxipropilmetilcelulosa es un derivado de celulosa que forma parte de una familia
que incluye entre otros a la metilcelulosa (MC), en la cual los sustituyentes son grupos metilo
y a la metilhidroxietilcelulosa (MHEC) la que posee como sustituyentes grupos hidroxietilo
hasta en un 5%. La HPMC presenta en su cadena grupos metilo e hidroxipropilos (Figura 2).
Difieren principalmente entre si en su peso molecular, viscosidad, grado de sustitución (DS) y
sustitución molar (MS).
A lo largo de la cadena de celulosa, los grupos metilos constituyen zonas hidrofóbicas
mientras que los grupos hydroxipropilos son más hidrofílicos. La introducción de estos
substituyentes permite a la HPMC comportarse como surfactante.
Introducción
8
La utilidad de los éteres no iónicos de celulosa se basa fundamentalmente en cuatro
atributos: son espesantes eficientes, presentan actividad superficial, tienen la habilidad de
formar películas interfaciales y la capacidad de formar geles termorreversibles.
Las interacciones hidrofóbicas son responsables de la formación de los geles de HPMC
durante el calentamiento. A medida que la temperatura aumenta, las moléculas adsorben
energía traslacional y pierden gradualmente su hidratación, resultando en una menor
viscosidad. Tienen lugar las interacciones polímero-polímero, debido a interacciones entre los
grupos hidrofóbicos, causando así opacidad en la solución y una red infinita que provoca un
aumento brusco en la viscosidad y la turbidez si la concentración es relativamente alta
(Sarkar y Walker, 1995).
La mayoría de los polisacáridos, siendo hidrofílicos, no tienen tendencia a adsorberse a la
interfase aire-agua o aceite-agua (Baeza y col, 2004.; Huang y col, 2001; Perez y col, 2006).
La HPMC tiende a concentrarse en interfases tanto aire – agua como aceite – agua (Daniels y
Barta, 1993,1994; Ochoa- Machiste y Buckton, 1996; Wollenweber y col, 2000). Con el
incremento en el grado total de sustitución (DS + MS), la hidrofobicidad del polisacárido y así
su actividad interfacial aumentan (Perez y col, 2006; Wollenweber y col, 2000).
La propiedad de comportarse como surfactante es el resultado de la sustitución heterogénea
en el polímero, es decir que hay zonas del polímero ricas en grupos hidrofílicos y otras ricas
en grupos hidrofóbicos. La concentración de este polisacárido en la interfase de soluciones
diluidas puede ser varias veces superior. Esta propiedad puede entonces conducir a la
estabilización de espumas y emulsiones y tener efectos positivos en la estructura de cortezas
panarias, leudado de masas de panadería, etc.
Figura 2. Estructura química de hidroxipropilmetilcelulosa.
Grupo metilo Grupo hidroxipropilo
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
9
La HPMC es un polisacárido que tiene numerosas aplicaciones, si bien el interés
fundamental reside en el aspecto alimentario, es importante destacar que la industria de
pinturas, la cosmética y la farmaceútica también hacen uso de este polímero en grandes
cantidades. La industria farmaceútica centra sus investigaciones en el empleo de las HPMC en
la liberación controlada de drogas (Ford, 1999) y como adsorbentes de drogas (Nilsonn,
1995). La hidroxipropilmetilcelulosa es empleada en una gran gama de productos
alimenticios. Los productos basados en proteínas frecuentemente necesitan estabilizantes para
prolongar su vida útil durante el almacenamiento a temperatura ambiente o en refrigeración,
estos polisacáridos pueden ser agregados para lograr este objetivo (Coffey y col, 1995).
En productos fritos, estos polisacáridos se usan como rebozador ya que tienen la capacidad
de impedir la pérdida de humedad durante la cocción por formar un gel alrededor del alimento
y simultáneamente bloquean la absorción de aceite.
Las HPMC tienen aplicación como espesantes y como ligantes de agua reduciendo la
sinéresis en alimentos fluidos como salsas, sopas y jarabes. Pueden proveer además
estabilidad contra la coalescencia de gotas en emulsiones durante el almacenamiento. En el
caso de productos batidos, es necesario mantener la integridad estructural de las celdas que
encierran a la fase aire. El polímero es capaz de acumularse en la interfase aire – agua
sufriendo gelificación por su alta concentración en la interfase y como consecuencia estabiliza
el sistema (Coffey y col, 1995).
La HPMC puede ser usada también en productos congelados ya que contribuye al control
del crecimiento de los cristales y a modificar la reología del producto. Esta aplicación tiene
mucha importancia en los productos batidos congelados donde el polisacárido contribuye a la
retención de aire. También en congelados se lo ha empleado para producir texturas similares a
la generada por lípidos en postres congelados bajos en calorías.
2.5.1 Antecedentes del empleo de las HPMC en sistemas dispersos.
La región interfacial que separa las fases aceite y acuosa constituye sólo una pequeña
fracción del volumen total de una emulsión. Sin embargo, tiene un impacto directo en las
propiedades fisicoquímicas y sensoriales de las emulsiones alimentarias, incluyendo su
formación, estabilidad, reología y aroma (McClements, 1999).
El uso de emulsificantes retarda la ruptura de una emulsión. Los emulsificantes son
sustancias con actividad superficial que se adsorben en la superficie de la gotas recién
formadas durante la homogeneización. Una vez en la interfase, facilitan la reducción en el
Introducción
10
tamaño de gota durante el proceso de homogeneización mediante la disminución de la tensión
interfacial. Los emulsificantes reducen también la tendencia de las gotas a la agregación
formando un film protector y/o generando fuerzas repulsivas entre las gotas. Un buen
emulsificante debe adsorberse rápidamente en la superficie de las gotas, disminuir la tensión
interfacial en gran medida y proteger a las gotas contra la agregación durante el
procesamiento de las emulsiones, almacenamiento y utilización (McClements, 1999; Moreau
et al., 2003).
Akiyama y col (2005) indicaron que una buena habilidad espesante del polímero, la
formación de un film elástico y el efecto protector del polímero mediante su adsorción a la
interface aceite-agua son las responsables de la estabilidad de las emulsiones aceite-agua.
Una amplia variedad de emulsificantes sintéticos y naturales pueden emplearse en las
emulsiones alimentarias, incluyendo a surfactantes de bajo peso molecular, fosfolípidos,
proteínas y polisacáridos (Moreau y col., 2003). Dentro del último grupo, se encuentran los
derivados de celulosa que presentan una gran tendencia a acumularse en la interface aire-agua
y aceite-agua (Nahringbauer, 1995). Sin embargo, sólo cuatro de ellos son utilizados en el
área de alimentos: metilcelulosa (MC), carboximetilcelulosa (CMC), hidroxipropilcelulosa
(HPC) e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). Se ha encontrado que la HPMC es más activa
superficialmente que las proteínas lácteas (Arboleya y Wilde, 2005; Mezdour y col, 2007;
Pérez, y col., 2007).
Las HPMCs se comporten como surfactantes. Así, las HPMCs se adsorben en las interfases
líquidas disminuyendo la tensión interfacial (Daniels y Barta, 1993; Daniels y Barta, 1994;
Nahringbauer, 1995; Ochoa Machiste y Buckton, 1996; Wollenweber y col., 2000). Si bien
existe en la bibliografía un amplio estudio de la adsorción de las HPMC en la interfase aire-
agua (Perez y col., 2006, Nahringbauer, 1995, Perez y col., 2007, Perez y col, 2008,
Wollenweber y col., 2000), ningún estudio se ha focalizado en la interfase aceite-agua con
aceite de girasol comercial, ampliamente empelado en la industria de alimentos.
Sun y col. (2007) informaron que la estabilidad de las emulsiones preparadas con
hidroxietilcelulosa modificada hidrofóbicamente (HMHEC) reside en el mecanismo de
espesamiento causado por HMHEC y en la adsorción de la HMHEC en la interfase aceite-
agua, que puede formar un film con carácter solido y así prevenir la coalescencia de las gotas.
Mezdour y col. (2008) encontraron que la disminución en la tensión superficial, cuando se
adsorbe hidroxipropilcelulosa (HPC) en la interface aceite-agua, y las propiedades reológicas
de la interfase son un factor clave para la estabilidad de una emulsión.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
11
3. Características de β-lactoglobulina
Las dos proteínas más importantes en el suero lácteo desde el punto de vista industrial
y funcional son la -lactoglobulina (-lg) y la -lactoalbumina (-la).
La -lg es el componente dominante entre las proteínas del concentrado de suero lácteo
y tiende a gobernar sus propiedades funcionales (Mulvihill y Donovan, 1987; Apenten,
Khokhar y Galani, 2002). Las propiedades fisicoquímicas más importantes de la -lg se
muestran en la Tabla 1.
El polimorfismo genético es una característica de la -lactoglobulina, pudiéndose
identificar siete variantes genéticas denominadas A, B, C, D, E, F y G, siendo las
mayoritarias las formas A y B (Eigel y col, 1984). Todas las variantes de la -
lactoglobulina poseen 162 residuos de aminoácidos, sin embargo cada variante puede
diferir en una a tres posiciones de los residuos, causadas por mutaciones en el código
genético de la proteína.
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de la - lactoglobulina (Morr y col, 1993)
Propiedad -lg
Punto isoeléctrico 5,2
concentración en las proteínas del suero (%) 56-60
Peso molecular (Da) 18000
Hidrofobicidad promedio (Kcal/res) 1075
Residuos de aminoácidos totales/ mol 162
Residuos apolares/mol 54
Residuos cisteína/ mol 5
Residuos disulfuro/mol 2
Residuos sulfhidrilo/mol 1
Residuos lisina/mol 15
Residuos ácido glutámico/mol 16
Residuos ácido aspártico/mol 10
Introducción
12
3.1 Estructura primaria de la -lactoglobulina.
Una reciente comparación de las secuencias de aminoácidos en la familia de la -
lactoglobulina ha revelado un promedio de homología en 33 aminoácidos, lo que indica
que esos residuos son decisivos en la estructura y conformación de la proteína. El más
alto grado de homología entre las proteínas ocurre en la región amino- terminal de cada
molécula de proteína, siendo consistente las posiciones de las uniones disulfuro formadas
entre cis 160-cis66 y cis119-cis106 y un grupo tiol libre en cis121.
A pesar de que puede obtenerse mucha información sobre la naturaleza química de la
-lg, lo que verdaderamente le imparte sus características biológicas y propiedades
funcionales es su conformación. El estudio de la estructura y características
conformacionales es fundamental para una interpretación molecular de las propiedades
fisicoquímicas y la relación existente entre estructura y actividad de la proteína.
3.2 Estructura secundaria de la -lactoglobulina.
Se describe la estructura secundaria de la -lg como monómero esférico (diámetro
aproximado 36 Å) (Verheul y col, 1999) y conteniendo una región de estructura tipo α-
hélice de aproximadamente 20 Å de longitud y una región de estructura plana く. Se ha
reportado que la molécula contiene un 10-15% de estructura α-helice, 43% de regiones
planas く y un 47% de estructura desordenada (Timasheff y col, 1966; Phillips y col
,1998).
3.3 Conformación de la -lactoglobulina.
La estructura nativa de una proteína resulta de un balance de fuerzas atractivas y
repulsivas entre las cadenas de polipéptidos y entre las cadenas de estos y el solvente (Relkin,
1996). La conformación nativa de la -lg se representa en la Figura 3 (Philips y col, 1994). En
ella se muestra que la molécula está formada por 9 cadenas planas く antiparalelas envueltas
juntas de forma tal que forman una especie de cono alisado. Las vueltas ocurren entre los
residuos 44 a 47, 59 a 62, 78 a 81 y 84 a 88.
La presencia simultánea de dos uniones disulfuro y de un grupo tiol libre imparten una
estructura espacial rígida. Sin embargo, la posición del grupo tiol libre es imprecisa, podría
estar localizada entre los residuos 119 y 121. Con exactitud se conoce la localización de un
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
13
enlace disulfuro entre los residuos cis 66 y cis 160, estando el otro posiblemente entre cis 106
y cis 119.
Según la conformación, el grupo tiol estaría mas o menos accesible y podría participar en
los intercambios de uniones diulfuro, que condicionan numerosas características y en
particular la solubilidad.
El grupo tiol libre de cis121 está localizado en la superficie de una región plana く del
monómero de -lg y está normalmente oculto debido a la asociación de dos monómeros. La
disociación del dímero en monómeros de -lg a pH mayor a 7 coincide con un aumento de
actividad en el grupo tiol. Por lo tanto, los reactivos que estabilizan la conformación nativa o
asociada en dímeros de -lg podrían reducir la actividad del grupo tiol libre al quedar ocultos
en el interior de las moléculas asociadas.
La unión disulfuro en las posiciones 106-119 no muestra intercambio con la cis121. La
distancia entre los grupos en las posiciones 119 y 121 es de 10,5Å y cualquier intercambio
entre estos grupos llevaría a un significativo reacomodamiento de la molécula. La ubicación
de la otra unión disulfuro en la posición 66-160 parece hallarse en la superficie externa
uniendo la cadena D a la región terminal de la cadena C (Philips y col, 1994).
Figura 3. Estructura terciaria del monómero de -lactoglobulina. Las flechas indican las zonas
planas b, nominadas con letras A-I. También se indica la ubicación de las uniones disulfuro y el grupo tiol libre (Philips y col, 1994).
Introducción
14
3.4 Asociación entre moléculas de lg
La く-lg bovina existe generalmente como dímero a 25°C entre pH 5,0 y 7,5 (Mc Kenzie,
1971). Esta asociación entre monómeros de く-lg se debe a interacciones electrostáticas entre
los residuos Asp130 y Glu134 con los residuos de lisina en la molécula vecina.
Cuando el pH es mayor a 7, ocurren cambios conformacionales caracterizados por un
aumento en la reactividad del grupo carboxilo oculto, el grupo tiol libre en Cys121 y en el
residuo Tyr. A pH cercanos a 5 se producen una transición mediante la cual la proteína se
asocia en octámeros, en esta forma está presente en un rango de pH de 3 a 5 aproximadamente
(Relkin, 1996). Cuando el pH es menor a 3,5, la proteína se encuentra principalmente como
monómero en solución. La asociación que se da entre las moléculas de proteína en diferentes
condiciones del medio afecta la estabilidad de la misma frente a la desnaturalización
irreversible ya que limita la exposición de grupos ocultos (disulfuros y tiol) en las zonas de
unión de las moléculas y la consiguiente formación de enlaces covalentes entre las moléculas
parcialmente desplegadas.
4. Caracterización del estado de asociación de proteínas y polisacáridos en solución.
4.1 Dispersión dinámica de luz.
La dispersión dinámica de luz (DLS, de sus siglas en inglés dynamic light scattering) es
también conocida como espectroscopía de correlación de fotones (PCS) y como dispersión de
luz casi elástica (QELS). Es una técnica no invasiva, que requiere poco volumen para el
análisis de una muestra y se emplea para la medición del tamaño de partícula, principalmente
en la escala submicrónica. Las aplicaciones más usuales del DLS son las mediciones de
tamaño y distribución de tamaños de las gotas de una emulsión y moléculas dispersas o
disueltas en un líquido como proteínas, polímeros, micelas, carbohidratos, nanopartículas y
dispersiones coloidales (McClements, 1999).
Debido a la dependencia del tamaño de partícula con la intensidad de dispersión de luz, la
asociación de diferentes biopolímeros puede monitorearse fácilmente por medio de
instrumentos de dispersión de luz. Es por ello que en este trabajo, para la caracterización de
interacciones en solución se seleccionó esta técnica con el objetivo de evaluar el efecto de las
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
15
condiciones del medio sobre el estado de asociación, la agregación o el autoensamblaje de las
moléculas en estudio.
La intensidad de dispersión de luz de una molécula es proporcional al cuadrado del peso
molecular. Por lo tanto, esta técnica es muy sensible a la aparición de formas asociadas o
agregadas. DLS también permite determinar las poblaciones existentes en una muestra con
múltiples tamaños de partículas.
En un equipo de DLS, las partículas en la muestra dispersan la luz en diferentes direcciones,
la cual incide en ellas desde una fuente de luz laser a una determinada longitud de onda. La
luz dispersada es recibida por un detector óptico (Figura 4) y fluctúa con el tiempo debido al
movimiento browniano de las partículas y es medido en DLS y relacionado con el tamaño de
la partícula.
El movimiento browniano es el desplazamiento aleatorio de las partículas debido al
bombardeo de las moléculas del disolvente que las rodean.
La temperatura debe ser conocida con exactitud porque es necesario conocer la viscosidad y
ambas están relacionadas. A mayor temperatura mayor será el movimiento Browniano. La
temperatura debe de ser estable para que no existan corrientes de convección en la muestra
que arruinaría la interpretación correcta del tamaño (Malvern Instruments).
Figura 4. Representación esquemática del equipo de DLS (Mattison y col., 2003).
La velocidad del movimiento Browniano se define por una propiedad conocida como
coeficiente de difusión de translación (D) y se relaciona con el tamaño de la partícula por
medio de la ecuación de Stokes-Einstein: d(H) = kT/( 3D) donde d (H) es el diámetro
hidrodinámico, D el coeficiente de difusión traslacional (m2s-1), k la constante de Boltzmann
(1,38 x10-23 NmK-1), T la temperatura absoluta (K) y la viscosidad (Nsm-2).
L
Á
S
E
R
DETECTOR
ÓPTICO
RECIBE LA LUZ DISPERSADA POR LAS
PARTÍCULAS A UN ÁNGULO FIJO
FUENTE
DE LUZ PÁRTÍCULAS DE LA MUESTRA
DISPERSANDO LA LUZ EN
VARIOS ÁNGULOS
Introducción
16
La Figura 5 muestra la correlación según el movimiento browniano de las partículas en
solución y su tamaño. Cuanto mayor sea la partícula menor será el movimiento Browniano y
viceversa. Si se sigue este movimiento a intervalos de tiempo cortos, puede obtenerse
información de cuánto se ha movido y relacionarlo así con su tamaño y distribución.
Partículas pequeñas se mueven rápidamente
tiempo
Partículas grandes se mueven lentamente
tiempo
Figura 5. Representación esquemática del movimiento browniano de las partículas en solución y su relación con la curva de distribución.
5. Propiedades interfaciales de proteínas y polisacáridos.
5.1 Termodinámica de adsorción de biopolímeros
Una aplicación de las proteínas y polisacáridos tensioactivos es su uso como surfactantes
en alimentos emulsionados o espumados.
Cualquier sustancia tensioactiva tiende a acumularse en la interfase aire-agua o aceite-
agua formando películas monomoleculares que se denominan monocapas. Si la concentración
del tensioactivo es elevada, estas películas son fuertemente condensadas.
El comportamiento de las moléculas de proteína en la interfase es diferente al de
moléculas simples y pequeñas de otros surfactantes. Las sustancias de alto peso molecular con
actividad interfacial, como proteínas y polisacáridos, pueden acumularse en la interfase
gracias a que presentan en su estructura cantidades significativas de grupos polares y no-
polares (Dickinson, 1992; Damodaran, 1996). Sin embargo a altas concentraciones pueden
Ta m a ño ( d.nm )Tamaño (d.nm)
10 100 1000
1
Tam año ( d.nm )Tamaño (d.nm)10 100 1000
1
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
17
agregarse. Ello dependerá de la solubilidad que presente la molécula, lo cual estará en función
de las interacciones existentes con el agua. Además dichas interacciones estarán influenciadas
por el pH, fuerza iónica, temperatura, y composición de la subfase acuosa.
En el seno de una solución, las moléculas están rodeadas de otras de su misma especie, y
las fuerzas de interacción entre ellas son iguales en todas las orientaciones. Sin embargo, las
moléculas en la superficie del líquido (o en una interfase entre dos líquidos inmiscibles) están
sujetas a una fuerza neta, porque las fuerzas de atracción ejercidas por las moléculas en el
seno de la solución son diferentes a las ejercidas por las de la fase vapor (o la otra fase
líquida) (Figura 6). El desbalance de fuerzas se traduce en una energía libre de superficie (o
interfacial) o energía libre de Gibbs. Como la energía libre de las moléculas en la interfase es
mayor que en el seno de la solución, el líquido tiende a contraerse para minimizar la
superficie expuesta. Una expansión de dicha superficie (A) de contacto requiere de un
trabajo proporcional a dicha expansión (W) según:
W = け.A
donde け es la tensión superficial si la interfase es aire – líquido o la tensión interfacial para
interfases líquido/líquido y tiene unidades de [fuerza]/[longitud] (ej.: N/m). Cuanto menor es
け, menor es el trabajo necesario para aumentar la superficie. Debido a su naturaleza anfifílica,
las proteínas y algunos polisacáridos pueden concentrarse en la superficie formando películas
(films) mono o multimoleculares disminuyendo la tensión superficial y generando una presión
superficial ““, que se define como け0 - け donde け0 y け son la tensión superficial del solvente
y la solución respectivamente.
Aire o aceite
Solución acuosa
Figura 6. Fuerzas de interacción entre moléculas en el seno de la solución y en la interfase.
Introducción
18
5.2 Cinética de adsorción en interfases.
La actividad superficial de una molécula es una medida de su habilidad para acumularse en
una interfase. Esta tiende a acumularse cuando la energía libre del estado adsorbido es
significativamente menor que la del estado en disolución (Hiemenz, 1986). La diferencia
energética entre ambos estados está determinada por las variaciones en las energías de las
interacciones de las moléculas involucradas, como también por efectos entrópicos (Shaw,
1980). Los cambios en las energías de las interacciones que ocurren como consecuencia de la
adsorción, tienen su origen en dos puntos, uno asociado con la interfase y otro con las
moléculas del tensioactivo en sí mismas. Con respecto al primer punto, al adsorberse una
molécula tensioactiva en una interfase es capaz de disminuir el contacto entre las moléculas
de ambas fases. El contacto directo de ambas es reemplazado por contactos entre segmentos
no polares del tensioactivo y moléculas de la fase no-polar y entre segmentos polares y
moléculas de agua (Israelachvili, 1992). Estas interacciones disminuyen la energía libre
generada en la interfase. Con respecto al segundo punto, los polímeros tensioactivos tienen en
sus moléculas segmentos polares y no-polares; cuando la molécula se disuelve en agua estos
últimos manifiestan un efecto hidrofóbico, energéticamente desfavorable, la consecuencia es
entonces su adsorción a la interfase. Las moléculas del tensioactivo son capaces de maximizar
el número de interacciones favorables entre los segmentos polares y el agua mientras
minimizan el número de interacciones desfavorables entre segmentos no-polares y el agua. La
fuerza impulsora que gobierna la adsorción de las moléculas anfifílicas a una interfase es la
hidrofobicidad. Sin embargo, otros tipos de interacciones pueden también contribuir a la
actividad superficial, favoreciendo o dificultando la adsorción (interacciones electrostáticas,
puentes hidrógeno, etc).
Los efectos entrópicos asociados con el proceso de adsorción se deben a que cuando una
proteína se adsorbe en la interfase, se confina en una región que es considerablemente más
pequeña que el volumen que ocuparía en el seno del líquido, de forma que su movimiento
molecular queda restringido. Estos efectos son entrópicamente desfavorables y así una
molécula solamente se adsorberá en una interfase si la energía ganada en las interacciones es
suficientemente grande como para contrarrestar la disminución de entropía. Es decir que
cuando la energía de adsorción es mayor que la energía cinética de las moléculas, éstas se
fijan fuertemente a la interfase presentando una elevada actividad superficial. Cuando ocurre
lo contrario, las moléculas tienden a localizarse principalmente en el seno del líquido
presentando una baja actividad superficial.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
19
El descenso de la energía libre de un sistema, el cual ocurre cuando una molécula
superficialmente activa se adsorbe en una interfase, se manifiesta como un descenso en la
tensión superficial, ya que se requiere menor energía para aumentar el área superficial entre
las fases no-polar y acuosa. La magnitud de este descenso depende de la eficacia con que las
moléculas evitan el contacto directo entre las fases, así como de la fuerza de las interacciones
entre los segmentos hidrofóbicos del tensioactivo y la fase no-polar (Israelachvili, 1992).
Cuanto mayor sea la eficacia del tensioactivo en evitar las interacciones entre las fases, más
baja será la tensión superficial.
La habilidad de las moléculas de un tensioactivo en evitar las interacciones directas entre
los líquidos inmiscibles está gobernada por el empaquetamiento óptimo en la interfase, que
dependerá de la geometría molecular. Además de conocer la disponibilidad de un tensioactivo
para adsorberse, sobre lo cual informa la termodinámica, es muy importante también conocer
la velocidad a la que este proceso ocurre. Dicha velocidad debe ser suficientemente alta para
que las moléculas puedan adsorberse en la interfase de gotas o burbujas creadas durante la
formación de la emulsión o la espuma respectivamente.
Esta característica, junto con la disminución de la tensión superficial y la de poder crear
una película interfacial son las tres propiedades más importantes que debe presentar cualquier
tensioactivo en la estabilización de emulsiones o espumas (Dickinson y Mc Clements, 1995;
Walstra, 1996, McClements, 1999, Baeza, 2003).
La velocidad de adsorción depende de las características moleculares del emulsionante
(tamaño, conformación e interacciones), la viscosidad de la fase continua y de condiciones
ambientales (temperatura, agitación mecánica, etc).
5.2.1 Conformación de los polímeros tensioactivos en la interfase
La formación de monocapas estables de compuestos poliméricos, como proteínas y
polisacáridos, depende de la atracción que ejerce la subfase sobre estas moléculas (Gaines,
1966). A bajas concentraciones, los tensioactivos poliméricos forman películas
monomoleculares insolubles tanto en la interfase aire - agua como aceite – agua, de forma que
los segmentos no-polares predominan en la fase hidrofóbica, mientras que los segmentos
polares se encuentran en contacto con el agua (Dickinson, 1992; Damodaran, 1996; Dickinson
y Stansby, 1982). Los polímeros pueden presentar diferentes orientaciones en la interfase ya
que el número de residuos o de segmentos en contacto con la interfase dependerá de la
flexibilidad molecular de la cadena y de la afinidad de esta por el medio de disolución. Así
Introducción
20
Lazos
por ejemplo, los cálculos de área molecular de una molécula de proteína adsorbida indican
que sólo una fracción de la cadena del polipéptido está en contacto con la interfase.
Las configuraciones de un polímero flexible en el plano bidimensional de la interfase pueden
ser representados como se muestra en la Figura 7.
I . Filas (trains): son los segmentos lineales que están en contacto directo con la interfase.
I I . Lazos (loops): son los segmentos del biopolímero entre las filas orientadas hacia el seno
de alguna de la dos fases.
I I I . Colas (tails): son los segmentos terminales de las cadenas de polímeros.
Aire o aceite
Solución acuosa
Figura 7. Configuración de un polímero tensioactivo en la interfase aceite – agua o aire-agua.
En el caso específico de proteínas globulares, éstas adoptan en solución una conformación
tridimensional en la cual los aminoácidos no-polares se disponen preferentemente en el
interior de la molécula, de forma de mantenerse ocultos al agua (Dill, 1990). Cuando una
proteína se adsorbe en la interfase (Figura 8), se encuentra menos rodeada de moléculas de
agua, de forma que puede reducir su energía libre alterando su conformación, orientando sus
aminoácidos hidrofóbicos hacia la fase aire o aceite y los hidrofílicos hacia la acuosa
(Dalgleish, 1996). La velocidad con la que la conformación de una proteína cambia en la
interfase depende de su estructura molecular (Dickinson, 1992). Las moléculas más flexibles,
Filas
Colas
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
21
que presentan una conformación aleatoria, pueden rápidamente alterar su conformación,
mientras que las moléculas más rígidas de conformación globular, cambian más lentamente.
Las moléculas de proteína se estructuran, interaccionando entre sí, con un consiguiente
aumento en la presión superficial. El reordenamiento de las moléculas adsorbidas en la
superficie puede ser retardado por varios eventos: presencia de una barrera de adsorción,
lentos reordenamientos moleculares, formación de complejos, transiciones de fase en la
superficie y formación o destrucción de una estructura tridimensional (Luchasen- Reynders,
1993).
Aire o aceite
Solución acuosa
Difusión Penetración Reordenamiento
Figura 8. Cambios conformacionales de una proteína globular durante su adsorción en la interfase aceite- agua o aire-agua.
Este modelo es también adecuado para describir las conformaciones estructurales de las
HPMC en la interfase, ya que presentan en sus cadenas carbonadas grupos metilo e
hidroxipropilo, de naturaleza hidrofóbica. La introducción de grupos hidrofóbicos permite a la
HPMC comportarse como un surfactante ya que sus moléculas se adsorben preferencialmente
en la interfase y provocan un descenso de la tensión superficial. Una vez adsorbidos en la
interfase, las cadenas de este polímero sufren reordenamientos moleculares con segmentos en
contacto con la superficie, llamadas filas y otros segmentos completamente inmersos en la
solución llamados lazos y colas (Figura 7) (Nahringbauer, 1995; Wollenweber y col, 2000).
Cuando la concentración del biopolímero adsorbido () se incrementa, se genera una
barrera electrostática sobre el lado acuoso de la superficie debido a la orientación preferencial
de los grupos poliméricos cargados hacia la fase acuosa polar. Las moléculas poliméricas
requieren cierta energía cinética para superar la barrera electrostática (que involucra fuerzas
repulsivas, impedimentos estéricos y osmóticos) y comprimir las moléculas ya adsorbidas en
Introducción
22
la interfase, para permitir la adsorción de polímero adicional. La habilidad de dichas
moléculas para adsorberse, penetrar y crear espacio en la película preexistente y reordenarse
en la interfase, es ahora la determinante de la velocidad. Una vez adsorbidas en la interfase,
las moléculas poliméricas interactúan en la misma, para lograr un estado de menor energía
libre (Phillips y col., 1994). Con el incremento de la cantidad de polímero adsorbido el
ordenamiento de las moléculas en forma extendida disminuye y la película interfacial cambia
su estructura de expandida a comprimida (Kinsella y Phillips, 1989). El proceso de
desnaturalización de una proteínapuede comenzar segundos u horas luego de la adsorción,
dependiendo de la flexibilidad y de la estructura de la misma, y puede continuar en un grado
más bajo durante días, reteniéndose la estructura terciaria en algunas películas (Wilde y Clark,
1996).
Para estudiar la cinética de adsorción de biopolímeros en la interfase se mide la variación
de la concentración superficial y de la presión superficial en función del tiempo. Se alcanza
un valor de equilibrio, presentando la adsorción cierto grado de reversibilidad (Gonzalez y
Mac Ritchie, 1970). Los procesos de desorción pueden ser muy lentos, siendo las barreras
energéticas mayores a menor concentración proteica (Narsimhan y Uraizee, 1992).
5.3 Propiedades de las películas poliméricas
La interfase no es un sistema autónomo y sólo existe como límite entre dos fases, pudiendo
variar su composición durante el transcurso del tiempo.
Para la formación de una película cohesiva, se necesitan extensas interacciones polímero -
polímero que formen una red continua tridimensional y que impartan rigidez estructural; sin
embargo, si el número de interacciones intermoleculares resulta excesivo, puede ocurrir una
coagulación y posterior desestabilización de la película (Halling, 1981). El desarrollo de
películas apropiadas, con óptimas propiedades viscoelásticas, no sería posible en el caso de
películas constituidas por polipéptidos simples de bajo peso molecular, donde las
interacciones intermoleculares son débiles; las interacciones en la interfase deben maximizar
las propiedades de cohesión y resistencia mecánica.
Las propiedades viscoelásticas de las películas determinan su capacidad para resistir y
acomodarse frente a deformaciones sin romperse. La reología interfacial (o de dos
dimensiones) define las relaciones entre tensión, deformación y velocidad de deformación en
términos de coeficientes de elasticidad y viscosidad, y está relacionada con el grado de
hidratación y las interacciones moleculares (Damodaran, 1989). Se presentan principalmente
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
23
dos clases de deformaciones: a) tensión de corte, que produce cambios de forma y b)
compresión/dilatación que produce cambios en el área. Debe especificarse qué clase de
tensión es aplicada en las mediciones de viscosidad superficial (Lucassen-Reynders, 1993).
Viscosidad superficial de corte:
Es la fuerza requerida para desplazar y mover las moléculas de un punto a otro y refleja la
atracción neta entre los polímeros de la película interfacial y entre esta última y las capas de
líquido adyacentes. Esta viscosidad superficial o resistencia a los esfuerzos de corte de la
superficie de la película suele ser muy alta, refleja la resistencia mecánica de la misma y es un
parámetro importante relacionado con la estabilidad de películas y emulsiones. Las
monocapas polipeptídicas en las interfases contienen entre 1 a 8 mg polipéptido/m² y exhiben
una viscosidad y elasticidad considerable a pesar de su espesor (1 a 10 nm). Luego de cierta
compresión de la película, los polipéptidos dentro de la misma colapsan y coagulan,
reflejando una extensiva interacción entre ellos. La viscosidad superficial se incrementa con el
espesor de la película y varía con el tipo de polipéptido, el tiempo y el pH (Phillips y col.,
1994b).
Elasticidad y viscosidad dilatacional:
Ambas propiedades pueden ser combinadas en un único parámetro, el módulo viscoelástico
superficial de la película “E“ que vincula la variación de la presión superficial() con los
cambios del área superficial “A” (E = -d/d(lnA)) (Kim, 1985). Durante la expansión de la
película ocurren diversos fenómenos: i) difusión del surfactante desde la subcapa en la
solución a la interfase y ii) reordenamientos de las moléculas adsorbidas dentro de la
interfase (los cuales pueden ser retardados por varios eventos: presencia de una barrera de
adsorción, lentos reordenamientos moleculares, formación de complejos, transiciones de fase
en la interfase y formación o destrucción de una estructura tridimensional) (Lucassen –
Reynders, 1993).
Las interacciones biopolímero - biopolímero, el espesor de la película, la presión superficial
desarrollada y las propiedades viscoelásticas están altamente influenciadas por la carga neta
del biopolímero. Las películas formadas a valores de pH cercanos al punto isoeléctrico son
más condensadas, más fuertes y se forman más rápido. Las películas compuestas por mezclas
de biopolímeros solubles con diferente carga neta y distintas relaciones entre residuos
hidrofílicos/hidrofóbicos, son usualmente más estables. La formación de uniones disulfuro
durante la formación de la película también aumenta la estabilidad. La fuerza de las películas
Introducción
24
proteicas tiende a incrementarse con el tiempo, reflejando reordenamientos y el incremento de
las interacciones entre las moléculas componentes de la película (Kinsella y Phillips, 1989).
La tabla 2 muestra los principales equipos utilizados para la evaluación de las propiedades
interfaciales.
Tabla 2. Principales equipos para la evaluación de las propiedades interfaciales de un agente emulsificante
Equipo Propiedad interfacial evaluada
Tensiómetro de placa Variación de en función de la concentración del agente emulsificante
Tensiómetro de anillo Variación de en función de la concentración del agente emulsificante
Tensiómetro de gota Cinética de adsorción interfacial. Variación de en función del tiempo. Reología interfacial.
Balanza de superficie Estructura de la monocapa. Reología interfacial (propiedades viscoelásticas del film interfacial)
Microscopío de ángulo Brewster (BAM) Morfología y espesor de la monocapa
Sin embargo existen numerosas metodologías que han sido desarrolladas para el estudio de
las propiedades interfaciales de biopolímeros y se describen a continuación.
Tensión superficial: puede ser determinada por el método del volumen de las gotas
(estalagmómetro de Traube), por caracterización de la forma y del tamaño de la gota (método
de Sessile) y por distintos métodos dinámicos como el anillo de Du Noüy, método de la gota
pendiente (Tornberg, 1978), tensiolaminómetro de la placa de Wilhelmy (Graham y Phillips,
1979a; German y col., 1985). En los últimos años se han desarrollado metodologías más
modernas: balanzas para películas tipo Langmuir donde se pueden estudiar procesos de
relajación y dilatación por aplicación de ciclos comprensión / expansión, por mediciones
dinámicas de presión superficial y área interfacial (Rodríguez Niño y col., 1998), método de
máxima presión sobre la burbuja, método del jet oscilatorio, método sometiendo gotas en el
interior de un capilar a oscilaciones con determinada frecuencia, medición de la amplitud y
frecuencia de ondas generadas en un capilar lleno de líquido (McClements, 1999).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
25
Características de flujo de películas superficiales (umbral de fluencia, viscosidades,
comportamiento no-newtoniano): viscosímetro de tracción viscosa de un canal (Mannheimer
y Schechter, 1970), viscosímetros de anillo (Blank y col., 1969; Blank y Britten, 1970) o
péndulo rotatorio (Miller y col., 1998), cilindros de sobreflujo (Prins, 1999).
Mediciones dilatacionales de la interfase: ensayos de compresión / extensión por
tensiolaminometría, cambios en el área interfacial por aumento o disminución del volumen de
una gota (Miller y col., 1998), técnicas con ondas sometiendo a la película a amplitudes
periódicas y pequeñas (Lucassen – Reynders, 1993).
Concentración superficial (): técnicas con marcadores radioactivos (Hunter y col.,
1991), incluyendo elipsometría (Graham y Phillips, 1979b); FRAP (fluorescence recovery
after photobleaching) donde se determinan por difusión con marcadores isotermas de
adsorción (vs ), características de drenado y de angostamiento de la película (Clark y col.,
1994), interferometría laser donde también se determina el espesor de la películas
(Damodaran, 1989; Wilde y Clark, 1996).
Espesor de la película: técnicas de barrido con luz (light – scattering), aplicación de rayos
X en pequeños ángulos (small-angle-X-ray-scattering), reflexión de neutrones (neutron
scattering), elipsometría (McClements, 1999).
Estudios morfológicos: microscopía del ángulo de Brewster (Rodríguez Niño y col.,
1998), microscopía electrónica con digitalización de imágenes de la formación de finas
películas líquidas suspendidas en aire (Clark y col., 1994; Miller y col., 1998); microscopía de
fuerza atómica (AFM) por medio de la cual se observan las redes interfaciales (Gunning y
col., 1996).
Estabilidad de la película: drenado de la película usando platos porosos, celda de
Sheludko.
Estudios de interacciones moleculares: las interacciones coloidales que involucran
biopolímeros adsorbidos en la interfase ocurren en general a distancias de nanómetros y son
una combinación de fuerzas de Van der Waals, electrostáticas y de interacciones entrópicas y
estéricas. La técnica de medición de fuerzas superficiales permite la determinación de las
magnitudes de las fuerzas moleculares entre dos películas superficiales, resultando una
técnica útil para determinar bases fundamentales de la funcionalidad y el comportamiento de
proteínas (Leckband y Israelachvili, 1993; Toprakcioglu, 1994).
Introducción
26
Además se pueden realizar estudios de estructura proteica, que consisten en dicroismo circular
con radiación UV lejana (Clark y col., 1989); técnicas bioquímicas de hidrólisis enzimática e
inmunoensayos que se aplican para el estudio de la orientación y conformación de las
proteínas en la interfase (McClements, 1999).
6. Emulsiones aceite-agua.
Muchos alimentos naturales o procesados son parcial o totalmente emulsiones o lo han
sido en alguna etapa durante la producción (McClements, 1999).
A pesar de ser los coloides más importantes en la vida diaria y encontrarse en numerosas
aplicaciones, las emulsiones son sistemas termodinámicamente inestables debido al contacto
desfavorable entre las gotas de aceite y la fase acuosa, y como el aceite y la fase acuosa tienen
densidades diferentes, siempre van a separarse en fases con el transcurso del tiempo (Moreau,
Kim, Decker & McClements, 2003).
Que posean estabilidad física durante el tiempo de interés es crucial y lograr la estabilidad
cinética es un desafío al formular emulsiones. Los requerimientos para que una emulsión sea
estable en el tiempo deseado son que no haya cambios en la distribución de tamaños de las
gotas o en su estado de agregación (Karlberg, Thuresson & Lindman, 2005). Esto puede
obtenerse por un control adecuado de los procesos de desestabilización como el cremado,
floculación y coalescencia. Muchas veces, estos procesos se presentan simultáneamente y
pueden retardarse mediante un aumento en la barrera de energía que hace que las gotas se
acerquen e interactúen.
Existen dos formas de lograr un aumento en la energía, por repulsión electrostática
mediante la creación de una doble capa cargada (surfactantes iónicos) y por repulsión estérica
debido a la adsorción de surfactantes no iónicos o polímeros.
El proceso de floculación puede también prevenirse si se aumenta la viscosidad de la fase
continua ya se reduce la velocidad de acercamiento de las gotas.
En una emulsión, los agentes emulsificantes promueven la formación de la emulsión y
estabilidad en el corto tiempo mediante acción en la interfase. Los estabilizantes brindan a la
emulsión estabilidad a largo plazo.
En una emulsión alimentaria, las proteínas tienen un rol principal como emulsificantes y
los polisacáridos son empleados principalmente como estabilizantes pero existen algunos
polisacáridos que actúan también como agentes emulsificantes (Karlberg y col., 2005).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
27
Las hidroxipropilmetilcelulosas se encuentran dentro de este grupo.
6.1 Procesos de formación de emulsiones
6.1.1. Homogeneización primaria y homogeneización secundaria
El proceso de convertir dos líquidos inmiscibles en una emulsión se denomina
homogeneización, mientras que el dispositivo diseñado para llevar a cabo este proceso
recibe el nombre de homogeneizador.
Para realizar una distinción según la naturaleza de los materiales de partida es
conveniente clasificar la homogeneización en dos categorías. La creación de una emulsión
a partir de dos fases líquidas separadas se denomina homogeneización primaria, mientras
que el proceso de reducir el tamaño de las gotas en una emulsión ya existente o pre-
emulsión se denomina homogeneización secundaria (Figura 9). La creación de un tipo
particular de emulsión puede involucrar una homogeneización primaria, secundaria o una
combinación de ambas (McClements, 1999).
1 2 Fase
acuosa
Aceite
Figura 9.: Representación esquemática del proceso de homogeneización para una emulsión aceite en agua (o/w): La homogeneización primaria (1) implica la conversión de dos fases separadas en una emulsión, mientras que en la homogeneización secundaria (2) se produce una reducción del tamaño de gota de la emulsión preexistente (Palazolo, 2006).
Introducción
28
6.1.2. Procesos críticos durante la formación de emulsiones
La formación de gotas en una emulsión es un proceso que requiere energía, la que es
suministrada por el homogeneizador. Durante la formación de las gotas el área interfacial
(A) aumenta considerablemente, de manera que la energía libre superficial del sistema se
incrementa en una cantidad . A , donde es la tensión interfacial. Sin embargo la
formación de gotas no es el único proceso que tiene lugar durante la preparación de una
emulsión. Se pueden distinguir tres procesos críticos: formación y ruptura de las gotas,
adsorción del agente emulsificante en la interfase y coalescencia de las gotas (Figura 10)
(McClements, 1999).
Durante el proceso de homogeneización primaria, la interfase entre las dos fases líquidas
inmiscibles se deforma en tal extensión, que comienzan a producirse gotas, en su mayoría,
de tamaño muy grande. Estas gotas deben deformarse y romperse para formar gotas de
menor tamaño, por fuerzas de ruptura. Las gotas de un líquido en otro que es inmiscible,
tienden a adoptar una forma esférica para minimizar la energía libre interfacial.
La fuerza responsable de la forma esférica está dada por la ecuación de Laplace:
donde PL es la diferencia de presión entre el interior y el exterior de la gota, es la
tensión interfacial y D es el diámetro de la gota. Las fuerzas interfaciales ejercen una
presión hacia el interior, que es mayor cuanto menor es el diámetro de las gotas y mayor la
tensión interfacial.
El agente emulsificante es necesario para la formación de la emulsión y para ello debe
adsorberse en la interfase, disminuyendo la tensión interfacial. Este proceso disminuye la
presión de Laplace (ecuación 1), lo cual facilita la deformación y en consecuencia, la
ruptura en gotas de menor tamaño. Además, la formación del film interfacial evita la
coalescencia de las gotas recién formadas (Figura 10).
El transporte de las moléculas del agente surfactante hacia la interfase durante el proceso
de homogeneización no está determinada por difusión sino por convección (Walstra,
1983). Por lo tanto, es sumamente importante que el agente emulsificante recubra la
interfase creada en una escala de tiempo similar a la del proceso de homogeneización. En
)1(D
け4ΔPL
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
29
caso de que la adsorción sea muy lenta en comparación con la capacidad del
homogeneizador de generar área interfacial, se produce el proceso de coalescencia de las
gotas recién formadas. Esto determina que el proceso de formación de la emulsión no sea
eficiente (Ford y col., 1997).
6.1.3. Fuerzas de ruptura en el proceso de homogeneización
Las gotas se forman mediante las fuerzas de ruptura, que se clasifican en fuerzas
viscosas y fuerzas inerciales. Las fuerzas viscosas generan esfuerzos de corte normales y
tangenciales en la superficie de la gota, mientras que las fuerzas inerciales generan
diferencias de presión en el seno de un fluido. En la práctica, es útil distinguir tres
situaciones que pueden darse durante la homogeneización: flujo laminar, flujo turbulento y
flujo cavitacional (Walstra, 1983).
En la situación de flujo laminar predominan las fuerzas viscosas, las cuales actúan sobre
la superficie de las gotas y producen su deformación y ruptura (en gotas más pequeñas). La
extensión de la deformación se caracteriza por un parámetro adimensional conocido como
número de Weber, WeL, el cual se define como el cociente entre el esfuerzo de corte
producido por las fuerzas viscosas y las fuerzas interfaciales conservativas que tienden a
restablecer la forma esférica de las gotas A un cierto valor de We L, llamado número de
Weber crítico
(We crit L), las fuerzas viscosas alcanzan un valor por encima de la cual se produce la
ruptura de las gotas. El parámetro We crit L, es función del cociente de viscosidades entre las
fases dispersa (D) y continua (C) (We = f(D/C)). Las gotas son menos estables a la
ruptura cuando la relación D/C está entre 0,1 – 1 y por lo tanto esta es la situación de
homogeneización más eficiente. Si D/C < 0,1 las gotas sufren procesos de deformación
sin ruptura; a alta relación de viscosidades (> 5), el tiempo de deformación no es
suficiente para producir la ruptura (Ford y col., 1997; McClements, 1999).
Introducción
30
Homogeneización
ADSORCIÓN RÁPIDA
ESTABILIZACION
ADSORCIÓN LENTA
COALESCENCIA
Figura 10. Proceso de homogenización que involucra la ruptura de gotas grandes en pequeñas y adsorción en la interfase creada del emulsificante (McClements, 1999).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
31
El movimiento global del líquido en un flujo turbulento se caracteriza por la presencia
de remolinos de gran tamaño que tienen asociada una energía cinética, la cual puede
transferirse a remolinos de menor tamaño en el seno del líquido sujeto a la agitación
mecánica. Si las gotas de aceite tiene un tamaño menor que los remolinos, estas gotas
siguen el movimiento de los mismos sin ruptura. En cambio, si el tamaño de las gotas es
mayor que el de los remolinos, los gradientes fluctuantes de velocidad en la superficie de
las gotas pueden deformarlas lo suficiente para producir su ruptura (Ford y col., 1997).
La cavitación es un fenómeno que ocurre en fluidos sometidos a cambios bruscos de
presión y es un fenómeno de formación y colapso de pequeñas burbujas de vapor en un
líquido. Un fluido se contrae cuando la presión crece y se expande cuando la presión
decrece. Cuando la presión en un líquido cae por debajo de una presión crítica (la presión
de vapor), se produce una cavidad, la cual crece por expansión y evaporación del fluido.
Durante una nueva compresión la cavidad colapsa repentinamente generando una onda de
choque que se propaga en el líquido circundante, causando deformación y ruptura de las
gotas (Walstra, 1983).
6.1.4. Equipos de homogeneización
Existen muchos tipos diferentes de homogeneizadores para la producción de emulsiones
alimentarias. La elección de un homogeneizador particular depende del volumen de
emulsión que se desea preparar, la naturaleza de los materiales a emulsificar, el tamaño de
gota deseado y el costo (McClements, 1999).
La intensidad de agitación mecánica se atribuye a la densidad de energía en el líquido (), la cual es la cantidad de energía mecánica disipada por unidad de volumen y por unidad de
tiempo (o la potencia por unidad de volumen). La cantidad total de energía mecánica
suministrada debe ser extremadamente grande, debido a la oposición de la presión de
Laplace (ecuación 1) (Walstra, 1983; Ford y col., 1997). La mayoría de la energía
suministrada actúa en un tiempo muy corto y localmente, disipándose como calor. Por tal
motivo, la temperatura del sistema debe controlarse, especialmente en los dispositivos de
alta . La tabla 3 muestra los principales tipos de homogeneizadores utilizados a escala industrial
y de laboratorio.
Los homogeneizadores de baja ( 3000 r.p.m.) y de alta velocidad (hasta 25000 r.p.m.) son
adecuados para producir emulsiones a partir de las fases líquidas separadas. El mecanismo
Introducción
32
de ruptura es un efecto combinado de fuerzas viscosas bajo un régimen de flujo laminar y
turbulento. Al tener baja densidad de energía () producen emulsiones de tamaño de gota
relativamente grande. Los homogeneizadores que tienen diseño rotor/estator de alta
velocidad (Ultraturrax – Polytron) son más efectivos que los de diseño a cuchilla.
Debido al número elevado de revoluciones del rotor, las fases líquidas a procesar se
aspiran axialmente y se presiona a través de las ranuras del conjunto rotor/estator. El
movimiento de alta velocidad a través de las ranuras produce el esfuerzo de corte
responsable de la ruptura de las gotas.
Homogeneizador Densidad de energía
Modo de operación
Mecanismo de ruptura
Tamaño de gota (d)
(m)
Viscosidad de la
muestra (e) () (a) (b) (c)
Homogeneizadores de baja velocidad (sistemas cuchilla)
B D L, T 5 B - M
Homogeneizadores de alta velocidad
(sistema cuchilla y rotor/estator)
B D L, T 2 B - M
Molino coloidal I C L, T 1 M - A
Homogeneizador a válvula de alta
presión
A C T, C 0,1 B - M
Homogeneizador ultrasónico
A D T, C 0,1 B – M
Homogeneizador de membrana
A C T 0,1 B – M
Los molinos coloidales son adecuados para la homogeneización de emulsiones de alta
viscosidad y tienen un diseño rotor/estator al igual que los homogeneizadores de alta
velocidad. La intensidad del esfuerzo de corte en este dispositivo se puede regular por
Tabla 3. Principales dispositivos de homogeneización y características: a) A = alta; M= mediana; B = baja; b) C = continuo; D = discontinuo o batch; c) L= flujo laminar; T= flujo turbulento; C= cavitación; d) tamaño de gota máximo, en promedio; e) B= baja; M= mediana; A=alta. (Palazolo, 2006).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
33
variación de la distancia entre el rotor y el estator. Aunque se pueden homogeneizar fases
separadas, son más eficientes para la reducción del tamaño de gota.
Los homogeneizadores a válvula de alta presión son sólo eficaces en reducir el tamaño
de gota de una emulsión preexistente y por ende, realizan una homogeneización
secundaria. A través de una bomba, la pre-emulsión es forzada a pasar a través de una
válvula a presión elevada (entre 10 y 50 MPa). Las gotas de gran tamaño se rompen por un
efecto combinado de flujo turbulento y cavitación. En muchos equipos, la presencia de una
segunda válvula regulada a una presión más baja, favorece la obtención de emulsiones de
gota de distribución de tamaño de gota monomodal.
En los homogeneizadores de membrana la fase dispersa se hace pasar forzosamente a
través de una membrana porosa de vidrio o cerámica. El pasaje forzado a través de los
pequeños orificios de la membrana produce el esfuerzo de corte necesario mientras el
agente emulsificante disperso en la fase acuosa se adsorbe en la superficie de las gotas
generadas. El tamaño de gotas producido depende de la rapidez con la que el agente
emulsificante se adsorbe en la interfase. La principal característica de la homogeneización
con membranas es la formación de emulsiones de distribución de tamaño monomodal.
En los homogeneizadores ultrasónicos, la fuente convierte el voltaje suministrado
(energía eléctrica) en ondas ultrasónicas (hasta 20 kHz) que se transmiten al seno del
líquido y producen millones de cavidades microscópicas. El colapso de estas cavidades
genera ondas de choque que producen deformación y ruptura de las gotas. La temperatura
dentro de las cavidades es extremadamente alta y la presión, superior a 500 atmósferas. Sin
embargo los tiempos de vida media de las cavidades están en el orden de los
microsegundos, con lo cual la energía liberada por cada cavidad es mínima. La alta
densidad de energía de este dispositivo de homogeneización se atribuye al efecto
acumulativo del gran número de cavidades generadas. Hay distintos diseños para uso de
laboratorio (piezoeléctricos, puntas sonicadoras) e industrial (generación de campo
ultrasónico por aguja vibrante) (McClements, 1999).
Introducción
34
6.2. Evaluación de la eficiencia de los procesos de homogeneización
La formación de una emulsión tiene por objeto aumentar del área interfacial entre las fases
continua y dispersa. Al ser un proceso termodinámicamente desfavorable, es necesario el uso
de emulsionantes para evitar los fenómenos de desestabilización.
La eficiencia de un emulsificante está gobernada por varias características, incluyendo la
mínima cantidad necesaria para producir una emulsión estable, su habilidad para prvenir la
agregación de las gotas, la velocidad a la cual se adsorbe a la superficie de una gota durante
la homogeneización, la tensión interfacial y el espesor y la viscoelasticidad de la película
interfacial formada. Todas estas características dependen del alimento en el cual el
emulsificante será empleado y de las condiciones de almacenamiento (pH, fuerza iónica, tipo
de aceite, interacción entre los ingredientes, temperatura y agitación mecánica) (Sherman,
1995; McClements, 1999).
6.2.1. Métodos basados en la dispersión de luz
Muchas propiedades importantes de las emulsiones como la estabilidad a largo plazo, la
apariencia y la textura están íntimamente ligadas al tamaño de las gotas que contienen. Por
consiguiente es sumamente importante poder contar con métodos para medir este parámetro
de manera sencilla y reproducible.
Las técnicas basadas en la dispersión estática de luz se utilizan para determinar tamaños de
partícula de emulsiones comprendidos entre 0,1 y 1000 m; por lo tanto se aplican
exhaustivamente a la caracterización de emulsiones alimentarias. Cuando un haz de luz incide
a través de la emulsión, el mismo es dispersado por las gotas en distintas direcciones. La
intensidad con la que se produce este fenómeno está determinada principalmente por el
tamaño de las gotas (y por ende, el área creada durante el proceso de homogeneización) la
longitud de onda de la luz y la diferencia entre los índice de refracción de las fases dispersa y
continua. La interacción de una onda electromagnética con una emulsión se caracteriza
mediante un patrón de dispersión, el cual representa la dependencia angular de la intensidad
de luz que emerge de la emulsión. A través de teorías adecuadas, este patrón de dispersión
puede dar información sobre la fracción volumétrica de la fase dispersa y el tamaño de gota
de las emulsiones.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
35
La interacción entre las ondas electromagnéticas y las gotas en la emulsión puede dividirse
en tres regímenes, de acuerdo a la relación entre el radio de las gotas (R) y la longitud de onda
de la radiación incidente (): régimen de longitud de onda larga (R< /20), régimen de
longitud de onda intermedia (R /20) y régimen de longitud de onda corta (R > /20).
La mayoría de las emulsiones alimentarias contienen gotas cuyo tamaño están en el
régimen de longitud de onda intermedio. El patrón de dispersión es extremadamente
complejo, porque las ondas de luz dispersadas por distintas partes de la misma gota están
fuera de fase y por lo tanto pueden interferirse entre si de manera constructiva o destructiva.
La teoría de Mie fue desarrollada para interpretar patrones de dispersión de emulsiones
diluidas que contienen partículas esféricas independientemente de su tamaño. Esta teoría
asume que las ondas de luz son dispersadas por una partícula por única vez, de manera que
puede aplicarse solo en emulsiones diluídas, cuando la concentración de gotas, , es menor a
0,05 %. En emulsiones más concentradas, el haz de luz dispersado por una gota interactúa
inmediatamente con otra gota, de manera que el patrón de dispersión se altera. La teoría de la
dispersión de luz múltiple se desarrolló para el análisis de patrones de dispersión de
emulsiones concentradas.
La dispersión de la luz por parte de las emulsiones está estrictamente ligada con su
apariencia. La intensidad de luz dispersada es mayor cuando la longitud de onda de la luz
incidente está en el mismo orden que el tamaño de las gotas y cuando la diferencia de índices
de refracción entre las fases continua y dispersa es mínima. Por tal motivo, la mayoría de las
emulsiones alimentarias tienen una apariencia opaca, mientras que las microemulsiones, al
tener un tamaño de gota que cae dentro de un régimen de longitud de onda larga (R< /20)
dispersan la luz con menor intensidad y por ende, son emulsiones traslúcidas (McClements,
1999).
6.2.2. Distribuciones de tamaño de partícula
Las emulsiones alimentarias son siempre polidispersas, es decir, el tamaño de todas las
gotas varían dentro de un rango definido entre un valor mínimo y un valor máximo,
especialmente aquellas que son de fuente natural. En el caso de emulsiones elaboradas de
composición más simple, los métodos de homogeneización normalmente empleados tampoco
tienen la capacidad de generar emulsiones monodispersas.
Por lo tanto, para el análisis del tamaño de gota de las emulsiones alimentarias es
conveniente referirse en términos de una distribución de tamaño de partícula. En una
Introducción
36
emulsión monodispersa este concepto carece de sentido por lo cual el tamaño de las gotas
esféricas puede caracterizarse de manera completa e inequívoca a través de un solo parámetro,
el radio (R) o el diámetro (D). Sin embargo, las emulsiones polidispersas requieren un análisis
más complejo. Dado que el diámetro de las gotas está siempre comprendido entre un valor
mínimo y un máximo, es conveniente dividir la escala de tamaños en varios rangos más
pequeños y discretos, detallando el número de gotas que entran dentro de cada rango. Los
resultados pueden presentarse en forma tabular o mediante un histograma. En la práctica es
más conveniente e informativo presentar los datos como una frecuencia de tamaños en
número, en superficie o en volumen.
f n = ni / N (2)
f s = ai / A (3)
f v = vi / V (4)
ni, ai y vi son el número, área y volumen de las gotas del í-ésimo rango; N es el número
total de gotas, A es el área total creada durante el proceso de homogeneización y V es el
volumen total de la gotas en la emulsión.
La distribución de tamaño de partícula también puede representarse como curvas
continuas: la función de distribución F (Di) y la función de distribución acumulativa C
(Di). La función de distribución en número se genera de manera tal que el área bajo la
curva en el rango de dos diámetros Di y Di + dDi es igual al número de partículas en dicho
rango, ni, de manera tal que ni = F(Di) . dDi. A partir del mismo razonamiento puede
generarse las correspondientes funciones de distribución en superficie y en volumen.
Asumiendo que las emulsiones están formadas por gotas esféricas, las funciones de
distribución en número, Fn (Di), superficie, Fs (Di) y volumen, Fv (Di) pueden relacionarse
entre sí a partir de las siguientes expresiones:
Fv (Di) = (1/6) . . Di3 . Fn(Di) (5)
Fs (Di) = . Di2 . Fn (Di) (6)
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
37
Las funciones de distribución son monomodales cuando presentan un único pico,
bimodales cuando presentan dos picos principales o multimodales si hay más de dos picos.
En general, la complejidad de las funciones de distribución hace imposible la descripción
mediante un modelo matemático. En algunos casos, cuando las funciones de distribución
son monomodales, se puede hacer un modelado mediante una función de distribución
normal o una función de distribución normal logarítmica.
Por otra parte, las funciones acumulativas C (Di) representan el porcentaje en número,
superficie o volumen de las gotas que son menores a Di. Los gráficos C (Di) en función de
Di son curvas sigmoidales, donde C (Di) varía entre 0 y 100 %. La Figura 11 muestra un
ejemplo de distribuciones en número, superficie y volumen para una emulsión o/w.
La utilización de modelos matemáticos para las funciones de distribución tiene la ventaja
de describir un sistema complejo mediante un número pequeño de parámetros. Aunque en
la mayoría de los casos no puede aplicarse un modelo matemático de manera satisfactoria,
a partir de las funciones de distribución pueden calcularse distintos diámetros promedio
(Tablas 4 y 5).
La determinación de los diámetros promedio D1,0, D2,0 y D3,0 requieren el conocimiento
del número total de gotas. El conteo de gotas en una emulsión es un proceso
extremadamente tedioso y complejo, de manera que se utilizan los diámetros promedio de
Sauter (D3,2) y de De Brouker (D4,3), cuyas fórmulas no contienen el número total de gotas
(Tabla 4). Estos diámetros se conocen como “moment diameters” e introducen otro
término lineal en el diámetro, de manera que en el numerador el término superficial tiene
una dependencia con D3 y el volumen con D4 (McClements, 1999; Wasltra, 1983; Rawle,
2005).
Introducción
38
0,1 1 10 100 10000
3
6
9
12
15
18
d
Fn (Di) Fs (Di) Fv (Di)
N (%
), S
(%),
V (%
)
Tamaño de partícula ( m)
0,1 1 10 100 10000
2
4
6
8
b
Sup
erfic
ie (%
)
Tamaño de partícula ( m)0,1 1 10 100 1000
0
3
6
9
12
15
18
a
N
úmer
o (%
)
Tamaño de partícula ( m)
0,1 1 10 100 10000
2
4
6
8
10
12
c
Vol
umen
(%)
Tamaño de partícula ( m)
0,1 1 10 100 10000
20
40
60
80
100e
Cn (Di) Cs (Di) Cv (Di)
N (%
), S
(%),
V (%
)
Tamaño de partícula ( m)
Figura 11: Distribuciones de tamaño de partícula para una emulsión multimodal: a), b) y c), distribuciones en número,
superficie y volumen, expresadas como histograma; d) y e) las mismas distribuciones anteriores expresadas como una función
de distribución continua o una función de distribución acumulativa (Palazolo, 2006).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
39
Tabla 4: Diferentes formas de expresar el diámetro promedio de las gotas en una emulsión polidispersa. Abreviaturas: N = número; S = superficie; V= volumen (Palazolo, 2006).
Diámetros promedio Notación Tipo de distribución relacionada
Diámetro promedio en número
D1,0 N
Diámetro promedio en superficie
D2,0 S
Diámetro promedio en volumen
D3,0 V
Diámetro promedio de Sauter
D3,2 S
Diámetro promedio de De Brouker
D4,3 V
Percentil 0,5 o 50 % (mediana)
D x,0,5 (x = N, S, V)
N, S, V
Tabla 5: Definición matemática de los diámetros promedio más utilizados en emulsiones
(Palazolo, 2006).
3ii
4ii
4,3
2ii
3ii
3,2
3ii
i
3ii
3,0
2ii
2ii
2,0
iiii,
Dn
DnD
Dn
DnD
N
Dn
n
DnD
N
Dn
ni
DnD
N
Dn
ni
Dn01D
Introducción
40
El diámetro promedio D3,2 se puede relacionar con el área interfacial específica (AIE, en
m2/ml de emulsión) a partir de la siguiente expresión (Walstra, 1983):
AIE = 6 . / D3,2 (7)
donde es la fracción volumétrica.
Las emulsiones polidispersas también pueden caracterizarse mediante los percentiles (D x, y)
donde x = n, s o v, dependiendo si la distribución es en número, superficie o volumen y es un
número cualquiera comprendido entre 0 y 1. El percentil 0,5 o del 50 % (D x, 0,5) es el más
común y se denomina mediana de la distribución. La mediana es el valor de tamaño de
partícula que divide a la población de gotas de la emulsión en dos partes iguales, es decir 50
% por encima y 50 % por debajo. Los percentiles 0,1 (10 %) y 0,9 (90 %) también se utilizan
para dar un parámetro relacionado con la polidispersidad (P) de la emulsión:
P = [(D x, 0,9 - D x, 0,1) / D x, 0,5 ] (8)
de manera que la emulsión es más polidispersa cuanto mayor es el valor de P. Los percentiles
Dx, y pueden calcularse fácilmente a partir de las funciones acumulativas.
La determinación del tamaño de partícula debe hacerse en condiciones de alta dilución ( <
0,05) y con agitación, con el objeto de que las gotas se distribuyan de manera uniforme. Un
volumen pequeño de la emulsión se coloca en un recipiente con agua y un haz de radiación
láser incide sobre una cubeta interna transparente por donde recircula la emulsión diluida. La
luz dispersada en distintos ángulos por gotas de diferente tamaño pasa por un complejo
sistema óptico e incide posteriormente sobre un arreglo de detectores obteniendo un patrón
angular de luz dispersada. El software incorporado en el equipo se encarga de traducir este
patrón en la correspondiente distribución de tamaño de partícula (McClements, 1999) (figura
12).
La teoría de Mie ha sido desarrollada para interpretar los patrones de dispersión de luz
de partículas homogéneas y esféricas, independientemente del tamaño de las mismas respecto
a la longitud de onda de la radiación incidente. Esta teoría concuerda muy bien con los
resultados experimentales y es utilizada por la mayoría de los analizadores de tamaño de
partícula. La traducción del patrón angular de dispersión de luz en la correspondiente
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
41
distribución de tamaño de partícula para una emulsión según la teoría de Mie, requiere el
conocimiento previo del índice de refracción de la fase dispersa y del índice de absorción de
luz que pueda causar el film interfacial. Aunque estos parámetros podrían determinarse
experimentalmente, generalmente están incluidos en una base de datos del software del
equipo.
Figura 12. Esquema de los componentes constituyentes del equipo de dispersión de luz (McClements, 1999).
Además, las distribuciones de tamaño de partícula pueden obtenerse en medios
ópticamente opacos, es decir en las emulsiones concentradas sin realizar una dilución previa:
- Se han desarrollado equipos que permiten obtener distribuciones de tamaño de partícula
en emulsiones concentradas por dispersión de luz. Sin embargo, tienen aplicación en
emulsiones cuyo tamaño de gota es muy pequeño (< 5 m) y por ende, sólo puede aplicarse a
algunos tipos de emulsiones alimentarias (McClements, 1999).
- Las espectroscopía acústica se basa en la interacción de las gotas de la emulsión con ondas
de ultrasonido de baja intensidad. Las mismas son dispersadas, obteniendo un espectro de
atenuación a partir del cual se obtiene la fracción volumétrica de fase dispersa () y
distribución de tamaño de partícula (Dickinson y col., 1997; Alba y col., 1999; McClements,
1999). Las ondas ultrasónicas son de baja intensidad y la energía involucrada es de varios
Emulsión diluída Emulsión diluída Detectores ubicados a
distintos ángulos
Introducción
42
órdenes de magnitud menor a las utilizadas para la emulsificación (Dickinson y McClements,
1996).
- La resonancia magnética nuclear de pulsos permite la obtención de la distribución de
tamaño de partícula de las emulsiones. Aunque los equipos tienen un costo muy elevado, la
principal ventaja es que también permite la caracterización de emulsiones w/o, lo cual no
puede realizarse con los métodos mencionados anteriormente (Dickinson y McClements,
1996).
6.3 Estabilidad de emulsiones: estabilidad termodinámica y estabilidad cinética.
La estabilidad de una emulsión se refiere a la capacidad de la misma de resistir
modificaciones de sus propiedades en función del tiempo. Las propiedades de una emulsión
pueden cambiar debido a la ocurrencia de procesos físicos y químicos. Los procesos físicos
originan variación en la distribución espacial o el tamaño de las gotas, mientras que los
procesos químicos producen una alteración de los componentes de las fases dispersa y/o
continua de la emulsión. En la práctica, estos procesos pueden actuar de manera simultánea.
El período de tiempo en que una emulsión debe permanecer estable depende de la
naturaleza del producto. Mientras que algunos productos deben permanecer estables durante
largos períodos de tiempo (mayonesas, aderezos, “soft drinks”), otros requieren un proceso de
desestabilización controlada durante su manufactura o elaboración (margarinas, manteca y
cremas heladas). La desestabilización total implica la separación de las fases que constituyen
el sistema y obviamente, esta situación no es deseable en una emulsión alimentaria.
Al considerar la estabilidad de una emulsión, es importante distinguir entre la estabilidad
termodinámica y la estabilidad cinética. La termodinámica trata sobre la posibilidad de que
un proceso puede ocurrir o no de manera espontánea; en cambio la cinética se refiere a la
velocidad con la que dicho proceso tiene lugar.
La inestabilidad termodinámica de una emulsión se demuestra de manera sencilla si se
agita vigorosamente un recipiente sellado que contiene agua y aceite. La emulsión
ópticamente opaca que se forma inicialmente se desestabiliza a lo largo del tiempo hasta
observar una capa superior de aceite sobre la capa acuosa, en la cual se minimiza el área de
contacto entre las fases inmiscibles. El origen de la inestabilidad termodinámica puede
ilustrarse comparando la energía libre de un sistema que contiene una fase oleosa dispersa y
una fase acuosa continua, antes y después de la homogeneización. Para simplificar el análisis
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
43
se asume que las densidades de la fase acuosa continua y dispersa son iguales, de manera que
el estado inicial consiste en una única gota suspendida en la fase continua en lugar de una
capa de aceite sobre la capa acuosa (McClements, 1999) (figura 13).
En el estado inicial, antes de la homogeneización la energía libre del sistema está dada por:
Gi = Gi fd + Gi fc + Gi I – TSi conf (9)
y en su estado final, después del proceso de emulsificación:
Gf = Gf fd + Gf fc + Gf I – TSf conf (10)
Gfd, Gfc y GI son las energías libres de las fases dispersa, continua e interfacial
respectivamente, T es la temperatura absoluta y Sconf es la entropía configuracional de las
gotas de la emulsión; los superíndices i y f se refieren los estados inicial y final del sistema.
Las energía libre de la fase continua y dispersa antes y después de la formación de la emulsión
permanecen constantes de manera que la diferencia de energía libre de los estados inicial y
final del sistema (G formación) viene dada por:
G formación = Gf I – Gi I – (TSf conf – TSi conf) = GI - TS conf (11)
Estado inicial Estado final
Figura 13. La formación de una emulsión es termodinámicamente desfavorable debido al aumento en el área superficial entre las fase aceite y acuosa.
Introducción
44
Las fases acuosa y dispersa son inmiscibles o muy poco miscibles entre sí, de manera que
las mismas presentan una tensión interfacial (). Por consiguiente el término GI es igual al
producto de y el incremento de área entre las fases acuosa y dispersa (A) de manera que:
G formación = A - TS conf (12)
El cambio de energía libre interfacial ( A) es siempre positivo porque el área interfacial
se incrementa después de la formación de la emulsión, mientras que la entropía
configuracional
(- TS conf) es siempre negativo, debido a que el ordenamiento posible que las gotas pueden
adoptar en el estado emulsificado es mucho mayor que en el estado inicial. En la mayoría de
las emulsiones alimentarias, con gotas que varían de 0,1 a 100 m, el término configuracional
es mucho menor que la energía libre interfacial (McClements, 1999).
La ecuación anterior se reduce a:
G formación = . A (13)
Por consiguiente la formación de una emulsión es un proceso termodinámicamente
desfavorable, debido al incremento de área interfacial. El término configuracional sólo puede
dominar el comportamiento del sistema en emulsiones donde la tensión interfacial entre las
fases continua y dispersa es extremadamente baja de manera que se forman sistemas
termodinámicamente estables. Este tipo de sistemas reciben el nombre de microemulsiones
para distinguirlos de las emulsiones.
El cambio de energía libre asociado con la formación de una emulsión determina si el
proceso es o no termodinámicamente desfavorable, pero no da ninguna indicación sobre la
velocidad a la cual las propiedades de la emulsión cambian con el tiempo ni del (de los)
mecanismo (s) responsables de estos cambios. El hecho de que las emulsiones permanezcan
en muchos casos en un estado cinéticamente estable (o metaestable) puede atribuirse a la
existencia de una energía de activación (G*), la cual debe superarse para alcanzar la
separación total de las fases, el estado termodinámico más estable (Figura 14). Para que una
emulsión sea cinéticamente estable el valor de G* debe ser significativamente mayor a la
energía térmica ET (ET = kT). En realidad, debido a que hay diferentes mecanismos por los
cuales una emulsión puede desestabilizarse es muy común que las emulsiones tengan más de
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
45
un estado metaestable, cada uno de ellos con su propia energía de activación. El pasaje de un
estado metaestable a otro puede ser suficiente para tener un efecto indeseable sobre la
estabilidad.
La estabilidad cinética de las emulsiones se atribuye a la naturaleza dinámica de estos
sistemas bifásicos. Las gotas de una emulsión, lejos de permanecer estáticas están en continuo
movimiento y colisionan unas con otras debido al movimiento browniano, la gravedad o
fuerzas externas aplicadas. Si las gotas se alejan o se fusionan después de una colisión
depende de la naturaleza de las interacciones coloidales entre ellas. Por lo tanto la estabilidad
cinética de las emulsiones está determinada por la dinámica y las interacciones de las gotas
que contienen.
La teoría de la estabilidad coloidal o teoría DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Oberveek)
establece que la estabilidad cinética de un sistema coloidal depende esencialmente de la
dependencia del potencial creado entre la superficie de dos gotas con la distancia que las
separa (h).
Es muy importante recalcar que la teoría DLVO no permite interpretar todos los
fenómenos que afectan la estabilidad de la emulsión (Friberg, 1997; McClements, 1999). La
complejidad de la estructura de las proteínas y aún de los agentes emulsificantes no proteicos
genera otras interacciones coloidales (Tabla 6).
El potencial total W (h) por lo tanto viene dado por la suma de los potenciales generados
por todas las interacciones coloidales (Tabla 6)
W (h) = W (VdW) + W (elect) + W (est) + W (hid) + W (dep) + W (hidrat) + W (fluc term) (14)
Depende de cada sistema el que algunas de las interacciones posibles sean despreciables
frente a otras, las cuales pasarán a ser las que gobiernan las características de la emulsión.
En el caso de que las emulsiones estén estabilizadas por proteínas, en base a las
características estructurales de estas macromoléculas, las interacciones electrostáticas son
muy importantes lejos del punto isoeléctrico (carga neta elevada) y se hacen despreciables
cerca del mismo, en el cual se intensifican las interacciones de carácter hidrofóbico.
Introducción
46
Tabla 6: Características de las interacciones coloidales posibles entre las gotas en una emulsión (Palazolo, 2006).
Interacción Signo Intensidad Rango Efecto del pH
Efecto de la fuerza iónica
Efecto de la temperatura
Van der Walls A F L N Reducido Disminuye Electrostática R D - F C - L S Reducido Aumenta Estérica: De mezclado A o R D - F C DS DS DS
Elástica R F C DS DS Aumenta Depleción A D - F C DS DS Aumenta Hidrofóbica A F L N S Aumenta Hidratación R F C - L Indirecto Indirecto Disminuye Fluctuación térmica
R F C Indirecto N Aumenta
A: atracción, R: repulsión, F: fuerte, D: débil, L: largo ( 10 nm), C: corto ( 10 nm), DS: dependiente del
sistema,
S: si, N: no
6.4 Mecanismos físicos de desestabilización de emulsiones
Desde el momento en que se forma una emulsión, inmediatamente después de la
homogeneización (y a veces durante), comienza el proceso de desestabilización, el cual tiende
a disminuir el área interfacial y llegar al estado termodinámico más estable, las fases
separadas. Existen distintos mecanismos que contribuyen simultánea y sinérgicamente a la
desestabilización y son la consecuencia de distintos fenómenos físicos, los cuales se
relacionan con la diferencia de densidad de las fases continua y dispersa, las interacciones
coloidales entre las gotas y la estructura y viscoelasticidad del film interfacial (McClements,
1999).
En el caso particular de las emulsiones alimenticias, los cambios producidos por la
desestabilización deben controlarse para que las características de la emulsión se mantengan
dentro de un rango de valores estrechos, fuera del cual ya no sería posible su utilización o
comercialización (Wagner, 2000).
El cremado y la sedimentación se conocen conjuntamente como fenómenos de separación
gravitacional. El cremado describe el movimiento ascendente de las gotas debido a la menor
densidad de la fase dispersa respecto a la de la fase continua, mientras que la sedimentación
describe el movimiento de las gotas en sentido contrario, precisamente también por un
efecto de diferencia de densidad. En general (aunque no de manera exclusiva) el cremado es
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
47
más común en emulsiones o/w y la sedimentación, en emulsiones w/o. Durante el proceso
de cremado se forma una fase inferior o suero, la cual está empobrecida en gotas y una fase
superior enriquecida en gotas, la fase crema. (Figura 14).
La floculación y la coalescencia son mecanismos de desestabilización que surgen como
consecuencia de un fenómeno de agregación entre las gotas. En el primer caso, las gotas
mantienen su integridad individual, mientras que en la coalescencia el proceso de agregación
entre dos gotas culmina con la formación de una gota de mayor tamaño y por lo tanto
implica la ruptura de la pelicula interfacial. Si la coalescencia se da en mayor extensión,
puede conducir eventualmente a la formación de una capa de aceite libre en la parte superior
de la emulsión (Friberg, 1997). Este fenómeno se conoce, en inglés, como “oiling off” y
culmina con la separación total de las fases constituyentes del sistema (Figura 14).
La desproporción de Ostwald es causada por transporte difusivo de la fase dispersa desde
las gotas más pequeñas a las más grandes en una emulsión. El efecto es el crecimiento de las
gotas más grandes a expensas de las más pequeñas. En la práctica, es muy difícil distinguir
este proceso del de coalescencia. Sin embargo, la insolubilidad del aceite en la fase acuosa
impide el transporte difusional por lo que este mecanismo es más importantes en otros
sistemas dispersos, como las espumas donde el gas de las burbujas puede difundir a través
de la fase acuosa. La presencia de sustancias hidrosolubles en la fase oleosa dispersa
(alcoholes, ácidos grasos de cadena corta) puede inducir en las emulsiones un cierto grado
de desproporción (Friberg, 1997; McClements, 1999).
La inversión de fase es un proceso en el cual se produce un cambio desde una emulsión
aceite en agua (o/w) a una emulsión agua en aceite (w/o) y viceversa. Este mecanismo de
desestabilización es muy importante en la manufactura de algunos productos alimenticios,
como la margarina y la manteca (Dickinson y Stainsby, 1982, McClements, 1999). La base
de este fenómeno es muy compleja, y se cree que involucra aspectos fisicoquímicos de la
floculación, coalescencia, coalescencia parcial (cuando las gotas son semicristalinas) y
formación de emulsiones. Después de la inversión de fase, las propiedades de la emulsión
pueden cambiar considerablemente.
Los mecanismos de desestabilización no ocurren de manera separada o aislada. Una
emulsión puede desestabilizarse simultáneamente por distintos mecanismos, dependiendo de
la viscosidad de la fase continua, el tipo de agente emulsificante empleado y su concentración
inicial en la fase acuosa (u oleosa), la magnitud de , la adición de componentes (sales,
Introducción
48
azúcares), el pH y la aplicación de distintos tratamientos, como trabajo mecánico, ciclos de
temperatura y congelación. En este caso, no se han incluido los mecanismos químicos de
desestabilización, producto de procesos tales como la oxidación lipídica o alteración por
crecimiento microbiano. Los cambios químicos en algunos componentes de la emulsión
pueden favorecer la desestabilización de una emulsión por mecanismos físicos (McClements,
1999).
Emulsión
inicial 1
2
3
4 5
Figura 14. Mecanismos de desestabilización más importantes de una emulsión aceite en agua (o/w): 1- Cremado; 2- Floculación; 3- Coalescencia. Si el proceso de coalescencia continua en el tiempo, se forma una capa de aceite libre en la parte superior de la emulsión (oiling off, 4), que culmina con la separación total de fases (5). Los mecanismos de desestabilización no son independientes. En general, el cremado y la floculación anteceden a la coalescencia (Palazolo, 2006).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
49
5.4.1. Cremado
Como se mencionó anteriormente, el cremado es un proceso de separación gravitacional.
La importancia del cremado en la industria alimentaria es muy alta y se estima que el 40 %
del costo de desarrollo de nuevas emulsiones alimentarias se atribuye a la realización de
ensayos de estabilidad frente a este mecanismo, porque da el primer indicio visual de la
desestabilización (Robins, 2000). La velocidad de cremado de una emulsión (v) puede
evaluarse a través de la ley de Stokes:
donde R es el radio de las gotas, es la diferencia de densidad entre la fase continua y
dispersa y es la viscosidad del medio. Según la ley de Stokes, la velocidad es directamente
proporcional al cuadrado del radio de las gotas, a la diferencia de densidad e inversamente
proporcional a la viscosidad del sistema. Sin embargo, esta ley tiene muchas limitaciones para
describir el comportamiento de las emulsiones. Las más importantes se describen a
continuación:
1- En primer lugar las emulsiones son siempre polidispersas (en el mejor de los casos,
tienen una distribución de tamaño de gota monomodal, lo cual no implica un único tamaño de
gotas), por lo tanto, hay diferentes “poblaciones” de gotas de distinto tamaño y por ende, con
una velocidad de cremado diferente. La velocidad de cremado de las gotas más pequeñas
podría frenar el movimiento de las gotas de mayor tamaño, especialmente en emulsiones de
alto (concentración de gotas).
2- La ecuación de velocidad de cremado no tiene en cuenta el movimiento browniano,
debido a la agitación térmica (E = kT). Por un efecto entrópico, este movimiento tiende a
distribuir las gotas de manera uniforme en el seno de la emulsión, lo que se opone al
movimiento ascendente de las gotas. El efecto es importante si el diámetro de las mismas es
menor a 1 m (McClements, 1999).
)15(η9
gΔhR2v
2
Introducción
50
3- Dado que la ley de Stokes predice la velocidad de cremado “a dilución infinita” no
tiene en cuenta el efecto de un aumento en ni las interacciones coloidales entre las gotas en
la emulsión. La magnitud con la que se dan estas interacciones puede determinar la formación
de flóculos, por lo que la velocidad de cremado se puede dar en mayor o menor grado de lo
que podría predecir la ecuación de velocidad de cremado.
4- El film interfacial está altamente hidratado, debido a la interacción de las moléculas de
agua con los restos hidrofílicos de los emulsificantes adsorbidos en la interfase. El efecto es
particularmente importante en gotas de menor tamaño, en la que la magnitud de espesor del
film interfacial es importante respecto al diámetro de la gota. En ese caso, la densidad de las
gotas es más cercana a la de la fase continua circundante, efecto que retarda la velocidad de
cremado.
5- La velocidad de cremado podría disminuir drásticamente durante el almacenamiento
estacionario si la fase continua tiene un comportamiento no-newtoniano, con una alta
viscosidad o con un umbral de fluencia (la emulsión se comporta como sólido en reposo y
como fluido por la aplicación de un esfuerzo de corte), aún cuando el diámetro de las gotas no
sea demasiado pequeño. Esto sucede normalmente en emulsiones alimentarias como la
mayonesa y aderezos.
En una emulsión o/w el cremado, se puede estudiar por distintos métodos. Según su
naturaleza, estos métodos pueden ser destructivos o no destructivos.
En los métodos destructivos, se producen modificaciones permanentes en la emulsión, de
manera que la misma no puede volver a utilizarse para una nueva medición.
Los métodos no destructivos, en cambio son más adecuados para evaluar la cinética de
cremado. Los métodos no destructivos pueden clasificarse en métodos mono-dato y multi-
datos (Robins, 2000). En los métodos mono-dato se obtiene un solo parámetro a un
determinado tiempo, mientras que los métodos multi-dato permiten obtener un perfil de datos
originado a partir de un barrido o “scanning” de la muestra. En muchos casos, el proceso de
floculación puede darse de manera simultánea al de cremado, por lo que estos métodos
evalúan la cinética de cremado-floculación.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
51
Tabla 7: Métodos para evaluar el cremado en emulsiones o/w. D: destructivo; ND: no destructivo * método ND- mono-dato, ** método ND multi-datos. Referencias: a) Tornberg y Hermansson (1977); Ye y Singh (2001) b) Dagorn-Scaviner y col. (1987) c) Kato y col., (1985) d) Mengual y col. (1999) e) Dickinson y col. (1997) f) Kauten y col. (1991).
Método Característica Descripción
Gravimétrico (a) D Determinación de materia grasa (MG) por el método de Mojonnier o Röse-Gottlieb. Comparación de MG entre el suero y la emulsión inicial a un tiempo determinado
Volumétrico (b) ND * Variación de la altura de la interfase entre la fase crema y el suero en función del tiempo
Conductimétrico (c) ND ** Variación de conductancia de la emulsión en la parte inferior del recipiente que contiene la muestra
Ópticos (dispersión de luz, d) ND ** Obtención de perfiles de dispersión de luz en función de la altura de la muestra
Ultrasónicos de baja intensidad (e) ND ** Obtención de fracción volumétrica de la emulsión en función de la altura de la muestra
Resonancia magnética nuclear (f) ND ** Obtención de la fracción volumétrica de la emulsión en función de la altura de la muestra / obtención de imágenes
6.4.2. Floculación
La floculación es un proceso de agregación de gotas, que puede ser o no reversible, el cual
depende fundamentalmente de las interacciones coloidales que existen entre las gotas. Se han
propuesto distintos mecanismos, los cuales dependen de la concentración y tipo de proteína o
emulsificante no proteico utilizado, del método de homogeneización y la presencia de
componentes sin actividad interfacial en la fase continua (McClements, 1999). Si las
interacciones atractivas predominan sobre las interacciones repulsivas se produce la atracción
entre las gotas con formación de flóculos.
En emulsiones preparadas con proteínas como agentes emulsificantes puede producirse la
floculación por un mecanismo de puenteo (“bridging flocculation”). Cuando un biopolímero
se adsorbe en la interfase toma configuraciones de “filas”, “lazos” y “colas” (Israelachvili,
1992). La floculación se da cuando las “colas” de una molécula de biopolímero adsorbido en
Introducción
52
la interfase de una gota interaccionan con la interfase de otra gota (Tornberg y col., 1997). La
concentración interfacial de biopolímero es el factor dominante que gobierna este mecanismo.
Sin embargo, también depende de otras propiedades del biopolímero tales como: peso
molecular, grado de disociación, flexibilidad molecular (Tornberg y col., 1997). Para un
determinado biopolímero hay una concentración interfacial donde la floculación es máxima.
Por debajo de esa concentración, la homogeneización es ineficiente debido al predominio de
la coalescencia (Figura H), obteniéndose emulsiones de tamaño de gota elevado. A
concentraciones altas de biopolímero la floculación por puenteo es inhibida (Dickinson y col.,
1997). Durante el proceso de homogeneización, el transporte de las moléculas de biopolímero
a la interfase es por convección (Walstra, 1983); si el biopolímero no se adsorbe
suficientemente rápido en relación a la creación de área interfacial, también puede darse la
floculación. Hay que destacar que la floculación por puenteo es irreversible en condiciones de
dilución y no tiene lugar en emulsiones estabilizadas por agentes surfactantes no proteicos
debido a que su estructura no es tan compleja como la de las proteínas (Tornberg y col.,
1997).
El mecanismo de floculación por puenteo también puede darse en emulsiones en donde las
proteínas cubren eficientemente el área interfacial creada. En el primer caso, cuando las
proteínas tienen una afinidad elevada por ciertos tipos de cationes (por ejemplo, Ca2+), los
mismos pueden servir de “puente” para la interacción entre las gotas. Los iones producen el
apantallamiento (“screening”) de las cargas entre las moléculas de proteína adsorbidas,
favoreciendo la agregación (Ye y Singh, 2001). En segundo lugar, la floculación por puenteo
puede favorecerse por efecto de un hidrocoloide sin o con muy poca actividad interfacial. La
adición de polisacáridos en las emulsiones tiene por objeto aumentar la viscosidad de la fase
continua, con lo cual se logra controlar el cremado. Sin embargo, con algunos polisacáridos a
concentraciones relativamente bajas las moléculas de polisacárido pueden interaccionar
fuertemente con las de proteína en la interfase, favoreciendo la floculación (Dickinson y col.,
1989, Mc Clements, 1999; Damodaran, 2005).
Cuando la floculación por puenteo es irreversible en condiciones de dilución, puede
estudiarse por técnicas de microscopía óptica y confocal (Tornberg y Ediriweera, 1988; Mc
Clements, 1999), turbidimetría y determinación de la distribución de tamaño de gota en
ausencia y presencia de SDS (Ye y Singh, 2001; Anton, 2002; Relkin y Sourdet, 2005). En
este último caso, las condiciones de alta dilución y agitación provocan la ruptura de los
flóculos inestables, dejando sólo aquellos que resisten dichas condiciones. En muchos casos,
las técnicas de dispersión de luz no dan el verdadero tamaño de los flóculos (Mc Clements,
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
53
1999). A pesar de estas limitaciones y de que los diámetros promedio obtenidos no sean
valores absolutamente fidedignos, este método se utiliza en gran extensión (Ye y Singh, 2001;
Anton, 2002; Relkin y Sourdet, 2005). Como conclusión, hay que destacar que los flóculos
que se determinan son aquellos estables en las condiciones de medición.
Por otra parte, existe un mecanismo de floculación conocido como floculación por
depleción o por agotamiento (“depletion flocculation”) que también fue propuesto para el
caso de emulsiones con polisacáridos (McClements, 1999). La adición de un polisacárido a
las emulsiones induce la floculación por agotamiento por un efecto de volumen de exclusión.
Cuando el espacio entre gotas adyacentes es más pequeño que el volumen hidrodinámico
termodinámicamente más estable del polisacárido, el polímero es excluido del espacio entre
las gotas. Esto establece un gradiente de concentración local y por ende, un gradiente de
presión osmótica que induce la floculación (Damodaran, 2005). Este efecto de depleción se ve
también en emulsiones sin adición de polisacáridos. Las emulsiones estabilizadas con bajas
concentraciones de caseinato de sodio en general son más estables que las estabilizadas con
concentraciones intermedias. El exceso de caseinato de sodio no adsorbido, el cual tiene una
estructura similar a las submicelas de caseína (Creamer y Berry, 1975) puede promover la
floculación por agotamiento, aumentando la velocidad de cremado (Dickinson y Golding,
1997; Dickinson y col., 1997).
6.4.3. Coalescencia
La coalescencia es el principal mecanismo mediante el cual una emulsión evoluciona a su
estado termodinámicamente más estable, ya que se disminuye el área de contacto entre las
fase aceite y acuosa. La fase final de la coalescencia culmina con la formación de una capa de
aceite en la parte superior (conocido como oiling off) (McClements, 1999).
Cuando una emulsión se almacena en condiciones estacionarias, con excepción de que se
haya elegido un método de homogeneización ineficiente, un agente emulsificante inadecuado
o tenga un valor de muy elevado, la coalescencia es un mecanismo de desestabilización
más lento que el cremado y la floculación (Britten y Giroux, 1991). Para que este proceso
ocurra, las gotas deben estar lo suficientemente cercanas entre sí. Este hecho es más probable
que se dé en emulsiones que presentan un alto grado de floculación o cuando se ha formado la
fase crema (Damodaran, 2005).
La coalescencia es un proceso irreversible. Se forma una gota más grande a expensas de
gotas más pequeñas por una ruptura del film interfacial (McClements, 1999; Damodaran,
Introducción
54
2005). Cuando dos gotas se acercan hay una delgada capa de fase continua (o lamela) que
tiene un determinado espesor. Cuando este espesor disminuye por debajo de un valor crítico
se produce la coalescencia. Por lo tanto, la estabilidad frente a la coalescencia en una
emulsión será mayor cuanto más elevado sea el espesor de la lamela que separa a las gotas. La
magnitud de este espesor está gobernada por dos fuerzas de carácter opuesto. En primer lugar,
la presión dentro de una gota de la fase dispersa es superior a la de la fase continua en una
magnitud que está dada por la ecuación de Laplace. La otra fuerza es la presión de
desprendimiento o de separación (“disjoining pressure”). Cuando dos gotas están desprovistas
de agente emulsificante (por ejemplo agua y aceite) la presión de separación es despreciable y
las gotas coalescen fácilmente por colapso del film interfacial cuando se acercan debido a la
presión de Laplace. Sin embargo, cuando las mismas están cubiertas con un agente
emulsificante, las interacciones coloidales entre las moléculas adsorbidas crean una presión de
separación que tiende a incrementar el espesor de la lamela. Por lo tanto, la magnitud y
naturaleza de las interacciones coloidales son de importancia fundamental para determinar si
una emulsión es estable o no frente a la coalescencia.
En los casos en que una emulsión es sometida a esfuerzos de corte (por ejemplo un trabajo
mecánico como es la agitación), la viscoelasticidad del film es de suma importancia para
impedir la coalescencia. En una emulsión en reposo, las gotas también están en continuo
movimiento y colisionan unas con otras. Sin embargo, bajo condiciones de trabajo mecánico,
la frecuencia y eficiencia de colisión entre las gotas puede aumentar considerablemente. El
esfuerzo de corte puede producir deformación en el film interfacial el cual genera hoyos y
posterior ruptura en el mismo, dando lugar a la coalescencia (Lucassen-Reynders, 1993;
Damodaran, 2005). En general los films interfaciales estabilizados por proteínas son más
resistentes a los esfuerzos de corte que los estabilizados por agentes emulsificantes no
proteicos, aún cuando éstos tienen mayor actividad superficial (Mc Clements, 1999;
Damodaran, 2005).
La coalescencia puede evaluarse por los mismos métodos utilizados para el estudio de la
floculación, porque en ambos procesos hay un aumento del tamaño de partícula. Sin embargo,
al ser un mecanismo de desestabilización más lento, se recurre a los métodos acelerados:
centrifugación, efectos combinados de almacenamiento y centrifugación, y fuerzas mecánicas.
Por otra parte, cuando el grado de desestabilización por coalescencia es muy alto, el
tamaño de algunas gotas es tal que se termina formando una capa de aceite en la parte
superior de la emulsión (“oiling off”). En emulsiones con este avanzado grado de
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
55
desestabilización, gran parte del aceite que permanece emulsionado está contenido en gotas de
tamaño elevado, lo cual dificulta su manipulación y caracterización por las técnicas
mencionadas. Por tal motivo, es necesario recurrir a técnicas que cuantifiquen la cantidad de
aceite separado en una emulsión.
6.5. Evaluación de la estabilidad global de una emulsión por medidas de dispersión múltiple
de luz
El analizador óptico vertical (Quick Scan, Turbiscan) permite evaluar la
desestabilización global de emulsiones, suspensiones y espumas sin dilución, con tamaños de
partícula entre 0,05 a 5000 m y una concentración de 60 % v/v, determinando los diferentes
mecanismos que la conducen. Este equipo consiste de una cabeza lectora que se mueve a lo
largo de una celda cilíndrica de vidrio donde la muestra es almacenada estacionariamente
durante un cierto período de tiempo. La cabeza lectora es una fuente pulsante de radiación
electromagnética en el infrarrojo cercano ( = 850 nm), conjuntamente con dos detectores
sincrónicos: el de transmitancia que detecta la radiación transmitida a través de la muestra y el
de backscattering recibe la radiación dispersada por la muestra en una dirección de 135º
respecto a la fuente (Pan y col., 2002). Este equipo permite medir la desestabilización en
emulsiones concentradas, las cuales son medios ópticamente opacos. El principio de medición
del equipo se basa en la teoría de dispersión múltiple de luz: los valores de transmitancia (T
%) y de backscattering (BS %) dependen no sólo del diámetro de las gotas, sino también de la
fracción volumétrica de la fase dispersa (). El principio de medición del analizador óptico
vertical ha sido exhaustivamente estudiado por Mengual y col. (1999).
La cabeza lectora adquiere los datos de trasmitancia (T %) y de backscattering (BS %)
cada 40 m a lo largo de la celda, en una longitud máxima de 80 mm, realizando un barrido
vertical de la emulsión contenida en la celda (Figura 15). Los resultados son presentados
mediante un software como curvas de T % y de BS % en función de la altura del tubo. La
adquisición de datos puede repetirse a lo largo del tiempo de una forma programada y los
resultados son expresados en función del tiempo. El análisis de los perfiles de T % y BS %
obtenidos permite determinar la cinética para un dado mecanismo de desestabilización
(cremado o coalescencia) si se elige adecuadamente la zona del tubo (Pan y col., 2002).
Introducción
56
Figura 15. Repreentación esquemática del principio de funcionamiento del analizador óptico vertical Turbiscan (Palazolo, 2006).
Analizador óptico verticalAnalizador óptico vertical
Cortesía Beckman Coulter
BackScattering
Transmitancia
Ca
beza
Móv
il
Long
itud
de la
mue
stra
0% 50% 100%
Clara
Turbia
Opaca
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
57
Objetivo general
La presente tesis tiene como objetivo general el estudio de la funcionalidad de
hidroxipropilmetilcelulosas y sus mezclas con lactoglobulina.
El enfoque del estudio será el siguiente:
1) Estudiar las hidoxipropilmetilcelulosas y sus mezclas con lactoglobulina
en la escala submicrónica (a nivel nanométrico), es decir, el comportamiento
de estos biopolímeros en solución y en interfases.
2) Estudiar el comportamiento a nivel macroscópico, en emulsiones aceite-
agua, y relacionarlo con el comportamiento a nivel nanométrico.
Objetivos específicos
Caracterizar el estado de asociación de HPMCs en solución acuosa a pH3 y pH6
por dispersión dinámica de luz.
Evaluar el efecto de ultrasonidos de alta intensidad en el tamaño de partícula de
las soluciones por medio de dispersión dinámica de la luz y su impacto en
algunas propiedades funcionales relevantes como gelificación, emulsificación,
viscosidad.
Estudiar la adsorción dinámica de HPMCs en la interfase aceite-agua a pH3 y
pH6 y comparar el comportamiento en la interfase aire-agua.
Estudiar el comportamiento de las HPMCs en emulsiones aceite-agua a
temperatura ambiente y su relación con las propiedades interfaciales.
Caracterizar las soluciones acuosas de mezclas de HPMC y -lactoglobulina a
pH3 y pH6 por dispersión dinámica de luz.
Estudiar la adsorción dinámica de mezclas de HPMC y -lactoglobulina en la
interfase aceite-agua a pH3 y pH6.
Evaluar el comportamiento de mezclas de HPMC y -lactoglobulina en
emulsiones aceite-agua a temperatura ambiente y su relación con las propiedades
interfaciales.
Objetivos
58
Se seleccionaron esos dos pHs (3 y 6) para realizar los estudios en el presente trabajo
de tesis por ser pH6 el pH natural de las soluciones de HPMC y pH3 por ser
representativo de los alimentos ácidos donde estos biopolímeros pueden emplearse.
Materiales y métodos
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
59
1. Materiales.
1.1 Hidroxipropilmetilcelulosa.
Las hidroxipropilmetilcelulosas Methocell E5LV, E15LV, E50LV y E4M (grado alimentario),
fueron gentilmente donadas por Colorcon Argentina, representantes de Dow Chemical Company y
empleadas sin purificación posterior.
La tabla 1 muestra algunas de las propiedades que caracterizan a las HPMCs tales como el
contenido de metilos e hidroxipropilos, la relación metilos/hidroxipropilos, la sustitución molar, el
grado de sustitución, la viscosidad a 25°C de soluciones al 2 % y el peso molecular . El contenido de
humedad fue de 1.6%.
Tabla 1.Propiedades de las HPMCs.
HPMC E4M E50LV E15LV E5LV
% metilos 28,0 29,1 29,2 29,5
% hidroxipropilos 10,2 9,2 9,3 9,7
Relación metilos/ hidroxipropilos 2,3 3,2 3,1 3,0
Sustitución en metilos (DS) 1,90 1,90 1,9 1,9
Sustitución en hidroxipropilos (MS) 0,23 0,23 0,23 0,23
Sustitución total (DS + MS) 2,13 2,13 2,13 2,13
Viscosidad (cp), solución2% p/p, 25°C 4965 41 15 5,4
Peso molecular (Da) 90000 18000 6000 2000
Materiales y métodos
60
1.2 -lactoglobulina.
BioPure -lactoglobulina fue provista por Davisco Foods International, Inc. (Le Sueur,
Minnesota, Estados Unidos). Su composición se resume en la tabla 2.
Tabla 2. Composición -lactoglobulina.
cantidad proteína (%), base seca 97,8 cantidad -lg /total proteínas (%) 93,6
grasa(%) 0,3 cenizas(%) 1,8
humedad(%) 5,0
1.3 Aceite vegetal
Se empleó aceite comercial de girasol (ampliamente utilizado en la industria de
alimentos) sin purificación posterior como fase aceite para la preparación de la emulsiones
como también para los estudios de interfases.
El aceite de girasol contiene triglicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos saturados e
insaturados. La longitud de la cadena alquílica varía entre 14 y 22 (Wüstneck, et al ,1999).
Se usó aceite de girasol purificado para algunas de las mediciones en interfases. Para ello
se dejó interactuar al aceite comercial de girasol con un compuesto (Fluorisil 60-100 Mesh,
Aldrich ®) atrapante de las sustancias tensioactivas del aceite (fosfolípidos, ácidos grasos
libres, monoglicéridos) durante 24 hs, se filtró luego (0,22 mm) la fase superior.
2. Métodos
2.1 Preparación de las soluciones de polisacárido y proteína
Las soluciones de hidroxipropilmetilcelulosa, en concentraciones del 0,01 al 7 % p/p
dependiendo de la HPMC, se prepararon disolviendo a 80-90 °C el polvo en buffer fosfato
5mM (para soluciones a pH6) o en buffer citrato/HCl 5 mM (para soluciones a pH3) y luego
enfriando hasta temperatura ambiente. Las soluciones se almacenaron a 4°C durante 24 hs
para lograr una completa hidratación del polisacárido.
Las soluciones de -lactoglobulina, en concentraciones del 0,01 al 7 % p/p, se prepararon
disolviendo a temperatura ambiente el polvo en buffer fosfato (para soluciones a pH6) o en
buffer citrato/HCl (para soluciones a pH3). Para prevenir el crecimiento microbiano, se
adicionó azida sódica (NaN3) en una concentración de 0,02% p/p.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
61
Las soluciones mixtas de -lg y polisacáridos a pH3 o pH6, se obtuvieron mezclando
partes iguales de las soluciones de cada biopolímero, preparadas al doble de la concentración
requerida en la mezcla. Las mezclas fueron agitadas al menos durante 30 minutos para lograr
una total dispersión de las soluciones.
El mismo procedimiento se siguió para la preparación de las mezclas de HPMC y SDS al
2%p/p de concentración final en la mezcla. El SDS se preparó con agua desionozada. La
misma solución de SDS fue empelada en las mediciones de estabilidad en emulsiones.
Las soluciones de buffer para ambos biopolímeros, se prepararon con agua desionizada y
luego se filtraron con filtros jeringa de 0,45 y 0,22 m de diámetro de poro para eliminar
cualquier impureza presente. Para los estudios en interfases, la ausencia de contaminantes
tensioactivos en el buffer se verificó mediante medidas de tensión superficial previo a la
preparación de las muestras en dicho buffer. La tensión superficial medida fue la aceptada
por la literatura (72-73 mN/m a 20ºC).
2.2 Determinación de la viscosidad de las soluciones
Se determinó la viscosidad de las soluciones de polisacáridos (2%) y proteína (2%) en un
viscosímetro Brookfield DV-LVT con cono y plato a 25°C, ya sea antes o inmediatamente
después del tratamiento con ultrasonidos de alta intensidad. Se utilizaron los conos CP41 y
CP52, de diámetros 4,8 y 2,4 mm respetivamente. En el rango de velocidad de deformación
de 0,5 a 120 s-1. Se obtuvieron los valores de esfuerzo de corte frente a las velocidades de
deformación. Los datos fueron ajustados mediante la ecuación de la ley de la potencia:
ぷ= 計.べ津 (1)
donde τ es el esfuerzo de corte,
es la velocidad de deformación,
K es el coeficiente de consistencia,
n es el índice de flujo.
Las mediciones de viscosidad se informan como el promedio y la desviación estándar de al
menos tres mediciones.
Materiales y métodos
62
2.3 Tratamiento de ultrasonido de alta intensidad
Se colocaron 5 ml de cada solución de HPMC en un tubo de vidrio de 1,5 cm de diámetro
y 10 cm de longitud y se sonicaron utilizando un procesador ultrasónico Vibra Cell Sonics,
modelo VCX 750 (Sonics & Materials INC.,Newtown, Estados Unidos) a una frecuencia de
20 kHz y una amplitud de 20%, durante 20 minutos continuos (figura 1). Para la sonicación
se utilizó una punta roscada de titanio de 13 mm de diámetro y acoplada a un microtip de 3
mm de diámetro. La muestra contenida en el tubo de vidrio de 10 mm de diámetro, fue
sonicada a temperatura controlada en un baño de glicerina, mantenido a temperatura
constante de 0,5 °C mediante un baño con agua en circulación constante (Polystat,Cole-
Parmer). A esta temperatura, el calor producido durante el proceso de sonicación es
totalmente disipado, manteniendo la muestra a una temperatura por debajo de los 25°C.
Figura 1. Fotografía del equipo de ultrasonido de alta intensidad.
Procesador ultrasónico
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
63
2.4 Evaluación visual de la gelificación. Ensayos de inclinación o tilting test.
Para la evaluación visual del tiempo de gelificación de los sistemas se utilizó un ensayo
de inclinación o tilting (Relkin y col, 1998). En un baño seco a temperatura constante (70°C),
se calentaron varios tubos conteniendo 2ml de solución. Los mismos fueron sellados por
medio de esferitas de vidrio para evitar así la evaporación del líquido. A tiempos sucesivos se
retiraban de a un tubo por vez del baño y se observaban los cambios visualmente perceptibles
en la solución como el cloud point (aparición de un punto opaco en la muestra) y el menisco
al inclinar levemente el tubo. El tiempo de gelificación (punto gel) se determinó como el
tiempo necesario para que el menisco de la solución no sufra deformación o no fluya al
inclinarlo. En el siguiente esquema (figura 2) se muestra el procedimiento de obtención del
punto gel.
Las mediciones se informan como el promedio y la desviación estándar de al menos tres
mediciones.
t1 t2 t3 t4 t6
t5 = gelt
Figura 2. Representación gráfica de la determinación del punto gel mediante el ensayo de inclinación o tilting test (Baeza, 2003).
2.5 Determinación de la distribución y tamaño de partícula en solución.
Los ensayos de dispersión dinámica de la luz, se llevaron a cabo en un equipo de
dispersión dinámica de luz (Zetasizer Nano-Zs, Malvern Instruments, Worcestershire,
Inglaterra) (Figura 3) provisto con un laser He- Ne (633 nm) y un correlator digital, modelo
ZEN3600. Las mediciones se realizaron a un ángulo de dispersión fijo de 173°. El Zetasizer
Materiales y métodos
64
Nano-ZS determina tamaño de partículas cuyo diámetro hidrodinámico se encuentra en el
rango de 0,6 nm a 6 m.
Las mediciones para las soluciones de HPMC, lg y sus mezclas y para las mezclas de
HPMC y SDS, se realizaron a 25 °C .Las muestras se colocaron en cubetas descartables de
poliestireno de 1 cm de arista y luego en el equipo.
Para el tratamiento térmico de las soluciones de HPMC, la muestra se colocó en cubetas
de vidrio y se varió la temperatura de 25 a 63 °C. Se realizó una medición de tamaño de
partícula por cada temperatura. Las mediciones de tamaño de partícula se informan como el
promedio y la desviación estándar de al menos tres mediciones.
Como se mencionó previamente en la introducción del presente trabajo, en DLS la
muestra es iluminada con un haz de laser y la intensidad de la luz dispersada producida por
las partículas fluctúa a una velocidad que es dependiente del tamaño de partícula
(movimiento browniano). Con un análisis de esta fluctuación de la intensidad, es posible
obtener el coeficiente de difusión de la partícula (D). El tamaño de la partícula es luego
calculado mediante la ecuación de Stokes-Einstein:
D
kTdh 3
(2)
donde dh es el diámetro hidrodinámico, D el coeficiente de difusión traslacional (m2s-1), k la
constante de Boltzmann (1,38 x10-23 NmK-1), T la temperatura absoluta (K) y la viscosidad
(Nsm-2).
Existen dos aproximaciones que pueden ser utilizadas para obtener el tamaño de partícula:
(i) análisis de CUMULANTES que ajusta una exponencial simple a la función de
correlación para obtener el tamaño de diámetro promedio (diámetro hidrodinámico
promedio o z-average) y una estimación del ancho de la distribución (índice de
polidispersidad) que es considerada como un indicador del grado de agregación
(Sharma y col, 1996).
Los resultados que se obtienen mediante este análisis son aplicables con propósitos
de comparación de un simple valor pero es inadecuado para dar una completa
descripción de los resultados de la distribución en sistemas polidispersos.
(ii) análisis de CONTIN que ajusta una exponencial múltiple a la función de
correlación para obtener los percentiles de distribución de los tamaños de
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
65
partículas/agregados (Stepanek, 1993). Los mismos se informan en un gráfico de
intensidad de luz relativa dispersada por las partículas en varios rangos de tamaños
(distribución de tamaños por intensidad). La distribución de tamaño original
generada por el equipo de DLS es la distribución de tamaños por intensidad.
Mediante la teoría de Mie (1908) puede convertirse a distribución de tamaños por
volumen o número con el objetivo de analizar la importancia de los diferentes
picos en relación a la cantidad de partículas presentes en la muestra.
Figura 3. Fotografía del equipo de dispersión dinámica de luz Zetasizer Nano-Zs, Malvern Instruments
Para comprender las diferencias entre las tres distribuciones mencionadas anteriormente,
puede considerarse como ejemplo una muestra comprendida por partículas esféricas de dos
tamaños, 5 nm y 50 nm, presentes en igual cantidad.
De la distribución por número de estas dos poblaciones de partículas, se obtienen dos
picos ubicados en 5 nm y 50 nm y en una relación 1:1 (figura 4A). Cuando se analiza la
distribución por volumen (figura 4B), la relación entre estas dos poblaciones es ahora 1:1000,
debido a que el volumen de una esfera es 4/γπ(diámetro/2)3 . Al analizar la distribución por
intensidad (figura 4C), la relación entre las partículas es 1:1000000, ya que la intensidad de la
Compartimiento
para la celda de
medición
Materiales y métodos
66
luz dispersada es proporcional al diámetro6 (de la aproximación de Rayleighs) (Malvern
Instruments, 2001).
Es importante recordar que en DLS, la distribución de tamaños que se obtiene originalmente
es en intensidad y que las distribuciones de volumen y número son obtenidas a partir de ésta,
de aquí la importancia de que la lectura del tamaño de partícula se haga a partir de la
distribución de tamaños en intensidad. La distribución de tamaños en volumen se analiza para
obtener información de la proporción de cada pico en la muestra analizada.
La distribución en número no se evaluará ya que arrastra muchos errores a partir de su
cálculo.
Figura 4. Distribución en (A) número, (B) volumen y (C) intensidad de una muestra bimodal de partículas de 5 y 50 nm presentes en igual cantidad (Malvern Instruments, 2001).
2.6 Determinación de la carga superficial de las partículas en solución.
Los estudios para determinar la carga neta superficial de las partículas en solución, se
realizaron mediante la medición del potencial zeta (ξ) en un equipo Zetasizer Nano-Zs
(Malvern Instruments, Worcestershire, Inglaterra) el mismo que se utiliza para la medición de
tamaño de partículas por DLS (Figura 3). Las soluciones, diluídas con su respectivo buffer al
0,02%, fueron inyectadas en la cubeta para medición de movilidad electroforética (Figura 5).
El potencial zeta se determinó midiendo la dirección y velocidad de las partículas al aplicar
un campo eléctrico. Las mediciones de potencial zeta se informan como el promedio y la
desviación estándar de al menos tres mediciones.
Inte
nsid
ad
(%)
Tamaño (d.nm)
(C)
Volu
me
n (%
)
Tamaño (d.nm)
(B)
Tamaño (d.nm)
Núm
ero
(%
)
(A)
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
67
Figura 5. Celda para la medición del potencial zeta. En los electrodos ubicados a cada lado, el equipo aplica el campo eléctrico (Malvern Instruments, 2001).
2.6.1 Principio de funcionamiento
El desarrollo de una carga neta en la superficie de una partícula, afecta la distribución de
iones de la región interfacial circundante. Esto resulta en un aumento de la concentración de
iones de carga opuesta a la partícula que están cercanos a la superficie. Así, una doble capa
eléctrica se genera alrededor de cada partícula (figura 6).
La capa de liquido que rodea a la partícula se la puede encontrar de dos formas: una región
interna, conocida como capa de Stern donde los iones están fuertemente ligados, y una región
externa, conocida como capa difusa, donde los iones están ligados con menos fuerza a la
partícula. Existe un límite imaginario que termina en la capa difusiva, donde los iones y la
partícula forman una entidad estable (capa de Stern).
Cuando una partícula se mueve (debido a la gravedad por ejemplo), lo hace con los iones
que conforman la capa Stern y la difusa. Este límite se conoce como plano slipping y su
correspondiente se conoce como potencial zeta (figura 6).
La magnitud del potencial zeta es un indicador de la estabilidad del sistema coloidal en
estudio. Esta técnica es empleada ampliamente para determinar la estabilidad de sistemas
coloidales líquidos, como una emulsión. Si todas las partículas en la suspensión tienen un
potencial zeta negativo o positivo alto, todas las partículas tenderán a repelerse evitando así la
floculación de la emulsión.
electrodo electrodo
capilar
Materiales y métodos
68
Figura 6. Esquema de una partícula cargada y la doble capa que la rodea (Malvern Instruments, 2001).
Si las partículas tienen, en cambio, bajos valores de potencial zeta las fuerzas que
previenen que las partículas se acerquen serán más débiles y la tendencia a flocular será
mayor. Se considera que una suspensión es estable cuando tiene valores de potencial zeta
mayores a 30 mV en valor absoluto (+30mV o -30mV). El factor más importante que afecta
el potencial zeta es el pH, especialmente cuando se estudian proteínas. A pH mayores al
punto isoeléctrico el potencial zeta es mayor a cero, y a pH menores es negativo y cero en el
punto isoeléctrico (figura 7).
Figura 7. Variación del potencial zeta con el pH para una proteína (Malvern Instruments, 2001).
Doble capa eléctrica
Plano Slipping
Partícula con carga
superficial negativa
Capa de Stern
Distancia desde la superficie de la partícula
Capa difusa
Potencial superficial
Potencial Stern
Potencial zeta
Punto
isoeléctrico
P Z O E T T E A N (mV) C I A L
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
69
Una consecuencia importante de la existencia de cargas eléctricas en la superficie de la
partícula es que exhiben ciertos efectos cuando se aplica un campo eléctrico. El efecto que se
analiza para la determinación del potencial zeta es la electroforesis (movimiento relativo de
una partícula cargada en el líquido en el cual está suspendida bajo la influencia de un campo
eléctrico).
Electroforesis
Cuando un campo eléctrico es aplicado a través de un electrolito, las partículas cargadas en
suspensión en el electrolito son atraídas al electrodo de carga opuesta. Las fuerzas viscosas
que actúan sobre las partículas tienden a oponerse a este movimiento. Cuando se alcanza el
equilibrio entre estas dos fuerzas opuestas, la partícula se mueve con una velocidad constante.
La velocidad de la partícula depende de:
- La fuerza del campo eléctrico aplicado o el gradiente de voltaje.
- La constante dieléctrica del medio
- La viscosidad del medio
- El potencial zeta
La velocidad que la partícula tiene al aplicarse el campo eléctrico se conoce como
movilidad electroforética.
El potencial zeta de una partícula se obtiene por medio de la aplicación de la ecuación de
Henry:
戟帳 =態悌佃捗(賃銚)戴禎 (3)
donde:
z es el potencial zeta (mV).
UE es la movilidad electroforética.
i es la constant dieléctrica.
es la viscosidad.
ƒ(Ka) es la function de Henry, que varía entre 1,0 (aproximación de Huckel) o 1,5
(aproximación de Smoluchowski) dependiendo del tamaño de la partícula y la concentración
de electrolitos del medio.
Materiales y métodos
70
2.7 Calorimetría diferencial de barrido (DSC).
Para el estudio de las transiciones térmicas de las soluciones de HPMC antes e
inmediatamente después del tratamiento con ultrasonido de alta intensidad, se utilizó un
calorímetro diferencial de barrido Mettler TA 4000 (Schwerzenbach, Suiza). La
concentración de HPMC fue de 3% para E4M y 7% para E5LV.
Se emplearon cápsulas de aluminio de 160 l para la medición. Como referencia se utilizó
una cápsula vacía. Se trabajó a una velocidad de calentamiento de 10°C/min y el rango de
temperatura barrido fue de 0°C a 130 °C. El análisis de los termogramas y parámetros
térmicos se realizó mediante el software TA72. Se realizó una calibración previa a la
medición utilizando indio y zinc puro según Roos y Karel (1991).
Se informa el promedio y la desviación estándar de al menos dos mediciones.
Parámetros calorimétricos
Se evaluaron las temperaturas de inicio y de pico de desnaturalización así como el cambio
de entalpía aparente (△HT) involucrado.
La temperatura de inicio (Tonset) se obtuvo por intersección de la línea de base con la
pendiente inicial de la curva al iniciarse la transición térmica (Relkin, 1994). La temperatura
de pico (Tp) de la endoterma, que indica la temperatura aparente de desnaturalización, fue
determinada en el punto de máximo flujo calórico para las condiciones de corrida.
El cambio de entalpía correspondiente al proceso de desnaturalización térmica (△HT) se
obtuvo integrando el área de la endoterma entre los valores de inicio (Tonset) y de finalización
(Tf), utilizando una línea de base polinomial ajustada entre los valores de inicio y fin (figura
8).
Figura 8. Parámetros calorimétricos evaluados.
Tonset
Tp
Tf
響HT
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
71
2.8 Resonancia magnética nuclear (NMR).
Se utilizó un equipo Bruker PC 120 Minispec de resonancia magnética nuclear por pulsos
(NMR), con un campo magnético 0.47 T operando a una resonancia y frecuencia de 20 MHz
(Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten,Germany) y a 20°C. La muestra de HPMC (E4M al 3%
o E5LV al 7%) se colocó previamente en tubos de vidrio de 10 mm de diámetro.
El tiempo de relajación spin-spin (T2) se midió utilizando la secuencia de pulsos Carr–
Purcel–Meiboon–Gill con un espaciamiento entre pulsos de 7 segundos. Las señales de
decaimiento fueron ajustadas con una exponencial simple.
Se informa el promedio y la desviación estándar de al menos tres mediciones.
Los equipos basados en la resonancia magnética nuclear (NMR) utilizan las interacciones
entre ondas de radio y el núcleo de los átomos de hidrógeno para obtener información sobre
las propiedades del material en estudio, como una partícula en suspensión o las gotas de una
emulsión (McClements, 1999).
Básicamente, la muestra se coloca en un gradiente de campo magnético estático y una
serie de pulsos de radiofrecuencias son aplicados. Estos pulsos pueden causar que algunos de
los núcleos de hidrogeno de la muestra se exciten a niveles de energía más altos, lo que lleva
a la generación de señales de NMR detectables. La amplitud de la señal depende del
movimiento del núcleo. La frecuencia, amplitud y tiempo de decaimiento de la señal
dependen de la relación sólido/ líquido en la muestra.
2.9 Reología dinámica.
La determinación de la dinámica de gelificación de las HPMCs se realizó en un reómetro
oscilatorio dinámico Phaar Physica MCR 300 con control de esfuerzo de corte. La geometría
de medición utilizada fue de platos paralelos de 29,95 mm (PP30/S) (Figura 9), con un
espacio o gap entre ellos de 1 mm. Se colocaron aproximadamente 0,7 ml de muestra entre
los platos, lo que permitió llenar completamente el espacio entre ellos. La temperatura del
plato inferior se controló mediante un sistema Peltier y un baño termostatizado (Viscotherm
VT2, Phaar Physica). Luego se cubrieron las superficies de los platos y el área expuesta de
muestra con silicona líquida para evitar la evaporación de agua de la misma.
Materiales y métodos
72
El calentamiento se efectuó a una velocidad de 10ºC/min, desde la temperatura inicial de
25°C hasta la temperatura deseada de 90ºC. Se mantuvo así durante 15 min. y luego se hizo
descender la temperatura con la misma rampa de velocidad hasta 10ºC.
Las condiciones de medición se evaluaron previamente en la zona de viscoelasticidad lineal,
resultando una deformación de 0,01% y una frecuencia de 1 Hz.
Se analizó el punto de gelificación como el punto de cruce entre G´ y G´´ o ascenso brusco de
G´ y descenso de la tan cuando el punto de cruce no quedara claro.
Las determinaciones se realizaron por duplicado siendo las diferencias menores al 10 %. Se
informa el promedio y la desviación estándar.
En un experimento de reología dinámica oscilatoria, la relación entre la deformación y
esfuerzo está descripta por el módulo complejo:
G* =G´+ iG´´ (4)
donde G´es el módulo de almacenamiento (o elástico), G´ ́ es el módulo de pérdida (o
viscoso).
G ́da una idea de la energía almacenada, G´ ́es la energía disipada por la muestra en forma
de flujo. La tangente de pérdida (tan ) indica el carácter viscoelástico del material y es la relación
entre la componente viscosa y la elástica (tan G´´/G )́.
La reometría dinámica es una técnica que involucra pequeñas deformaciones por lo cual es
de mucha utilidad para el estudio de la transición sol-gel y para la caracterización del
comportamiento viscoelástico de geles (Matsumura y col.,1996).
La transición de una estructura viscosa (sol) a una viscoelástica (gel) durante el calentamiento
es determinada por el punto de cruce entre el módulo viscoso (G’’ ) y el elástico (G’). En este
cruce el ángulo de desfasaje es de 45º y la tan δ es igual a 1. Luego de este punto de cruce o
“punto gel” G’ asciende bruscamente y se observa el consecuente descenso de la tan δ.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
73
Figura 9. Sistemas de platos paralelos en posición para colocar la muestra.
2.10 Emulsiones
2.10.1 Preparación de las emulsiones
Las emulsiones aceite en agua (O/W) en relación 10/90 respectivamente, se prepararon
utilizando dos equipos emulsionantes distintos:
1) por homogeneización de 4,5 ml de las soluciones acuosas de HPMC o sus mezclas
con -lg con 0,5 ml de aceite de girasol comercial, utilizando un homogeneizador Ultraturrax
T-8 (IKA-Labortechnik, Staufen, Alemania). La velocidad del rotor (S8N-5G, Staufen,
Alemania) se ajustó en 25.000 r.p.m., el tiempo de homogeneización fue de 3,5 minutos y la
temperatura se mantuvo constante a 25º C 2ºC mediante un baño de agua con hielo durante
el tiempo de proceso. Las condiciones de homogeneización se eligieron con el objeto de
minimizar la inclusión de aire en el seno de la emulsión, la cual es una característica del
método de homogeneización empleado.
2) por homogeneización de 4,5 ml de las dispersiones acuosas de HPMC o sus mezclas
con -lg con 0,5 ml de aceite de girasol comercial, utilizando un procesador ultrasónico Vibra
Cell Sonics, modelo VCX 750 a una frecuencia de 20 kHz y una amplitud de 20%, durante
20 minutos continuos (Figura 1). Se siguió el mismo procedimiento explicado en el apartado
2.3.
Materiales y métodos
74
2.10.2 Determinación de la distribución y tamaño de partícula
Los diámetros promedio y las curvas de distribución de gotas de las emulsiones se
determinaron por dispersión estática de luz en un equipo Mastersizer 2000 con una unidad de
dispersión Hydro 2000MU provisto con un laser He- Ne (633 nm) (Malvern Instruments,
Worcestershire, Inglaterra) (Figura 10). El rango de medición del equipo se encuentra entre
los 0,1 m a 1000 m. La velocidad de la hélice se mantuvo en 1800 RPM. Se utilizó el
índice de refracción (RI) de la fase dispersa (1,47) y su parámetro de absorción (0,001). El
tamaño de gota se informa como el diámetro promedio de volumen-superficie o diámetro de
Sauter (D32= ni di3/ ni di2) y el diámetro promedio de volumen equivalente o diámetro De
Broucker (D43= ni di4/ ni di3) , donde ni es el número de gotas de diámetro di (Huang y
col., 2001; Leroux, y col, 2003).
D32 brinda una medida del diámetro promedio en donde se encuentran la mayoría de las
gotas. D43 está relacionado con cambios en el tamaño de partícula que involucran procesos de
desestabilización.
Se informa también el área interfacial específica (AIE) y la polidispersidad (P) de las
emulsiones, según se vio previamente en Introducción, apartado 6.2.2.
Los parámetros informados corresponden al promedio y la desviación estándar de al menos
tres mediciones
Figura 10. Fotografía del equipo Mastersizer 2000 con su unidad de dispersión Hydro 2000MU
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
75
2.10.2 Determinación de la carga superficial de las emulsiones
Se determinó la carga superficial de las emulsiones por la medición del potencial zeta
como se indica en el apartado 2.6, en un equipo Zetasizer Nano-Zs (Malvern Instruments,
Worcestershire, Inglaterra) (figura 3). Las soluciones injectadas en la cubeta para medición
de movilidad electroforética figura 7), fueron previamente diluidas con el mismo buffer con
el cual fueron preparadas, hasta una concentración aproximada de 0.02% p/p.
El potencial zeta informado corresponde al promedio y desviación estándar de tres
mediciones.
2.10.3 Determinación de la estabilidad de las emulsiones.
La estabilidad global de las emulsiones se analizó usando un analizador óptico vertical
(Quick Scan, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Estados Unidos). Las emulsiones
recientemente preparadas se colocaron en una celda cilíndrica de vidrio (80 mm) para
registrar los perfiles de trasmitancia (T %) y backscattering (BS %) en función de la altura en
la celda. Los perfiles de T % y BS % se registraron durante 20 días, a intervalos de 1 minuto
durante las primeras 2 horas para las emulsiones preparadas con Ultraturrax y a intervalos de
15 minutos para las emulsiones preparadas con ultrasonido de alta intensidad. Luego se
realizó una medida cada 24 horas de almacenamiento a temperatura ambiente.
La cinética de cremado-floculación se evaluó a partir de la variación de los valores
promedio de BS % (BSprom %) en la parte inferior del tubo de medida (10-20 mm). La
constante cinética de cremado-floculación (C) se definió por medio de la expresión:
C (h-1) = 103/ BS0 prom % . t1/2 (5) (Palazolo, 2005,2006)
donde BS0 prom % es el valor promedio inicial de BS (correspondiente al perfil a t = 0
min) y t1/2 es el tiempo (expresado en horas) para el cual BSprom % = BS0 prom %/2.
Además de C, la cual da información sobre la velocidad con la que se desarrollan los
procesos de cremado-floculación en los estadios iniciales.
Materiales y métodos
76
A partir de los valores de D4,3 obtenidos de las mediciones de tamaño de gota con y sin el
agregado de SDS, se calcularon los índices de coalescencia (IC %) y el grado de floculación
(GF%) (Palazolo, 2005,2006):
IC % = [(D4,3 +SDS – D4,3 i +SDS)/D4,3 i +SDS].100
GF %= [(D4,3 - SDS - D4,3 +SDS)/D4,3 +SDS].100
donde D4,3 -SDS y D4,3 + SDS son los diámetros promedio de las emulsiones almacenadas un
tiempo t ( en este trabajo 24 hs), medidos en ausencia y presencia de SDS, respectivamente;
D4,3 i +SDS es el diámetro promedio de la emulsión inicial con SDS.
Aunque estos parámetros podrían calcularse también a partir del diámetro promedio de
Sauter D3,2 , a fin de evaluar adecuadamente el grado de coalescencia y el de floculación es
más conveniente utilizar D4,3 debido a que los cambios producidos en las emulsiones son
detectados con mayor sensibilidad (Relkin y Sourdet, 2005, Palazolo, 2006).
La principal diferencia entre IC % y GF % es que el primero toma como referencia a la
emulsión inicial y los cambios producidos en el tamaño de partícula (por coalescencia y
floculación) respecto a la misma. En cambio, GF % refleja simplemente la variación del
tamaño de partícula cuando la distribución se determina en ausencia y presencia de SDS y
por ende, puede calcularse para las emulsiones iniciales y las sometidas a cualquier
tratamiento. Cuando una emulsión no se desestabiliza por coalescencia o por efecto de un
determinado tratamiento, IC % 0.
Las determinaciones se realizaron al menos por duplicado y se informa el promedio y la
desviación estándar.
2.10.4 Determinación de la microestructura de las emulsiones. Microscopia confocal.
La microestructura de las emulsiones se evaluó colocando alícuotas de 10 L de emulsión
(sin dilución previa) sobre un portaobjetos. El cubreobjetos (22 22 mm) se colocó
cuidadosamente y sin deslizamiento para no inducir la coalescencia de las gotas de aceite.
Las emulsiones se observaron con un microscopio confocal Olympus FV 300, operando con
un aumento de 60 X y zoom de 2,5X.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
77
La microscopia confocal permite obtener información valiosa sobre la microestructura de
las emulsiones (McClements, 1999). La microscopia confocal brinda una mayor claridad en
las imágenes que la microscopia convencional. Permite además, la generación de imágenes
tridimensionales. En la microscopia confocal, un haz de laser muy estrecho es direccionado a
un punto particular de la muestra analizada y un detector mide la señal de la intensidad
resultante (figura 11).
La observación de la microestructura de sistemas multicomponentes es frecuentemente
facilitada empleando fluorescencia natural. La microscopía confocal se ha empleado para
estudiar el tamaño, concentración y organización de las gotas en una emulsión (Jokela y col.,
1990; McClements, 1999).
Figura 11. En la microscopia confocal, un haz de laser es escaneado a través de un plano particular x-y de la muestra. Combinando distintos planos x-y, es posible obtener una imagen tridimensional
(McClements, 1999).
2.10.5 Determinación la viscosidad de las emulsiones.
La viscosidad de las emulsiones se determinó según el apartado 2.2. Las emulsiones a
analizar se colocaron el sistema de medición sin previa dilución.
Se informa el promedio y la desviación estándar de al menos dos mediciones.
Materiales y métodos
78
2.11 Propiedades interfaciales
2.11.1 Determinación de la tensión interfacial/superficial.
Por definición, la tensión superficial se refiere a la interfase gas-líquido, mientras que la
tensión interfacial a la interfase fluido-fluido. Ambas propiedades son determinadas usando
instrumentos denominados tensiómetros superficiales o interfaciales, respectivamente. Estos
tensiómetros son empleados para obtener información sobre las características de las
superficies o de las interfases y las propiedades de los surfactantes, tales como su
concentración en exceso, su presión superficial, la concentración micelar crítica y cinética de
adsorción (Hiemenz, 1986; Hunter, 1986; Evans y col., 1994; Carrera Sánchez, 2000).
Existen diferentes tipos de tensiómetros (Couper, 1993) que difieren de acuerdo al
principio físico en el que se basan, el diseño mecánico, si las mediciones son dinámicas o
estáticas y si son capaces de medir la tensión superficial, la interfacial o ambas. Las medidas
estáticas se realizan en superficies o interfases que se encuentran en equilibrio, mientras que
las dinámicas se llevan a cabo en sistemas que no están en equilibrio.
Los métodos empleados en este trabajo fueron:
Método basado en la medida de una fuerza: Tensiómetro tipo Wilhelmy
Método dinámico basado en una medida geométrica: Tensiómetro de gota
En los apartados siguientes se presentan los métodos empleados en este trabajo para medir
tensiones superficiales en condiciones de equilibrio y dinámicas, con el fin de determinar las
características estructurales y la estabilidad de las monocapas de HPMC, -lg y sus mezclas a
pH3 y pH6.
2.11.1.1Tensiómetro tipo Wilhelmy (determinación de isotermas vs concentración)
Este tensiómetro permite medir la dependencia de la tensión superficial o interfacial (o
presión superficial o interfacial, ) con la concentración de surfactante en la subfase. Este
método consiste en medir la fuerza adicional sobre una placa vertical inmersa parcialmente
en un líquido.
El tensiómetro empleado para realizar las medidas de tensión superficial en el equilibrio
fue un tensiómetro digital Sigma 701 (KSV, Finlandia) y consta de dos partes (Figura 12), la
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
79
unidad de medida y una interfase que permite la adquisición de datos. La interfase incluye la
fuente de alimentación y un indicador digital. La unidad de medida posee la placa de
Wilhelmy que se suspende de un brazo de balanza. Esta placa es de platino, de superficies
rugosas y es el sensor de la tensión superficial. Además se encuentra también, una camisa de
circulación de agua termostatizada en cuyo interior se deposita el vaso conteniendo la
solución a medir. La calibración del equipo es automática. Las puertas anchas de la abertura
en frente permiten el fácil acceso al compartimiento que mide, y proporciona la protección
contra disturbios ambientales.
Figura 12. Fotografía del Tensiómetro de Wilhelmy.
Principio de funcionamiento
Esta técnica posee una gran importancia debido a su universalidad, precisión y
simplicidad. Se fundamenta en que las moléculas de la interfase están sujetas a un esfuerzo
(tensión). Cuando un cuerpo sólido se pone en contacto con la interfase, la tensión interfacial
actúa a lo largo de la línea de mojado. En este tensiómetro, el cuerpo sólido es una lámina de
platino rectangular suspendida verticalmente y de geometría conocida. El borde inferior de la
lámina se pone en contacto con el líquido y de ese modo se moja. La fuerza F con que es
empujada la lámina mojada hacia el líquido puede medirse, como lo muestra la Figura 13.
Materiales y métodos
80
Figura 13. Placa del tensiómetro tipo Wilhelmy en posición de medida.
Si Lb es la longitud mojada, entonces la tensión superficial (け) es:
cos
bL
F (8)
donde es el ángulo de contacto; es decir, el ángulo entre la superficie de la lámina y la
tangente a la línea de mojado. Para medir tensiones interfaciales, la placa debe mojarse
completamente por el líquido que se encuentra en un vaso o cápsula de medición.
Descripción del equipo
El equipo consta de un vaso circular, con un área de termostatización de 63,6 cm2, donde
se introduce la cápsula conteniendo la solución acuosa que se desea medir. La figura 14
ofrece una representación esquemática del tensiómetro empleado. La humedad en el interior
del receptáculo del tensiómetro se mantiene constante mediante colocación de un recipiente
con agua dentro de este.
La longitud mojada de la placa de platino está determinada por 2l + 2b, donde l, es el largo
de la placa y b, su espesor. En este caso las dimensiones del plato son: l=19,9 mm y b=0,1
Fuerza, mN/m Placa de platino rugoso
Longitud mojada
Placa
Angulo de contacto0º
Líquido
Fuerza, mN/m Placa de platino rugoso
Longitud mojada
Placa
Angulo de contacto0º
Líquido
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
81
mm por lo que Lb=40 mm. La temperatura del sistema se mantiene constante 20 °C 0,5ºC,
mediante circulación de agua por una camisa que rodea el recipiente de medida desde un
termostato.
Figura 14. Esquema del Tensiómetro de Wilhelmy con sus partes constituyentes.
Procedimiento experimental
Este equipo se utilizó para realizar medidas de la presión de equilibrio de todas las
soluciones de HPMC. Dicha presión (eq) se determina a partir de la medida de la tensión
superficial, siendo:
eoeq (9)
donde けo es la tensión superficial o interfacial de la fase acuosa en ausencia de tensioactivo y
けe es el valor de equilibrio correspondiente a la tensión superficial o interfacial cuando en la
interfase acuosa hay un exceso de tensioactivo.
Para obtener los valores de equilibrio, se ha procedido de la siguiente forma:
Una vez preparadas las soluciones (el rango de 10-7 a 2 % p/p de concentración), se
conservaron a 4ºC durante 24 hs con el fin de alcanzar el estado de equilibrio, momento en
cual la tensión interfacial fue medida.
Visualización digital de la medida
Ajuste del cero
Placa de Wilhelmy
Camisa de circulación de agua de termostatización
Salida analógica de datos
ON / OFF
Cápsula contenedora de la muestra
Ajuste fino del cero
Materiales y métodos
82
Se introducen aproximadamente 25 ml de solución de las muestras en el vaso de medida.
En primer lugar se ajustó el cero con la placa suspendida muy cerca del líquido. Luego se
subió la plataforma con el vaso que contiene el líquido hasta que entre en contacto con la
placa, momento en que comienza la medida. De esta manera se mide la tensión superficial de
la subfase a la temperatura deseada que en estas experiencias se mantuvo constante a 20ºC.
Se asume que la tensión superficial alcanza el equilibrio, cuando la medida no varía más de
0,1 mN/m en 30 minutos. Cuando se llega al equilibrio en la interfase aire-liquido, se agrega
en la superficie la fase aceite cuidando que se cubra toda la placa de medida. Se mide la
tensión en la interfase aceite- agua hasta que la tensión interfacial alcanza el equilibrio,
cuando la medida no varía más de 0,1 mN/m en 30 minutos (Murray y col, 1998; Murray,
1997; Williams y Prins, 1996).
La representación de la presión superficial de equilibrio en función de la concentración de
surfactante es lo que se denomina isoterma de adsorción ( vs C).
Como norma general, en todas las experiencias realizadas con el tensiómetro de
Wilhelmy, antes de realizar cualquier medida de tensión superficial, la placa de platino se
calienta a la llama de un mechero Bunsen, con el fin de eliminar cualquier impureza que
pueda contaminar la superficie. Los vasos que contenían las soluciones se limpiaron
cuidadosamente, usando primero una mezcla compuesta por ácido sulfúrico y peróxido-
disulfato de amonio, enjuagadas con agua destilada varias veces y secadas por último a la
llama del mechero.
Se informa el promedio de al menos dos mediciones.
2.11.1.2 Tensiómetro de Gota
Las mediciones de tensión superficial dinámica de las películas de HPMC y sus mezclas con
lg adsorbida a la interfase aceite- agua, se realizaron en un tensiómetro automático de gota
(Tracker, IT Concept, Longessaigne, Francia) como se muestra en la Figura 15.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
83
Figura 15. Fotografía del tensiómetro de gota.
Principio de funcionamiento
Los métodos de gota montada o sésil pueden ser empleados para determinar tensiones
superficiales o interfaciales de líquidos. La forma de una gota de líquido depende de un
balance entre fuerzas gravitacionales y superficiales. Las fuerzas superficiales favorecen la
forma esférica de la gota ya que ésta minimiza el área de contacto entre el líquido y su
alrededor. Las fuerzas gravitacionales tienden a ocasionar una elongación (si la gota es
pendiente) o un aplastamiento (si se encuentra sobre una superficie). La forma de equilibrio
adoptada por la gota está determinada por su volumen, densidad y su tensión superficial o
interfacial (Mc Clements, 1999). Dependiendo de la densidad relativa de los dos fluidos entre
los que se encuentra la interfase a estudiar, la gota puede estar montada (gota de aceite en
agua) o colgante (gota de agua en aire). En este trabajo se utilizó la segunda modalidad.
El instrumento permite crear deformaciones periódicas del área de la interfase a una
frecuencia fija durante ciertos períodos de tiempo, y calcula de forma automática la evolución
de las propiedades viscoelásticas de la interfase con respecto al tiempo. Para este trabajo, el
protocolo seguido consiste en que la oscilación sinusoidal del volumen de la gota comienza a
los quince minutos de adsorción del tensioactivo. Transcurrido este tiempo, se somete a la
gota a medidas repetidas con cinco ciclos de oscilación seguidos por otros cincuenta ciclos
Materiales y métodos
84
sin oscilación, hasta el tiempo requerido para la adsorción del tensioactivo. Este tipo de
experiencias suele tener una duración de tres horas.
Descripción del equipo
En la unidad de medida del Tracker (Figura 16) se pueden distinguir dos zonas principales:
i) Dispositivo de formación de la gota: en éste se forma y se controla la gota que se
encuentra dentro de la cubeta. Consta de dos partes: la primera de ellas formada por la jeringa
que termina en un capilar (aguja) y su sistema de impulsión; la segunda está formada por una
cubeta de vidrio y una cubierta donde se introduce ésta, que permite el control de su
temperatura.
La tensión interfacial o superficial entre dos fluidos se determina mediante el análisis del
perfil de una gota, formada de manera que el primer fluido se introduce en la jeringa, cuya
punta queda dentro de la cubeta, que contiene al segundo fluido.
Estas dos partes quedan situadas en un dispositivo que permite realizar movimientos
verticales y laterales de forma separada.
ii) Sistema óptico: incluye una fuente de luz, lentes y una cámara CCD. La gota se
ilumina mediante una fuente de luz uniforme, de forma que su perfil queda registrado con la
ayuda de la cámara CCD y la computadora.
Figura 16. Esquema de los componentes y sistema operativo del tensiómetro de gota.
Estas dos zonas principales tienen a su vez diferentes partes que se pueden configurar de
diferentes maneras permitiendo distintas condiciones para realizar las experiencias.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
85
Jeringa y aguja: las jeringas empleadas en el Tracker son del tipo Exmire, pero se pueden
emplear otras, usando adaptadores en el caso que fuera necesario.
La jeringa se coloca en una cubierta, cuya temperatura se puede controlar gracias a un baño
de circulación de agua. El rango de temperatura suele oscilar normalmente entre 10 y 60 ºC.
Las puntas empleadas pueden ser rectas o curvadas hacia arriba, suelen estar recubiertas de
teflón de manera que cuando se forme la gota, ésta no se quede adherida al extremo de la
aguja.
Cubeta: la cubeta es de vidrio y tiene forma de paralelepípedo, y sus medidas son 10 mm x 20
mm x 40 mm.
La cubeta se introduce en una cámara cuya temperatura también se controla con un baño de
circulación de agua. El rango de temperatura oscila normalmente entre 10 y 60 ºC.
Sistema óptico: constituido por: eje óptico, fuente de luz que proporciona una iluminación
uniforme a la cubeta mediante una lámpara halógena y lentes y cámara CCD.
Cámara de protección de la unidad de medida: esta cámara tiene sus paredes completamente
oscuras y tiene la misión de proteger a la unidad de medida de las perturbaciones procedentes
del exterior.
Procedimiento experimental
Todos los experimentos en el tensiómetro de gota fueron realizados a una temperatura de
20ºC, la cual se mantuvo constante con una variación de 0,1 ºC por circulación de agua desde
un baño termostatizado.
Las concentraciones utilizadas de las soluciones de HPMC y -lg fueron 10-2 %,1% y 2%
p/p. Además se estudiaron mezclas de proteína y polisacáridos con concentraciones de
0,5%/0,5%; 0,5%/1% y 1%/0,5 % p/p respectivamente.
Antes de la medición se procede a la limpieza de la jeringa para eliminar toda impureza
que pueda existir en el interior de la misma. Una vez limpia, se succiona un volumen de
solución correspondiente a la capacidad total de la jeringa. Se incorpora la aguja y se coloca
la jeringa en un soporte especialmente diseñado para mantenerla en posición. Se observa en
Materiales y métodos
86
la pantalla la punta de la aguja (figura 16), la cual debe quedar perfectamente centrada en la
parte superior del monitor.
Una vez formada la gota, comienza inmediatamente la adquisición de datos de tensión
superficial en función del tiempo. Su perfil es digitalizado y analizado a través de una cámara
CCD acoplada a un digitalizador de perfil de imágenes conectado a un procesador. Para
mantener el control visual de la gota, la imagen de la misma es captada en forma permanente
en un monitor de video. La señal de video se transmite a un procesador–digitalizador, que
graba y procesa los datos geométricos de la imagen.
A partir de los 60 segundos comienzan las oscilaciones sinusoidales para la obtención de
los parámetros reológicos. Estos son: el módulo dilatacional superficial (E), con sus
componentes elástica (Ed) y viscosa (Ev) y el ángulo de desfase (δ), medida de la
viscoelasticidad relativa de la película. Estos datos se registraron a lo largo del tiempo, 12000
s y con una amplitud (ΔA/A) y frecuencia angular (ω). Se determinó la variación del área (%),
de manera que estuviera en la región lineal. De este modo, en todas las experiencias se
mantuvo constante la amplitud y la frecuencia a 10 % y 100 mHz, respectivamente.
La computadora permite la adquisición, el análisis de imagen y la realización de los cálculos
necesarios.
Concluida la medición, se retiró la jeringa, se descartó la solución y se procedió con el
protocolo de limpieza que consta de repetidos lavados de la jeringa con etanol y finalmente
con hexano.
Se informa el promedio de al menos dos mediciones.
Determinación de la tensión superficial a partir del perfil de la gota.
Con un procesador de imágenes se puede obtener, a partir de la imagen de la gota, su perfil
completo y así poder calcular el valor de la tensión superficial en un período de tiempo muy
corto, y puede hacerse con una gran precisión mediante la optimización de dicho perfil
mediante un sistema de ecuaciones.
El perfil de la gota se procesó de acuerdo con la ecuación de Laplace para obtener la tensión
superficial:
(10) zC
bsenx
dx
d
x 2
) (1
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
87
donde x y z son las coordenadas cartesianas en una posición dada del perfil de la gota, b es el
radio de curvatura de la gota, es el ángulo del perfil de la gota y C es una constante de
capilaridad (C = g / donde け es la tensión interfacial, es la diferencia entre las
densidades de las dos fases y g es la aceleración de la gravedad). El software empleado
calcula tres parámetros característicos de la gota, que son área, A, volumen, V y la tensión
interfacial け. La exactitud promedio de la tensión interfacial con el equipo utilizado en este
trabajo es de 0,1 mN/m. Sin embargo la reproducibilidad de los resultados se encuentra en un
rango que oscila entre 0,5 y 1,5 %, la reproducibilidad mínima corresponde a las altas
temperaturas (Rodríguez Patino y col., 1999).
Determinación de la velocidad de adsorción.
La cinética de adsorción de la sustancia tensioactiva (por ejemplo, proteína, polisacáridos o
lípidos) sobre la interfase aire–agua se analiza a partir de los cambios de presión superficial
(π) con el tiempo.
Las principales etapas de la cinética de adsorción de un tensioactivo fueron definidas en la
Introducción (figura 8) y son las siguientes (Graham y Philips, 1979; MacRitchie, 1978;
MacRitchie, 1990): (i) difusión del tensioactivo desde el seno de la fase acuosa hacia la
interfase aire–aceite; (ii) adsorción (penetración) y desplegamiento interfacial; y (iii)
agregación (reordenamiento) en la interfase, formación de multicapas e incluso gelificación
interfacial.
i) Etapa de difusión hacia la interfase:
Durante la primera etapa, a presiones interfaciales relativamente bajas o bajas
concentraciones de tensioactivo en la interfase (menores a 10 mN/m), que es cuando la
difusión es la etapa controlante del proceso, puede emplearse una forma modificada de la
ecuación de Ward y Tordai (1946) para correlacionar la variación de la presión interfacial con
el tiempo:
)11()14,3/(2 2/10 tDKTC dif
donde Co es la concentración en la fase acuosa; K es la constante de Boltzmann; T es la
temperatura absoluta; Ddif es el coeficiente de difusión; y t es el tiempo de adsorción. Si la
Materiales y métodos
88
tkit
0180
180ln
0 5 10 150
5
10
15
20
(mN
/m)
tiempo1/2 (s0,5)
(A)
difusión es la etapa que controla el proceso de adsorción, la representación de π frente a t1/2
será lineal (de Feijter y Benjamins, 1987; MacRitchie, 1990; Pérez y col, 2008; Xu y
Damodaran, 1994) y la pendiente que se obtiene a partir de esta se corresponderá con la
constante cinética de difusión (Kdif) (figura 17).
Cuando π es mayor a 10 mN/m se puede estimar la constante de difusión como la pendiente
del primer punto de medición y el origen de coordenadas.
ii y iii) Etapas de penetración y reordenamiento interfacial:
A la hora de analizar la penetración en la interfase y el reordenamiento de las moléculas
adsorbidas en la interfase, se emplea la siguiente ecuación semiempírica de primer orden
(Graham y Philips, 1979) :
(12)
donde, π180, π0, y πt son los valores de presión superficial a los 180 min de adsorción, en el
momento inicial t = 0, y en cada momento t, respectivamente, y ki es una constante cinética
de primer orden.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
89
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
ln
(( 1
80- t)/
( 180
))
tiempo (s)
(B)
Figura 17. Etapas de adsorción de un biopolímero en la interfase aceite-agua: (A) difusión de las
moléculas hacia la interfase y (B) penetración y reordenamiento de las moléculas adsorbidas.
En la práctica, una representación de dicha ecuación en función del tiempo normalmente
proporciona una o más regiones lineales (figura 17). La pendiente inicial corresponde a la
constante cinética de primer orden del proceso de adsorción/penetración (Kads), mientras que
la segunda pendiente corresponde a la constante cinética de primer orden del proceso de
reordenamiento (Kr), que tiene lugar en un número aproximadamente constante de moléculas
previamente adsorbidas (Graham y Philips, 1979; Suttiprasit y col., 1992). A la hora de
aplicar esta ecuación, hay que tener la precaución de seleccionar un intervalo de tiempo que
no se vea afectado por la difusión.
2.11.2 Determinación de la reología de las películas interfaciales.
Las propiedades reológicas describen el comportamiento mecánico de las películas
interfaciales. Estas determinaciones se realizaron también en el tensiómetro automático de
gota (Tracker, IT Concept, Longessaigne, Francia), simultáneo a la adquisición de los datos
de tensión interfacial.
Materiales y métodos
90
El método consiste en someter a la gota a una compresión–expansión sinusoidal controlada
automáticamente con el consecuente incremento y disminución del volumen de la gota a la
frecuencia y amplitud deseadas.
El módulo dilatacional superficial derivado de un cambio sinusoidal en la tensión
interfacial, dけ resultante de un pequeño cambio sinusoidal en el área superficial de la gota, dA
puede ser descripto como (Lucassen & Van Den Tempel, 1972):
Ad
d
AdA
dE
ln/
(13)
= 0. sen (.t + ) (14)
)(0 tsenAA (15)
donde o y Ao son las amplitudes del esfuerzo y deformación, es el ángulo de desfase entre
la deformación y esfuerzo, es la presión interfacial/superficial, けo es la tensión interfacial
en ausencia del tensioactivo y t es el tiempo.
El módulo dilatacional superficial se compone de una parte real y otra imaginaria, 継 = 継鳥 +件継塚 La parte real del módulo, o componente de almacenamiento, es la elasticidad dilatacional
superficial,
Ed = E ∙ cos δ (16)
La parte imaginaria del módulo, o componente de pérdida, es la viscosidad dilatacional
superficial,
Ev = E ∙ sen δ (17)
Mediante la relación entre la componente de pérdida y la de almacenamiento puede
determinarse la tangente del ángulo de pérdida (tg ), que es el desfase de la respuesta de la
tensión (o la presión) superficial respecto a la deformación que se ha realizado. Esta
magnitud proporciona una idea de cuán elástico es el comportamiento de la película, de
forma que si su valor es muy pequeño se considera que la película es prácticamente elástica,
y por ello, la respuesta de la película será inmediata a la perturbación a la que se somete. Si
por el contrario se trata de un valor alto, en la película hay pérdida de energía suministrada,
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
91
por lo cual no responderá tan rápidamente a la perturbación externa. En estos casos, se asocia
a la película un comportamiento viscoso en cierto grado, que depende del valor del ángulo de
pérdida.
建訣 絞 =帳寧帳匂 (18)
En un material puramente elástico el esfuerzo de corte y la deformación se encuentran en
fase, =0°, de forma que la parte imaginaria del módulo es cero y la tg es cero. En el caso
de un material perfectamente viscoso, el desfase será de 90°, siendo por tanto la parte real del
módulo es nula y la tg es uno. Así, el ángulo de desfase aporta información sobre las
propiedades viscoeláticas del material. Las películas más elásticas (a una determinada
frecuencia), darán lugar a menores ángulos de desfase y por lo tanto a una menor cantidad de
energía disipada por ciclo.
Resultados
SECCIÓN I
Comportamiento de
hidroxipropilmetilcelulosa en
solución, interfases y
emulsiones O/W
CAPÍTULO 1
Caracterización del estado de asociación de
hidroxipropilmetilcelulosas en solución por
dispersión dinámica de luz.
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
92
1.1 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de HPMC a pH3 y pH 6.
Las hidroxipropilmetilcelulosas, como muchos otros derivados de polisacáridos, son
difíciles de caracterizar debido a su heterogeneidad, no sólo en su peso molecular sino
también en su composición química (Rinaudo y col., 1993). Las HPMCs son materiales
polidispersos, cada polisacárido contiene un número de cadenas de monosacárido
diferente, dando origen así a una distribución de peso molecular (Pérez y col., 2009;
Viriden y col., 2009). La naturaleza heterogénea de las celulosas lleva a variaciones en
la habilidad y reactividad de los grupos hidroxilo. Para disminuir esta variación entre
las HPMCs comerciales, las muestras deben tener una viscosidad y grado de sustitución
promedio dentro de ciertos límites, los cuales están estipulados en farmacopeas (U.S.P.,
2008). En el área de la química de polímeros, la polidispersidad puede medirse
experimentalmente por dispersión dinámica de la luz.
En este punto es importante tener claro ciertos conceptos que servirán para la
comprensión de este capítulo.
Autoensamblaje (o “self assembly”): es una organización (asociación)
espontánea y reversible de moléculas por medio de interacciones no covalentes, es
decir, puente hidrógeno, hidrofóbicas, van der Waals, electrostáticas. Algunos ejemplos
de este tipo de asociación son la formación de micelas, de cristales de lípidos y de
monocapas.
Asociación: son cambios a nivel molecular caracterizados por uniones débiles
entre sitios específicos de unión, por ejemplo formación de monómeros, dímeros.
Agregación: es el término general que describe diferentes tipos de interacciones
biopolímero–biopolímero promovidas por factores externos como temperatura que
puede involucrar uniones covalentes y puede entonces ser irreversible.
La figura 1.1 muestra la distribución de tamaños por intensidad para soluciones de
E5LV a pH6 y a distintas concentraciones.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
93
1 10 100 1000 100000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Inte
nsi
dad
(%
)
tamaño (d.nm)
> concentración
Figura 1.1. Distribución del tamaño de partícula por intensidad para soluciones de E5LV a pH6 y a distintas concentraciones: 0,2% (►), 0,5% (◄), 1% (●), β% (■), γ% (▲), 4% (♦) y 5% (▼).
En todos los casos se observa una distribución por intensidad multimodal, con
diferentes tamaños dependiendo de la concentración.
De acuerdo al peso molecular promedio de E5LV (tabla 1, materiales y métodos), se
puede estimar mediante el software del equipo de medición de DLS para polisacáridos
lineales que el tamaño de partícula debería ser 2 ,5 nm.
Los resultados indican la existencia de asociaciones o clusters (denominación en
inglés) en las soluciones de HPMC, aún cuando las muestras fueran agitadas con el fin
de destruir los posibles agregados antes de la medición. El autoensamblaje de las
HPMCs se debería a las interacciones hidrofóbicas entre los sustituyentes hidrofóbicos
(Kato y col, 1978) resultando en un incremento del tamaño de los clusters dependiente
de la concentración. Se observa que con el incremento de la concentración, los clusters
tienen tamaños mayores (Figura 1.1).
En la bibliografía se ha reportado que los derivados de celulosa y en general los
derivados de polisacáridos modificados hidrofóbicamente, forman asociaciones o
clusters (Doublier y Launay, 1981).
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
94
1 10 100 1000 100000
4
8
12
16
20
24
28
Vol
um
en (
%)
Tamaño (d.nm)
(A)
1 10 100 1000 100000
4
8
12
16
20
24
28
Vol
um
en (
%)
Tamaño (d.nm)
(B)
Duval-Terrie, Huguet y Muller (2003) encontraron que los derivados de pululanos
establecen asociaciones hidrofóbicas en solución y que este autoensamblaje ocurre a
concentraciones bajas cuando el número de sitios hidrofóbicos aumenta. Los clusters
que se forman son resultado de asociaciones hidrofóbicas inter e intra- moleculares.
Sarkar y Walker (1995) informaron que la metilcelulosa se asocia aún a temperatura
ambiente y que este proceso puede influir en su capacidad para hidratarse y
deshidratarse. Funami, Kataoka, Hiroe, Asai, Takahashi y Nishinari (2007) propusieron
que la metilcelulosa tiene una alta tendencia a asociarse en solución acuosa con el
aumento del peso molecular y/o la concentración y sugirieron la existencia de
interacciones intermoleculares en soluciones de metilcelulosas a partir de mediciones de
viscosidad. Resultados similares se encontraron al estudiar hidroxipropilmetilcelulosas a
pH 6,5 en solución (Jumel y col., 1996) y metilhidroxipropilcelulosa (Yuguchi y col.,
1995).
Como en DLS la intensidad dispersada es proporcional al cuadrado del peso
molecular (o R6), la distribución por intensidad tenderá a sobredimensionar la presencia
de las partículas más grandes. La distribución de tamaños por volumen (figura 1.2A)
indica que las partículas más grandes encontradas entre los 300 y los 5000 nm en la
figura 1.1 para E5LV, representan sólo una pequeña población dentro de la muestra.
Cuando se analiza la distribución de tamaños por volumen para las cuatro HPMCs
estudiadas (Figura 1.2), se observa que en todos los casos los picos mayoritarios
aparecen en tamaños menores a los 100 nm. Sólo para las concentraciones mayores a
1%, se evidencia una pequeña población a los 1000 nm.
En las figuras 1.2 B, C y D, se observa una tendencia similar para HPMCs de mayor
peso molecular como E15LV, E50LV y E4M.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
95
1 10 100 1000 100000
4
8
12
16
20
24
28
V
olum
en (
%)
Tamaño (d.nm)
(C)
1 10 100 1000 100000
4
8
12
16
20
24
28
Vol
ume
n (%
)
Tamaño (d.nm)
(D)
1 10 100 1000 100000.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
Inte
nsi
da
d (%
)
Tamaño (d.nm)
(A)
1 10 100 10000.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
Vo
lum
en
(%)
Tamaño (d.nm)
(B)
Figura 1.2. Distribución del tamaño de partícula por volumen para soluciones de E5LV (A),
E15LV (B), E50LV (C) y E4M (D) a pH6 y distinta concentración: 0,2% (►), 0,β5% (), 0,5% (◄), 1% (●), 1,5% (*), β% (■), γ% (▲), 4% (♦) y 5% (▼).
En la figura 1.3A se compara la distribución del tamaño de partícula por intensidad
para una misma concentración de diferentes HPMC (2 % p/p) a pH6. Se evidencia la
misma tendencia, todas presentaron distribuciones multimodales, con distintos tamaños
dependiendo del polisacárido. Las poblaciones de mayor tamaño representan sólo una
pequeña proporción en la muestra, evidenciado por el análisis de la distribución por
volumen (Figura 1.3B).
Figura 1.3. Distribución del tamaño de partícula por intensidad (A) y volumen (B) para
soluciones de HPMCs al 2 % y pH6: (■) E5LV, (▲) E15LV, (▼) E50LV y () E4M.
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
96
1 10 1000
5
10
15
20
25
7,53 nm
Vol
ume
n (%
)
Tamaño (d.nm)
(A)
2,33 nm
1 10 1000
5
10
15
20
25
8,72 nm4,18 nm
Vol
ume
n (%
)
Tamaño (d.nm)
(B)
1 10 1000
5
10
15
20
25
7,53 nm
5,61 nm
Vo
lum
en
(%
)
Tamaño (d.nm)
(C)
1 10 1000
5
10
15
20
2511,70 nm
10,10 nm
Vo
lum
en (
%)
Tamaño (d.nm)
(D)
La figura 1.4 muestra el efecto del pH (3 o 6) en la distribución por volumen para las
diferentes HPMCs estudiadas a la concentración de 2%.
A pH3 las distribuciones fueron bimodales con un pico predominante a los menores
tamaños, alrededor de 2, 4 y 13 nm para E5LV, E15LV y E50LV respectivamente. Sólo
las soluciones de E4M a pH3 presentaron una distribución monomodal, con el máximo
del pico a los 10 nm.
Figura 1.4. Distribución del tamaño de partícula por volumen para soluciones de HPMCs al 2% a pH3 (símbolos llenos) y a pH6 (símbolos vacíos). E5LV (A), E15LV (B), E50LV (C) y E4M (D).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
97
Con el software del equipo Zetasizer Nano ZS se puede realizar una estimación del
peso molecular de las HPMCs, ingresando para tal fin el diámetro hidrodinámico
obtenido. Los valores obtenidos de la curva de distribución corresponden a 2,1; 7,4;
13,6 y 39 kDa para E5LV, E15LV, E50LV y E4M respectivamente.
Sin embargo, los picos obtenidos fueron anchos, siendo esto indicativo de la
existencia de una distribución de pesos moleculares. La estimación del peso molecular
basado en los extremos del pico de distribución indica un rango de pesos moleculares,
0,9 -7,7 kDa para E5LV, 2,7-12 kDa para E15LV, 4,6-80 kDa para E50LV y 10,1 -
246,8 kDa para E4M.
Como puede observarse, los pesos moleculares informados para los monómeros de
HPMCs (Tabla 1, Materiales y Métodos) se encuentran dentro de la distribución de
pesos moleculares obtenida por DLS para cada HPMC.
El pico a mayores tamaños (y de menor % volumen) (Figura 1.4) corresponde a formas
autoensambladas o clusters formados por cada HPMC. La tendencia de las HPMC a
asociarse sería consecuencia de su alto grado de substitución con grupos metilos (Tabla
1, Materiales y Métodos), lo cual permitiría fuertes interacciones hidrofóbicas.
A pH6, todas las distribuciones resultaron monomodales, con un pico ancho lo que
indica la presencia de una amplia distribución de tamaños de partícula. Este pico, con
excepción de E4M, coincide con el pico de menor tamaño observado a pH3 alrededor
de los 10 nm, atribuido a las formas autoensambladas del polisacárido.
Puede verse también la ausencia del pico a tamaños menores que se observó a pH3. El
máximo del pico monomodal para pH6 está alrededor de los 8 nm para E5LV, E15LV y
E50LV indicando la ausencia de la forma monomérica. La estimación de los pesos
moleculares en base a los valores de tamaños del ancho del pico, indicaron un rango de
7,7-189,1 kDa para E5LV, 10,1-322,6 kDa para E15LV y 7,7-342,6 kDa para E50LV.
Esto revela la existencia de clusters y la ausencia de las formas monoméricas a pH6.
El pH casi no afecta la distribución de tamaños de E4M (Figura 1.4D), las
asociaciones están presentes en mayor proporción a pH6 (Figura 1.4 D) dentro de las
curvas de distribución obtenidas. Se presentan formas asociadas de hasta 247 kDa. Este
comportamiento estaría vinculado al menor % de metilos de esta HPMC (tabla 1,
materiales y métodos) y a la menor tendencia a la asociación al aumentar el peso
molecular (Sarkar, 1977).
Con el fin de explicar las diferencias observadas con el pH, se estudió la carga
superficial por medio de la medición del potencial zeta (tabla 1.1).
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
98
Tabla 1.1 Potencial zeta determinado en soluciones de HPMCs al 2 %p/p
* promedio DS de al menos n = 3
A pH3, las HPMCs presentan una pequeña carga neta superficial negativa, que
causaría un menor autoensamblaje, predominando las formas monoméricas (Figura 1.4).
A pH6, el potencial zeta ligeramente positivo estaría relacionado con la fuerte tendencia
a la formación de clusters observada en la figura 1.4.
Dada la naturaleza no iónica de las HPMCs, la carga negativa a pH3, sería
consecuencia de la presencia de los iones cloruro, provenientes del buffer citrato. Estos
iones podrían interactuar con las moléculas de HPMC, generando una repulsión
electrostática que impediría las interacciones hidrofóbicas.
Sin embargo, la magnitud del potencial zeta (carga negativa) no es suficientemente
alta como para justificar la falta de interacción entre los residuos hidrofóbicos debido a
fuerzas de repulsión electrostáticas. En estos polisacáridos a bajas temperaturas las
moléculas de agua se disponen rodeando los grupos hidrofóbicos constituyendo
estructuras llamadas tipo-jaula (Sarkar, 1995). Puede pensarse que los iones cloruro
estén interaccionando con los grupos hidrofóbicos, reforzando la estructura tipo jaula
del agua alrededor de estos grupos e impidiendo así el autoensamblaje.
Un efecto similar se observa para las proteínas. Phillips, Whitehead y Kinsella
(1994) informaron que los solutos como hidrocloruro de guanidina y urea pueden alterar
la estructura del agua alrededor de los residuos amino no polares. La alteración en la
estructura de las moléculas de agua que rodean los grupos no polares de las proteínas
aumenta la solubilidad porque debilita las interacciones hidrofóbicas y aumenta las
interacciones dipolo-dipolo entre las proteínas y el agua.
Tritt-Goc y Pislewski (2002), al estudiar la hidratación de HPMCs a pH2 y pH6,
encontraron una gran afinidad entre las moléculas de HPMCs y el medio circundante a
HPMC pH3* pH6*
E4M -1.04 0.10 +0.81 0.08 E50LV -1.22 0.15 +0.79 0.10 E15LV -1.23 0.08 +0.41 0.15
E5LV -1.81 0.05 +0.78 0.05
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
99
E4M E50LV E15LV E5LV0
100
200
300
400
500
(A)
d(H
) p
rom
edio
(n
m)
pH 2. A bajos pH predomina un alto número de uniones hidrógeno entre los protones
del solvente y las moléculas de HPMCs.
Por lo tanto, el aumento de las interacciones entre las HPMCs y el solvente sería un
factor adicional que previene las interacciones hidrofóbicas, responsables de la
formación de agregados.
Sawyer y Reed (2001) también señalaron que un cambio en el pH tiene influencia en
las propiedades de las moléculas de HPMC cuando se adsorben sobre partículas sólidas.
Ellos observaron que las uniones hidrógeno son dependientes del pH del medio. Hay
menor adsorción a la interfase de las partículas sólidas a mayores pHs, indicando mayor
interacción entre las moléculas de HPMCs.
A fin de comparar el efecto del pH, se muestra en la figura 1.5 el análisis de
cumulantes, diámetro promedio (d(H)) y el índice de polidispersidad (IPD) para las
soluciones de HPMCs 2% a ambos pHs. Se observa que el diámetro promedio es mayor
en todos los casos a pH6 y mayor para E4M, es decir, las asociaciones son dependientes
del peso molecular. La polidispersidad, asociada con el grado de asociación, es mayor
también a pH6 y creciente con el peso molecular del polisacárido.
A pH3, E4M presenta la menor carga superficial, evidente en el mayor diámetro
promedio e índice de polidispersidad (Figura 1.5) como también en la distribución por
volumen (Figura 1.4).
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
100
Figura 1.5. Diámetro promedio (A) e índice de polidispersidad (B) para soluciones de HPMCs 2% p/p a pH3 (…) y pH6 (░).
El efecto del pH puede verse reflejado también en el coeficiente de difusión (D) (tabla
1.2) calculado por DLS y que proviene del movimiento browniano de las partículas
como se vio en la introducción, aparatado 4.1. Este coeficiente relaciona la movilidad de
las moléculas de HPMC en el seno de la solución y está directamente relacionado con el
peso molecular.
Puede observarse que el D disminuye con el incremento del peso molecular, es mayor
para E5LV y menor para E4M, polisacáridos con el menor y mayor peso molecular
respectivamente. El diámetro promedio también resultó mayor para E4M (Figura 1.5A).
Las soluciones a pH6, presentaron un D menor que las soluciones de HPMCs a pH3.
Esto está directamente relacionado con las formas asociadas a pH6 mientras que a pH3
prevalece la forma monomérica.
E4M E50LV E15LV E5LV0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
(B)IP
D
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
101
Tabla 1.2. Coeficientes de difusión, D (m2/s), para soluciones de HPMC 2% a pH3 y pH6
* promedio DS de al menos n = 3.
1.2 Efecto de la temperatura en la distribución de tamaño de partícula en las
soluciones de HPMC a pH6.
Existen en la literatura diferentes interpretaciones acerca del mecanismo de
gelificación de soluciones acuosas de metilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. La
mayoría de los trabajos coinciden en que la gelificación de estas moléculas
involucra dos etapas. La etapa I, llamada régimen pre-gel, incluye interacciones
hidrofóbicas con la consecuente formación de asociaciones o clusters. Kato y col.
(1978) han propuesto que la etapa I está determinada principalmente por la
asociación de los dominios más hidrofóbicos de la cadena de celulosa, que son los
residuos de glucosa trisustituidos con grupos metilo. Esto lleva a la formación de
asociaciones hidrofóbicas de tamaño creciente (Figura 1.6).
La etapa II, o régimen gel, corresponde a la gelificación propiamente dicha que
ocurre a altas temperaturas y está comúnmente asociada con la separación de fases
(Yuguchi y col, 1995; Kobayashi, 1999). Según Kato y col (1978) la segunda etapa
involucra la asociación hidrofóbica de dominios menos hidrofóbicos (glucosas di y
mono sustituidas). Las formas autoensambladas o clusters, crecen y forman
cristalitos que causan la separación de fases (Yuguchi y col, 1995). La presencia de
cristalitos formados por trimetilglucosas ha sido confirmada por la técnica de
difracción de rayos X (Kato y col, 1978) y por microcalorimetría (Yuguchi y col,
1995). En este último caso se han observado dos picos exotérmicos en el
termograma correspondiente al enfriamiento de geles de HPMC. El pico presente
alrededor de 60ºC corresponde a la disolución de las dos fases separadas y el de
50ºC a la fusión de las micelas cristalinas.
pH6* pH3*
E4M 0,96 0,13 1,04 0,10 E50LV
1,90 0,10 2,72 0,17
E15LV
8,02 0,20 10,90 0,15 E5LV 14,1 0,15 17,10 0,17
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
102
La temperatura que divide a ambas etapas ha sido establecida alrededor de 50ºC
por Kobayashi y col (1999). Esta interpretación del proceso de gelificación fue
fundamentada por trabajos que incluyen el estudio teórico del proceso (Tanaka y
col, 1996).
25ºC >55ºC >74ºC TºC
Grupos hidrofóbicos
Cadenas de celulosa
Agua
Figura 1.6. Asociación de las cadenas de HPMC durante la gelificación por calor
(Perez, 2005).
En la literatura se encuentran diversos trabajos donde se caracteriza la agregación y/o
gelificación de los derivados de celulosa por medio de calorimetría y reometría
dinámica (Desbrieres y col., 1998; Duval- Terrie, J. y Muller, 2003; Funami y col, 2007;
Hussain y col, 2002; Sekiguchi y col., 2003; Silva y col, 2008). Muy pocos autores se
centran en la caracterización de las soluciones de HPMC durante el calentamiento por
DLS, a pesar de ser este método muy sensible a la aparición de formas asociadas o
agregados. Es un método ampliamente utilizado para la caracterización de la agregación
de otros biopolímeros, como la lg (Bauer y col., 1998; Schokker y col., 2000). Funami
y col. (2007) utilizaron la técnica de dispersión estática de la luz para estudiar
soluciones acuosas de metilcelulosas.
Con el fin de caracterizar el comportamiento de las HPMCs frente al calentamiento,
se seleccionaron las celulosas de mayor y menor peso molecular, que también difieren
en el porcentaje de grupos metilo (Tabla 1, materiales y métodos).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
103
1 10 100 1000 100000
5
10
15
20
25
30
35
40
Vol
umen
(%
)
Tamaño (d.nm)
> Temperatura(A)
1 10 100 1000 100000
5
10
15
20
25
30
35
40
Vo
lum
en
(%
)
tamaño (d.nm)
> Temperatura
(B)
En la figura 1.7, se muestra la variación en la distribución de tamaños por volumen
para soluciones de E5LV y E4M al 2 % p/p a pH6 al aumentar la temperatura desde 25
a 63 °C.
Figura 1.7. Distribución del tamaño de partícula por volumen para soluciones de HPMCs al
2% a pH6, E4M (A) y E5LV (B) . (■) β5°C, (●) γ0°C, (▲) γ5°C, (▼) 40°C, (◄) 45°C, (►)50°C, ()55°C, ()60°C y ()63°C.
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
104
Puede verse en la figura 1.7 que para ambas HPMCs hay un gran aumento de
tamaño a partir de los 50 °C, temperatura relacionada con el inicio de la etapa II, donde
las formas asociadas o clusters previamente formados, crecen y forman un gel.
Similares resultados fueron obtenidos por Silva y col. (2008) al estudiar la asociación y
gelificación de las HPMCs. Entre los 25 y los 55°C los resultados de fluorescencia
indicaron que hay poca interacción pero ocurre una desorganización en los dominios
hidrofóbicos de la molécula. Luego de los 55°C, hay un marcado aumento en las
interacciones hidrofóbicas, indicando una mayor asociación del polímero.
Todas las HPMCs estudiadas tienen un grado de sustitución (DS) mayor a 1,5 (Tabla
1, materiales y métodos), necesario para que las asociaciones hidrofóbicas tengan lugar
(Funami y col., 2007; Hirrien y col., 1996).
Por encima de los 50°C aparecen formas autoensambladas de tamaño mayor a 300
nm, aproximadamente 30 veces más grandes que los obtenidos a temperaturas menores.
Funami y col. (2007) estudiaron la asociación de soluciones acuosas de metilcelulosa y
encontraron que a partir de los 60°C, el tamaño de partícula de los polisacáridos
aumenta marcadamente.
E4M tiene menor % de grupos metilos pero es la HPMC con mayor peso molecular, lo
cual se traduce en una mayor grado promedio de polimerización, en realidad es cuatro
veces mayor que la correspondientes a las otras HPMC (dato suministrado por Dow
Chemical Co.). Es por ello, que los picos a cada temperatura en la curva de distribución
se presentan con un porcentaje en volumen más alto para las soluciones de E4M (Figura
1.7A) que para las soluciones de E5LV (Figura 1.7B). En la sección 1.1.1 del presente
capítulo, se evidenció que con el aumento del peso molecular, el tamaño de los clusters
es mayor.
Funami y col. (2007), Nishinari, Hofmann, Moritaka, Kohyama y Nishinari (1997) y
Vigouret, Rinaudo y Desbrieres (1996), informaron que la gelificación de la
metilcelulosa depende no solamente del peso molecular, sino también del patrón de
sustitución.
Según Kobayashi, Huang y Lodge (1999) durante la primera etapa del proceso de
gelificación se observa la transición de soluciones transparentes a turbias que acontece a
una temperatura que se denomina cloud point, el cual ocurrió alrededor de 38ºC para
las HPMCs de mayor peso molecular y a los 45 °C y 50°C para E15LV y E5LV
respectivamente, como se verá en el capítulo 2 de esta sección. El cloud point es
indicativo del comienzo de las asociaciones mediadas por interacciones hidrofóbicas. A
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
105
20 25 30 35 40 45 50 55 60 650
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Temperatura (°C)
d(H
) pr
ome
dio
(nm
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
D (m
2/s)
cloud point
(A)
bajas temperaturas el polímero en solución presenta moléculas de agua que se disponen
rodeando los grupos hidrofóbicos constituyendo estructuras llamadas tipo-jaula
provocando el aumento en la solubilidad del polímero (Figura 1.6). Con el
calentamiento, las estructuras tipo-jaula sufrirían distorsiones, eliminación del agua de
hidratación y finalmente desorganización exponiendo las regiones hidrofóbicas e
induciendo la formación de agregados (Sarkar y col., 1995). Kobayashi y col. (1999)
informaron que entre los 55 °C y los 65 °C hay un aumento importante en el valor de G´
(módulo de almacenamiento) que ellos atribuyen a la formación de un gel fuerte, donde
no hay flujo. Comprobaron también por DLS que el aumento en el valor de G´ va
acompañado por una mayor formación de formas asociadas. Perez, Wargon y Pilosof
(2006) encontraron, al estudiar la asociación de soluciones de HPMCs, que hay dos
etapas bien diferenciadas en el proceso de gelificación y que el punto gel detectado por
tilting test difiere del detectado por reometría dinámica, más sensible a la formación de
una estructura primaria de gel.
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
106
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Temperatura (°C)
d(H
) pr
omed
io (
.nm
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
D (m
2/s)
(B)
cloud point
Figura 1. 8. Diámetro promedio (d(H)) y coeficiente de difusión (D) en función de la temperatura para HPMCs 2% a pH6. (A) E4M y (B) E5LV. Desviación estándar < 1%.
El análisis del diámetro promedio (d(H)), Figura 1.8), muestra un brusco ascenso en su
valor después de los 50°C para ambos polisacáridos. A partir de este valor, empiezan a
crecer los clusters formados en la etapa pre-gel (etapa I), las interacciones hidrofóbicas
aumentan y finalmente se llega a la formación de una estructura de red tridimensional.
Funami y col. (2007) también concuerdan con que la asociación por temperatura de las
metilcelulosas, lleva a la formación de una estructura tipo red.
En la figura 1.8 se muestra también el coeficiente de difusión en solución,
directamente relacionado con la movilidad y tamaño de las partículas. Este disminuye
gradualmente con el aumento de la temperatura, pero el mayor descenso se observa
también a los 50°C, donde el tamaño de las formas agregadas se hace mayor y la
difusión en solución, entonces, se enlentece.
Puede observarse también, que el diámetro promedio obtenido para E4M es mayor
que para E5LV a todas las temperaturas, y que el coeficiente de difusión en solución es
menor para E4M, relacionado con su mayor peso molecular.
En la figura 1.8 se indica también el cloud point determinado experimentalmente. Se
observa que a esta temperatura crítica el tamaño de las formas agregadas en ambas
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
107
0.1 1 10 100 1000 100000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Inte
nsi
dad
(%
)
tamaño (d.nm)
(A)
HPMC es similar (alrededor de los 40 nm) y representa el inicio de la visualización de
la turbidez en la solución. Para E4M la temperatura de cloud point es menor.
1.3 Distribución de tamaño de partículas en soluciones de mezclas de HPMC y
agentes disociantes a pH 6 y temperatura ambiente.
En la bibliografía existen muchos trabajos donde se han estudiado las interacciones
entre las HPMC y SDS principalmente (Avranas y Iliou, 2003; Nilsson, 1995; Ridell y
col., 2002; Soviljy y col., 2006), pero muy pocos se han focalizado en el estudio de
estas interacciones por DLS.
Los aspectos más importantes de esta interacción son el grado de redistribución
(adsorción) de las moléculas anfifílicas (SDS), la fuerza iónica, los solventes presentes y
del tipo y tamaño de los clusters formados (Nilsson, 1995).
En este apartado, se estudian las interacciones de E5LV con SDS 2%.
En la Figura 1.9 se muestra la distribución de tamaños de partículas por intensidad
(Figura 1.9A) y por volumen (Figura 1.9B) en presencia de SDS 2%.
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
108
0.1 1 10 100 10000
5
10
15
20
25
30
Vo
lum
en (
%)
tamaño (d.nm)
sds 2%
E5LV + sds 2%
E5LV
(B)
Figura 1.9. Distribución del tamaño de partícula por intensidad (A) y volumen (B) para soluciones de E5LV + SDS 2% a pH6, (■) 0,25%, (●) 0,50% y (▲) 1%. En Figura B: E5LV: (□) 0,β5%, (0)0,50%, () 1% y SDS 2% solo (*).
De la interacción de E5LV y SDS 2% en solución, puede observarse en la figura
1.9A, una distribución por intensidad multimodal, con tres poblaciones bien definidas.
La primera con un máximo de 2,5 nm, la segunda alrededor de los 20 nm y la última
varía entre los 200 nm y los 2000 nm dependiendo de la concentración de E5LV en la
solución. Puede verse que a mayor concentración, las familias de mayor tamaño
aparecen a mayores tamaños.
Al ser las HPMCs de naturaleza polidispersa (Rinaudo y col., 1993; Viridén y col,
2009), estas poblaciones a mayores tamaños pueden deberse a formas autoensambladas
al igual que cuando las HPMCs están solas en solución (sección 1.1).
Cuando se analiza la distribución por volumen de estas soluciones (Figura 1.9B),
puede verse una distribución monomodal. Los picos pertenecientes a las soluciones de
E5LV +SDS 2% están todas por debajo de los 5 nm, indicando que las formas asociadas
de mayor tamaño sólo presentan una pequeña proporción dentro de la mezcla.
En la figura 1.9B se compara simultáneamente la distribución de las mezclas con las
correspondientes a E5LV sola y a la solución de SDS 2%.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones O/W
109
Se observa que para todas las concentraciones estudiadas, las distribuciones de tamaño
para las mezclas de E5LV y SDS, tienen un diámetro promedio (3nm) que es mucho
menor que el correspondiente a las soluciones de E5LV solas. Para las soluciones de
E5LV solas el máximo está en los 4nm para 0,25 % y 0,5% y en los 10nm para 1%,
presentando esta última concentración una distribución monomodal.
Es decir, en todos los casos las distribuciones correspondientes a las mezclas de
HPMC+SDS 2% presentan una distribución cuyos diámetros están por debajo de los
correspondientes a las soluciones de HPMC solas en solución pero son mayores al
diámetro de la solución de SDS 2% sola (Figuras 1.9).
Con el agregado de SDS 2%, se ve afectado la asociación de las HPMCs en solución.
Por naturaleza, las HPMCs tienden a asociarse en solución (figura 1.4) pero la
presencia de SDS hace que estas formas asociadas sean de menor tamaño (figura 1.9B ).
Se conoce que el SDS forma micelas en solución y que a partir de una concentración
dada (concentración micelar crítica, CMC), el tamaño de estas micelas no aumenta. Esta
concentración está determinada en 7,5 mM (Nilsson, 1995), mucho menor a la
concentración empleada en los ensayos realizados con SDS 2% ( 20mM).
Nilsson (1995) y Sovilj y col. (2006), al estudiar las interacciones de HPMCs y SDS en
solución acuosa, informaron que a partir de una cierta concentración de SDS, se
detectan cambios en la interacción con las HPMCs. También coinciden en que la
interacción entre HPMC y SDS provoca cambios conformacionales en la molécula del
polímero.
Estos autores sostienen que cuando el SDS es agregado a una solución acuosa de
HPMC, no se detecta ninguna interacción hasta que se supera cierta concentración de
SDS, determinada en 4mM. Luego, el SDS comienza a adsorberse a la cadena de
HPMC en forma de pequeñas micelas. El SDS continúa redistribuyéndose a lo largo de
la cadena de HPMC hasta que el polímero se satura. Si la concentración de SDS
aumenta, se forman luego micelas de mayor tamaño entre las moléculas de SDS. Estas
micelas de mayor tamaño interaccionan con los sitios hidrofóbicos de cada molécula
impidiendo así su interacción.
Las curvas de distribución obtenidas para E5LV en mezclas con SDS 2%, coinciden
con el modelo de interacción descripto ya que reflejan la desaparición de los clusters de
E5LV y de las micelas de SDS y la aparición de partículas con un d(H) correspondiente
a la forma monomérica de E5LV o a complejos con SDS.
Sección I- Capítulo 1. Caracterización de soluciones de HPMC por DLS
110
Al ser tan alta la concentración de SDS empleada, las micelas que se forman
interaccionan con los sitios hidrofóbicos de las HPMCs, impidiendo o enlenteciendo así
la asociación entre las moléculas de HPMC.
1.4 Conclusión.
Las HPMC muestran una fuerte tendencia a autoensamblarse en solución mediantes
uniones hidrofóbicas, especialmente a pH6, donde las formas monoméricas se aprecian
en menor proporción. El tamaño de los clusters formados aumenta con la concentración
de HPMC y con el tamaño molecular de los mismos siendo menores a 100 nm.
Esta tendencia se minimiza a pH3, donde ocurriría una modificación en la estructura del
agua asociada a los grupos hidrofóbicos, previniendo su interacción y la formación de
estructuras autoensambladas. Un aumento de temperatura favorece el autoensamblaje de
las HPMC mientras que la presencia de SDS lo previene.
Capítulo 2
Efecto de ultrasonidos de alta intensidad en el
estado de asociación de
hidroxipropilmetilcelulosas y su impacto en las
propiedades funcionales.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
111
2.1 Usos de ultrasonidos de alta intensidad.
Los ultrasonidos de alta intensidad (USAI) (16– 100 kHz, 10-1000 W cm-2)
presentan un inmenso potencial para una gran variedad de procesos en la industria de
alimentos. El efecto del ultrasonido está relacionado a la cavitación, calor, agitación
dinámica, esfuerzo de corte y turbulencia (Floros y Liang, 1994; Fukas y col, 1994;
Mason y col, 1996). Puede causar cambios físicos y químicos en un medio viscoso
mediante la generación y colapso de cavidades. El incremento de presión y temperatura
en la vecindad de estas cavidades es la base de los efectos químicos y mecánicos
observados.
El rápido colapso de las burbujas (cavidades) produce esfuerzos de corte en el seno
del líquido que las rodea y estos esfuerzos son lo suficientemente fuertes por ejemplo,
para romper enlaces covalentes en materiales poliméricos que están en suspensión en el
líquido (Güzey, 2002).
Los ultrasonidos de alta intensidad han sido aplicados para acelerar los procesos de
transporte de masa en el mezclado, secado y extracción, degasificación de líquidos en
alimentos, para la inducción de reacciones de oxidación / reducción, para la extracción
de enzimas y proteínas, para inactivación microbiológica y enzimática, para la
inducción de la nucleación en cristales y también es uno de los pocos métodos que
permite la obtención de emulsiones submicrónicas (McClements, 1995; Mason y col,
1996; Knorr y col, 2004).
La aplicación de ultrasonidos de alta intensidad para modificar los biopolímeros está
siendo muy estudiado y muchos trabajos se centran en la habilidad del ultrasonido de
depolimerizar a los polisacáridos tales como dextrano, - carragenano, quitosano y
almidón (Lorimer y col, 1995; Chen y col, 1997; Kardos y Luche, 2001; Eschette y
Norwood, 2003; Liu y col, 2006; Iida y col, 2008) con el objetivo de modificar sus
propiedades funcionales. Kardos y Luche (2001) encontraron que la irradiación de
ultrasonido ofrece un importante potencial para la conversión de materiales de biomasa
cruda tales como carbohidratos polimericos a moléculas de mayor utilidad y de menor
peso molecular.
El efecto de los ultrasonidos de alta intensidad sobre la estructura y funcionalidad de
proteínas ha sido menos estudiado. Recientemente se han reportado cambios
estructurales y funcionales en albumina de suero bovino (BSA) (Gurelsen y col, 2007).
Los autores informan un incremento en la actividad superficial y cambios mínimos en la
Sección I- Capítulo 2. Efectos de USAI en la asociación de HPMC y su impacto en las propiedades funcionales
112
estructura global de la BSA. El tamaño de partícula aumentó hasta 3,4 veces después de
un tratamiento de 90 minutos de ultrasonido. El aumento en el tamaño de partícula y el
decrecimiento del número de grupos sulfhídricos libres fue atribuido a la formación de
agregados.
El efecto de los ultrasonidos en la degradación de polisacáridos depende de la
concentración, temperatura, tipo de solvente y tiempo del tratamiento de ultrasonido.
Los polisacáridos son degradados en mayor medida en soluciones diluídas y a
temperaturas bajas (Chen y col, 1997). La degradación aumenta con un mayor tiempo
de ultrasonido. Generalmente, los polisacáridos de mayor peso molecular son
degradados en mayor extensión (Xiaodong y col, 1998; Liu y col, 2006). Esto puede
deberse a que hay más chances de ser atacado por la energía de la cavitación al tener
mayor peso molecular. Las especies de menor peso molecular tienen tiempos de
relajación menores y entonces, pueden resistir el stress de la cavitación en mayor
medida que las especies de mayor peso molecular. Recientemente, Iida y col (2008) han
informado que el poder del ultrasonido puede efectivamente disminuir la viscosidad de
soluciones de almidón después de su gelatinización pero el proceso no induciría grandes
cambios en la estructura química.
A continuación se describen los principales factores que afectan al proceso:
1) Presencia de gases: La eficiencia del ultrasonido reside en la generación y el
colapso de las cavidades. La introducción de cavidades de gas (burbujas) en un sistema
aumenta el número de sitios de nucleación. Esto lleva a una distribución de la energía
más uniforme en todo el sistema. Los gases monoatómicos con capacidad calorífica alta
como argón pueden mejorar los efectos de la cavitación (Güzey, 2002).
2) Temperatura: Mason y col., (1996) investigaron el efecto de la temperatura del
medio en la eficiencia de la reducción del tamaño de partícula utilizando ultrasonidos.
Observaron un decrecimiento en la intensidad de la energía de ultrasonidos de 79 a 23
W cm-2 cuando la temperatura se incrementó de 0 a 90 °C. Esta relación inversa entre la
temperatura y la energía de ultrasonido se atribuye al incremento en la presión de vapor
del solvente resultando en un retardo en el tiempo de colapso de las burbujas de aire.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
113
1 10 100 1000 100000
5
10
15
20
25
30
Vol
umen
(%
)
Tamaño (d.nm)
(A)
1 10 100 1000 100000
5
10
15
20
25
30
Vo
lum
en
(%
)
Tamaño (d.nm)
(B)
3) Propiedades del solvente: La presión de vapor, viscosidad y la tensión superficial
del solvente tienen una importante influencia en la intensidad de la energía de
ultrasonidos. El volumen del solvente procesado es otro factor importante que puede
influenciar la energía entregada.
2.2. Distribución de tamaño de partículas en soluciones de HPMC a pH3 y pH6
después del tratamiento de ultrasonido.
Se estudió el impacto del tratamiento de ultrasonidos en el tamaño de partícula de
distintas soluciones de HPMC a pH 3 y pH6. La figura 2.1 A-D muestra la distribución
de tamaños por volumen de soluciones a pH6 2% p/p de E5LV, E15LV y E50LV y de
0,5 % p/p de E4M inmediatamente después del tratamiento del ultrasonido en
comparación a las distribuciones de las muestras sin tratamiento. En todos los casos el
pico de la muestra sin tratamiento decrece o desaparece y aparecen clusters de mayor
tamaño en las muestras sonicadas, la mayoría de los cuales tienen un tamaño cercano a
los 1000 nm.
Sección I- Capítulo 2. Efectos de USAI en la asociación de HPMC y su impacto en las propiedades funcionales
114
1 10 100 1000 100000
5
10
15
20
25
30
Tamaño (d.nm)
Vol
umen
(%
)
(C)
1 10 100 1000 100000
5
10
15
20
25
30
Vo
lum
en
(%
)
Tamaño (d.nm)
(D)
Figura 2.1. Distribución de tamaño de partículas por volumen para soluciones de HPMC a pH6 sin tratamiento (símbolos llenos) y con tratamiento (símbolos vacíos) para (A) E5LV 2% (B) E15LV
2%, (C) E50LV 2% y (D) E4M 0.5%.
La figura 2.2 muestra el diámetro promedio (Zaverage) de las partículas antes e
inmediatamente después del tratamiento de ultrasonido en función de la concentración
de soluciones de HPMC a pH6.
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
10
100
1000
10000
E4M USAI
E4M sin USAI
(A)
concentración (% p/p)
d(H
) pr
omed
io (
nm)
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
115
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.010
100
1000
10000
E50LV sin USAI
E15LV sin USAI
E50LV USAI
E15LV USAI
E5LV sin USAI
E5LV USAI(B)
concentración (% p/p)
d(H
) pr
omed
io (
nm)
Figura 2.2. Diámetro promedio (d(H)) en función de la concentración para soluciones a pH6 sin tratamiento (símbolos rellenos) y con tratamiento de ultrasonido (símbolos vacíos) para (A):
(劬, 劭) E4M, (B):(鏡, ) E15LV, (▼,) E50LV y (■, ☐) E5LV. Desviación estándar < 1%.
El tratamiento de ultrasonido aumentó el tamaño promedio de las partículas de
HPMC siendo la magnitud de este incremento máxima a la menor concentración, donde
las soluciones exhiben una menor viscosidad. Cuando la viscosidad aumenta, las fuerzas
de atracción entre las moléculas son mayores generando un mayor umbral para el inicio
de la cavitación (Behrend y Schubert, 2000).
Generalmente se asume que los efectos de corte como el colapso de las burbujas de
la cavitación, son los responsables de los cambios en la estructura de los biopolímeros,
es decir, de la ruptura de los enlaces químicos en una macromolécula. Los estudios de
distribución de tamaño de partícula con dispersión dinámica de luz después de tratar con
ultrasonido a las soluciones de HPMCs (Figura 2.1), no sugirieron la degradación de la
estructura, ya que ningún nuevo pico en diámetros de menor tamaño pudo ser detectado.
Además, las formas asociadas de mayor tamaño fueron predominantes. Puede ser
posible que el ensayo de DLS no haya revelado la presencia de estos pequeños
fragmentos ya que es una técnica muy sensible a la formación de agregados. Sin
embargo, si hubiera ocurrido en algún grado la degradación del polímero, ésta podría no
haberse detectado por la fuerte tendencia de las HPMCs a auto ensamblarse.
Sección I- Capítulo 2. Efectos de USAI en la asociación de HPMC y su impacto en las propiedades funcionales
116
Una burbuja de cavitación puede tener una vida media tan pequeña como 0,1 s y
genera puntos localizados de alta temperatura de aproximadamente 4000 K. Estos
puntos calientes pueden promover la pérdida gradual del agua de hidratación de las
moléculas de HPMCs favoreciendo así las interacciones hidrofóbicas entre los
sustituyente metilos. Este escenario es comparable con el fenómeno que tiene lugar
durante el primer estadío de la gelificación de soluciones de metil e
hidroxipropilmetilcelulosas, mediado por interacciones hidrofóbicas que lleva a la
asociación del biopolímero (formación de clusters) (Kobayashi y col, 1999).
Cuando se analiza el efecto del ultrasonido a pH3, se observa el mismo efecto que a
pH6. La figura 2.3 A-D muestra la distribución de tamaños por volumen de soluciones a
pH3 2% p/p de E5LV, E15LV y E50LV y de 0,5% de E4M inmediatamente después del
tratamiento del ultrasonido en comparación con las distribuciones de las muestras sin
tratamiento. En todos los casos el pico principal de la muestra sin tratamiento decrece o
desaparece y formas asociadas de mayor tamaño aparecen en las muestras tratadas con
ultrasonidos. Para E50LV, E15LV y E5LV aumenta la proporción del pico de mayor
tamaño en las muestras sonicadas.
No obstante a este pH, el aumento en el tamaño de partícula debido al USAI es mucho
menor que a pH6. Como se analizó en el capítulo 1, a pH3 las HPMCs tienen baja
tendencia a autoensamblarse y ello podría ser una razón de los menores tamaños de
partícula de los clusters luego del ultrasonido.
A ambos pH se observa que las HPMC de menor peso molecular (E5LV y E15LV)
son las que más se agregan por efecto de USAI, si se considera la variación entre el
tamaño inicial de las partículas y el obtenido al finalizar el tratamiento por USAI. Esta
mayor tendencia a la asociación al disminuir el peso molecular ha sido descripta por
Sarkar (1977) quien encontró que las metilcelulosas de pesos moleculares menores
exhibieron un menor cloud point, debido a la tendencia de éstas a asociarse (formación
de clusters).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
117
1 10 100 10000
5
10
15
20
25
30
35
40
Vol
umen
(%
)
Tamaño (d.nm)
(A)
1 10 100 10000
5
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20
25
30
35
40
Vo
lum
en (
%)
Tamaño (d.nm)
(B)
1 10 100 10000
5
10
15
20
25
30
35
40
Vol
umen
(%
)
Tamaño (d.nm)
(C)
1 10 100 10000
5
10
15
20
25
30
35
40
Vol
umen
(%
)
Tamaño (d.nm)
(D)
Figura 2.3. Distribución de tamaño de partículas por volumen para soluciones de HPMC a pH3 sin tratamiento (símbolos llenos) y con tratamiento (símbolos vacíos) para (A) E5LV 2% (B) E15LV
2%, (C) E50LV 2% y (D) E4M 0.5%.
2.3 Evolución del tamaño de partícula de las soluciones de HPMC después del
tratamiento de ultrasonido.
Con el fin de estudiar si el tamaño de partícula revertía luego de la aplicación de
USAI, se determinó la evolución del tamaño promedio (d(H)) de las soluciones
sonicadas con el tiempo de almacenamiento a 20°C. Para todas las HPMCs estudiadas a
pH3 y pH6, el diámetro promedio disminuyó con el tiempo de almacenamiento,
2,33 nm 4,18 nm
5,61 nm
7,03 nm
14,23 nm 17,33 nm
15,75 nm
19,03 nm
Sección I- Capítulo 2. Efectos de USAI en la asociación de HPMC y su impacto en las propiedades funcionales
118
tendiendo hacia el valor del diámetro promedio de las muestras antes del tratamiento,
como se muestra en las tablas 2.1 y 2.2 respectivamente.
Tabla 2.1. Evolución del d(H) (nm) con el tiempo de almacenamiento a 20 ºC para soluciones de HPMC al 2% a pH6.
HPMC Inicial* Después del
ultrasonido*
1 día* 2días* 3 días*
E5LV 65,0 587,0 524,0 285,0 184,0
E15LV 125,1 1038,0 986,0 547,0 204,0
E50LV 353,3 2040,0 576,0 573,0 373,0
E4M 499,6 3090,0 793,0 475,0 458,0
* promedio 0.1 nm (DS) de n= 3.
Tabla 2.2. Evolución del d(H) (nm) con el tiempo de almacenamiento a 20 ºC para soluciones de HPMC al 2% a pH3.
HPMC Inicial* Después del
ultrasonido*
1 día* 2días* 3 días*
E5LV 33,2 285,2 110,1 87,8 57,7
E15LV 45,2 340,0 225,9 178,0 83,5
E50LV 175,5 872,3 239,0 224,1 204,0
E4M 341,4 1081,2 729,0 406,2 354,3
* promedio 0.1 nm (DS) de n= 3.
La naturaleza reversible de las formas asociadas producidas durante el tratamiento de
ultrasonido, indica que no se establece ningún enlace covalente durante la formación de
clusters inducidos por USAI. Un menor decrecimiento en el tamaño de las formas
agregadas se observó para E15LV y E5LV a pH6.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
119
2.4 Impacto del tratamiento de ultrasonido en la emulsificación y gelificación de las
HPMCs.
Debido a que la aplicación de USAI modifica el grado de asociación de las HPMC, es
posible que esto se manifieste en un cambio en sus propiedades funcionales. Por ello, se
estudiaron algunas propiedades funcionales al finalizar el tratamiento de ultrasonido.
Se seleccionaron las celulosas de mayor y menor peso molecular (E4M y E5LV
respectivamente) y se trabajó en concentraciones que permitan la obtención de
emulsiones submicrónicas y la gelificación por calor (3% p/p para E4M y 7% p/p para
E5LV). La tabla 2.3 muestra los diámetros de gota promedios de las emulsiones
formadas por ultrasonidos. No se observaron diferencias apreciables entre el tamaño de
gota obtenido en la emulsión preparada con la solución de HPMC tratada previamente
con ultrasonidos y la emulsión obtenida con la solución de HPMC sin tratamiento. Esto
indica que el comportamiento durante la emulsificación no es afectado.
Tabla 2.3. Diámetros de gota de emulsiones preparadas con soluciones de HPMC a pH6 sin y con tratamiento previo de ultrasonido.
E4M (3%p/p) E 5LV (7% p/p)
Sin tratamiento * Con tratamiento* Sin tratamiento * Con tratamiento *
D32(m) 0,67 0,61 0,58 0,50
D43(m) 0,98 0,83 0,78 0,67
* promedio 0.20 m (DS) de n= 5.
Cuando se estudió la gelificación, se obtuvieron resultados distintos.
Durante la primera etapa del calentamiento de las HPMCs, se observa una transición en
la solución de transparente a turbio. Como se analizó en el capítulo 1, la temperatura
que corresponde a esta transición, conocida como cloud point, indica el comienzo de la
formación de clusters mediante interacciones hidrofóbicas, suficientemente grandes
como para producir turbidez visualmente. La tabla 2.4 muestra que el cloud point de las
soluciones de HPMC disminuyó entre 8 y 9°C, señalando que el tratamiento de
Sección I- Capítulo 2. Efectos de USAI en la asociación de HPMC y su impacto en las propiedades funcionales
120
ultrasonido modificó el comportamiento de las HPMC durante la primera etapa del
proceso de gelificación, relacionado con este cloud point.
Tabla 2.4. Gelificación, transiciones térmicas, viscosidad aparente () y movilidad del agua (T2) para soluciones de HPMC a pH6 antes y después del tratamiento con ultrasonido.
E4M( 3% p/p) E5LV
(7%p/p)
Sin tratamiento Después del
ultrasonido
Sin
tratamiento
Después del
ultrasonido
Cloud point (ºC) 38,0 1,1 30,0 0,9 37,0 1,1 28,0 1,2
Temperatura de gelificación (ºC) 63,0 1,1 61,0 0,9 65,0 1,1 67,0 0,8
Tp (ºC) 62,4 1,1 64,0 0,9 63,1 0,8 63,5 1,0
T onset (ºC) 53,0 0,5 53,0 0,8 55,0 0,6 56,5 0,8
H( J/g) 0,4 0,1 0,5 0,2 0,7 0,2 0,8 0,2
(cp) 9708ª 6 6446ª 5 43b 2 43 b 2
T2 (ms) 32 4 23 2 18,8 0,8 18,0 0,8
a esfuerzo de corte: 1,2 s-1
b esfuerzo de corte: 24 s-1
El fenómeno de cavitación que se produce durante el tratamiento de ultrasonido,
induce el autoensamblaje de las HPMC (Figuras 2.1 y 2.3) formando clusters que
facilitan la aparición de formas asociadas de mayor tamaño durante la etapa pre-gel.
Sarkar y Walker (1995) estudiaron la asociación de metilcelulosa almacenada a
temperatura ambiente, la cual mostró un menor cloud point que aquellas soluciones sin
almacenamiento previo, debido a las asociaciones existentes aún a temperatura
ambiente.
La temperatura de gelificación (Tabla 2.4) determinada por el ensayo de inclinación,
no mostró cambios significativos debido al tratamiento con ultrasonidos. El punto gel
que se detecta por el ensayo de inclinación corresponde a la temperatura donde la
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
121
estructura de gel es desarrollada completamente, es decir la estructura formada no fluye
cuando se inclina el tubo. Esta temperatura es levemente mayor que la temperatura de
gelificación obtenida por mediciones reológicas dinámicas, donde se detecta la
formación de una estructura de gel primaria (Perez y col, 2006).
Las transiciones endotérmicas (determinadas por DSC) alrededor de los 50°C, se
atribuyen a la ruptura de la estructura del agua que rodea a las cadenas de HPMC
(Sarkar y Walker, 1995; Yuguchi y col, 1995). De acuerdo a Yuguchi y col (1995), la
ruptura de esta estructura del agua es termodinámicamente más dominante que la
formación de la estructura gelificada. El punto de gel determinado por el incremento del
módulo elástico G’ se encuentra entre las temperaturas de inicio (Tonset) y de pico (Tp)
determinado por las mediciones de DSC (Perez y col, 2006). Algunos autores han
atribuido el pico endotérmico en la curva obtenida en el DSC principalmente a la
formación de un gel turbio a través de interacciones hidrofóbicas (Desbrieres y col,
1998). En la tabla 2.4 se muestran las entalpías y las temperaturas de inicio (Tonset) y de
pico (Tp) en las muestras de HPMC sin tratamiento y sonicadas.
Las temperaturas de transición (Tonset y Tp) no se modificaron por el tratamiento de
ultrasonido, lo cual está de acuerdo con los resultados obtenidos por el ensayo de
inclinación en la determinación de la temperatura de gelificación. Entonces, se puede
concluir que la segunda etapa del proceso de gelificación no se ve afectada por la
formación de clusters en las muestras sonicadas. El calor de transición se incrementó
levemente en las soluciones sonicadas, lo cual indica que se requiere una energía mayor
para formar una estructura de gel.
Resultados similares en todas las propiedades anteriores, se obtuvieron para las otras
HPMCs, otras concentraciones y también a pH3. A modo de ejemplo en la tabla 2.5 y
2.6, se muestran la temperatura de gelificación obtenida por el ensayo de inclinación
para soluciones de HPMCs a 2% p/p pH6 y pH3 respectivamente.
Tabla 2.5. Gelificación para soluciones de HPMC 2% p/p a pH6 antes y después del tratamiento con ultrasonido.
Cloud point (°C) Tgelificacion (°C)
Sin tratamiento Con tratamiento Sin tratamiento Con tratamiento
E4M 38 ,0 ± 1,1 32,0 ± 1,1 65 ,0± 0,8 65 ,0± 0,8 E50LV 38,0 ± 1,1 35,0 ± 0,8 65,0 ± 0,9 65,0 ± 0,9 E15LV 45,0 ± 0,9 41,0 ± 0,8 sin formacion gel * sin formacion gel * E5LV 50,0 ± 1,0 43,1 ± 0,9 sin formacion gel* sin formacion gel *
* hasta los 70°C, sin formación gel
Sección I- Capítulo 2. Efectos de USAI en la asociación de HPMC y su impacto en las propiedades funcionales
122
20 40 60 80 100 120 140 1600
1
2
3
4
5
6
7
(Pa)
(s)
(A)
Tabla 2.6. Gelificación para soluciones de HPMC 2% p/p a pH3 antes y después del tratamiento con ultrasonido.
Cloud point (°C) Tgelificacion (°C)
Sin tratamiento Con tratamiento Sin tratamiento Con tratamiento
E4M 40 ,0 ± 1,1 32,0 ± 1,1 65 ,0± 0,8 65 ,0± 0,8 E50LV 41,0 ± 1,1 38,0 ± 0,8 65,0 ± 0,9 65,0 ± 0,9 E15LV 48,0 ± 0,9 40,0 ± 0,8 sin formacion gel * sin formacion gel * E5LV 63,0 ± 1,0 43,1 ± 0,9 sin formacion gel* sin formacion gel *
* hasta los 70°C, sin formación gel
Las temperaturas correspondientes al cloud point de las muestras sin ultrasonido son
mayores a pH3 lo cual refleja la baja tendencia al autoensamblaje que muestran las
HPMCs a este pH, en comparación con pH6. Sin embargo, luego del tratamiento las
temperaturas de la primera etapa de la gelificación son muy similares. Como se mostró,
el ultrasonido a pH3 promueve la asociación entre las moléculas de HPMC (figuras 2.1
y 2.3), pero en menor grado que a pH6.
2.5 Impacto del tratamiento de ultrasonido en la viscosidad y movilidad del
agua de soluciones de HPMC.
Se evaluó el comportamiento de flujo de las soluciones de HPMCs a pH3 y pH6
antes y después del tratamiento con ultrasonido.
Como ejemplo se muestran en la figura 2.4 las curvas de flujo obtenidas para E4M y
E5LV, las HPMCs de mayor y menor peso molecular respectivamente, a ambos pH
estudiados.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
123
0 20 40 60 80 100 120 140 1600
20
40
60
80
100
120
140
160
180
(P
a)
(s-1)
(B)
Figura 2.4. Esfuerzo de corte () en función de la velocidad de deformación () para
soluciones al 2%. (A) E5LV pH3 (鏡, 響) y pH6 (斤, 欣); (B) E4M pH3 (●,○) y pH6
(峡,強). Símbolos llenos: muestras sin tratamiento. Símbolos vacíos: muestras tratadas con
USAI.
En la tabla 2.7 y 2.8 se observan los valores obtenidos para el índice de consistencia
(K) y el índice de flujo (n).
Tabla 2.7. Parámetros de flujo de las soluciones a pH3 de HPMC al 2% obtenidos a partir del modelo de Ostwald. K, índice de consistencia; n, índice de flujo. R2 > 0,97.
HPMC sin tratamiento con tratamiento
K n K n
E5LV 0,038 ± 0,002 0,995 ± 0,009 0,038 ± 0,002 0,991 ± 0,010 E15LV 0,107 ± 0,006 0,979 ± 0,012 0,080 ± 0,002 0,977 ± 0,005 E50LV 0,427 ± 0,017 0,960 ± 0,008 0,132 ± 0,006 0,985 ± 0,013
E4M 25,370 ± 0,285 0,982 ± 0,007 0,439 ± 0,034 0,977 ± 0,003
Sección I- Capítulo 2. Efectos de USAI en la asociación de HPMC y su impacto en las propiedades funcionales
124
Tabla 2.8. Parámetros de flujo de las soluciones a pH6 de HPMC al 2% obtenidos a partir del modelo de Ostwald. K, índice de consistencia; n, índice de flujo. R2 > 0,97.
Para ambos pHs, tanto en las muestras sin tratamiento como las tratadas con USAI,
el valor de K, indicativo de la naturaleza viscosa de la solución, fue en aumento según el
peso molecular de las HPMC (Tabla 1, materiales y métodos), siendo significativamente
mayor para E4M.
El índice de consistencia a pH3 es menor para todas las HPMC que a pH6,
mostrando una menor interacción entre las moléculas del polisacárido. El
comportamiento viscoso revela las diferencias en el grado de asociación de las HPMCs
en función del pH. De hecho en el capítulo 1, se mostró que el diámetro promedio a
pH3 es significativamente menor que a pH6 (Figura 1.5).
Puede observarse un mayor impacto del tratamiento con ultrasonido en las
propiedades de flujo de las soluciones de HPMC de mayor peso molecular (E50LV y
E4M) para ambos pH. Esta diferencia es significativamente más notable para E4M, el
polisacárido de mayor peso molecular (Tabla 1, materiales y métodos). En estos casos el
índice de consistencia de las soluciones, mostró una gran disminución luego del
tratamiento de USAI.
Con respecto al índice de flujo, todas las muestras presentaron un comportamiento
Newtoniano antes y después del tratamiento con USAI.
La disminución del índice de consistencia podría deberse a una modificación en la
estructura molecular de las HPMCs o a una modificación de la interacción con el agua.
La primera opción no se desprende de los estudios por DLS, como se mostró
anteriormente. Con respecto a la interacción de las HPMCs con el agua, a temperatura
ambiente, la HPMC estaría hidratada con las moléculas de agua rodeando los grupos
hidrofóbicos, conformando una estructura conocida como tipo jaula (cage-like en
inglés) (Sarkar, 1977; Kobayashi y col, 1999) (figura 1.6).
Cuando la temperatura se incrementa alrededor de los 40°C, las moléculas pierden
gradualmente el agua de hidratación. Esto resulta en una desorganización de las
HPMC sin tratamiento con tratamiento K n K n
E5LV 0,052 ± 0,003 0,977 ± 0,011 0,049 ± 0,005 0,980 ± 0,019 E15LV 0,127 ± 0,003 0,995 ± 0,005 0,085 ± 0,002 0,991 ± 0,005 E50LV 0,665 ± 0,085 0,982 ± 0,027 0,168 ± 0,010 0,975 ± 0,013 E4M 32,910 ± 0,322 0,992 ± 0,007 0,689 ± 0,097 0,997 ± 0,003
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
125
estructuras tipo jaula, lo cual implica una disminución en la viscosidad de las soluciones
(Sarkar, 1977) y un decrecimiento del módulo elástico (G’) (Pérez y col, 2006). Durate
la aplicación de USAI se produciría una deshidratación parcial de las moléculas de
HPMc debido a los puntos calientes generados durante la cavitación (apartado 2.2)
produciendo una disminución de la viscosidad de las soluciones de HPMC.
Para comprobar si la interacción entre el agua y la HPMC se afectó durante el
tratamiento de ultrasonido, se determinó el tiempo de relajación (T2) por medio de
RMN como un indicador de la movilidad molecular del agua asociada a E4M y E5LV
(tabla 2.4). Los valores más altos de T2, se corresponden con una mayor movilidad del
agua. Un decrecimiento en el tiempo de relajación para las soluciones de E4M durante
el tratamiento de ultrasonido puede asociarse con un decrecimiento en la movilidad de
los protones, mientras que esta movilidad no se vio afectada cuando se trató a las
soluciones de E5LV con ultrasonido.
La falta de cambios en la viscosidad y la movilidad del agua en las soluciones de
E5LV con el tratamiento puede indicar una mínima modificación de su estructura y /o
interacción con las moléculas de agua. Las especies de menor peso molecular presentan
tiempos de relajación menores y, entonces, pueden resistir el stress causado por el
ultrasonido en mayor medida.
Contrariamente, la molécula de E4M, debido a su alto peso molecular, presenta más
posibilidades de ser modificada por el ultrasonido. El decrecimiento anómalo de la
movilidad del agua reflejaría otras modificaciones en la estructura causadas por el
ultrasonido, posiblemente la desintegración de los empaquetamientos en las regiones no
sustituidas o con pocos sustituyentes de la celulosa que incrementaría la unión de las
moléculas de agua con estas regiones hidrofílicas. Haque y Morris (1993) sugirieron
que las cadenas de metilcelulosa están presentes en solución como formas asociadas
estabilizados por interacciones hidrofóbicas entre los grupos metilos en zonas de la
cadena de celulosa donde el número de estos sustituyentes es alto o bien por
empaquetamiento de regiones no sustituídas o poco solubles de la celulosa. Cuando se
eleva la temperatura durante el régimen de pre gel, estos empaquetamiento o clusters se
expanden y los grupos metilos antes ocultos se exponen al medio circundante. Las
moléculas de agua rodean estos grupos y forma la estructura conocida como jaula de
agua (water-cage en inglés) alrededor de estos grupos funcionales.
.
Sección I- Capítulo 2. Efectos de USAI en la asociación de HPMC y su impacto en las propiedades funcionales
126
2.6. Conclusión.
La aplicación de USAI a soluciones de HPMC induce la formación de clusters de
carácter reversible por interacciones hidrofóbicas. La formación de estos clusters se
refleja en una disminución del punto de turbidez (cloud point) de las HPMC,
independientemente del peso molecular o del pH.
Los cambios en la viscosidad e interacción con el agua por aplicación de USAI, se
observan sólo en las HPMC de mayor peso molecular.
Las propiedades de emulsificación de las HPMC estudiadas no se modifica por
efecto de la aplicación de USAI.
Capítulo 3
Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas
en la interfase aceite-agua y comparación con la
interfase aire-agua.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
127
3.1 Comportamiento comparativo de HPMCs en interfases A/W y O/W.
La estructura y composición del film que rodea a las gotas de aceite en una emulsión y las
burbujas de aire en una espuma, son fundamentales para la estabilidad y comportamiento de
los sistemas dispersos durante su procesamiento. Sin embargo, debido a la diferente
naturaleza de la fase hidrofóbica (aire o aceite) el comportamiento de un biopolímero (por
ejemplo una proteína o polisacárido), puede diferir en ambas interfases. No existen en la
literatura muchos trabajos comparando el comportamiento en ambas interfases.
Williams y Prins (1996) compararon el comportamiento dilatacional de dos proteínas
lactéas, - lactoglobulina y -caseina, en ambas interfases y establecieron una sorprendente
similitud entre las dos interfases para ambas proteínas. Esto sugiere que la estructura
interfacial de las moléculas de proteína en la interfase O/W y A/W pueden ser similares.
Wüstneck, Moser y Muschiolik (1999), al estudiar la adsorción de la -lactoglobulina en la
interfase A/W y O/W (aceite de girasol o tetradecano), encontraron que la concentración
requerida para la saturación interfacial fue menor en la interfase con aceite de girasol.
La elasticidad dilatacional interfacial y la viscosidad interfacial fueron mayores en la
interfase aire- agua y resultaron menores en la interfase con aceite de girasol. Las similitudes
y diferencias de los sistemas estudiados se atribuyeron al comportamiento de adsorción y a la
solvatación de los segmentos polares y apolares de las moléculas de proteína.
Más recientemente, Rotureau, Leonard, Dellacherie y Durand (2004) estudiaron la
adsorción de un polisacárido, un derivado anfifílico del dextrano, en la interfase A/W y O/W.
Concluyeron que la cinética de adsorción del polímero a la interfase aceite es similar a la
cinética en la interfase aire.
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
128
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
log (concentración,% p/p)
(mN
/m)
(A)
3.1.1 Isotermas de adsorción en la interfase A/W y O/W.
Las isotermas de adsorción de las HPMCs en la interfase A/W y O/W, se determinaron a
pH6.
Las mediciones de presión en el equilibrio, se muestran comparativamente en la figura 3.1
para la interfase A/W (figura 3.1A) y O/W (figura 3.1B) para concentraciones de polisacárido
de 1.10-7 hasta 2% p/p.
Como sucede con las proteínas, un verdadero equilibrio en la adsorción no parece ser posible
con las HPMCs (donde no se detecte cambio alguno en el valor de con el tiempo) (Perez y
col., 2006; Rodríguez Niño y Rodríguez Patino, 1998). Luego, se consideró la presión
superficial después de 24 hs de almacenamiento como valor de pseudo-equilibrio.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
129
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 10
5
10
15
20
25
30
35
40
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 10
5
10
15
20
25
30
35
40
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 10
5
10
15
20
25
30
35
40
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 10
5
10
15
20
25
30
35
40
(mN
/m)
log (concentración, % p/p)
(B)
Figura 3.1. Isotermas de adsorción para E4M (斤), E50LV (▼), E15LV(鏡) y E5LV(■) en la interfase A/W (A) y O/W (B). Temperatura 20°C, pH 6.0 y I= 0.05 mM.
En la interfase A/W, se observó un comportamiento sigmoideo, el cual es similar para
biopolímeros superficialmente activos y surfactantes de bajo peso molecular (Damodaran y
Song, 1988b; Graham y col., 1979; Rodríguez Niño y col., 1998; Suttiprasit y col., 1992). La
presión superficial () aumenta con el aumento de la concentración de HPMC en el seno de la
solución y tiende a un valor de pseudo-equilibrio. Nahringbauer (1995) obtuvo resultados
similares con etilhidroxietilcelulosa (EHEC) en la interfase aire-agua; encontró que los
menores valores de tensión (mayor ), se alcanzan para las soluciones más concentradas.
También indicó que existe un valor crítico de concentración por encima del cual no se
aprecian cambios en el valor de la tensión interfacial.
A las menores concentraciones en el seno de la solución (1.10-6%), E4M mostró actividad
superficial, mientras que fueron necesarios dos órdenes de magnitud mayores en la
concentración para observar el mismo efecto para E50LV, E15LV y E5LV. Para las
concentraciones entre 10-6 y 1.10-4%, E5LV mostró una presión superficial levemente mayor
que E15LV, seguido por E50LV. Para las concentraciones entre 1.10-4% y 1.10-1%, no se
observan diferencias en la presión superficial entre las HPMCs estudiadas. Por encima de
(B)
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
130
1.10-1%, E4M mostró mayores valores en . De acuerdo a los resultados, el orden en la
actividad interfacial sería: E4M E15LV E5LV E50LV.
Las isotermas -c en la interfase aire-agua, presentan inflexiones a medida que la
concentración en el seno de la solución aumenta lo cual está relacionado con diferentes
patrones estructurales adoptados por los segmentos de los polisacáridos en la interfase.
Li y col. (2008) y Perez y col. (2008) presentaron evidencia del cambio en el patrón
estructural de las monocapas de HPMCs a medida que aumenta la concentración: de una
estructura I ( estructura más expandida con la formación de trenes) a una estructura II, de
conformación más condensada. Para las concentraciones más altas en el seno de la solución,
puede formarse una estructura colapsada con la eventual formación de multicapas. La
hidrofobicidad y flexibilidad molecular de las HPMCs permite que más moléculas se
adsorban y compacten en la interfase, provocando un mayor incremento en la presión
superficial. Como se informó previamente (Pérez y col., 2008), E50LV sólo adopta la
estuctura I para finalmente colapsar y E4M, la estructura I y II con formación de multicapas
en la estructura colapsada. De acuerdo al presente trabajo, E5LV y E15LV presentarían un
comportamiento similar a E50LV.
En la interfase O/W (Figura 3.1B), las isotermas -c no fueron sigmoideas y no se observó
ninguna inflexión en todo el rango de concentraciones estudiado, sugiriendo que no ocurre
ningún cambio estructural. Además, el incremento en la concentración de HPMC en el seno
de la solución tuvo un efecto pequeño. A concentraciones mayores que 1.10-4%, la interfase
aceite- agua parece estar saturada, ya que no hay cambios apreciables en la presión
superficial con el aumento de la concentración en el seno de la solución.
Para el estudio de la actividad interfacial y de las propiedades emulsionantes de las HPMC
se seleccionó como fase aceite el aceite comercial de girasol, ya que éste es el más utilizado a
nivel comercial. Sin embargo, desde el punto de vista de estudios básicos, su utilización
puede no ser tan conveniente debido a la presencia de componentes con actividad interfacial.
Los componentes activos superficialmente en el aceite de girasol pueden ser una mezcla de
monoglicéridos, ácidos grasos libres y fosfolípidos.
De acuerdo a Wüstneck y col. (1999), estos contaminantes pueden ser esenciales para el
comportamiento interfacial del aceite.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
131
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
tiempo (s)
(mN
/m)
Para establecer la contribución de los componentes con actividad interfacial presentes en el
aceite comercial, se realizaron mediciones de la dinámica de adsorción con el aceite de girasol
purificado.
En la Figura 3.2 se muestra la presencia de bajos niveles (o de baja actividad superficial) de
compuestos con actividad interfacial en el aceite de girasol, con efectos hasta los 10 mN/m.
Puede verse además que las impurezas del aceite se adsorben rápidamente y alcanzan un valor
de equilibrio a tiempos muy cortos (2000 s). Este comportamiento es característico de los
surfactantes de bajo peso molecular.
Figura 3.2. Presión interfacial en función del tiempo para el sistema aceite de girasol comercial y buffer (sin agregado de HPMC) (□) y E5LV 1% de concentración en la interfase aceite de girasol-
buffer (*) y aceite de girasol purificado-buffer (ɒ). Temperatura 20°C, pH 6.0 y I= 0.05 mM.
En la Figura 3.2 se muestra también que el aceite de girasol purificado por tratamiento con
un agente secuestrante de las sustancias activas superficialmente (Fluorisil, ver materiales y
métodos), presenta un comportamiento similar al no purificado en presencia de HPMC (en
este caso E5LV). A tiempos menores a 2000 s se manifiesta ligeramente el efecto de las
impurezas.
Los resultados de la figura 3.2 indican que los valores de para concentraciones de HPMCs
menores a 1.10-5% en la figura 3.1B, pueden verse afectados por los compuestos
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
132
superficialmente activos del aceite. A tan bajas concentraciones, este efecto puede estar
magnificado (Williams y col., 1996).
A concentraciones mayores a 10-5%, las moléculas de HPMC desplazarían los bajos niveles de
impurezas presentes, como se observa en los altos valores de presión superficial de equilibrio
alcanzada (Figura 3.1B) por todos las HPMCs (alrededor de 20 mN/m), el cual permanece constante
con el aumento de la concentración de HPMC en el seno de la solución.
Las HPMCs y las impurezas deben competir por la interfase pero las HPMCs dominan la presión
superficial aún a tiempos cortos de adsorción (Figura 3.2) debido a las siguientes consideraciones:
(a) Alta actividad interfacial de las HPMC que lleva a un fuerte comportamiento competitivo que
desplaza a otras moléculas (Pérez y col., 2007; Pérez y col., 2009). Además, todas las HPMCs
estudiadas exhibieron mayores valores de que las impurezas, aún a muy bajas concentraciones. Ha
sido reportado previamente que las HPMCS dominan la presión superficial en mezclas con proteínas
aún cuando ambos componentes pueden saturar la interfase (Martinez y col., 2007; Pérez y col., 2007).
(b) Saturación de la interfase a muy bajas concentraciones en el seno de la solución. En la
interfase A/W o O/W la saturación de la interfase se alcanza por encima de una concentración en el
seno de la solución de 10-4% (Figura 3.1A y 3.1B).
En mezclas de emulsificantes solubles en aceite (monoglicéridos y fosfolípidos) y proteínas, la
actividad superficial está determinada por la proteína, la cual satura la interfase (Rodríguez Patino y
col., 2003). Un comportamiento similar debería esperarse en mezclas de impurezas (monoglicéridos,
fosfolípidos y ácidos grasos libres) y HPMCs, especialmente porque las celulosas son más activas
superficialmente que muchas proteínas (Arboleya y Wilde, 2005; Mezdour y col., 2007; Pérez y col.,
2007). Murray (1997) mostró que las impurezas del aceite, no generaban diferencias substanciales al
estudiar la adsorción de sero albúmina bovina (BSA) en la interfase aceite-agua. Luego, no tomaron
ninguna precaución para remover estas impurezas durante el ensayo.
El comportamiento de las HPMCs en la interfase O/W (Figura 3.1B) fue apreciablemente diferente
al exhibido en la interfase A/W (Figura 3.1A). Estas diferencias pueden deberse a la naturaleza de la
fase hidrofóbica (aceite) formada por triglicéridos y ácidos grasos. La presión superficial alcanzada a
cada concentración de HPMC fue menor en la interfase O/W. Wüstneck y col.(1999) obtuvieron la
misma tendencia en las isotermas de presión superficial al estudiar el comportamiento de -
lactoglobulina en la interfase A/W y O/W. Valores menores de en la interfase O/W han sido
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
133
reportados por Rotureau y col.(2004) al trabajar con derivados anfifílicos de dextrano y por Ganzevles,
Cohen Stuart, Vliet y de Jongh (2006) en mezclas de -lactoglobulina y pectinas.
La mejor solvatación ofrecida por la fase aceite para los grupos hidrofóbicos, en comparación con el
aire, puede explicar la menor eficiencia de las HPMCs para incrementar la presión superficial en la
interfase O/W. εędrzycka y Zwierzykowski (2000) propusieron que existen más interacciones entre
las moléculas de la cadena carbonada del surfactante en la interfase A/W. Tales interacciones estarían
ausentes, o presentes en un menor número, en la interfase O/W.
El orden para la actividad interfacial en la interfase O/W sería: E15LV E5LV E4M E50LV. La
HPMC E50LV fue la menos eficiente en la disminución de la presión superficial en ambas
interfases. Al contrario de lo que sucede en la interfase A/W, las HPMCs de menor peso
molecular (E5LV y E15LV), promovieron un fuerte decrecimiento en la tensión superficial en
la interfase O/W. La mayor eficiencia de estas dos HPMCs en la fase aceite puede explicarse
por su hidrofobicidad (es decir, substitución en metilos) y menor peso molecular que les
permitiría una mayor flexibilidad para anclarse entre los triglicéridos de la fase aceite
(Hutchinson, 1948).
3.1.2 Dinámica de adsorción en la interfase A/W y O/W.
Para comparar la dinámica de adsorción de las HPMCs en las interfases A/W y O/W,
fueron seleccionados dos tipos de HPMCs. E4M posee características moleculares que la
hacen singular, mayor peso molecular, mayor viscosidad y también, mayor eficiencia de
adsorción y actividad superficial en la interfase A/W. Además, esta HPMC presenta todas las
transiciones estructurales descriptas: estructura I, estructura II y colapso de la monocapa
(Perez y col, 2006).
Por otro lado, E50LV, representa al grupo de HPMCs de baja viscosidad analizado en este
trabajo, carece de transiciones estructurales durante su adsorción en la interfase A/W y
presenta mayor carácter hidrofóbico (Tabla 1, materiales y métodos).
La figura 3.3 muestra la evolución de la presión superficial () con el tiempo para E4M y
E50LV en la interfase A/W y O/W para dos concentraciones en el seno de la solución,
1.10-2% (Figura 3.3A) y 1% (Figura 3.3B). Estas concentraciones en el seno de la solución
fueron lo suficientemente altas para la saturación de la interfases A/W o O/W, como puede
deducirse de las correspondientes isotermas -c (Figura 3.1A y 3.1B respectivamente).
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
134
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
(mN
/m)
tiempo (s)
(A)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
(mN
/m)
(mN
/m)
tiempo (s)
(B)
El incremento de la presión superficial está asociado a la adsorción de los polisacáridos a la
interfase (Damodaran y Song, 1988; Graham y col., 1979). El rápido aumento inicial de por
la difusión de moléculas de HPMC a la interfase es seguido por una etapa más lenta,
controlada por la penetración, desplegamiento y reordenamiento de las moléculas adsorbidas.
Figura 3.3. Presión interfacial en función del tiempo para E4M (斤,欣) y E50LV (▼,) en la interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos) para concentraciones en el seno de la solución de 1∙10-2 % (A) y 1%p/p (B). Temperatura 20°C, pH 6.0 y I= 0,05 mM.
La presión interfacial es apreciablemente menor en la interfase O/W. Graham y col (1979)
observaron resultados similares al estudiar la adsorción de -caseina en la interfase A/W y
O/W y Ganzevles, Fokkink, van Vliet, Cohen Stuart y de Jongh (2008) obtuvieron menores
valores en la presión superficial para la interfase O/W al comparar el comportamiento de
mezclas de -lactoglobulina con pectinas de bajo y alto metoxilo en la interfase A/W y O/W.
Esta tendencia se correlaciona perfectamente con la obtenida en las isotermas -c, donde los
valores de en el equilibrio resultaron menores para la interfase O/W (Figura 3.1).
Como se mencionó previamente, la razón para este comportamiento reside en la diferente
naturaleza de la fase hidrofóbica. Murray (1997) al estudiar las características superficiales
de -lactoglobulina y sero albúmina bovina (BSA) en ambas interfases, concluyó que las
diferencias en el comportamiento de estas proteínas se debían a la mejor solvatación ofrecida
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
135
por el aceite para las cadenas hidrofóbicas de los residuos de amino ácidos hidrofóbicos, lo
cual se traduce en una menor actividad interfacial.
Al analizar la interfase A/W en la figura 3.3, se observan pequeñas diferencias en los valores
de presión superficial para largos tiempos de adsorción con diferentes concentraciones de
HPMC. Es decir, el valor final de para E4M al 1% en la interfase A/W es 29 mN/m,
mientras que fue 26 mN/m para 1.10-2%. La misma tendencia puede deducirse para la
interfase O/W. Sin embargo, los valores de obtenidos en los estudios dinámicos resultaron
ligeramente menores que los obtenidos en las mediciones de equilibrio debido a que en los
estudios dinámicos (hasta 3 hs), el valor de pseudo-equilibrio no se alcanzó.
En la interfase O/W y a 10-2% de concentración en el seno de la solución (Figura 3.3A), no
se observan diferencias apreciables en el valor de de pseudo-equilibrio (16 mN/m) entre
E4M y E50LV a t > 8000s. Cuando t < 8000 s si hay diferencias entre ellas, ya que E4M
promueve un mayor aumento en la presión superficial.
Beverung, Radke y Blanch (1999) postularon que el número de segmentos en contacto con la
interfase juega un papel importante en la presión superficial de una interfase fluida. Como se
reportó anteriormente (Pérez y col., 2006), E4M presenta el mayor número de segmentos que
potencialmente pueden adsorberse, ya que su grado de polimerización promedio es 4 veces
mayor al de E50LV. Esto se traduce en un rápido y continuo incremento de .
E4M y E50LV no mostraron diferencias a 1% de concentración en el seno de la solución
(Figura 3.3B) en la interfase O/W, es decir, en la forma de las curvas y valores de presión
superficial. Los valores de para 1% resultaron levemente mayores que a 1.10-2%, al menos
durante el tiempo de las mediciones dinámicas.
En la interfase A/W, se observaron diferencias en el comportamiento de adsorción durante
todo el tiempo estudiado y para ambas concentraciones. El efecto de incrementar la
concentración fue más importante para la interfase A/W que para la O/W, en coincidencia con
las isotermas obtenidas en cada caso (Figura 3.1).
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
136
3.1.3 Cinética de adsorción en la interfase A/W y O/W.
El paso más importante en la formación de una espuma o emulsión es la adsorción inicial
del biopolímero en la interfase. A bajas concentraciones superficiales, la presión es baja y las
moléculas se adsorben irreversiblemente por difusión. En el caso de la adsorción controlada
por la difusión, en ausencia de convección, la difusión es gobernada por el gradiente de
concentración (McRitchie, 1978).
Entonces como se vio en materiales y métodos, es posible monitorear la cinética de
adsorción en la interfase aceite-agua midiendo los cambios que se producen en la presión
interfacial () con el tiempo. Como la velocidad de cambio en la presión interfacial depende
principalmente de la velocidad de adsorción del biopolímero en los primeros tiempos, se
utilizó la ecuación de Ward y Tordai para describir estos cambios en función del tiempo.
Se observó que el proceso de difusión para estos polisacáridos (con excepción de las
HPMCs a la concentración de 1.10-2% en la interfase O/W) fue muy rápido (el primer valor de
resulta > 10 mN/m) para ser detectado por la técnica experimental empleada en este trabajo.
Por ello se informa una estimación de las constantes de difusión obtenidas entre el primer
punto y el origen de coordenadas (Tabla 3.1).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
137
Tabla 3.1. Comparación de los parámetros cinéticos para la adsorción de HPMCs en la interfase A/W y O/W. T= 20°C, pH6 y I= 5mM.
Perez y col, (2008). * promedio DS de al menos n = 2. Kdiff, Kads constantes de difusión, penetración/ adsorción y reordenamiento respectivamente. (RL): coeficiente de regresión lineal.
HPMC (%p/p) Kdif .104 ( mN·m-1·s-0.5) Kads .104
(s-1)(RL) t fin ads (s)
A/W O/W A/W O/W A/W O/W
E4M (10-2) 28,80± 0,10 7,00 ± 0,10 2,90±0,10 (0,98) 1,62 ±0,11(0,97) 10000 7500
E50LV (10-2) 80,40± 0,05 2,40±0,06 2,20±0,06( 0,77) 1,09±0,09(0,96) 11000 7000
E4M (1) 88,10±0,11 73,10±0,05 2,00±0,05 (0,99) 2,01±0,06(0,99) 9300 8000
E50LV (1) 101,40±0,07 55,50±0,08 2,20±0,05(0,93) 1,25±0,08 (0,97) >10000 7500
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
138
Independientemente de la HPMC, KdifA/W > Kdif
O/W, demostrando que la naturaleza de la
fase (aire o aceite) influencian el proceso de difusión. A la concentración de 10-2%, la
velocidad de difusión en la interfase O/W podría estar afectada por la presencia de
componentes activos superficialmente en la fase aceite, que competirían a bajas
concentraciones y en tiempos cortos de adsorción (< 2000 s) por la interfase.
Después de la difusión inicial de las HPMCs a la interfase, la velocidad de adsorción
de las HPMCs es controlada por la penetración y reordenamiento de las macromoléculas
en la interfase (Pérez y col., 2008; Rodríguez Niño y Rodríguez Patino, 2002).
Malmsten y Lindman (1990) encontraron que la cantidad de etilhidroxietilcelulosa
(EHEC) adsorbida en la interfase aumenta inmediatamente después del contacto entre
la solución del biopolímero y el aceite. Luego disminuye, indicando la saturación de la
interfase.
Como se vio en materiales y métodos, la grafica de la ecuación empleada para
determinar las constantes de adsorción y reordenamiento (figura 17) permite obtener
dos o más regiones lineales. La primer pendiente se corresponde con la constante de
primer orden de penetración (desplegamiento/ adsorción), Kads, y la segunda pendiente
con la constante de primer orden de reordenamiento , Kr, que ocurre entre un número
prácticamente constante de moléculas adsorbidas (Graham y col., 1979).
Debido a que la concentración en la interfase es muchas veces mayor que la presente
en el seno de la solución, los procesos de desplegamiento y reordenamiento están
magnificados, especialmente para macromoléculas de alto peso molecular (Pérez y col,
2008).
La figura 3.4 muestra el ajuste de los datos experimentales para E4M y E50LV al 1%
en la interfase A/W y O/W. La mayor diferencia observada entre las dos interfases es el
quiebre que se produce en el gráfico lineal a tiempos cortos para la interfase O/W.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
139
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000 2000 4000 6000 8000 10000 12000-6
-5
-4
-3
-2
-1
ln (
( 18
0- )/ 18
0)
tiempo (s)
(A)
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000-6
-5
-4
-3
-2
-1
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000-6
-5
-4
-3
-2
-1
ln(
tiempo(s)
(B)
Figura 3.4. Evolución de la presión interfacial con el tiempo de adsorción según la velocidad de adsorción y reordenamiento en la interfase aire-agua (A) y aceite-agua (B) para E4M (●) y E50LV (▲) a la concentración de 1% en el seno de la solución. Temperatura β0°C, pH6 y I= 0,05M.
El proceso de reordenamiento en la interfase A/W para E4M, parece comenzar luego
de los 10000 s, cuando se alcanza una alta presión superficial, pero para E50LV el
proceso de reordenamiento no se apreció durante el tiempo de las mediciones dinámicas
(12000 s).
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
140
Baeza, Sanchez, Pilosof y Patino (2004) obtuvieron resultados similares al estudiar la
adsorción de alginatos de propilenglicol (PGA) en la interfase A/W, ya que sólo
observaron una constante de primer orden, relacionada con la penetración del
polisacárido en la interfase.
La tabla 3.1 resume los tiempos en los cuales comienza el proceso de reordenamiento
(o termina el proceso de penetración) como también la constante de penetración
(desplegamiento/ adsorción), Kads. El proceso de reordenamiento de las HPMCs que
ocurre a menores presiones superficiales y tiempos de adsorción en la interfase O/W,
estaría relacionado con un impedimento estérico debido a la presencia de las moléculas
de triglicéridos que forman la fase aceite. En forma análoga, las constantes de
adsorción fueron menores en presencia de la fase aceite.
Puede verse también en la tabla 3.1 que KadsA/W > Kads
O/W. Hutchinson (1948) sugirió
que las moléculas de aceite están presentes en la interfase con las moléculas adsorbidas
del surfactante, entonces, existe una competencia a nivel interfacial entre las porciones
no polares de la molécula del surfactante y el aceite. Como consecuencia, la penetración
de la molécula de HPMC estaría impedida estéricamente debido a la presencia de las
moléculas de ácidos grasos en la interfase O/W.
Con respecto a la concentración del seno de la solución, K ads en la interfase O/W
aumenta levemente con el aumento de la concentración (Tabla 3.1). Rodriguez Patino,
Rodriguez Niño y Carrera Sánchez (1999) al estudiar la adsorción de aislados de
proteínas del suero lácteo, encontraron que la adsorción y penetración ocurrieron más
fácilmente a mayores concentraciones. Sin embargo, K ads disminuyó o resultó igual en
la interfase A/W cuando aumentó la concentración de HPMC (Tabla 3.1)
3.1.4 Características viscoelásticas de las películas en la interfase A/W y O/W.
Al igual que en la mediciones -t, en este apartado se analizan las características
reológicas de las películas (films) interfaciales formadas por E4M y E50LV. La figura
3.5 muestra la evolución de los parámetros reológicos interfaciales con el tiempo de
adsorción: elasticidad dilatacional (Ed) y tangente del ángulo de desfase (tg ).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
141
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
E
d(m
N/m
)
tiempo (s)
(A)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
tg
tiempo (s)
(B)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000123456789
101112131415161718
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000123456789
101112131415161718
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000123456789
101112131415161718
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Ed(
mN
/m)
tiempo(s)
(C)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
tg
tiempo (s)
(D)
Con respecto a la contribución de los componentes activos superficialmente presentes
en el aceite, no se observaron diferencias apreciables en los parámetros reológicos
superficiales al comparar las películas obtenidas con aceite de girasol purificado o sin
purificar.
Figura 3.5. Elasticidad dilatacional superficial, Ed, y tangente del ángulo de desfase, tg , en función del tiempo de adsorción para películas de E4M (斤,欣) y E50LV (▼,) en la
interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos) a las concentraciones de HPMC en el seno de la solución de 1.10-2% (A y B) y 1% (C y D). Temperatura 20°C, pH6 y I= 0,05 mM.
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
142
En la interfase O/W ambas HPMCs presentaron un aumento continuo en el valor de
Ed con el tiempo de adsorción, indicando una lenta pero mayor evolución, en muchos
casos, de la estructura interfacial en comparación con la interfase A/W (Figuras 3.5 A y
C). La lenta evolución de la estructura se hace evidente también en la evolución de la
viscoelasticidad relativa de la película (tg ) en la figura 3.5 B y D, principalmente para
E50LV.
Los valores de Ed para 1.10-2% de concentración (Figura 3.5A) fueron mayores en la
interfase A/W durante todo el tiempo de adsorción, principalmente para E4M. Esta
celulosa mostró un fuerte carácter elástico, con un Ed máximo de 21 mN/m, el cual fue
alcanzado casi instantáneamente. Esto demuestra una rápida adsorción y estructuración
de las monocapas de E4M en la interfase A/W, como consecuencia de la existencia de
fuertes asociaciones entre las moléculas adsorbidas (Rodriguez Patino y col., 1999).
Al igual que para los valores de (Figuras 3.2 A) los valores de Ed fueron menores
en la interfase O/W. Como previamente se ha reportado (Benjamins y col., 1996;
Wüstneck y col, 1999), las condiciones para formar una estructura interfacial de alta
estabilidad mecánica son mejores cuando los cambios conformacionales no están
restringidos, es decir, en la interfase con aire. Las interacciones intramoleculares entre
la moléculas de HPMC necesarias para formar un film elástico estarían restringidas por
la solvatación de los grupos hidrofóbicos en la fase aceite. Williams y col. (1996)
también obtuvieron menores valores en el módulo elástico en la interfase O/W cuando
estudiaron el comportamieno de -lactoglobulina y -caseína en ambas interfases.
La viscoelasticidad relativa (tg ) de las películas de HPMC (Figura 3.5B) para una
concentración en el seno de la solución de 1.10-2%, indica que las películas más
viscoelásticas (menores tg ) se forman en la interfase A/W. El valor casi constante en
la tgindica que Ed y Ev cambian en la misma magnitud con el tiempo. Los valores de
tg por debajo de 1, alcanzados en el transcurso de la adsorción, muestran que las
películas tienen una estructura tipo gel, lo cual implica la asociación de los grupos
metilos de las HPMCs (Kita, Kaku, Kubota y Dobashi, 1999), con excepción de E50LV
en la interfase O/W, donde una película viscoelástica se formó recién a largos tiempos
de adsorción (t> 8000 s).
Para una concentración en el seno de la solución de 1%, el carácter sólido de las
películas en la interfase O/W aumenta lentamente con el tiempo de adsorción , como se
discutió previamente. E4M formó películas más elásticos en la interfase A/W debido al
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
143
10 15 20 25 30 35
5
10
15
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15
20
25
E
(m
N/m
)
(mN/m)
aumento de la viscosidad dilatacional relacionada con el colapso de la película y
formación de multicapas (Pérez y col., 2008).
El carácter elástico de las películas de E50LV al 1% en presencia de la fase aceite,
aumentó marcadamente luego de los 6000 s de adsorción y alcanzó valores mayores que
aquellos observados para la interfase A/W (Figura 3.5C). Análogamente, la
viscoelasticidad relativa de las películas aumenta (menores tg ), alcanzando los valores
observados para la fase aire (Figura 3.5D).
La evolución del módulo dilatacional superficial E con la presión superficial para la
adsorción de las HPMCs en ambas interfases se observa en la figura 3.6. Si los valores
del módulo dilatacional superficial se deben únicamente a la cantidad de HPMC
adsorbida en la interfase, todos los valores de E deberían poder normalizarse en una
curva patrón. La figura 3.6 indica que esta normalización no fue posible para ninguna
concentración de HPMC en ninguna de las interfases estudiadas, indicando un
comportamiento no- ideal y reflejando el impacto de las interacciones de las
macromoléculas.
Figura 3.6. Módulo dilatacional superficial, E, en función de la presión interfacial, , para las películas de E4M y E50LV en la interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos). Frecuencia: 0,1 HZ. Amplitud de los ciclos de compresión/expansión: 10%. Las
concentraciones de HPMC en el seno de la solución fueron: 1.10-2% (E4M,■, □ y E50δV, ▲,) y 1% (E4M ●,○ y E50LV ♦, ◊). Temperatura β0°C, pH6 y I= 0,05mM.
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
144
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.0
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0.2
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0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
(mN/m)
tan
Al igual que para otros biopolímeros, como las proteínas (Horne y Rodriguez Patino,
2003; Rodríguez Patino y col., 2003) y otros polisacáridos (Baeza y col., 2004), E
aumentó en la mayoría de los casos con la presión interfacial y esta dependencia refleja
la existencia de mayores interacciones entre los residuos de los polisacáridos
adsorbidos.
El aumento de E con la presión interfacial, excepto para E50LV en la interfase A/W, es
consistente con el aumento de las interacciones entre las HPMCs adsorbidas, las cuales
son mayores a mayores tiempos y/o a mayores concentraciones en el seno de la solución
(a mayores ).
Figura 3.7. Tangente del ángulo de desfase, tg , en función de la presión interfacial, , para las películas de E4M y E50LV en la interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos). Frecuencia: 0,1 HZ. Amplitud de los ciclos de compresión/expansión: 10%. Las concentraciones de HPMC en el seno de la solución fueron: 1.10-2% (E4M,■, □ y E50δV, ▲,) y 1% (E4M ●,○ y E50LV ♦, ◊). Temperatura β0°C, pH6 y I= 0,05mM.
La figura 3.7 muestra la normalización de la viscoelasticidad relativa de las
películas (tg = Ev/Ed) en función de la presión interfacial. Se observa un decrecimiento
casi lineal de la tg con el aumento de , excepto para E4M 1%, indicando un aumento
del carácter elástico de los films. El aumento de la tg con el aumento de para E4M al
1%, se atribuye al colapso y formación de multicapas lo cual aumenta la contribución
viscosa (Pérez y col., 2008). Esto puede comprobarse en la figura 3.8 donde se muestra
la componente viscosa del módulo dilatacional en función de la presión interfacial.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
145
10 15 20 25 30 350
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4
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2
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10
(mN/m)
Ev(
mN
/m)
Figura 3.8. Componente viscosa, Ev, del modulo dilatacional, E, en función de la presión interfacial, , para películas de E4M y E50LV en la interfase aire-agua (símbolos llenos) y aceite-agua (símbolos vacíos). Frecuencia: 0,1 HZ. Amplitud de los ciclos de compresión/expansión: 10%. Las concentraciones de HPMC en el seno de la solución fueron:
1.10-2% (E4M,■, □ y E50δV, ▲,) y 1% (E4M ●,○ y E50LV ♦, ◊). Temperatura β0°C, pH6 y I= 0,05mM.
Sin embargo, fuertes diferencias en el comportamiento de las HPMCs en las dos
interfases se observan al analizar las figuras 3.6 y 3.7:
(a) en la interfase O/W se forman películas con estructura tipo gel y con alta
viscoelasticidad (tg = 0,2) a presiones interfaciales mucho menores que en la
interfase A/W (18 mN/m en O/W y 25 mN/M en A/W).
(b) en la interfase A/W la estructura tipo gel se alcanza rápidamente al comienzo
de la adsorción se alcanzan con valores de tg debajo de 0,5. En la interfase
O/W la adsorción es más lenta (Figura 3.2) entonces también lo es la formación
de la estructura tipo gel en la interfase. Este resultado refleja el rol de la fase
hidrofóbica en la estructuración de la película interfacial debido a la interacción
de las moléculas de triglicéridos con los segmentos hidrofóbicos de las HPMCs.
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
146
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
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(mN
/m)
(m
N/m
)
tiempo(s)
(A)
(mN
/m)
(mN
/m)
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tiempo(s)
(B)
(mN
/m)
(mN
/m)
(mN
/m)
3.2 Efecto del pH en las propiedades interfaciales de HPMC en interfases O/W.
3.2.1 Efecto del pH en la dinámica de adsorción de HPMC
La Figura 3.9 muestra la evolución de la presión interfacial en función del tiempo de
adsorción en forma comparativa para las diferentes HPMCs a pH6.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
147
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
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6
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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
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0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
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(mN
/m)
(mN
/m)
tiempo(s)
(C)
(mN
/m)
(mN
/m)
Figura 3.9. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para E4M (欣), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a pH6 y una concentración de HPMC en el
seno de 1∙10-2 %p/p (A), 1%p/p (B) y 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC, pH6 y I = 5mM.
A la concentración de 1.10-2 % en el seno de la solución y bajos tiempos de
adsorción (t < 8000 s) (Figura 3.9A), el incremento de la presión interfacial sigue el
siguiente orden E4M > E15LV E5LV > E50LV. Sólo E4M parece alcanzar un estado
de pseudo-equilibrio. La mayor presión interfacial alcanzada por E4M al comenzar la
adsorción estaría relacionada con su estructura molecular. E4M posee el menor número
de grupos metilos (hidrofóbicos) (Tabla 1, materiales y métodos) pero tiene un grado de
polimerización promedio cuatro veces mayor que las otras HPMCs. Esto involucra un
aumento en el número de segmentos que potencialmente se pueden adsorber por mol de
polímero (Perez y col., 2006).
Luego de los 8000 s, se observa un aumento en para E5LV, E50LV y
especialmente E15LV. Este comportamiento obedecería al mayor número de grupos
hidrofóbicos (metilos) y menor peso molecular que estos tres polisacáridos poseen en
comparación con E4M (Tabla 1, materiales y métodos) que les permitiría seguir
penetrando y reacomodándose a largos tiempos de adsorción.
Para la concentración de 1% (Figura 3.9B), E5LV muestra la mayor actividad
interfacial y sólo E4M parece llegar a un estado de pseudo-equilibrio en el tiempo de
adsorción, como resultó también para la concentración de 1.10-2%. E15LV y E50LV
muestran un incremento continuo en la presión indicando una constante adsorción y
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
148
0 2000 4000 6000 8000 10000 1200010
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(mN
/m)
(mN
/m)
tiempo(s)
(mN
/m)
(mN
/m)
(A)
reordenamiento en esta interfase. E5LV es la HPMC con menor peso molecular (Tabla
1, materiales y métodos), lo cual le permitiría un mayor incremento de la presión
superficial, seguido por E15LV y E50LV.
Baeza y col (2004) encontraron también una correlación entre el mayor incremento
en la presión superficial y el mayor grado de esterificación y mayor viscosidad en
alginatos de propilenglicol en la interfase aire- agua.
A la concentración de 2% p/p (Figura 3.9C), no se observan grandes diferencias en la
presión interfacial de las cuatro HPMC. Los valores obtenidos de presión son muy
similares a los obtenidos para 1% de concentración. Esto podría deberse a la saturación
de la interfase a concentraciones superiores a 10-2%, como se mostró en las isotermas de
adsorción (Figura 3.1).
La Figura 3.10 muestra la evolución de la presión interfacial con el tiempo de
adsorción en forma comparativa para las diferentes HPMCs a pH3.
Es interesante destacar que para todas las HPMCs y todas las concentraciones, el valor
de presión alcanzado a pH3 es menor que el obtenido a pH6. Un valor de pseudo-
equilibrio parece alcanzarse en todos los casos.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
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0 2000 4000 6000 8000 10000 1200013
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(mN
/m)
tiempo(s)
(B)
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(mN
/m)
(mN
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(mN
/m)
tiempo(s)
(mN
/m)
(mN
/m)
(mN
/m)
(C)
Figura 3.10. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para films de E4M (斤), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a pH3 y una concentración de HPMC en el seno de 1∙10-2 % p/p (A), 1% p/p (B) y 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC, pH6 y I =
5mM.
Como se mostró en el capítulo 1, todas las HPMCs presentan una carga superficial
neta negativa (potencial zeta) a pH3 que está ausente a pH6. Esta carga superficial
debida principalmente a la posible interacción de los iones cloruro con los grupos
hidrofóbicos, impediría en parte su adsorción, causando una menor presión interfacial
a pH 3.
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
150
3.2.2 Efecto del pH en la cinética de adsorción de HPMC.
Como se mostró en la figura 3.9, la difusión para las HPMC a pH6 (con excepción de
las HPMCs a la concentración de 10 -2%) fue muy rápida ( 10 mN/m) al inicio de la
medición para ser detectada por la técnica experimental empleada en este trabajo.
El rápido aumento de al inicio estaría relacionado con el peso molecular
principalmente de acuerdo a lo esperado, ya que a mayor peso molecular, menor kdif.
Excepto para la concentración de 10-2% donde la presencia de compuestos activos
superficialmente es relevante a tiempos cortos.
En la tabla 3.2 se resumen las constantes de adsorción y reordenamiento obtenidas
para las cuatro HPMCs.
Las Kads son del mismo orden de magnitud para todas las HPMCs. Las asociaciones
entre las HPMC dependientes de la concentración, enlentecería también el proceso de
adsorción a la concentración de 2%, ya que requeriría una previa desorganización de los
agregados. Esto ocurriría más fácilmente para las HPMCs con menor número de grupos
metilos. E4M presenta el menor número (Tabla 1, Materiales y Métodos), por lo cual se
adsorbería más fácilmente en la interfase O/W (Tabla 3.2).
No se observó la etapa de reordenamiento para E4M y E50LV al 2% dentro del
tiempo de adsorción. En los otros casos, se observa un aumento de la constante de
velocidad de reordenamiento a medida que disminuye el peso molecular. Estos
resultados indicarían que a medida que aumenta el tamaño molecular de la HPMC, su
reordenamiento interfacial se hace más dificultoso, es decir requiere más tiempo.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
151
Tabla 3.2. Parámetros cinéticos para la adsorción de HPMCs a pH6 en la interfase aceite-agua. 20°C y I= 5mM.
HPMC (%p/p) Kdif .104 *(s-1) Kads .104
*(s-1)(RL) t end ads (s) Kr .104
*(s-1)(RL)
E4M (10-2) 7,00 ± 0,10 1,62 ±0.11(0,97) 8000 3,94 ± 0,80 (0,94)
E50LV (10-2) 24,89±0,06 1,09±0.09(0,96) 8000 11,80 ± 2,45(0,95)
E15LV (10-2) 11,14 ±0,09 1,39±0,17(0,89) 7200 12,2±1,80(0,97)
E5LV (10-2) 10,82±0,05 1,14±0,09 (0,98) 6800 5,85±0,43(0,98)
E4M (1) 23,10±0,05 2,10 ±0.06(0,99) 8500 4,13 ± 0,90 (0,89)
E50LV (1) 25,50±0,08 1,78±0.08 (0,97) 8800 6,64 ± 0,42 (0,99)
E15LV (1) 28,63±0,05 2,01±0,17(0,97) 7400 8,13±0,94(0,98)
E5LV (1) 55,332±0,05 1,88±0,07(0,99) 6900 9,26±3,54(0,80)
E4M (2) 14,97 ± 0,05 1,85 ± 0,06 (0,98) 10000 --------
E50LV (2) 22,33 ± 0,05 1,73± 0,11 (0,98) 10000 --------
E15LV (2) 36,28± 0,10 1,77±0,14(0,97) 8000 8,47±0,64(0,98)
E5LV (2) 63,82±0,10 1,60±0,08 (0,98) 8000 8,74±2,22(0,92)
* promedio DS de al menos n = 2. Kdif, Kads, Kr: constantes de difusión, penetración/ adsorción y reordenamiento respectivamente. (RL): coeficiente de
regresión lineal.
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
152
En la tabla 3.3, se presentan las constantes cinéticas obtenidas para las HPMCs a pH3.
Las constantes de difusión siguen el orden E5LV ˃ E15δV ˃ E50δV ˃ E4ε para
todas las concentraciones estudiadas, contrariamente a lo observado a pH6. De acuerdo
a la figura 1.4, a pH3 predomina la forma monomérica de la HPMC que sería la especie
que se adsorbe en la interfase. Por lo tanto difunden en mayor medida (mayor kdif) las
HPMC de menor peso molecular. A pH6 predominan las formas asociadas (figura 1.4),
siendo el grado de autoensamblaje mayor para las HPMC de mayor peso molecular.
Las constantes de adsorción son mayores a 10-2% p/p, principalmente para E4M y
E50LV. Probablemente, a mayores concentraciones del polisacárido, exista una barrera
de energía para la adsorción y, en consecuencia, la habilidad de las moléculas de
HPMCs para crearse espacio y reacomodarse en la película ya formado, sea
determinante en la velocidad de adsorción. La repulsión electrostática entre los grupos
metilos, presente a pH3, de las moléculas previamente adsorbidas y las que arriban a la
interfase, impediría también la posterior adsorción.
No se obtuvo ninguna constante de reordenamiento para E4M, E50LV y E15LV al 2%
(Tabla 3.3). Como es un proceso que transcurre en un lapso de tiempo largo, la carga
neta negativa presente a este pH en las HPMCs y su mayor peso molecular (en
comparación con E5LV) impediría el proceso de reordenamiento en el lapso de tiempo
estudiado.
3.2.3 Efecto del pH en las características viscoelásticas de las películas de HPMCs.
La evolución con el tiempo del módulo elástico dilatacional, o de sus componentes
elástica (Ed) y viscosa (Ev) así como de la tangente del ángulo de desfase (tg ) para las
películas de HPMCs, se obtuvieron en forma simultánea con los estudios de adsorción
dinámica. En la figura 3.11 se muestra para pH6 la evolución con el tiempo del módulo
elástico dilatacional (Ed) para las concentraciones en el seno de la solución de 10-2%
(Figura 3.11A), 1% (Figura 3.11B) y 2% p/p (Figura 3.11C). En todos los casos las
cuatro HPMCs presentaron un continuo aumento en los valores de Ed, lo cual indica una
lenta y gradual evolución de la estructura interfacial. La lenta evolución en la estructura
de las películas, se observa también en la evolución de la viscoelasticidad relativa del
film (tg ) en la Figura 3.12.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
153
Tabla 3.3. Parámetros cinéticos para la adsorción de HPMCs a pH3 en la interfase aceite-agua. 20°C y I= 5mM.
* promedio DS de al menos n = 2.
Kdiff, Kads, Kr: constantes de difusión, penetración/ adsorción y reordenamiento respectivamente. (RL): coeficiente de regresión lineal.
HPMC (%p/p) Kdiff .104 * (s-1)(R Kads .104
*(s-1)(RL) t end ads (s) Kreor .104
*(s-1)(RL)
E4M (10-2) 8,17± 0,08 3,49±0,48(0,92) 10000 -----
E50LV (10-2) 7,95±0,15 11,1±1,34(0,94) 10000 -----
E15LV (10-2) 25,68±0,05 2,66±0,23(0,96) 10000 -----
E5LV (10-2) 38,72±0,05 1,56±0,08(0,98) 5800 4,90±1,30(0,93)
E4M (1) 45,60± 0,05 1,24±0,21(0,85) 10000 -----
E50LV (1) 48,42±0,07 1,97±0,43(0,98) 10000 -----
E15LV (1) 50,5±0,10 2,4±0,39(0,92) 10000 -----
E5LV (1) 52,03±0,05 1,55±0,10(0,97) 5800 5,35±0,21(0,99)
E4M (2) 44,76±0,10 1,98±0,22(0,91) 10000 -----
E50LV (2) 50,53±0,08 1,72±0,55(0,82) 10000 -----
E15LV (2) 49,28± 0,05 1,95±0,27(0,95) 10000 -----
E5LV (2) 68,56±0,07 9,57±0,11(0,95) 6000 4,91±0,13(0,99)
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
154
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
Ed(
mN
/m)
tiempo(s)
(B)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
tiempo(s)
Ed(
mN
/m)
(C)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
Ed(
mN
/m)
Ed(
mN
/m)
tiempo(s)
(A)
Figura 3.11. Evolución del módulo elástico dilatacional, Ed, con el tiempo de adsorción para
las películas de E4M (欣), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a pH6 para las concentraciones de HPMC en el seno de la solución de 1∙10-2 % (A), 1% (B) y 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
155
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
tg
(A)
tiempo (s)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
tiempo (s)
(B)
tg
En general, independientemente de la concentración, E5LV y E15LV presentaron
una mejor habilidad para la formación de películas elásticas. E4M presentó los valores
más bajos de Ed, probablemente relacionado con su menor grado de sustitución de
grupos metilo (tabla 1, materiales y métodos).
Las interacciones entre las moléculas de HPMC necesarias para formar una película
elástica estarían restringidas por la solvatación de los grupos hidrofóbicos en la fase
aceite, como se discutió anteriormente al comparar con el comportamiento en la
interfase aire-agua.
Con respecto a la evolución de la viscoelasticidad relativa (tg ) de las películas
(Figura 3.12) en la mayoría de los casos se forman películas viscoelásticas (tg 1).
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
156
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
tg
(C)
tiempo (s)
Figura 3.12. Evolución de la tangente del ángulo de desfase, tg , con el tiempo de adsorción
para las películas de E4M (欣), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a pH6 para concentraciones de HPMC en el seno de la solución de 1∙10-2 % (A), 1% (B) 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Mayoritariamente, los valores de la tg alcanzados durante la adsorción a tiempos
largos, están todos por debajo de 1, indicando que los films formados poseen una
estructura con carácter tipo gel. Esto involucra la asociación de los grupos hidrofóbicos
metilos de las HPMCs (Kita, Kaku, Kubota y Dobashi, 1999).
En la figura 3.13 se presenta la evolución con el tiempo de adsorción del módulo
elástico dilatacional (Ed) para las concentraciones en el seno de la solución de 10-2%
(Figura 3.13A), 1% (Figura 3.13B) y 2% (Figura 3.13C) a pH3.
El continuo incremento del carácter elástico observado para los films a pH6 (Figura
3.11), no fue evidente a este pH. Esto indica que la estructura sólida del film no presenta
una evolución con el transcurso del tiempo de adsorción.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
157
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Ed
(m
N/m
)
tiempo(s)
(A)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
tiempo(s)
Ed
(mN
/m)
(B)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Ed(m
N/m
)
tiempo(s)
(C)
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 1400010
15
20
25
Ed
(m
N/m
)
tiempo (s)
Figura 3.13. Evolución del módulo elástico dilatacional, Ed, con el tiempo de adsorción para
las películas de E4M (欣), E50LV (), E15LV () y E5LV (強) en la interfase aceite-agua a
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
158
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
(mN/m)
(A)
E (
mN
/m)
pH3 para las concentraciones de HPMC en el seno de la solución de 1∙10-2 % (A), 1% (B) 2% p/p (C). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Más aún, los valores de Ed son muy bajos ( 5 mN/m) para las tres concentraciones
estudiadas, con excepción de E4M al 2% (figura inserta) en donde los valores de Ed
son mayores a 15 mN/m hasta los 8000 segundos de adsorción. Al analizar los valores
de tg para los films de HPMCs a pH3, sólo las HPMCs al 1%, y en particular E5LV,
presentaron carácter viscoelástico (tg 1) a todos los tiempos de adsorción (datos no
mostrados). Al 2% de concentración ninguna de las HPMCs tuvo carácter viscoelástico
y al 10-2%, sólo E5LV presentó valores de tg 1 a tiempos de adsorción menores a
6000 segundos.
Como se discutió previamente, las HPMCs a este pH no se autoensamblan como a
pH6 (figura 1.4) lo que les impediría la formación de una estructura sólida en la
interfase.
La relación entre el módulo dilatacional superficial (E) y la presión interfacial para
la adsorción de las HPMCs a ambos pH, se observa en la Figura 3.14. Si el módulo
dilatacional superficial se debe solamente a la cantidad de HPMC adsorbida en la
interfase aceite-agua, todos los datos de E deberían normalizarse en una curva patrón.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
159
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
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14
16
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0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20 252
4
6
8
10
12
14
16
18
(mN/m)
E (
mN
/m)
(B)
Figura 3.14. Módulo dilatacional superficial, E, en función de la presión interfacial, , para films de HPMCs adsorbidas en la interfase aceite-agua a pH3 (A) y pH6 (B). Frecuencia: 0,1 HZ. Amplitud de compresión/expansión por ciclo: 10%. Concentración de HPMC en el seno de
la solución: 1∙10-2 % p/p (E4M , E50LV ◮, E15LV,ɒ; E5LV ◨), 1 % p/p ( E4M,♢;
E50LV,△; E15LV, ○; E5LV, □) y 2% p/p (E4M, ◆;E50LV,▲; E15δV,●; E5δV,■). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Se observa que esta normalización no fue posible para ninguna de las
concentraciones, indicando un comportamiento no ideal y reflejando así el impacto en
las interacciones entre las macromoléculas.
Como sucede para otros biopolímeros, tales como las proteínas (Horne y Rodriguez
Patino, 2003; Rodríguez Patino, Molina, Carrera, M.R. y Añon, 2003) y polisacáridos
(Baeza y col., 2004b), el módulo E aumenta, en la mayoría de los casos con la presión
superficial y esta dependencia refleja la existencia de mayores interacciones entre los
residuos adsorbidos de los polisacáridos. El incremento del módulo E con la presión, es
consistente con el incremento entre las interacciones entre las HPMCs adsorbidas, que
es mayor a tiempos largos de adsorción (Baeza y col., 2004).
El incremento del módulo E con la presión interfacial a pH3 (Figura 3.14A) fue
prácticamente nulo y marcadamente menor que a pH6 (Figura 3.14B), revelando la
ausencia de interacciones entre las moléculas de HPMC adsorbidas.
Sección I- Capítulo 3. Comportamiento de HPMC en la interfase O/W y comparación con la interfase A/W
160
3.3. Conclusión.
El comportamiento en la interfase O/W se vio fuertemente influenciado por el pH y
guarda correlación con el comportamiento en solución, estudiado por DLS en el
capítulo 1.
Se ha mostrado que el pH modula la asociación hidrofóbica entre las moléculas de
HPMC, lo cual impacta enormemente en su comportamiento en solución como en la
interfase O/W.
A pH3 el autoensamblaje de las HPMC se ve impedido tanto en solución como en la
interfase O/W. Por ello todas las HPMC a pH3 mostraron una reducción en su actividad
interfacial con respecto a pH6 y las películas interfaciales no presentaron propiedades
elásticas.
Con respecto al comportamiento de cada celulosa, se concluye que las HPMC de menor
peso molecular y mayor hidrofobicidad (E5LV y E15LV) son más eficientes para la
estabilización de la interfase O/W, mientras que el comportamiento contrario se observa
en la interfase A/W.
Capítulo 4
Comportamiento de hidroxipropilmetilcelulosas
en emulsiones O/W
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
161
4.1 Características iniciales de las emulsiones.
4.1.1 Distribución de tamaño de gota en emulsiones preparadas con Ultraturrax
(UT).
La figura 4.1 muestra la distribución de tamaños de gota para las emulsiones O/W en
relación aceite/solución HPMC 10/90 respectivamente, preparadas con UT a ambos
pHs.
Puede observarse que tanto a pH3 (Figura 4.1A) como a pH6 (Figura 4.1 B), se
obtienen poblaciones trimodales para todas las HPMCs, con predominio de la población
II (Figura 4.1). Mitidieri y Wagner (2002) y Palazolo (2006) también encontraron
poblaciones trimodales al estudiar emulsiones O/W preparadas con proteínas de soja
mediante UT.
La población I tiene el máximo del pico a los 0,2 m para todas las emulsiones a
pH6 y para las emulsiones de E5LV y E15LV a pH3. Este primer pico se encuentra
desplazado a 0,3 m para E50LV y a 1 m para E4M a pH3.
La población II tiene su máximo en 10 m para las emulsiones a pH3 y pH6. Por
último, la población III tiene su máximo en los 100 m para ambos pHs. A pH3, las
emulsiones de E5LV, E15LV y E50LV tienen una pequeña proporción de este tamaño
de gotas y es mayoritario para las emulsiones de E4M. A pH6 este máximo se encuentra
en los 100 m para las emulsiones de E50LV y E4M. Las emulsiones de E5LV no
presentan la población III y las correspondientes a E15LV presentan una pequeña
proporción de este tamaño de gotas.
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
162
0.01 0.1 1 10 100 1000 100000
2
4
6
8
10
Vol
um
en
(%)
tamaño gota (m)
(A)III
II
I
0.01 0.1 1 10 100 1000 100000
2
4
6
8
10
Vol
ume
n (%
)
tamaño gota (m)
I
II
III
(B)
Figura 4.1. Distribución del tamaño de gota por volumen (%) para emulsiones O/W de HPMC al 2% preparadas por Ultraturrax a pH3 (A) y pH6 (B). E5LV (峡,強), E15LV (鏡,響), E50LV
(▼,) y E4M (斤,欣). I: tamaño de gotas incluidas en la población I. II: tamaño de gotas incluídas en la población II. III: tamaño de gotas incluidas en la población III.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
163
Las distribuciones de tamaño de partícula expresadas en número (no mostradas)
fueron similares para todas las emulsiones y presentaron una gran proporción de gotas
de la población I y en menor medida de la población II. Esto significa que la población I
y parcialmente la II, no contribuyen ampliamente al volumen total de la fase dispersa
(Figura 4.1) pero si al área creada durante el proceso de homogeneización (Palazolo,
2006). Por el contrario, la población II y la población III, concentra casi todo el
volumen de la fase dispersa de las emulsiones.
El comportamiento de estos sistemas coloidales, en lo que se refiere al cremado y la
coalescencia, está gobernado por la presencia de gotas de mayor tamaño, aún cuando
están presentes en un pequeño porcentaje con respecto al número total de gotas.
Cuando mayor sea el tamaño de gotas en una emulsión, serán más propensas a la
coalescencia inducida por colisión. Las fuerzas de impacto que se generan y la magnitud
de las mismas durante una colisión, se hacen mayores con el aumento del tamaño de las
gotas (McClements, 1999). Es por este motivo que el análisis de estabilidad se realiza
en base a las distribuciones de tamaño de partícula en volumen (Palazolo, 2006).
La tabla 4.1 muestra los diámetros promedio, la polidispersidad y el área superficial
específica creada para las emulsiones de HPMCs recién preparadas con UT.
A partir de la mediana (Dv,0,5) y los percentiles 10 y 90 % (Dv,0,1 y Dv,0,9
respectivamente) de la distribución en volumen, se calculó el grado de polidispersidad
de las emulsiones (apartado 6.2.2 de la introducción).
El área interfacial específica (AIE) o área superficial por unidad de masa de la fase
dispersa, es calculada por el software del Mastersizer mediante el valor del diámetro
promedio D3,2 (Carrera Sanchez y Rodriguez Patino, 2005; Cornec y col.., 1998).
Durante el proceso de homogeneización con un agitador de alta velocidad, las fases
acuosa y oleosa son sometidas a una agitación mecánica intensa en un régimen de flujo
laminar y turbulento. Por consiguiente, el área interfacial resultante es un balance entre
los procesos de ruptura (creación de área interfacial) y coalescencia (reducción de área
interfacial) de las gotas ((McClements, 1999; Palazolo, 2006; Walstra, 1993). Las
condiciones de homogeneización fueron las mismas para todas las emulsiones, lo cual
permite inferir que la variación del AIE se atribuye en mayor medida al emulsificante
empleado (en esta sección HPMC), que favorece o inhibe en distinto grado los procesos
mencionados.
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
164
Tabla 4.1. Diámetros promedios de Sauter (D32), de De Brouker (D43), polidispersidad y área específica interfacial (AIE) de las distribuciones
de tamaño de gota de las emulsiones de HPMC al 2% preparadas con UT a ambos pH. Desviación estándar máxima: 5%.
HPMC E4M E50LV E15LV E5LV
pH3 pH6 pH3 pH6 pH3 pH6 pH3 pH6
D32 (m) 21,301 2,921 2,902 2,481 1,512 1,991 1,441 1,811
D43(m) 52,211 25,413 20,302 20,903 17,241 12,771 18,742 10,771
polidispersidad 4,951 3,902 4,532 3,763 4,431 2,553 4,161 2,161
AIE (m2/g) 0,282 2,981 2,471 2,023 3,902 3,082 3,441 3,321
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
165
Los diámetros promedio D32 para las emulsiones de E4M y E50LV resultaron
mayores a pH3 que a pH6, mientras que ocurrió lo contrario para las emulsiones de
E15LV y E5LV. Sin embargo, las emulsiones de E4M fueron las que mostraron mayor
variación en el D32 con el pH.
El área superficial específica creada fue mayor cuando menor es el valor de D3,2
(Carrera Sanchez y col., 2005). Por lo tanto también las emulsiones de E4M fueron las
que exhibieron una mayor variación en el área interfacial con el pH.
Los D4,3, que están relacionados con los fenómenos de desestabilización, por ser más
sensible a la variación de volumen y la polidispersidad fueron mayores en todos los
casos para las emulsiones a pH3.
Como se ha mostrado en el capítulo 3, las películas interfaciales de HPMCs a pH3
presentan una baja viscoelasticidad y pobre carácter sólido. Para minimizar la
coalescencia de las gotas de aceite la película interfacial debe ser suficientemente
resistente para evitar que las mismas se fusionen durante el proceso de
homogeneización (McClements, 1999; Palazolo, 2006). Por lo tanto, las emulsiones de
HPMCs a pH3 tendrían una mayor tendencia a desestabilizarse durante su formación.
Baeza (2003) también encontró correlación entre la estabilidad de espumas de lg y
polisacáridos con el módulo elástico de los films y la viscosidad de las soluciones a
partir de las cuales se formaron las espumas.
Para ambos pHs, los valores de polidispersidad siguieron el orden E4M > E50LV>
E15LV> E5LV. Esto se evidenció en las distribuciones de tamaño de gota (Figura 4.1),
principalmente en la proporción de gotas en la población III para las distintas HPMCs.
A ambos pH, las HPMC más eficientes en cuanto a la obtención de un menor
diámetro de gota (D32 o D43) fueron las de menor peso molecular (E5LV y E15LV) las
cuales, como se discutió en el capítulo 3, pueden producir un aumento más rápido de la
presión interfacial y generan películas interfaciales elásticas.
La viscosidad de las soluciones iniciales también tiene influencia en el tamaño de
gota formado. La viscosidad es una medida cualitativa de las interacciones moleculares,
cuando mayor es la viscosidad, mayores son las fuerzas atractivas entre las moléculas
del polisacárido y mayor debe ser la energía entregada por el sistema para obtener gotas
de menor diámetro (Behrend, Ax y Schubert, 2000). En todos los casos el valor del
índice de consistencia sigue el mismo orden que el establecido para la polidispersidad y
es mayor en la emulsiones a pH6 (Tabla 4.2).
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
166
Tabla 4.2. Parámetros de flujo de las emulsiones de HPMC al 2% preparadas por UT obtenidas a partir del modelo de Ostwald. K, índice de consistencia; n, índice de flujo. R2 > 0,97.
HPMC pH3 pH6
K n K n
E5LV 0,050 1,036 ± 0,025 0,340 ± 0,087 0,927 ± 0,055
E15LV 0,272 ± 0,067 1,015 ± 0,077 0,377 ± 0,005 0,917 ± 0,006
E50LV 0,273 ± 0,063 1,015 ± 0,073 5,399 ± 0,304 0,935 ± 0,012
E4M 43,030 ± 1,056 1,034 ± 0,026 67,370 ± 1,833 1,024 ± 0,047
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
167
0.01 0.1 1 10 100 1000 100000
2
4
6
8
10
Vol
ume
n (%
)
tamaño gota(m)
Como puede observarse en la tabla 4.2, las viscosidades iniciales de las emulsiones
guardan relación con las viscosidades iniciales de las soluciones de HPMC (tabla 2.7 y
2.8, capítulo 2). Las emulsiones de E4M a ambos pHs, presentan un valor mucho mayor
lo cual refleja la mayor viscosidad de esta celulosa.
Para las emulsiones preparadas con UT, el comportamiento obtenido fue Newtoniano,
a pH3 y pseudoplástico para las emulsiones a pH6, con excepción de E4M.
La viscosidad de una emulsión está influenciada por varios factores, viscosidad de la
fase continua, viscosidad de la película interfacial y tamaño de gota principalmente.
4.1.2 Distribución de tamaño de gota en emulsiones preparadas con ultrasonidos de
alta intensidad (USAI).
Existen en la bibliografía muchos trabajos que proponen preparar una pre-emulsión
con un agitador antes de formar una emulsión con ultrasonidos o con altas presiones,
con el fin de disminuir el tamaño de partícula (Carrera Sanchez y col.., 2005; Gu y col.,
2005; Schulz y Danields, 2000). Por ello se determinó si era conveniente hacer una pre-
emulsión con UT y luego tratarla con USAI.
La figura 4.2 muestra las curvas de distribución para emulsiones O/W 10/90 de
E5LV 2% a pH6 preparadas con 20 minutos de USAI y pre-emulsionadas con UT
durante 1 minuto antes de los 20 minutos continuos con USAI.
Figura 4.2. Distribución del tamaño de gota por volumen (%) para emulsiones O/W de
E5LV al 2% y pH6 preparadas por 20 minutos con USAI (欣) y pre- emulsionada con UT
durante 1 minuto (斤).
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
168
Se observa que la emulsión preparada con USAI es monomodal, con un máximo de
pico a 1 m y una población polidispersa con tamaño de gota entre los 0,2 m y los 4
m. La emulsión pre-emulsionada previamente al tratamiento con ultrasonidos,
presentó una población con cuatro tamaños bien definidos, siendo la población de 2 m
la mayoritaria. Se distinguen dos poblaciones con tamaño de gota mayores a los 10 m,
una con un máximo a los 30 m y la otra en los 200 m. Behrend y col. (2000)
sostienen que son necesarias una amplia gama de frecuencias de ultrasonidos para
obtener un tamaño de partícula gobernante y así una distribución monomodal y
estrecha. Esto es bastante difícil de conseguir cuando se parte de una pre-emulsión con
una distribución con varios tamaños de partículas, como sucede con el UT.
Por lo tanto, en el presente trabajo, se preparararon emulsiones de HPMCs a ambos
pH directamente con 20 minutos de USAI.
En la figura 4.3 se muestra la distribución de tamaños de gotas para las emulsiones
O/W en relación aceite/solución HPMC 10/90, preparadas con USAI y a ambos pHs.
Se observa la misma tendencia a ambos pHs. Mayoritariamente las poblaciones son
monomodales, con excepción de las emulsiones de E4M, las cuales presentan una
distribución bimodal. Las emulsiones de E5LV, E15LV y E50LV aún siendo
monomodales, son polidispersas ya que presentan una población que varía entre los
0,15 m y los 3 m con un máximo en la distribución a 1 m. La emulsión de E4M
presenta gotas entre los 0,15 m y los 6 m con el máximo de la población mayoritaria
a los 2 m.
Las distribuciones de tamaño de partícula expresadas en número (no mostradas)
fueron similares para todas las emulsiones y presentaron una población monomodal con
predominancia de gotas alrededor de los 0,3 m. En todos los casos, las poblaciones en
número presentaron un tamaño menor a los 0,5 m. Esto indica que las gotas mayores a
0,5 m contribuyen ampliamente al volumen total de la fase dispersa pero no al área
creada durante el tratamiento con USAI.
Es importante destacar, que el tamaño de gotas obtenido para todas las emulsiones se
encuentra mayoritariamente por debajo de los 2 m, lo cual implica una mayor
estabilidad de las emulsiones en función del tiempo ya que las gotas de mayor tamaño
aceleran los procesos de cremado y floculación (McClements, 1999).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
169
Figura 4.3. Distribución del tamaño de gota por volumen (%) para emulsiones O/W de
HPMC al 2% preparadas por USAI a pH3 (A) y pH6 (B). E5LV (峡,強), E15LV (鏡,響),
E50LV (▼,) y E4M (斤,欣).
0.01 0.1 1 10 1000
2
4
6
8
10
Vol
ume
n (%
)
tamaño gota (m)
(A)
0.01 0.1 1 10 1000
2
4
6
8
10
Vo
lum
en (
%)
tamaño gota (m)
(B)
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
170
Es de esperar entonces, que las emulsiones preparadas con USAI sean más estables
durante el almacenamiento a temperatura ambiente que las emulsiones preparadas con
UT. Estas últimas presentaron tamaños de gotas mayores a los 10 m y una distribución
trimodal en la mayoría de las emulsiones analizadas (Figura 4.1).
La tabla 4.3 muestra los diámetros promedio, la polidispersidad y el área superficial
específica creada para las emulsiones de HPMCs recién preparadas con USAI.
Cuando se comparan las emulsiones obtenidas por UT (tabla 4.1 y Figura 4.1) con
las emulsiones obtenidas por USAI (tabla 4.3 y Figura 4.3), se observa una gran
influencia del equipo empleado para su obtención. Las emulsiones preparadas con USAI
presentaron menores diámetros promedio y la polidispersidad también fue menor en
todos los casos. El área interfacial creada (AIE) es notablemente mayor para las
emulsiones con USAI, lo cual está asociado a un menor tamaño de gota.
Al igual que para las emulsiones preparadas por UT, se obtienen mayores diámetros
promedio (D32 y D43) para todas las HPMCs estudiadas a pH3. El orden de
polidispersidad obtenido también es el mismo (E4M > E50LV> E15LV> E5LV). Las
emulsiones de E4M son las más polidispersas a ambos pHs, lo cual se ve reflejado en la
curva de distribución (Figura 4.3). El área específica interfacial creada es mayor a pH6.
En estas emulsiones preparadas por USAI, también son más eficientes en reducir el
tamaño de gota las HPMc de menor peso molecular.
Jafari, He y Bhandari (2007) al preparar, emulsiones O/W de d-limoneno con
maltodextrina y almidón modificado con agitación mecánica y ultrasonidos, encontraron
que tanto el D32 como el D43 eran tres veces mayores en las emulsiones preparadas con
agitación mecánica que las preparadas con ultrasonidos. Las curvas de distribución de
gotas en volumen (%), resultaron bimodales cuando se prepararon las emulsiones con
agitación mecánica.
Abismail, Canselier, Wilhelm, Delmas y Gourdon (1999) estudiaron
comparativamente emulsiones de Tween 60 y aceite de girasol formadas por agitación
mecánica (Ultraturrax) y por ultrasonidos. Para todos los tiempos de tratamiento
analizados, encontraron que el diámetro promedio D32 fue mayor para las emulsiones
preparadas con UT. Resultaron más estables durante el almacenamiento y menos
polidispersas, las emulsiones preparadas con ultrasonidos.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
171
Tabla 4.3 Diámetros promedio de Sauter (D3,2), de De Brouker (D4,3), polidispersidad y área interfacial específica (AIE) de las distribuciones de tamaño de gota de las emulsiones de HPMC al 2% preparadas con USAI a ambos pH. Desviación estándar máxima: 5%.
HPMC E4M E50LV E15LV E5LV
pH3 pH6 pH3 pH6 pH3 pH6 pH3 pH6
D32 (m) 0,814 0,708 0,620 0,546 0,623 0,587 0,614 0,537
D43(m) 1,531 1,370 0,923 0,843 0,944 0,866 0,959 0,812
polidispersidad 2,053 2,089 1,703 1,851 1,693 1,815 1,599 1,599
AIE (m2/g) 7,370 8,470 9,680 11,000 11,599 10,200 9,770 11,200
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
172
Las diferencias encontradas residen en la energía que se le entrega al sistema. Cuando
se emplea un agitador mecánico, como el Ultraturrax, las fuerzas involucradas son
esfuerzos cortantes en régimen laminar que no causan una buena ruptura de las gotas.
Por eso hay poblaciones en la distribución con tamaño mayor a los 10 m.
Durante la emulsificación por ultrasonidos, la cavitación es la causa de la ruptura de las
gotas. Hay otros fenómenos involucrados como calor, agitación dinámica, esfuerzos de
corte y turbulencia (Floros y Liang, 1994; Fukase y col., 1994; Guzey, 2002; Mason y
col., 1996) que causan cambios físicos y químicos mediante la generación y el colapso
de las cavidades. El rápido colapso de estas cavidades producen fuerzas de corte lo
suficientemente fuertes para romper enlaces covalentes en materiales poliméricos
(Guzey, 2002). Es por ello que al emulsificar con USAI, es posible obtener tamaño de
gotas submicrónicas (Jafari, He y Bhesh, 2006).
Si bien la influencia del USAI es notable en la reducción de tamaños cuando se
compara con las emulsiones preparadas con UT (tabla 4.1), al comparar las emulsiones
de HPMCs entre sí, se observan diferencias. En la tabla 4.2, puede verse que se obtienen
mayores D32 y D43 para las emulsiones de E4M tanto a pH3 como a pH6. Las curvas de
distribución en volumen correspondientes (Figura 4.3) presentan una distribución
bimodal, mientras que para las otras 3 HPMCs, las emulsiones presentan curvas de
distribución monomodales. Esto indica un efecto diferente del USAI en la preparación
de emulsiones estabilizadas con E4M. Loning, Horst y Hoffmann (2002) sostienen que
cuando mayor es la viscosidad de la fase continua, resulta más difícil de inducir el
fenómeno de cavitación. Esto llevaría a obtener diámetros promedios levemente
mayores (Tabla 4.2) y una distribución bimodal (Figura 4.3) en las emulsiones de E4M.
Luego de la preparación de las emulsiones con USAI, se determinaron las curvas de
flujo de las mismas (Tabla 4.4).
Tabla 4.4. Parámetros de flujo de las emulsiones de HPMC al 2% prepraradas por USAI obtenidas a partir del modelo de Ostwald. K, índice de consistencia; n, índice de flujo. R2 > 0,97.
HPMC pH3 pH6 K n K n
E5LV 0,058 ± 0,005 0,916 ± 0,020 0,056 ± 0,004 0,968 ± 0,015 E15LV 0,129 ± 0,003 0,973 ± 0,005 0,121 ± 0,001 0,979 ± 0,003 E50LV 0,070 ± 1,165 0,820 ± 0,035 0,086 ± 0,018 1,070 ± 0,043 E4M 3,843 ± 1,694 0,749 ± 0,091 1,099 ± 0,028 0,978 ± 0,005
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
173
Puede observarse un mayor valor de K para las emulsiones de E4M a ambos pH. El
efecto del USAI es mayor en las emulsiones preparadas con las HPMCs de mayor peso
molecular, especialmente E4M. Se observa gran reducción en el valor de K, en
comparación con las emulsiones preparadas con UT (tabla 4.2) y con las soluciones sin
tratamiento (tabla 2.7 y 2.8). Como se discutió en el capítulo 2, las ondas ultrasónicas
promueven la deshidratación parcial y/o modificación en la estructura de la E4M en la
fase continua, provocando una disminución global en la viscosidad de la emulsión.
En la tabla 4.5 se muestra la carga superficial de las gotas en las emulsiones a pH3 y
pH6 obtenidas por UT y USAI. Se observa la misma tendencia que en las soluciones de
HPMCs a esos pHs (tabla 2.7 y 2.8). Es decir una carga neta negativa a pH3 y positiva a
pH6.
Es interesante destacar que el valor absoluto del potencial zeta resultó
significativamente mayor en las emulsiones formadas con USAI, lo cual está vinculado
al menor tamaño de gota de las mismas (McClements, 1999).
Tabla 4.5 Potencial zeta de emulsiones de HPMCs al 2 %p/p a pH3 y pH6, preparadas con UT y USAI. Desviación estándar: 1%
HPMC E4M E50LV E15LV E5LV pH UT USAI UT USAI UT USAI UT USAI 3 -1,040 -1,320 -0,683 -1,910 -1,080 -2,340 -1,510 -2,590 6 +0,239 +0,687 +0,125 +0,118 +0,253 +0,413 +0,291 +0,928
* promedio de al menos n = 5
4.2 Estabilidad de las emulsiones preparadas con Ultraturrax y ultrasonidos de alta
intensidad frente al almacenamiento estacionario a temperatura ambiente.
El término estabilidad en una emulsión se refiere a la habilidad para resistir los
cambios en sus propiedades a través del tiempo; cuando más estable es una emulsión,
más lento es el proceso de cambio en sus propiedades (McClements, 1999).
El tiempo durante el cual una emulsión debe ser estable, depende de la naturaleza del
producto alimentario (Dickinson, 1992). Algunas emulsiones alimentarias se generan en
etapas intermedias durante un proceso de manufactura por lo tanto sólo se necesita que
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
174
sea estable durante algunos segundos, minutos o horas. Otras emulsiones deben
presentar estabilidad por días, meses o hasta años previamente a su consumo.
En esta sección se analizarán los resultados obtenidos de la evaluación global de las
emulsiones de HPMCs O/W (10/90) a pH3 y pH6.
Las emulsiones con baja relación volumétrica entre las fases dispersas y acuosas, como
las emulsiones en estudio, tienden a desestabilizarse por cremado. La floculación tiene
una gran influencia sobre el cremado y puede favorecer la separación gravitacional
dependiendo del tamaño y estructura de los flóculos (McClements, 1999; Palazolo,
2006). Después de un tiempo de almacenamiento, se forma en la parte superior de la
emulsión una fase crema, la cual no es más que una emulsión más concentrada en gotas
que la inicial. La fase inferior o suero está empobrecida en gotas de aceite y por lo tanto
enriquecida en agua.
En general, en ausencia de fuerzas externas aplicadas, la coalescencia es un mecanismo
de desestabilización lento, en comparación con el cremado y la floculación. Por lo tanto,
excepto que el proceso de emulsificación o el agente emulsificante no hayan sido
efectivos, la coalescencia tiene lugar una vez que se ha formado la fase crema, es decir,
cuando el cremado y la floculación han alcanzado un grado avanzado de desarrollo.
En una emulsión más concentrada en la fase dispersa, como la fase crema, las gotas
pierden movilidad y pueden permanecer en íntimo contacto durante un período
prolongado, lo cual promueve la coalescencia (Palazolo, 2006). La naturaleza de las
interacciones coloidales entre las gotas y la resistencia del film interfacial determinará el
grado de desestabilización (McClements, 1999). Por consiguiente, la estabilidad frente a
la coalescencia de una emulsión O/W, se evalúa a través de las características de la fase
crema después del almacenamiento estacionario (Palazolo, 2006).
La estabilidad de las emulsiones, se analizó mediante los perfiles de backscattering
(BS%) en función de la longitud del tubo de medida. Si bien el principal objetivo de
este estudio es la evaluación de la estabilidad de las emulsiones preparadas, los perfiles
iniciales dan cierta información de la microestructura de la emulsión de partida
(Palazolo, 2006). El BSo permite hacer una evaluación cualitativa del tamaño de las
gotas en la emulsión. Márquez, Palazolo y Wagner (2005) han encontrado una relación
similar entre BSo % y D32 en emulsiones preparadas con leche de soja, aceite de girasol
y grasa láctea.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
175
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
o (
%)
longitud del tubo (mm)abajo arriba
Las figuras 4.4 y 4.5 muestran los perfiles iniciales de backscattering (BSo %) de las
emulsiones formadas con UT y USAI, respectivamente.
Los valores de BS% dependen no sólo del diámetro de las gotas (D), sino también de
la fracción volumétrica de la fase dispersa () (Mengual y col., 1999; Palazolo, 2006).
Los perfiles de BSo % corresponden a las emulsiones recién preparadas, donde las gotas
están uniformemente distribuidas a lo largo del todo el tubo de medida, es decir con un
valor de constante. Por lo tanto, inicialmente el BSo % dependerá sólo del diámetro de
las gotas.
Figura 4.4. Perfiles iniciales de backscattering (BSo%) de emulsiones de HPMCs O/W
preparadas con Ultraturrax a pH3 (símbolos llenos) y pH6 (símbolos vacíos) para E4M (斤,欣)
y E5LV (峡,強) .
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
176
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
o (
%)
longitud del tubo (mm)abajoarriba
(A)
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
o (
%)
longitud del tubo (mm)abajo arriba
(B)
Figura 4.5. Perfiles iniciales de backscattering (BSo%) de emulsiones de HPMCs O/W
preparadas con Ultrasonidos de alta intensidad a pH3 (A) y pH6 (B) para E5LV (強,峡),
E15LV (響,鏡), E50LV (,▼) y E4M (欣,斤).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
177
Para las emulsiones preparadas con UT, se muestra los perfiles de BSo para las
emulsiones de E4M y E5LV (Figura 4.4), con viscosidades extremas (tabla 4.2), a
ambos pHs.
A fracción volumétrica constante, como es el caso de estas emulsiones, las gotas de
menor tamaño dispersan una mayor cantidad de luz. Esto se traduce en un mayor
porcentaje de BSo.
Este comportamiento puede verse en la figura 4.4 donde las gotas de mayor tamaño
de las emulsiones de E4M a pH3, dispersan una menor cantidad de luz, produciendo un
menor valor de BSo (50%), lo cual está en concordancia con el tamaño de gota obtenido
(Tabla 4.1), un orden mayor para las emulsiones de E4M a pH3.
No se observaron diferencias (figura 4.4) entre las emulsiones a pH6 ni para E5LV,
indicando un menor tamaño de gota inicial. El BSo% obtenido para estas emulsiones es
de 60%.
Cuando se analizan los perfiles de BSo obtenidos para las emulsiones de HPMCs
preparadas con USAI, puede verse un mayor % de BSo en comparación con las
emulsiones preparadas con UT (Figura 4.5 y 4.4, respectivamente), lo cual refleja un
menor tamaño de gota (tabla 4.3). Se observan también mayores diferencias en los
perfiles de las emulsiones obtenidas a pH3 (figura 4.5 A) en comparación con las
emulsiones a pH6 (figura 4.5B).
4.2.1 Microscopía óptica de las emulsiones iniciales
En una microscopía óptica, las gotas que se observan con mayor facilidad son
aquellas de mayor tamaño, las cuales dominan el proceso de cremado. Sin embargo
debe tenerse en cuenta que no son las mayoritarias en número y por lo tanto las
micrografías nos brindan una información parcial de la microestructura de las
emulsiones. Lo que puede verse claramente es si las gotas visibles están o no floculadas
y las características de los flóculos formados (Palazolo, 2006). La presencia de flóculos
se atribuye a un balance entre las interacciones coloidales atractivas y repulsivas entre
las gotas (McClements, 1999; Palazolo, 2006). Si hay un predominio de las
interacciones atractivas, las gotas se agregan formando flóculos.
Las figuras 4.6 y 4.7 muestran las micrografías obtenidas para las emulsiones recién
preparadas con ultrasonidos de alta intensidad a pH3 y pH6 respectivamente.
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
178
Cuando se analizan las micrografías de las emulsiones a pH3 para ninguna emulsión
se observa gran tendencia a la formación de flóculos (Figura 4.6)
Figura 4.6.Micrografías ópticas (60 X, zoom 2,5 X) de emulsiones de HPMCs recién preparadas con USAI a pH3. (A) E4M, (B) E50LV, (C) E15LV y (D) E5LV. Barras blancas:
20 m
D C
B A
A B
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
179
Figura 4.7. .Micrografías ópticas (60 X, zoom 2,5 X) de emulsiones de HPMCs recién preparadas con USAI a pH6. (A) E4M, (B) E50LV, (C) E15LV y (D) E5LV. Barras blancas:
20 m.
Para las emulsiones de HPMCs preparadas a pH6, tampoco se observa una gran
tendencia a la formación de flóculos.
Para todas las emulsiones a ambos pHs, se observa una distribución de tamaño de
partículas uniforme, con baja polidispersidad, lo cual es visible en la tabla 4.3 en
comparación con la emulsiones preparadas con UT (Tabla 4.1), más polidispersas y con
distribuciones trimodales (Figura. 4.1).
4.2.2 Estabilidad frente al cremado-floculación.
Para evaluar la cinética de cremado de las emulsiones, se analizaron los perfiles de
BS% durante el almacenamiento estacionario a T ambiente.
En todas las emulsiones analizadas, se obtuvieron los perfiles de BS cada 5 minutos
durante la primera hora de preparada la emulsión. Luego cada dos horas durante los
primeros tres días y por último, cada un día.
En los estadíos iniciales de un almacenamiento estacionario y dependiendo de la
relación entre las velocidades de floculación (Vfloc) y de cremado (Vcrem), pueden
presentarse tres casos (Figura 4.8) (Palazolo, 2006; van Aken, Blijdenstein & Hotrum,
2003).
Cuando Vcrem > Vfloc se produce predominantemente la migración de las gotas
individuales. Si VcremV floc, se forman flóculos de estructura cerrada, los cuales migran
como partículas individuales de mayor tamaño. Finalmente, cuando V crem< Vfloc, se
favorece la formación de flóculos de estructura más abierta y reticular.
C D
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
180 0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
(%
)
> tiempo
(A)
Figura 4.8. Evolución estructural de emulsiones O/W para diferentes relaciones de velocidades de cremado (Vcrem) y floculación (Vfloc); a) Vcrem> Vfloc, migración de gotas individuales; b)
VcremVfloc, formación de floculos de estructura cerrada; c) Vcrem< Vfloc, formación de flóculos de estructura abierta (Palazolo, 2006; van Aken et al., 2003).
Las figuras 4.9 y 4.10 muestran los perfiles de BS (%) para las emulsiones de E4M y
E5LV preparadas con UT y USAI respectivamente.
a
b
c
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
181
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
(%
)
longitud del tubo (mm)abajo arriba
> tiempo
(C)
0 10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
(%
)
longitud del tubo (mm)abajo arriba
> tiempo
(D)
0 10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
(%
)
longitud del tubo (mm)abajo arriba
> tiempo
(B) Figura 4.9. Perfiles de Backscattering (BS%) de emulsiones de HPMCs preparadas con UT
a pH3 (A,B) y pH6 (C, D) para E4M (A , C) y E5LV (B, D). Las flechas indican el avance de los perfiles en función del tiempo de almacenamiento estacionario. Se seleccionó la parte
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
182
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
tiempo
BS
(%
)
longitud del tubo (mm) arribaabajo
(A)
10 20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
100
BS
(%
)
longitud del tubo(mm)abajo arriba
tiempo
(B)
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
(%
)
longitud del tubo (mm)abajo arriba
> tiempo
(C)
inferior del tubo (10-20 mm) para la evaluación de la cinética de cremado-floculación. Tiempo analizado: 1-20 dias.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
183
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
(%)
longitud del tubo (mm)abajoarriba
> tiempo
(D)
Figura 4.10. Perfiles de Backscattering (BS%) de emulsiones de HPMCs preparadas con
USAI a pH3 (A,B) y pH6 (C, D) para E4M (A , C) y E5LV (B, D). Las flechas indican el avance de los perfiles en función del tiempo de almacenamiento estacionario. Se seleccionó la parte inferior del tubo (10-20 mm) para la evaluación de la cinética de cremado-floculación. Tiempo analizado: 1-20 dias.
En los perfiles de BS (%) para las emulsiones formadas con UT (Figura 4.9) puede
verse una gran variación en función del tiempo, siendo más notoria para E5LV,
polisacárido con menor peso molecular y menor viscosidad (tabla 1.1, materiales y
métodos). Aún cuando el tamaño de gota de las emulsiones de E4M es el mayor debido
a su mayor viscosidad, los fenómenos de cremado y floculación se ven minimizados
(McClements, 1999), ya que la velocidad con la cual se pueden mover las gotas es
mucho menor. Las emulsiones a pH3 evidencian una mayor variación en los perfiles de
BS (%), principalmente E5LV.
Los perfiles de BS(%) de las emulsiones preparadas con USAI presentan una menor
variación en función del tiempo, indicando mayor estabilidad (Palazolo, 2006).
Las constantes de la cinética de cremado-floculación (C) obtenidas para las
emulsiones preparadas con UT y USAI a ambos pHs, se muestran en la tabla 4.6. Las
mismas se obtienen de la inversa de la pendiente del grafico correspondiente a la capa
inferior de la emulsión (10-20 mm en el tubo de medida) en función del tiempo (Carrera
Sanchez y col., 2005; Chanamai y McClements, 2000). Cuando mayor es el valor de
esta constante, mayor es el grado de desestabilización en la emulsión en estudio
(Palazolo, 2006).
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
184
Tabla 4.6. Constantes cinéticas de cremado-floculación (C) de emulsiones de HPMCs a pH3
y pH6 preparadas con UT y USAI.
Analizando los datos se observa que existe una gran diferencia entre las emulsiones
preparadas con UT y con USAI en cuanto a la velocidad de cremado que es dos órdenes
de magnitud menor en estas últimas. Esto guarda relación con el menor tamaño de gota
obtenido por USAI. Las curvas de distribución (figura 4.2) y los valores de los
diámetros promedios obtenidos (tabla 4.3) para las emulsiones preparadas con USAI,
son muy similares entre sí e indicativo de emulsiones con baja polidispersidad. Es decir,
la población es mayoritariamente monomodal, con un tamaño de gota predominante, lo
cual fue evidenciado en las micrografías obtenidas (figura 4.7 y 4.8).
Los perfiles de BS (%) (figura 4.10), muestran poco cambio con el tiempo, en
concordancia con el tamaño de partícula obtenido para estas emulsiones.
El fenómeno de cremado y floculación presente en estas emulsiones sería debido a
la migración de las gotas individuales, donde Vcrem>Vfloc (figura 4.6) debido
principalmente a la baja tendencia a la formación de flóculas detctada por microscopía
(figuras 4.7 y 4.8).
Las emulsiones preparadas con UT, presentan mayor diferencia entre los diámetros
promedio D32 y D43 (Tabla 4.1), lo cual es indicativo de una mayor tendencia a la
desestabilización (Gu y col., 2005). También su mayor polidispersidad (tabla 4.1)
promueve el cremado y floculación.
En cuanto al efecto del pH, se observa una tendencia similar para las emulsiones
obtenidas por UT y USAI, la velocidad de cremado es mayor a pH3. Esto estaría
relacionado al mayor tamaño de gota obtenido a este pH.
La tabla 4.6 muestra además que la velocidad de cremado en las emulsiones preparadas
por UT como por USAI aumenta en el orden E5LV > E15LV> E50LV> E4M, lo cual
C x 102 (h-1) UT USAI
HPMC pH3 pH6 pH3 pH6
E5LV 340,6 291,9 ± 0,8 1,6 ± 0,1 1,0 ± 0,1
E15LV 154,2 ± 0,3 103,8± 1,0 1,4 ± 0,3 0,6 ± 0,1
E50LV 50,2 ± 1,1 43,0 ± 0,9 0,9 ± 0,2 0,6 ± 0,1
E4M 30,3 ± 1,5 27,2 ± 1,1 0,8 ± 0,1 0,4 ± 0,1
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
185
refleja el enorme impacto de la viscosidad de la emulsión (Tabla 4.2 y 4.4) y de la fase
continua (Tabla 2.7 y 2.8) en los fenómenos de cremado y floculación. De hecho, las
emulsiones de E4M aún teniendo un D32 mucho mayor que, por ejemplo, E5LV, crema
más lentamente por la predominancia del efecto viscoso.
4.2.3 Estabilidad frente a la coalescencia.
El párametro D43 permite estimar los procesos de coalescencia y floculación con
mayor sensibilidad. A partir de los diámetros promedio D4,3 sin y con SDS puede
determinarse el grado de floculación (GF %) y coalescencia (IC%). (Palazolo, 2006;
Relkin & Sourdet, 2005). La dilución y agitación durante la medición en el analizador
de partículas (Mastersizer 2000), disocia los flóculos formados por interacciones débiles
dejando intactos los flóculos formados por interacciones fuertes (McClements, 1999;
Palazolo, 2006).
En este contexto, es importante señalar que la presencia de flóculos no está
necesariamente relacionada con el carácter bimodal de una distribución. Por ejemplo, si
una distribución de tamaño de partícula en ausencia de SDS es monomodal no significa
la ausencia de flóculos. De la misma manera, una distribución bimodal o multimodal no
siempre indica que en la emulsión haya flóculos; los picos pueden corresponder a
distintas poblaciones de gotas individuales, las cuales se logran generalmente con
dispositivos de homogeneización de baja energía (como el Ultraturrax empleado en este
trabajo). Sólo a partir de la comparación entre las distribuciones determinadas en
ausencia y presencia de SDS es posible evaluar la existencia de flóculos. En este caso,
nuevamente hay que destacar que los flóculos detectados son estables en las condiciones
de medición (dilución y agitación) del analizador de tamaño de partícula (Palazolo,
2006). La adición de SDS previene la floculación, el SDS adsorbido le da las gotas una
carga neta negativa, lo cual previene su agregación debido a la repulsión electrostática
(Palazolo, 2006).
Las tablas 4.8 y 4.9 muestran los valores de los parámetros IC% y GF% para las
emulsiones preparadas con UT y USAI respectivamente, para E4M y E5LV como
ejemplo.
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
186
Tabla 4.8. Parámetros de desestabilización a partir del diámetro D43, para las emulsiones O/W de HPMCs al 2% preparadas con UT. IC%: coalescencia. GF%: grado de floculación. Máxima desviación estándar: 1%. Tiempo de análisis: a las 24 hs de almacenamiento.
pH3 inicial (m) sin SDS(m) con SDS (m) IC% GF%
E4M 52,210 56,815 52,821 31,100 8
E5LV 18,743 21,683 19,740 59,700 10
pH6 inicial (m) sin SDS(m) con SDS (m) IC% GF% E4M 25,411 28,123 25,781 27,000 9
E5LV 10,768 15,804 11,493 42,500 38
Tabla 4.9. Parámetros de desestabilización a partir del diámetro D43, para las emulsiones O/W de HPMCs al 2% preparadas con USAI. IC%: coalescencia. GF%: grado de floculación. Máxima desviación estándar: 1%. Tiempo de análisis: a las 24 hs de almacenamiento.
pH3 inicial (m) sin SDS(m) con SDS (m) IC% GF% E4M 1,531 1,581 1,553 2,200 2
E5LV 0,959 1,043 0,991 0,200 5,24
pH6 inicial (m) sin SDS(m) con SDS (m) IC% GF% E4M 1,370 1,372 1,372 0 0
E5LV 0,812 0,813 0,812 0 0,08
Puede observarse que para las emulsiones preparadas con UT a pH3 (tabla 4.8), hay a
las 24 hs un alto grado de coalescencia a las 24 hs, visible en su índice %C cercano a
30-60 %. Si bien hay floculación en estas emulsiones, el grado de floculación es menor
en comparación con la coalescencia presente. La mayor desestabilización reside en el
fenómeno de coalescencia. A pH6 el grado de floculación es similar al de las
emulsiones a pH3, pero la coalescencia se reduce enormemente (tabla 4.8). Para ambos
pHs, se aumenta la estabilidad con el aumento de la viscosidad de la fase continua
(mayor estabilidad para E4M).
La coalescencia puede también evidenciarse en el aumento del diámetro promedio D32
con el tiempo de almacenamiento hasta 25 días, a temperatura ambiente (tabla 4.10)
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
187
(Carrera Sanchez et al., 2005), relacionado con el tamaño promedio de todas las
partículas en la emulsión (Gu et al., 2005). El gran aumento en el D32 en las emulsiones
preparadas con UT, confirma indefectiblemente el fenómeno de coalescencia,
principalmente en las emulsiones de E5LV.
Tabla 4.10. Diámetros promedios de Sauter, D32 (m), para las emulsiones de HPMCs al 2% preparadas con UT y almacenadas a T ambiente. Desviación estándar:1%.
pH3 pH6
recién
preparada Día1 Dia5 Dia25 recién
preparada Día1 Dia5 Dia25 E4M 21,301 23,501 28,109 33,851 2,921 3,501 3,703 7,951
E5LV 1,441 2,532 10,931 28,137 1,811 2,602 5,327 9,304
Es evidente que en las emulsiones preparadas con UT, los fenómenos de
desestabilización son importantes. La coalescencia puede originarse debido a la
existencia de una población trimodal (Figura 4.1). Las gotas de mayor tamaño crecen a
expensas de las más pequeñas, debido a la ruptura del film interfacial o porque hay
zonas en la gota sin polisacárido adsorbido. La viscosidad de la fase continua es
importante en evitar que las gotas se acerquen, es por ello que las emulsiones de E4M
tienen un menor grado de coalescencia.
Se logran emulsiones más estables con USAI. La evolución del diámetro D32 para
emulsiones preparadas por USAI (Tabla 4.11), muestra que para E4M el D32
prácticamente no varía con el tiempo (25 días) mientras que lo hace ligeramente para la
emulsión de E5LV.
Tabla 4.11. Diámetros promedios de Sauter, D32 (m), para las emulsiones de HPMCs a 2% preparadas con USAI y almacenadas a T ambiente. Desviación estándar:1%.
pH3 pH6
recién
preparada Día1 Dia5 Dia25 recién
preparada Día1 Dia5 Dia25
E4M 0,804 0,834 0,830 0,883 0,798 0,718 0,771 0,773
E5LV 0,614 0,624 0,756 0,772 0,537 0,587 0,699 0,769
Sección I- Capítulo 4. Comportamiento de HPMC en emulsiones O/W
188
4.3 Conclusión.
La determinación de posibles correlaciones entre las características de las películas en
la interfase aceite-agua y las emulsiones O/W resulta de gran interés para un mejor
control de estos sistemas coloidales. El rol principal del agente emulsificante es reducir
la tensión interfacial en la interfase aceite-agua y formar una película interfacial que
proteja a las gotas de la coalescencia (Phillips, Whitehead & Kinsella, 1994).
En la bibliografía hay muy pocos trabajos que han abordado este tema. Dickinson,
(2001) estudió la influencia de las propiedades interfaciales en emulsiones estabilizadas
por proteínas lácteas y encontró que la reología superficial interfacial tiene gran
influencia en la estabilidad de estas emulsiones. Carrera Sanchez y col. (2005)
observaron una correlación entre la estabilidad de emulsiones de caseinato de sodio y la
presión superficial de equilibrio, el modulo dilatacional superficial, y la viscosidad
superficial.
El método de preparación tiene gran influencia sobre las características de las
emulsiones resultantes. Una mayor energía entregada al sistema permite obtener
emulsiones de menor diámetro de partícula y más estables, siempre que haya en la fase
continua suficiente emulsionante para cubrir esta mayor superficie creada. El tiempo
que tarda un emulsificante en adsorberse en la superficie de las gotas recién formadas
también es un factor determinante del tamaño de gota final en una emulsión
(McClements, 1999).
El efecto del pH parece ser bastante general para ambos métodos de preparación (UT
y USAI) en la emulsiones de HPMC.
A pH3 la asociación por interacciones hidrofóbicas se ve impedida por lo cual no se
forma una película elástica. Hay coalescencia entonces durante la formación de la
emulsión, resultando en mayores tamaños iniciales de gota que a pH6.
Durante el almacenamiento, las emulsiones a pH3 se desestabilizan más rápidamente,
principalmente las obtenidas por UT, ya que las obtenidas por USAI sólo muestran
cambios muy pequeños en el tiempo analizado. La mayor desestabilización a pH3
estaría relacionada con las características iniciales de la emulsión, es decir, mayor D32,
mayor índice de polidispersidad, menor elasticidad de la película interfacial y menor
viscosidad de las emulsiones o de la fase continua.
Con respecto al tipo de HPMC empleado, el diámetro inicial de las emusliones guarda
relación con el peso molecular y/o viscosidad de la HPMC, siendo las de menor peso
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
189
molecular las que generaron un menor tamaño de gota. Esta tendencia se minimiza al
utilizar USAI. Además la de menor peso molecular (E5LV) fue la HPMC que generó
películas interfaciales más elásticas por su alto grado de sustitución en grupos metilo y
bajo peso molecular que le permite un alto grado de adsorción.
Sin embargo, las HPMC de menor peso molecular presentaron mayores velocidades de
desestabilización por cremado/floculación y coalescencia reflejando la importancia de la
viscosidad de la fase continua como barrera al movimiento de las gotas de aceite
(McClements, 1999).
En conclusión, si es importante obtener un pequeño diámetro promedio, es conveniente
emplear E5LV como emulsificante, incorporando un estabilizante que aumente la
viscosidad y así enlentecer la desestabilización.
Si lo que interesa es que la emulsión sea estable en el tiempo estudiado, es conveniente
emplear a E4M como emulsificante.
CONCLUSIÓN GENERAL
Sección I
Sección I- Conclusión general
190
En esta sección se analizó el comportamiento en solución, en interfases y en emulsiones
O/W a dos pH, de distintas HPMCs con diferente peso molecular.
Los estudios realizados para caracterizar el estado de asociación/ autoensamblaje de las
HPMC, muestran que estos polisacáridos en solución presentan un comportamiento
complejo que se manifiesta en un autoensamblaje mediado por interacciones hidrofóbicas y
modulado fuertemente por el pH, como también por la concentración y la temperatura. En
particular se observa que a pH3 el autoensamblaje de HPMC se ve impedido.
El grado de asociación/autoensamblaje también puede modificarse por la aplicación de
USAI, impactando en algunas propiedades físico-químicas de las celulosas.
Las HPMC, especialmente las de bajo peso molecular, presentan una importante actividad
en la interfase aceite/ agua, la cual está modulada por el pH.
A pH ácido (pH 3) se afecta drásticamente la formación de una película interfacial
viscoelástica, reflejando el impacto del pH en el grado de autoensamblaje de las HPMC, tal
como ocurre en solución.
No obstante, debido a su buena actividad interfacial aún a pH 3, las HPMC presentan
buenas propiedades emulsificantes a ambos pH.
SECCIÓN II
Comportamiento de mezclas de
hidroxipropilmeticelulosas y
-lactoglobulina en solución,
interfases O/W y emulsiones.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
191
Introducción
Las interacciones proteína – polisacárido juegan un rol significativo en la estructura
y estabilidad de muchos alimentos procesados. El control o la manipulación de estas
interacciones macromoleculares, son un factor clave para el desarrollo de nuevos
productos alimenticios (Tolstoguzov, 1997).
Las interacciones principales entre proteínas y polisacáridos son las siguientes
(McClements, 2006):
Interacciones electrostáticas: estas interacciones son importantes para
aquellos biopolímeros que tienen una carga eléctrica bajo las condiciones de
trabajo (pH y fuerza iónica). Pueden ser atractivas o repulsivas dependiendo
si las cargas de los grupos involucrados tienen signos opuestos o similares,
respectivamente.
Volúmenes de exclusión: es una interacción repulsiva que se produce debido
al gran volumen que ocupan algunos biopolímeros en solución, produciendo
un importante efecto sobre la repulsión estérica, es decir hay una reducción
en el volumen disponible a ser ocupado por una molécula de biopolímero.
Interacciones hidrofóbicas: resultan importantes estas interacciones para
aquellos biopolímeros con grupos no polares y se manifiestan por la
tendencia que poseen los grupos no polares.
Uniones hidrógeno: estas interacciones son enlaces de hidrógeno
relativamente fuertes que ocurren en biopolímeros con segmentos a lo largo
de su cadena que pueden formar estos enlaces con los segmentos de otras
moléculas.
La importancia relativa de estas interacciones en un determinado sistema depende del
tipo de biopolímero considerado (peso, molecular, densidad de carga superficial,
flexibilidad, hidrofobicidad), de la composición de la solución (pH y fuerza iónica) y de
las condiciones del medio circundante (temperatura, cizalla) (McClements, 2006).
Manipulando estos parámetros es posible controlar las interacciones entre los
biopolímeros y, entonces, crear diferentes atributos funcionales en un sistema
alimentario.
Sección II- Introducción
192
La mezcla de proteínas y polisacáridos puede originar una fase estable o dos fases
separadas, dependiendo de la naturaleza de los biopolímeros, la composición de la
solución y las condiciones del medio circundante. La interacción entre ellos es
segregativa cuando los biopolímeros se repelen mutuamente (incompatibilidad) o
asociativa cuando los biopolímeros se atraen (de Kruif y Tuinier, 2001; Tolstoguzov,
1986, 2003).
Pueden originarse cuatro tipos de sistemas que difieren en sus estructuras y
propiedades (figura 1). En un sistema de una fase, los dos biopolímeros pueden
presentarse como moléculas individuales (cosolubilidad, sistema d, la mezcla resulta
estable debido al efecto predominante de la entropía de mezclado) o como complejos
solubles distribuidos en todo el sistema (sistema a). Este último fenómeno se da en
ciertos casos de atracción electrostática.
En un sistema de dos fases, la solución se separa en dos fases bien definidas que
presentan diferente composición de cada biopolímero. Esta separación en dos fases
puede ocurrir por dos mecanismos, separación por asociación o segregativa.
En la separación por asociación (sistema b) existe una atracción fuerte entre los dos
biopolímeros que causa una asociación entre ellos (puede ser por atracción electrostática
entre moléculas de carga opuesta). Una de las fases es rica en ambos biopolímeros
mientras que la otra es diluída en ellos. La fase que contiene a los biopolímeros puede
estar coacervada o precipitada, dependiendo de la fuerza de atracción y de la naturaleza
de los biopolímeros. Este fenómeno de complejamiento es la coacervación compleja.
En la separación segregativa hay una fuerte repulsión entre los dos biopolímeros (cargas
netas similares) (sistema c y d, conocido como incompatibilidad termodinámica).
La diferencia entre el sistema c y el sistema d reside en la concentración de los
biopolímeros. A baja concentración, los dos biopolímeros están íntimamente mezclados
y forman una fase (sistema d). Cuando se excede cierta concentración de biopolímeros,
se separa en dos fases la solución con una fase rica en uno de los bipolímeros y diluída n
el otro (sistema c) (Ledward, 1994; Samant, Singhal, Kulkarni & Rege, 1993,
McClements, 2006, deKruif y Tuinier, 2001).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
193
+
Figura 1. Representación esquemática de cuatro posibles sistemas obtenidos de la mezcla de soluciones de proteína y polisacárido (Tolstoguzov, 1997, McClements, 2006).
El término “compatibilidad entre biopolímeros” implica miscibilidad de diferentes
biopolímeros a nivel molecular. El proceso de mezcla de dos biopolímeros es
espontáneo si el cambio en la energía libre de Gibbs de la mezcla ̈GM¨ es negativo:
GM = HM - TSM 0
donde HM y SM son la entalpía y la entropía de mezcla, respectivamente, y T es la
temperatura absoluta.
La incompatibilidad termodinámica se presenta cuando GM 0. SM depende del
volumen molar, la forma, el tamaño, la flexibilidad y de la fracción de cada componente
en la mezcla. El cambio entrópico es levemente positivo en mezclas de polisacáridos de
largas cadenas y proteínas globulares compactas. El cambio entálpico, basado en
Solución de
proteína
Solución de
polisacárido
INTERACCIONES
ATRACTIVAS
INTERACCIONES
REPULSIVAS
Complejamiento Baja
concentración
Alta
concentración
1 fase 2 fases 2 fases 1 fase
(a) Complejo
soluble
(b) Coacervado o
precipitado
(c) incompatibilidad (d) Cosolubilidad
Sección II- Introducción
194
fuerzas repulsivas y atractivas será entonces determinante de la compatibilidad del
sistema. El mismo está determinado por la magnitud de varias interacciones
intermoleculares existentes en la mezcla acuosa de biopolímeros: polímero1 – solvente;
polímero2 – solvente; polímero1 – polímero1; polímero2 – polímero2 y solvente –
solvente (Schmitt, Sanchez, Desobry – Banon & Hardy, 1998; Tolstoguzov, 1997).
Formación de complejos electrostáticos (coacervación compleja)
Las interacciones macromoleculares involucradas en la formación de complejos
pueden ser de tres tipos: a) entre macroiones, b) entre grupos con cargas opuestas
(ácidos y básicos) y c) entre otros grupos disponibles de los macroiones. En el primer
caso, la carga neta, forma, tamaño y flexibilidad de las macromoléculas son
importantes, mientras que en los otros casos es importante la reactividad de los grupos
de los residuos de aminoácidos disponibles en la superficie exterior de la molécula
proteica y de las unidades de azúcares de las cadenas de los polisacáridos (Tolstoguzov,
1997).
La formación de complejos electrostáticos es usualmente un proceso reversible que
depende del pH y la fuerza iónica del medio, entre otros factores y está favorecida
cuando los componentes presentan cargas opuestas (Tolstoguzov, 1997).
Durante la formación de los complejos electrostáticos, la carga neta disminuye,
reduciéndose la hidrofilicidad y la solubilidad del complejo. Las partículas dispersas de
complejo insoluble se agregan y precipitan. Existen diversas técnicas para caracterizar
la estructura de complejos proteína - polisacárido: CD (dicroismo circular); SANS
(dispersión de neutrones en ángulos pequeños); IR (espectroscopía infrarroja); NMR
(resonancia magnética nuclear); DSC (calorimetría diferencial de barrido); DLS
(dispersión de luz).
Algunas aplicaciones industriales de complejos proteína – polisacárido son la
purificación de macromoléculas (ej. proteínas); microencapsulación, cosméticos,
farmacia y medicina; ingredientes alimenticios: sustitutos de grasas, aceites, crema,
análogos de carne, biomateriales: formación de películas comestibles,
empaquetamiento, injertos y bioprótesis en medicina (Schmitt y col., 1998). En
alimentos se aplican en la estabilización de productos lácteos procesados, inhibición de
la precipitación de proteínas (en bebidas lácteas saborizadas), recuperación de proteínas
(de plasma y lácteas), estabilización de calcio en proteínas vegetales sensibles al calcio,
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
195
formación de geles, concentración y purificación de proteínas, texturización de
proteínas, extrusión termoplástico (Samant y col., 1993).
Incompatibilidad termodinámica
Este fenómeno se observa en condiciones en las cuales la formación de complejos
está inhibida y se promueve la asociación entre macromoléculas del mismo tipo
(sistema c y d). La Figura 2 representa un diagrama de fases de la mezcla de soluciones
de proteína y polisacárido. La región debajo de la curva binodal, corresponde a una
única fase formada por una solución de ambos biopolímeros, mientras que la región
superior representa un sistema de dos fases.
Figura 2. Composición de fases en un sistema termodinámicamente incompatible agua- proteína-polisacárido.
La fase A, rica en proteína (Pr), contiene una fracción en peso 1w de proteína y 2w
de polisacárido (Ps). La fase B, rica en polisacárido, contiene una fracción en peso 1w
de proteína y 2w de polisacárido. El punto I corresponde a la composición global del
sistema (Pr= 1w y Ps= 2w ). La longitud de las líneas AI y BI son proporcionales a las
fracciones de los volúmenes de las fases de A y B respectivamente. Las líneas de unión
TM Curva binodal
Líneas de unión
A
B
I
Ps %p/ p
Pr %p/ p 1w
2w
2w
2w
1w
1w
PM
Sección II- Introducción
196
vinculan la composición de las fases coexistentes. TM y PM significan miscibilidad
total y parcial respectivamente (Dickinson & McClements, 1995).
A una concentración total de biopolímero alta (en general mayor a un 4%) las
soluciones acuosas de diferentes biopolímeros se separan en dos fases, que coexisten en
equilibrio, formándose una emulsión agua / agua, la cual presenta una tensión interfacial
muy baja, debido a la significativa co-solubilidad y a tener ambas fases el mismo
solvente (agua). Un fenómeno de limitada compatibilidad termodinámica se presenta a
bajas concentraciones, por debajo de la curva binodal, observándose una co-solubilidad
parcial. La incompatibilidad entre los biopolímeros incrementa la actividad
termodinámica, es decir la concentración efectiva y el potencial conformacional de
ambos. El potencial conformacional puede definirse como la habilidad de una proteína
para formar uniones intermoleculares que contribuyen a potenciar propiedades físico –
químicas, reológicas y estructurales (por ej. la formación de geles, estabilización de
espumas y emulsiones) (Tolstoguzov, 1993).
Usualmente existe cierto grado de asimetría en los diagramas de fase, presentándose
una diferencia de escala entre el eje de las concentraciones de proteína y de
polisacárido, siendo la concentración de la proteína en la fase A mayor que la del
polisacárido en la fase B (1w 2w ). La asimetría puede atribuirse al mayor volumen
molecular ocupado por el polisacárido expandido con respecto al componente proteico
más compacto e hidrofóbico (Tolstoguzov, 1986).
La interacción de los biopolímeros entre sí y con el solvente puede describirse
cuantitativamente por los valores del segundo coeficiente del virial (Apr-w, Apr-pr, Aps-w y
Aps-ps) y del valor de cruce del segundo coeficiente del virial (A pr-ps), según: pspsprprprprprprprpr mAmAmmRT 00 /ln , donde es el potencial químico y
mi son las concentraciones molales (una expresión análoga existe para el polisacárido).
Si Apr-ps es positivo, indica interacciones termodinámicas desfavorables. La exclusión
de las moléculas de un biopolímero del volumen de solución ocupado por las moléculas
del otro biopolímero (denotando incompatibilidad), reduce la entropía de mezcla. Si el
valor de Apr-ps es negativo, es indicativo de mutua atracción y miscibilidad,
disminuyendo (Grinberg & Tolstoguzov, 1997; Semenova, 1996; Tolstoguzov, 1997).
La incompatibilidad de los biopolímeros depende de la intensidad de las
interacciones entre ellos, entre las moléculas de cada uno consigo mismas y con el
solvente (diferencias en la hidrofilicidad de los biopolímeros). A una concentración total
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
197
de biopolímero moderada, la separación del sistema en dos fases depende de la carga
del biopolímero, del pH y la fuerza iónica, siendo el factor entrópico determinante en la
posibilidad de dicha separación (Alves, Antonov & Gonçalves, 1999). Otros factores
también influyen sobre la incompatibilidad, la cual puede aumentar por: i) el aumento
del peso molecular y la rigidez estructural de los biopolímeros; ii) la desnaturalización
de proteínas globulares debido al incremento de la hidrofobicidad y al tamaño de las
cadenas polipeptídicas agregadas; iii) aumento de la concentración de sales y de la
temperatura (Tolstoguzov, 1997). Los polisacáridos con estructura lineal presentan
mayor incompatibilidad que los de estructura ramificada, y disminuye la
incompatibilidad en el orden polisacáridos con grupos carboxilo neutros sulfato
(Grinberg y col., 1997). La compatibilidad termodinámica también varía por la
presencia de otros componentes como moléculas lipofílicas y de sacarosa, los cuales
presentan en general un efecto negativo y positivo respectivamente (Semenova, 1996).
Distintos métodos pueden aplicarse para determinar la incompatibilidad
termodinámica en sistemas acuosos: determinación de los segundos coeficientes del
virial por dispersión de luz, variaciones en índices de refracción, modificaciones en
termogramas obtenidos por DSC, calorimetría diferencial de mezcla (medición de la
variación entálpica por mezcla de soluciones de ambos biopolímeros) (Semenova y col.,
1999).
La incompatibilidad termodinámica presenta numerosas aplicaciones: concentración
de soluciones proteicas por “ósmosis sin membrana”, fraccionamiento de biopolímeros,
cambios en las propiedades funcionales de las macromoléculas donde la actividad
termodinámica de cada componente aumenta en la mezcla, comportándose como si
estuvieran en soluciones de mayor concentración.
CAPÍTULO 1
Caracterización de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosa y
lactoglobulina en solución y en la interfase O/W.
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
198
1.1 Comportamiento de soluciones mixtas de HPMCs y lg a pH3 y pH6.
Cuando se mezcla una proteína (PR) globular, como la lg, y un polisacárido (PS), la
interacción resultante depende fuertemente del pH, fuerza iónica y proporción de cada
biopolímero en la mezcla. En esta sección, se estudiaron mezclas de HPMC (E5LV) y lg a
bajas concentraciones totales (máximo 2%p/p) a pH3 y pH6.
A pH3 la proteína está cargada positivamente (pH< pI) y a pH6 negativamente. Las HPMcs
son polisacáridos no iónicos, por lo cual no se ven afectados mayoritariamente por cambios en
el pH. Sin embargo, como se mostró en el capítulo 1 de la sección I, a pH3 las HPMCs están
principalmente presentes en solución en forma monomérica y poseen una carga neta negativa
pequeña. A pH6 en cambio, presenta una pequeña carga positiva y fuerte tendencia a
autoensamblarse formando clusters.
A pH6, por encima del punto isoeléctrico (pI) de la proteína existe una limitada
compatibilidad termodinámica entre la proteína y el polisacárido, debido a interacciones de
repulsión y una afinidad diferente con el solvente (Martinez y col., 2007; Tolstoguzov, 1997).
A este pH, en la región de bajas concentraciones, la proteína y el polisacárido pueden
coexistir en una sola fase (miscibilidad) (sistema d, figura 1, Introducción Sección II) pero
en dominios en los cuales se excluyen mutuamente. Trabajos anteriores (Perez y col, 2008;
Jara y Pilosof, 2009) han mostrado que a pH6 a estas concentraciones no hay separación de
fases. A pH3 en cambio, las mezclas de HPMC y proteínas del suero lácteo son compatibles
aún a altas concentraciones (Jara y Pilosof, 2009).
La figura 1.1 muestra las curvas de distribución por intensidad de mezclas en donde el
polisacárido está presente en igual concentración que la proteína y donde uno de los dos
biopolímeros se encuentra en exceso.
Cuando se observa la distribución por intensidad de tamaños de la lg sola (figura 1.1), se
aprecia una distribución trimodal, con una población mayoritaria (I) cuyo tamaño varía entre
los 2 nm y los 10 nm, con un máximo en los 4 nm para pH3 (figura 1.1A), y a los 3 y los 15
nm, con un máximo en los 6 nm para pH6 (figura 1.1B). Estos tamaños son consistentes con
la presencia de monómeros a pH3 y dímeros a pH6 (Phillips y col., 1994; Griffin y Griffin,
1993; Harnsilawat y col., 2006; Hoffmann y van Mil, 1999; Mc Kenzie y Sawyer, 1967;
Mulvihill y Donovan, 1987).
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
199
0.1 1 10 100 10000
2
4
6
8
10
12
14
16
Inte
nsid
ad (
%)
tamaño (d.nm)
I
II
III
(A)
0.1 1 10 100 10000
2
4
6
8
10
12
14
16
Inte
nsi
dad
(%
)
tamaño (d.nm)
I
II
III
(B)
Figura 1.1. Distribución del tamaño de partícula por intensidad para mezclas de E5LV: lg , 1%: 1%
(鏡), 1%:0,5% (▼), 0,5%: 1% (◄) a pH3 (A) y pH6 (B). lg sola: 0,5 % (強), 1% (○). Temperatura 25°C.
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
200
Figura 1.2. Distribución del tamaño de partícula por volumen para cada mezclas de lg: E5LV a pH3 en comparación con los biopolímeros solos, (A) mezcla 1%:1%, (B) 0,5%:1%. (C) 1%: 0,5%. lg sola
(強), E5LV solo (峡) mezcla (◨).Temperatura 25°C.
1 10 100
tamaño (d.nm)
(B)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Vol
um
en
(%)
(A)
1 10 1000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Vo
lum
en
(%
)
tamaño (d.nm)
(C)
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
201
Figura 1.3. Distribución del tamaño de partícula por volumen para cada mezcla de lg: E5LV a pH6
en comparación con los biopolímeros solos, (A) mezcla 1%:1%, (B) 0,5%:1%.,(C) 1%: 0,5%. lg sola
(強), E5LV solo (峡) mezcla (◨).Temperatura 25°C.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
volu
men (
%)
(A)
1 10 1000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
vo
lum
en (
%)
tamaño (d.nm)
(C)1 10 100
tamaño (d.nm)
(B)
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
202
Hay que tener en cuenta, que al ser una población con una amplia distribución de tamaños,
también se encuentran en menor proporción agregados de lg de mayor tamaño. En la
bibliografía se han encontrado la presencia de agregados a estos pH (Bauer y col., 1998;
Verheul y col., 1998).
En las mezclas con HPMC a ambos pH, se observa que el pico correspondiente a la lg se
hace menor con respecto a la intensidad de la luz dispersada y aparecen poblaciones entre los
20 nm y 800 nm (población II y III, figura 1.1), ausentes o presentes en menor proporción en
la solución de proteína sola (figura 1.1).
Al analizar las curvas de distribución por volumen (figura 1.2 y figura 1.3), se observa que los
agregados II y III no representan gran proporción con respecto a la población total de
partículas, ya que no están presentes en la distribución por volumen de las mezclas, son
despreciables cuantitativamente. La mayoría de las partículas se encuentran por debajo de los
100 nm.
En la figura 1.2 se muestra la distribución de tamaños de partícula por volumen para cada
mezcla en comparación con los componentes solos a pH3. En las mezclas lg:E5LV 0,5%/1%
y 1%/0,5% (figuras 1.3B y C) se observa claramente que los picos correspondientes a E5LV
monomérico no están presentes en la mezcla así como tampoco parte del pico correspondiente
a la lg sola, desplazándose la curva de las mezclas hacia tamaños mayores. En todos los
casos se observa la desaparición de las formas autoensambladas de E5LV (pico de mayor
tamaño en la distribución de E5LV solo).
La figura 1.3 muestra la comparación entre las distribuciones de las mezclas y los
componentes solos a pH6. A este pH predomina la forma dimérica de la lg mientras que
E5LV está presente en formas autoensambladas (capítulo 1, sección I).
La curva de distribución de tamaños para las mezclas se sitúa en todos los casos entre las de
los componentes solos, lo cual en principio indicaría la ausencia de interacciones.
En el capítulo 1 de la sección I, se analizó el coeficiente de difusión molecular (D) calculado
por DLS. Este coeficiente relaciona la movilidad de las moléculas en el seno de la solución y
está directamente relacionado con el tamaño molecular. Un menor valor en D, indica una
menor difusión en la solución, relacionado con un aumento en el tamaño molecular.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
203
En la figura 1.4 se muestran en forma comparativa los coeficientes de difusión (D) de los
componentes solos y las mezclas a pH3. Salvo en el caso de la mezcla lg:E5LV 1%:1%
donde el valor de D se acerca a un promedio aritmético, en las otras mezclas el valor de D es
mucho menor a lo esperado si no existieran interacciones, lo cual indica la formación de
partículas más grandes a expensas de las partículas más pequeñas (lg y E5LV
monoméricos).
A pH6 (figura 1.5) sólo se observa una tendencia a la formación de partículas de mayor
tamaño (menor D) en la mezcla lg: E5LV 0,5%:1%. En los otros casos el valor de D de las
mezclas presenta un comportamiento intermedio a los componentes solos.
Figura 1.4. Coeficientes de difusión, D (m2/s) para mezclas de lg: E5LV a pH3. M: mezcla. (….)
lg1%, E5LV1%, M: 1%:1%.(峡) lg0,5%, E5LV1%, M: 0,5%:1%. (//) lg 1%, E5LV0,5%, M: 1%:0,5%. Desviación estándar máxima: 0,5%.
Dos posibles fenómenos podrían explicar los resultados anteriores:
(a) La formación de complejos entre la lg y E5LV.
(b) La agregación de la lg debido a la presencia del polisacárido, producto de una
limitada compatibilidad termodinámica entre ambos biopolímeros.
Dado el carácter no iónico de las HPMC, la formación de complejos electrostáticos no debería
ser muy factible. Sin embargo a pH3 se evidencia un complejamiento que podría ocurrir por
lg E5LV M lg E5LV M lg E5LV M0
10
20
30
40
D ( m
2 /s)
lg E5LV M lg E5LV M lg E5LV M
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
204
interacción de la lg cargada positivamente con la HPMC que presenta una ligera carga
negativa. A pH6 los resultados de DLS no arrojan una evidencia de complejamiento.
Figura 1.5. Coeficientes de difusión, D (m2/s) para mezclas de lg: E5LV a pH6. M: mezcla. (….)
lg1%, E5LV1%, M: 1%:1%.(峡) lg 0,5%, E5LV1%, M: 0,5%:1%. (//) lg 1%, E5LV0,5%, M: 1%:0,5%. Desviación estándar máxima: 0,5%.
Pérez y col., (2007) al estudiar la interacción entre concentrado de suero lácteo y HPMC,
sostienen que el fenómeno de formación de complejos entre la proteína y el polisacárido es
menos probable a pH6 por estar la proteína por encima de su punto isoeléctrico.
Martínez y col (2007) y Tolstoguzov (1997) afirman que por encima del punto isoeléctrico de
la proteína, existe una limitada compatibilidad termodinámica con el polisacárido debido a
diferentes afinidades de los biopolímeros por el solvente.
Para comprobar la afirmación anterior, se midió también el potencial zeta en la mezcla de
E5LV 1% + lg 1% como ejemplo y se lo comparó con la carga neta superficial obtenida para
los biopolímeros solos a ambos pHs. Los resultados se muestran en la tabla 1.1.
McClements y col., (2008) emplearon esta técnica para verificar la interacción entre lg y
pectinas a distintos pH y concentraciones.
lg E5LV M lg E5LV lg E5LV 0
10
20
30
40D
(m
2 /s)
lg E5LV M lg E5LV M lg E5LV M
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
205
Gu y col., (2005) al estudiar la influencia del pH en la interacción entre carragenanos y lg
en emulsiones, también emplearon la técnica de potencial zeta para corroborar el grado de
interacción entre los biopolímeros.
Tabla 1.1. Potencial zeta determinado en soluciones de lg y en mezclas con E5LV.
potencial zeta (mV)
pH3 pH6
lg 1% 9,33 0.10 -10.60 0.08 E5LV 1% -1,71 0.05 0,78 0.10
lg 1% /E5LV 1% 7,49 0.10 -10.30 0.05
Puede observarse que la proteína presenta carga positiva a pH3, lo cual hace posible el
complejamiento con la HPMC que presenta carga neta negativa a este pH.
En la mezcla analizada el valor del potencial se hace menor al de la proteína sola, por lo tanto
puede inducirse que ocurre interacción electrostática entre ambos biopolímeros.
A pH6 no hay cambios apreciables en el valor del potencial zeta en la mezcla. Por lo que
tanto la proteína y el polisacárido estarían presentes en la mezcla en dominios en los cuales
ambos polímeros se excluyen mutuamente debido a una limitada compatibilidad
termodinámica.
Samant y col., (1993) sostienen que cuando más cerca se está del punto isoeléctrico de la
proteína (en este caso sería pH6), se observa que disminuye la compatibilidad termodinámica
de la proteína con un polisacárido neutro (como es el caso de las HPMC en el presente
trabajo).
Ganzevles y col., (2007) encontraron que un aumento en el radio hidrodinámico como
también una reducción en la carga neta negativa eran indicativos de la formación de
complejos entre lg y pululanos a pH 4,5 (pH<pI).
Jara y Pilosof (2009) al estudiar la interacción entre HPMC y WPC (concentrado de suero
lácteo) por microscopia confocal y por DSC, encontraron que a pH 3 las mezclas presentaban
una sola Tg indicando que son compatibles aún a mayores concentraciones que las de este
trabajo. Esto pudo ser comprobado por microscopía confocal donde también, tanto la proteína
como el polisacárido se encuentran en una fase. A pH6 se observaron dos Tg indicando que
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
206
ambos biopolímeros coexisten en fases separadas, aún sin separación macroscópica. Lo
mismo pudo verse en las imágenes microscópicas.
1.2 Comportamiento de mezclas de HPMCs y lg en la interfase aceite- agua.
1.2.1 Dinámica de adsorción y características viscoelásticas de las películas a pH6.
El estudio de la interacción entre proteínas y polisacáridos a nivel interfacial es de gran
importancia dado la implicancia directa en las propiedades de emulsificación, como se analizó
para el caso de las emulsiones estabilizadas sólo por HPMCs (capítulo 4).
Como la lg y también la HPMC poseen actividad interfacial, ambos competirán por la
interfase.
Las figuras 1.6 y 1.7 muestran la evolución de la presión interfacial en función del tiempo de
adsorción para mezclas de E5LV y lg a pH6. Las concentraciones de cada biopolímero son
capaces de saturar la interfase O/W (Pérez y col., 2007).
La dependencia de la presión interfacial con el tiempo, mostró que la adsorción en la
interface aceite- agua comienza con una rápida difusión de los biopolímeros a la interfase.
A pH6 en las mezclas de 0.5%/0.5% (Figura 1.6A) y 1%/1% (Figura 1.6B), la actividad
interfacial es dominada por la HPMC en los primeros instantes (t2000s). Luego, la actividad
de la mezcla presenta comportamiento similar al de くlg sola, indicando que la HPMC es
desplazada de la interfase.
En la mezcla de 2%/2% (Figura 1.6 C), existe un efecto ligeramente sinérgico entre los dos
biopolímeros en todo el rango de tiempo estudiado, con predominio de la くlg en la interfase
O/W.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
207
Figura 1.6. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para mezclas en igual
concentración de lg y E5LV en la interfase aceite-agua a pH6. (A) mezclas de 0,5% de cada biopolímero. (B) mezclas de 1% de cada biopolímero (C) mezclas de 2% de cada biopolímero (D)
comparación distintas mezclas. E5LV (峡) y lg (強).mezclas de lg y E5LV (◨). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Es decir, en todos los casos la proteína predomina en la interfase O/W. Según Graham y
Phillips (1979), hay mayor desplegamiento de la lg (proteína globular) en la interfase O/W,
con mayor exposición de los grupos hidrofóbicos antes ocultos desarrollando una mayor
presión superficial que en la interfase aire-agua.
Se ha informado anteriormente que la lg presenta una menor actividad interfacial que las
HPMCs la interfase A/W. Tal es el caso de Pérez y col. (2007) al estudiar la adsorción de
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
(mN
/m)
(mN
/m)
(A)
(mN
/m)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000 2000 4000 6000 8000 10000 120000 2000 4000 6000 8000 10000 12000
tiempo (s)
(B)
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
(mN
/m)
tiempo(s)
(C)
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
208
mezclas de distintas HPMC con concentrado de proteínas del suero lácteo. Martinez y col.
(2007) también llegaron a la misma conclusión al estudiar la adsorción de proteínas de soja
con distintos polisacáridos, entre ellos HPMC.
En el presente trabajo, la fase hidrofóbica la constituye el aceite y previamente se ha discutido
(capítulo 3, sección I) que es un mejor solvente para los grupos hidrofóbicos de los
biopolímeros. Entonces, es de esperarse un mayor desplegamiento de esta proteína globular
con una mayor presión superficial en la interfase O/W que en la interfase A/W. Por otro lado
se ha mostrado en la sección I que las HPMCs son menos activas en la interfase O/W que en
A/W.
El efecto sinérgico obtenido para las mezclas al 2% (Figura 1.4C) podría deberse a la
limitada compatibilidad termodinámica entre ambos biopolímeros que prevalece cuando
mayor es la concentración (Pérez et al., 2007).
Cuando se analiza la adsorción en la interfase O/W de mezclas de lg y E5LV en distinta
concentración, se obtienen resultados similares (figura 1.7), es decir, la presión de la mezcla
es dominada por la くlg.
Los resultados en ambos casos indican que la proteína desplaza al polisacárido de la
interface aceite- agua a tiempos superiores a 2000s, aún cuando la misma esté presente en la
mezcla a menor concentración que la HPMC.
Figura 1.7. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para mezclas en distinta
concentración de lg y E5LV en la interfase aceite-agua a pH6. (A) mezclas de lg 1% +E5LV 0,5%
0 2000 4000 6000 8000 10000 1200002468
1012141618202224262830
(mN
/m)
tiempo (s)
(A)
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000tiempo(s)
(B)
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
209
(B) mezclas de lg 0,5% + E5LV 1%. E5LV (峡) y lg (強).mezclas de lg y E5LV (◨). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
La figura 1.8 muestra la evolución con el tiempo del módulo elástico dilatacional (Ed) para
las mezclas de E5LV y lg a pH6.
Figura 1.8. Evolución del módulo elástico dilatacional, Ed, con el tiempo de adsorción a pH6 para
mezclas de lg y E5LV (◨), (A) 0,5%:0,5%, (B) 1%: 1%, (C) 0,5%:1% (D) 1%: 0,5%. En todos los
casos, se compara con los componentes solos. E5LV (峡) y lg (強). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
Ed(
mN
/m)
Ed(
mN
/m)
tiempo(s)
Ed(
mN
/m)
(A)
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
0
5
10
15
20
25
30
35
Ed
(mN
/m)
Ed
(mN
/m)
tiempo (s)
(B)
0 2000 4000 6000 8000 100000
5
10
15
20
25
30
35
0 2000 4000 6000 8000 100000
5
10
15
20
25
30
35
0 2000 4000 6000 8000 100000
5
10
15
20
25
30
35
Ed(
mN
/m)
(C)
tiempo(s)
0 2000 4000 6000 8000 100000
5
10
15
20
25
30
35
0 2000 4000 6000 8000 100000
5
10
15
20
25
30
35
0 2000 4000 6000 8000 100000
5
10
15
20
25
30
35
Ed
(mN
/m)
tiempo(s)
(D)
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
210
La lg sola forma películas muy elásticas aún a tiempos muy cortos de adsorción (t< 200s)
llegando a tiempos largos a valores de Ed entre los 25 y 35 mN/m, dependiendo de la
concentración en el seno de la solución. Por otro lado, E5Lv forma películas de muy baja
elasticidad (Ed 5-7 mN/m) dependiendo de la concentración.
El comportamiento de las películas mixtas muestra un mayor predominio de la proteína en el
carácter elástico de la película a tiempos largos de adsorción. La lg tiene mayor actividad
superficial (figuras 1.6 y 1.7) y mucho mayor carácter elástico en comparación con el
polisacárido, por lo tanto domina la interfase a este pH.
La evolución en la estructura de las películas interfaciales determinada mediante la
evolución de la viscoelasticidad relativa de la película (tg ) se muestra en la Figura 1.9 para
pH6.
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
(A)
tg
tiempo (s)0 2000 4000 6000 8000 10000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 100000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 100000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
tiempo(s)
(B)
tg
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
211
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
tg
tiempo (s)
(D)
Figura 1.7. Evolución de la viscoelasticidad dilatacional, tg , con el tiempo de adsorción a pH6 para
mezclas de lg y E5LV (◨), (A) 0,5%:0,5%, (B) 1%: 1%, (C) 0,5%:1% (D) 1%: 0,5%. En todos los
casos, se compara con los componentes solos. E5LV (峡) y lg (強). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Puede verse que en todos los casos, el carácter viscoelástico de las películas en las mezclas
está dominado por la proteína, con carácter tipo gel (tg < 0,2).
Martinez, Carrera Sanchez, Pizones Ruiz-Henestrosa, Rodríguez Patino y Pilosof (2007) y
Pérez, Carrera-Sánchez, Rodríguez-Patino y Pilosof (2007) encontraron que tanto el carácter
sólido de la película como su viscoelasticidad relativa, estaban dominadas por la HPMC y no
por la proteína, principalmente antes de los 8000 s de adsorción. Como se discutió
previamente, la fase aceite ofrece mejor solvatación que la fase aire para los grupos
hidrofóbicos de la proteína globular. Esto le permite desarrollar mayor carácter elástico (Ed) y
mayor carácter gel que en la interfase aire, incluso muy por encima de los valores obtenidos
por el polisacárido (figuras 1.6, 1.7, 1.8 y 1.9).
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
tiempo (s)
(C)
tg
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
212
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
(mN
/m)
(C)
(mN
/m)
tiempo(s)
(mN
/m)
1.2.2 Dinámica de adsorción y características viscoelásticas de las películas a pH3.
La figura 1.10 muestra la evolución de la presión interfacial en función del tiempo de
adsorción para mezclas de E5LV y lg a pH3.
Figura1.10. Presión interfacial en función del tiempo de adsorción para mezclas de lg y E5LV en la
interfase aceite-agua a pH3. (A) mezclas de 1% de cada biopolímero (B) mezclas de lg 1% + E5LV
0,5%. (B) mezclas de lg 0,5% + E5LV 1%. E5LV (峡) y lg (強).mezclas de lg y E5LV (◨). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Al igual que a pH6, analizando los componentes solos a pH3, el polisacárido presenta menor
presión superficial que la lg en todas las concentraciones estudiadas (Figuras 1.10). Sin
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
(mN
/m)
tiempo(s)
(A)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
(B)
(mN
/m)
tiempo(s)
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
213
embargo a este pH la lg domina la presión interfacial sólo en el sistema 1%:1%. En las otras
mezclas domina E5LV.
Como se discutió previamente, tanto la proteína como el polisacárido, se encuentran en
solución en forma monomérica mayoritariamente a pH3 y posiblemente interactúen
electrostáticamente (formación complejos) debido a sus cargas netas opuestas, lo cual se
evidenció en las mediciones de potencial zeta (tabla 1.1) y en la distribución de tamaños de
partícula.
El complejamiento de estos biopolímeros, tendría efectos antagónicos sobre la adsorción de la
lg en la mezcla, impidiendo que la misma domine la interfase en los sistemas mixtos.
La figura 1.11 muestra la evolución con el tiempo del módulo elástico dilatacional (Ed)
para las mezclas de E5LV y lg a pH3.
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ed(
mN
/m)
(A)
Ed(
mN
/m)
tiempo(s)
Ed(
mN
/m)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ed(
mN
/m)
tiempo(s)
(B)
Ed(
mN
/m)
Ed(
mN
/m)
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
214
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
tiempo (s)
(B)
tg
Figura 1.11. Evolución del módulo elástico dilatacional, Ed, con el tiempo de adsorción a pH3 para
mezclas de lg y E5LV (◨), (A) 1%: 1%, (B) 0,5%:1% (C) 1%: 0,5%. En todos los casos, se compara
con los componentes solos. E5LV (峡) y lg (強). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Para todas las mezclas, se obtiene un módulo elástico con valor igual al polisacárido (figura
1.11C) o entre el valor de los biopolímeros solos (figura 1.11 A y B).
La evolución en la estructura de la película de las mezclas, se observa también en la
viscoelasticidad relativa de la película (tg ) en la Figura 1.12.
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ed
(mN
/m)
tiempo(s)
(C)
Ed
(mN
/m)
Ed
(mN
/m)
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
tiempo(s)
tg
(A)
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
215
Figura 1.12. Evolución de la viscoelasticidad dilatacional, tg , con el tiempo de adsorción a pH3 para
mezclas de lg y E5LV (◨), (A) 1%: 1%, (B) 0,5%:1% (C) 1%: 0,5%. En todos los casos, se compara
con los componentes solos. E5LV (峡) y lg (強). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Los valores indican que en las mezclas 1%:1% y 0,5%:1% se forman películas
viscoelásticas (tg 0,3) (figura 1.10 A y B). En la mezcla de lg/E5LV 1%/0,5% se forma
una película viscoelástica (tg <1) en los primeros tiempos de adsorción (t< 4000 s), luego
la viscoelasticidad relativa revela que las mezclas tienen poca estructura de gel (tg
figura 1.12Cen forma similar al polisacárido solo.
1.3 Conclusión.
Los resultados obtenidos a pH6 indican que tanto la presión interfacial como el carácter
elástico de la película interfacial en las mezclas (Ed), son dominados por la proteína la cual
guarda relación con que la lg es más activa interfacialmente y forma películas muy elásticas
(valores altos de Ed) que impediría la adsorción del polisacárido.
0 2000 4000 6000 8000 100000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
tg
tiempo(s)
(C)
Sección II- Capítulo 1.Caracterización de mezclas de HPMC y lg en solución y en interfases O/W
216
A este pH en trabajos previos (Jara y col, 2009; Perez y col, 2008) se ha reportado que
existe incompatibilidad entre las HPMC y la lg, que se manifiesta a altas concentraciones
como una separación de fases.
En las concentraciones estudiadas en el presente trabajo, no se observó una separación
macroscópica de fases, no obstante existe un fenómeno de exclusión a nivel molecular.
Los resultados de DLS, avalan esta situación ya que no se observan la aparición de partículas
de mayor tamaño en las mezclas (por ejemplo, debido a la formación de complejos) (figura
1.3).
A pH3 se observa otra interacción entre los biopolímeros. Si bien la lg presenta mayor
actividad interfacial y forma películas interfaciales muy elásticas, en ningún caso domina el
comportamiento interfacial como lo hace a pH 6. La presión interfacial como el carácter
elástico de la película interfacial, se ven influenciados por la presencia del polisacárido en la
mezcla (figuras 1.10 y 1.11).
En general, lo que se observa a pH3 es que la presencia del polisacárido en la mezcla, inhibe a
la lg en la formación de una película elástica. Puede verse en la mezcla 1%:0,5% que el
pobre carácter elástico de la mezcla está determinado por el polisacárido, aún cuando la
proteína puede formar películas muy elásticas (alto valor de Ed). Es decir, la proteína ve
impedida su interacción en la interfase aceite-agua.
Este comportamiento altamente antagónico se observa también en la siguiente figura para
mezclas 0,5%:0,5%.
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
tiempo(s)
(mN
/m)
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
217
Presión interfacial en función del tiempo de adsorción .E5LV (峡) y lg (強).mezclas de lg y E5LV
(◨). Temperatura 20 ºC y I = 5mM.
Puede verse que tanto la presión superficial como el carácter elástico de la película, están
dominados por el polisacárido en la mezcla.
Este comportamiento puede ser atribuido a la formación de complejos entre ambos biopolímeros lo
cual bloquearía las regiones de la proteína que pueden interactuar en la formación de una película
interfacial elástica (formación de geles). El antagonismo parece ser máximo cuando E5LV se
encuentra a 0,5% en la mezcla, lo cual puede estar relacionado al predominio de la forma monomérica,
mayormente en las concentraciones menores (capítulo 1, sección I), que sería la que interactúa con la
lg.
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 2000 4000 6000 8000 10000 120000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ed(
mN
/m)
Ed(
mN
/m)
Ed(
mN
/m)
tiempo (s)
CAPÍTULO 2
Comportamiento de mezclas de hidroxipropilmetilcelulosas
y β−lactoglobulina en emulsiones O/W.
Sección II- Capítulo 2.Comportamiento de mezclas de HPMC y βlg en emulsiones O/W
218
0.01 0.1 1 10 1000
2
4
6
8
10
Volu
men
(%
)
tamaño (μm)
I
II
2.1. Características iniciales de las emulsiones de mezclas de E5LV y βlg.
En este capítulo, se estudió principalmente el efecto del pH (3 o 6) en las propiedades
de emulsiones O/W 10/90 respectivamente, formadas a partir de mezclas de βlg 1%: E5LV
1%, siendo la concentración total de biopolímeros 2%.
Se ha mostrado anteriormente que el pH tiene un alto impacto en el estado de asociación
de las HPMCs y en su interacción con la βlg, afectando el comportamiento interfacial.
En la figura 2.1 se muestra la distribución de tamaños de gotas para las emulsiones O/W,
preparadas con USAI a pH3 y pH6.
Figura 2.1. Distribución del tamaño de gota por volumen (%) para emulsiones O/W de βlg 1% +
E5LV 1% a pH3 (■) y pH6 (●)
Las curvas de distribución de gotas para ambas emulsiones son similares, con una
distribución bimodal, indicando que son emulsiones polidispersas. El tamaño de gotas está
comprendido entre 0,1 μm y 5 μm para pH3 y 0,1 μm y 6 μm para pH6.
La población II es mayoritaria en volumen, aunque cuando se analiza la distribución en
número (no mostrada), ésta representa sólo una pequeña proporción, indicando que
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con βlg en solución, interfases y emulsiones
219
contribuye significativamente al volumen total de la fase dispersa pero no al área creada
durante el tratamiento con USAI.
Como se analizó en la sección I, los fenómenos de desestabilización, principalmente el
cremado y la coalescencia, están gobernados por la presencia de gotas de mayor tamaño,
aún cuando están presentes en un pequeño porcentaje con respecto al número total de gotas.
Cuando mayor sea el tamaño de gotas en una emulsión, serán más propensas a la
coalescencia inducida por colisión. Las fuerzas de impacto que se generan y la magnitud de
las mismas durante una colisión, se hacen mayores con el aumento del tamaño de las gotas
(McClements, 1999).
La tabla 2.1 muestra los diámetros promedio, la polidispersidad y el área superficial
específica creada para las emulsiones de mezclas de E5LV 1% y βlg 1% recién preparadas.
Tabla 2.1 Diámetros promedios de Sauter (D3,2), de De Brouker (D4,3), polidispersidad y área
específica interfacial (SSA) de las emulsiones de mezclas de E5LV y βlg a ambos pHs. Desviación
estándar máxima: 5%.
Puede observarse que se obtienen mayores diámetros promedio a pH6. El área superficial
específica creada fue mayor cuando menor es el valor de D32 (Carrera Sanchez &
Rodriguez Patino, 2005).
Los D43, que están relacionados con los fenómenos de desestabilización, y la
polidispersidad fueron mayores para las emulsiones a pH6. Esto puede verse reflejado en
las curvas de distribución (Figura 2.1), donde las emulsiones de pH6 presentan una mayor
proporción de gotas entre los 5 μm y los 6 μm.
En el capítulo 1, se indicó que a pH6 la proteína y el polisacárido están presentes en la
mezclas en dominios en los cuales se excluyen mutuamente debido a una limitada
compatibilidad termodinámica.
D32 (μm) D43 (μm) polidispersidad AIE (m2/g)
pH3 0,672 1,338 1,952 8,930
pH6 0,711 1,463 2,047 8,440
Sección II- Capítulo 2.Comportamiento de mezclas de HPMC y βlg en emulsiones O/W
220
Cuando se analiza la carga superficial de las gotas de las emulsiones a pH3 y pH6, se
obtiene la misma tendencia observada en las soluciones de βlg sola. Cabe recordar que las
HPMC presentan una carga neta superficial cercana a cero (capítulo 1, sección I), por lo
tanto la carga neta de las emulsiones estaría principalmente gobernada por la carga neta de
la proteína (Tabla 2.2). Sin embargo a pH3, debido a la presencia de una carga negativa en
E5LV y al complejamiento con la proteína el potencial zeta positivo de la mezcla se ve
reducido.
Tabla 2.2. Potencial zeta determinado en emulsiones de mezclas de E5LV 1% y βlg 1% a pH3
y pH6. Desviación estándar máxima: 5%.
pH3 pH6
βlg 1% 11,80± 0.10 -11,40± 0.08
E5LV 1% -1,71± 0.05 0,78± 0.10
E5LV 1%+βlg 1% 8,83± 0.10 -11,30± 0.10
Como se discutió en el capítulo 4, en una microscopía óptica las gotas que se observan
con mayor facilidad son aquellas de mayor tamaño, las cuales dominan el proceso de
cremado. Sin embargo debe tenerse en cuenta que no son las mayoritarias en número y por
lo tanto las micrografías nos brindan una información parcial de la microestructura de las
emulsiones. Lo que puede verse claramente es si las gotas visibles están o no floculadas y
las características de los flóculos formados (Palazolo, 2006).
La figura 2.2 muestra las micrografías obtenidas para las emulsiones recién preparadas
de las mezclas de E5LV 1% y βlg 1%.
En las imágenes microscópicas, puede evidenciarse el alto grado de floculación presente
en las emulsiones a pH6, mientras que a pH3 (Figura 2.2A) las gotas están distribuidas en
forma más uniforme.
A pH3, la reología de la película interfacial revela que ambos biopolímeros están presentes
en la interfase cuando la relación entre βlg y E5LV es 1%/1% (Capítulo 1, sección II). Por
ello, no existiría una adsorción preferencial a esta relación de E5LV y βlg. A este pH la
mezcla no evidenció incompatibilidad termodinámica y como se mostró (capítulo 1,
sección II) predomina la formación de complejos.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con βlg en solución, interfases y emulsiones
221
Jourdain y col., (2008) al estudiar la estabilización de emulsiones O/W con caseinato de
sodio y dextranos, sostienen que en los casos que existe complejamiento entre los
biopolímeros, la emulsión resultante es estable (no ocurre floculación) si la concentración
del polisacárido supera 1%. Tal es el caso de las emulsiones analizadas en el presente
trabajo a pH3 (figura 2.2A).
A pH6 los estudios interfaciales mostraron que la presión interfacial, el carácter elástico de
la película, y la viscoelasticidad relativa (capítulo 1, sección II) están dominados por la βlg,
lo cual indica que se adsorbe mayoritariamente quedando E5LV en la fase continua.
Figura 2.2. Micrografías ópticas (60 X, zoom 2,5 X) de emulsiones de mezclas de E5LV 1% y βlg
1%HPMCs recién preparadas con USAI a (A) pH3 y (B) pH6. Barras blancas: 20 μm.
Según se reporta en la bibliografía, los hidrocoloides localizados en la fase continua de la
emulsión, pueden inducir la desestabilización de la emulsión por el mecanismo de
floculación por depleción (depletion flocculation en inglés) (Dickinson, 1995, Dickinson y
Euston, 1991, Dickinson, 2003, McClements, 1999). Este fenómeno ocurre cuando dos
gotas se acercan de tal manera que el espacio entre ellas es menor al volumen
hidrodinámico más estable del polisacárido en la fase continua. La exclusión del
(A) (B)
Sección II- Capítulo 2.Comportamiento de mezclas de HPMC y βlg en emulsiones O/W
222
polisacárido del espacio entre las gotas está asociada a la tendencia del solvente a fluir del
espacio entre las gotas debido a un gradiente de presión osmótica (Napper, 1983,
Dickinson, 2003). Esta fuerza atractiva entre la gotas se hace mayor cuando se incrementa
la concentración de los biopolímeros (Aronson, 1991; Dickinson y Golding, 1997,
McClements, 1999).
Cuando la concentración del polisacárido es alta (1%), la emulsión se desestabiliza por un
rápido cremado y separación de fases con un alto grado de floculación por depleción
(Dickinson, 2003).
Este fenómeno explica lo observado en la emulsión a pH6 (figura 2.2B).
En la bibliografía existen numerosos estudios en emulsiones que indican que numeros
polisacáridos no adsorbidos (hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrano, goma
xántica) provocan floculación pos depleción (Radford y Dickinson, 2004).
2.2 Estabilidad de las emulsiones frente al almacenamiento estacionario a
temperatura ambiente.
2.2.1 Estabilidad frente al cremado-floculación.
Se evaluó la estabilidad al cremado /floculación mediante el análisis de los perfiles de
BS% durante el almacenamiento estacionario a temperatura ambiente.
Se obtuvieron los perfiles para las emulsiones de las mezclas de E5LV 1% +βlg 1% cada
5 minutos durante la primera hora de preparada la emulsión. Luego cada dos horas durante
los primeros tres días y por último, cada un día. La figura 2.3 muestra los perfiles de BS%
obtenidos para las emulsiones a pH3 (A) y pH6 (B).
En los perfiles obtenidos puede verse reflejado el alto grado de floculación presente en las
emulsiones a pH6, evidenciado en las imágenes microscópicas (Figura 2.2). La exclusión
entre ambos biopolímeros presente a este pH, permite que las gotas se acerquen y favorece
este fenómeno de desestabilización.
Los perfiles de BS(%) de las emulsiones a pH3 presentan una menor variación en función
del tiempo, indicando mayor estabilidad.
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con βlg en solución, interfases y emulsiones
223
0 10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BS
(%
)longitud del tubo (mm)abajo arriba
> tiempo
(B)
10 20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
100
BS
(%
)
longitud del tubo(mm)abajo arriba
> tiempo
(A)
Figura 2.3. Perfiles de Backscattering (BS%) de emulsiones de mezclas de E5LV 1% y βlg 1%
a pH3 (A) y pH6 (B). Las flechas indican el avance de los perfiles en función del tiempo de
almacenamiento estacionario. Se seleccionó la parte inferior del tubo (10-20 mm) para la evaluación
de la cinética de cremado-floculación. Tiempo analizado: 1-20 dias.
Las constantes de la cinética de cremado-floculación (C) obtenidas para estas emulsiones
a ambos pHs, fueron 0,108 ± 0,001 a pH3 y 2,542 ± 0,003 a pH6.
Se observa que la velocidad de cremado es dos órdenes de magnitud menor para la
emulsión preparada a pH3. Esto guarda relación con lo observado en las imágenes
microscópicas pero no con el valor de los diámetros promedio obtenidos en la emulsión
recién preparada (Tabla 1.1). Si bien el valor de D43 es ligeramente mayor a pH6, no refleja
el grado de floculación presente (Figura 2.2). Es lógico suponer, entonces, que los flóculos
formados son debido a interacciones débiles, ya que son fácilmente disociados por la
agitación durante la medición del tamaño de partícula en el Mastersizer 2000. La medición
en el Turbiscan es no invasiva y no destructiva por lo tanto es posible evidenciar la
presencia de estos flóculos al igual que en las imágenes microscópicas (Palazolo, 2006).
El fenómeno de cremado y floculación presente en estas emulsiones a pH6 sería debido
a la migración de flóculos a causa de la exclusión entre ambos biopolímeros, siendo Vfloc
>Vcrem (Figura 4.8, capítulo 4, sección I).
Sección II- Capítulo 2.Comportamiento de mezclas de HPMC y βlg en emulsiones O/W
224
2.2.2 Estabilidad frente a la coalescencia.
Como se analizó en el capítulo 4, el diámetro D43 permite estimar los procesos de
coalescencia y floculación con mayor sensibilidad.
La tabla 6.4 muestran los valores de los parámetros IC% y GF% para las emulsiones de
mezclas de E5LV 1% y βlg 1% a ambos pHs.
Tabla 2.3. Parámetros de desestabilización a partir del diámetro D43, para las emulsiones de
mezclas de E5LV 1% y βlg 1% a pH3 y pH6. C%: coalescencia. GF%: grado de floculación.
Máxima desviación estándar: 1%. Tiempo de análisis: 24 hs.
E5LV 1%+βlg 1% inicial (μm) sin SDS(μm) con SDS (μm) C% GF%
pH3 1,367 1,576 1,437 2,43 2,03
pH6 2,053 2,875 2,134 2,54 4,53
Según los resultados anteriores, no hay un grado de coalescencia significativo a las 24 hs
a ambos pH. El hecho de que no haya grandes diferencias cuando las determinaciones se
realizaron en presencia de SDS, no es indicativo de la ausencia de flóculos, como se discutió
previamente, el SDS disocia las interacciones hidrofóbicas.
La coalescencia también puede evidenciarse en el aumento del diámetro promedio D32 con
el tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente (tabla 2.4) (Carrera Sánchez y col.,
2005), relacionado con el tamaño promedio de todas las partículas en la emulsión (Gu,
Decker & McClements, 2005).
La poca variación en el D32 en las emulsiones a ambos pHs durante 25 dias de
almacenamiento, confirma el bajo grado de coalescencia de ambas emulsiones. Sin
embargo el aumento porcentual en D32 fue mayor a pH3 (29 %) que a pH6 (21%). La
coalescencia depende muy fuertemente de las características reológicas de las películas
interfaciales.
Tabla 2.4. Diámetros promedios de Sauter, D32 (μm), para las emulsiones de mezclas de
E5LV 1% y βlg 1% a pH3 y pH6 almacenadas a T ambiente. Desviación estándar:1%.
recién preparada Día1 Dia5 Dia25
pH3 0,672 0,680 0,687 0,867
pH6 0,711 0,742 0,783 0,861
Comportamiento de HPMC y sus mezclas con βlg en solución, interfases y emulsiones
225
Como se ha mostrado al estudiar la reología de las películas interfaciales de los sistemas
mixtos βlg: E5LV, la presencia de E5LV en los sistemas a pH6 no afecta la capacidad de la
βlg para formar películas muy elásticas. Sin embargo, a pH3 la presencia de E5LV tiene un
efecto antagónico en la mezcla ya que disminuye el carácter elástico de la película (o
aumenta tg δ) en relación al comportamiento de la βlg sola.
Por lo tanto es de esperar que las gotas de las emulsiones mixtas a pH3 sean menos
resistentes a la coalescencia debido a su menor elasticidad.
CONCLUSIÓN GENERAL
SECCIÓN II
226
En esta sección se analizó el comportamiento en solución, en interfases y en emulsiones
O/W, de mezclas de HPMC con lg a pH3 y 6 comparativamente.
Al igual que en la sección anterior, el pH del medio afecta considerablemente el
comportamiento de estas mezclas en solución, interfases y emulsiones.
El pH modula la formación de complejos lg:E5LV, lo cual se refleja en una disminución
de la actividad interfacial de la lg y de las propiedades viscoelásticas de las películas
interfaciales a pH3. Esto impacta en las emulsiones a pH3 que muestran una coalescencia
ligeramente mayor que a pH6. Aún así el grado de coalescencia durante el tiempo de
almacenamiento estudiado fue muy bajo. Sin embargo, las emulsiones a pH6, presentan una
mayor desestabilización por cremado-floculación debido al fenómeno de floculación por
depleción, por la presencia de HPMC en la fase continua.
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Comportamiento de HPMC y sus mezclas con lg en solución, interfases y emulsiones
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FE DE ERRATAS
“COMPORTAMIENTO DE HIDROXIPROPILMETILCELULOSAS Y SUS
MEZCLAS CON -LACTOGLOBULINA EN SOLUCIÓN, INTERFASES Y
EMULSIONES”
Resumen donde dice “aplicación de ultrasonidos de lata intensidad” debe decir “aplicación de ultrasonidos de alta intensidad”. Indice, pag iii Punto 2.10.5 donde dice “Determinación de la viscosidad de las emulsione” debe decir “Determinación de la viscosidad de las emulsiones”. Página 10 donde dice “ampliamente empelado” debe decir “ampliamente empleado”. Página 68 donde dice “A pH mayores al punto isoeléctrico el potencial zeta es mayor a cero, y a pH menores es negativo” debe decir “A pH menores al punto isoeléctrico el potencial zeta es mayor a cero, y a pH mayores es negativo”.
Página 89 Figura 17, eje y, donde dice “ 健券 (訂迭添轍貼肺禰訂迭添轍 ) ” debe decir “健券 (
訂迭添轍貼肺禰訂迭添轍貸訂轍) ”
Página 91 donde dice “siendo por tanto la parte real del módulo es nula y la tg es
uno” debe decir “siendo por lo tanto la parte del módulo nula y la tg uno”.
Página 104 donde dice “ se traduce en una mayor grado”…”cuatro veces mayor que la correspondientes” debe decir “ se traduce en un mayor grado”…”cuatro veces mayor que las correspondientes”.
Página 110 donde dice “a autoensamblarse en solución mediantes” debe decir “a autoensamblarse en solución mediante”.
Página 122-123. Figura 2.4 eje x. donde dice “(s-1)” debe decir “ (s-1)”.
Figura 2.4 Leyenda. Donde dice “velocidad de deformación ()” debe
decir “velocidad de deformación ()”. Página 125 donde dice “Durate la aplicación de USAI” debe decir “Durante la aplicación de USAI”
Página 163 donde dice “Esto significa que la población I y parcialmente la II, no contribuyen ampliamente al volumen total de la fase dispersa” debe decir “Esto significa que la población I no contribuye ampliamente al volumen total de la fase dispersa”.
Página 184 donde dice “baja tendencia a la formación de flóculas detctadas por microscopia” debe decir “baja tendencia a la formación de flóculos detectadas por microscopía”.
Página 185 donde dice “el SDS adsorbido le da las gotas” debe decir “el SDS adsorbido le da a las gotas”.
Página 186 donde dice “hay a las 24 hs un alto grado de coalescencia a las 24 hs” debe decir “hay un alto grado de coalescencia a las 24 hs”.
Página 188 donde dice “el diámetro inicial de las emusliones” debe decir “el diámetro inicial de las emulsiones”.
Página 212. Leyenda Figura 1.10, donde dice “(B) mezclas de lg 0,5% + E5LV 1%” debe decir “(C) mezclas de lg 0,5% + E5LV 1%”.
Página 222 donde dice “en emulsiones que indican que números polisacáridos no adsorbidos” debe decir “en emulsiones que indican que numerosos polisacáridos no adsorbidos”.
Página 224 donde dice “La tabla 6.4 muestran” debe decir “La tabla 2.3 muestra”.