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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
INFORME FINAL
“Evaluación del efecto de la aplicación de ácido acetilsalicílico en el
mejoramiento del sistema de resistencia sistémica adquirida (RSA) de
plantas de tomate susceptibles a virus.”
PROYECTO FODECYT No. 033-2009
Dra. Mónica Orozco
Investigador Principal
GUATEMALA, 1 de mayo de 2011.
ii
EQUIPO DE INVESTIGACION
Dra. Mónica Orozco – Investigador Principal
Licda. Margarita Palmieri – Investigador Asociado
Sr. Wilfredo López – Técnico de Laboratorio
Sr. Erik Pérez – Técnico de Invernadero
iii
AGRADECIMIENTO
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro
del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología -CONCYT-.
iv
OTROS AGRADECIMIENTOS
Queremos agradecer a todos las personas que contribuyeron a llevar a cabo este
proyecto. Al Laboratorio de Protección Vegetal de la Universidad del Valle de
Guatemala, quién nos brindó apoyo a través del uso de sus instalaciones de laboratorio,
equipo, vehículos y apoyo logístico. Al personal del Laboratorio de Protección Vegetal,
quien desinteresadamente colaboró con este proyecto, en especial a los señores Leonel
Marroquín, Marlon Mejía y a Julio Granados. Especiales agradecimientos al Ing. Luis
Fernando Orellana de Bayer Crop Science, Guatemala, quién nos proporcionó semillas,
pilones, asesoría y apoyo en el campo. Finalmente, a la Universidad del Valle de
Guatemala por el apoyo brindado a este proyecto.
v
ÍNDICE
Pág.
RESUMEN ix
ABSTRACT x
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN 1
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS 5 I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General 5
I.3.1.2 Específicos 5
I.3.1.3 Hipótesis 5
I.4 METODOLOGIA
I.4.1 Localización y condiciones atmosféricas 6
I.4.2 Las Variables 1.4.2.1 Variables dependientes 6
1.4.2.2 Variables Independientes 6
I.4.3 Indicadores 6 I.4.4 Estrategia Metodológica 6
I.4.3.1 Población y Muestra 6
1.4.5 El Método
I.4.5.1 Muestreo de plantas infectadas con virus 7 I.4.5.2 Evaluación preliminar de mecanismos de transmisión y capacidad de infección de
virus
7
I.4.5.2.1 Inoculación por transmisión mecánica 8 I.4.5.2.2 Inoculación por injerto 8
I.4.5.3 Evaluación de efectos de aplicación de ácido acetilsalicílico
(AAS) en plantas indicadoras de tomate variedad Silverado 8 I.4.5.3.1 Plantas indicadoras 9
I.4.5.3.2 Inoculación con virus y tratamiento con AAS 10
I.4.5.4 Análisis de Laboratorio 11
I.4.5.4.1 ELISA para detección de virus y determinación de carga viral 11
I.4.5.4.2. Enzimas antioxidantes 11
I.4.5.4.3 Evaluación de sintomatología 12 I.4.6 La Técnica Estadística 12
PARTE II
MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL) 13
II.1.1 Generalidades del tomate 13
II.1.2 Cultivo del tomate 13
II.1.2.1 Requerimientos para cultivo de tomate 14
II.1.2.2 Establecimiento de las plantas 15
II.1.2.3 Variedades de tomate 16
II.1.2.3.1 Rojo temprano primero (60 días o menos para cosechar) 16
II.1.2.3.2 Mediano temprano rojo (60 a 69 días) 16
II.1.2.3.3 Cultivo principal rojo (70 días o más) 17
II.1.2.3.4 Extra grande rojo 17
II.1.2.3.5 Variedad Silverado F1 18
II.1.2.4 Producción de tomate 18
vi
II.1.3 Patologías del tomate 19
II.1.3.1 Septoria 19
II.1.3.2 Alternaria 20
II.1.3.3 Fusarium 21
II.1.3.4 Verticillium 22
II.1.3.5 Manchas bacterianas 23
II.1.3.6 Geminivirus transmitidos por mosca blanca 23
II.1.3.7 TMV, TSWV y los potyvirus 25
II.1.4 Resistencia Sistémica Adquirida (RSA): 26
II.1.4.1 Acido salicílico y especies oxigenadas reactivas (EOR) 27
II.1.4.2 Biosíntesis del ácido salicílico (AS) 28 II.1.4.3 Inducción de tolerancia a estrés por acción de ácido acetilsalicílico (AAS) 29
PARTE III
III.1 RESULTADOS III.1.1 Ensayos de infectividad 30
III.1.2 Determinación de carga viral en plantas F1 31
III.1.3 Determinación de actividad enzimática en plantas F1 y F2 34 III.1.4 Severidad de infección utilizando escala de sintomatología en generación F1 36
III.1.5 Efectos del AAS en la transmisión del virus a una segunda generación de plantas
(F2)
38
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 39
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES 42
IV.2 RECOMENDACIONES 43
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44
IV.4 ANEXOS 46
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO 56
vii
INDICE DE FIGURAS
Figura Pág.
1 Esquema de diseño experimental que incluye inoculación y tratamiento
de plantas indicadoras de tomate………………………………………. 9
2 Tomates en proceso de maduración (A) y flor de tomate (B)………….. 13
3 Esquema de características de variedades de tomate determinadas……. 15
4 Esquema de plantas de tomate indeterminadas………………………… 16
5 Tomates variedad Mountain Spring……………………………………. 17
6 Tomates Mountain Delight (A) y Floramerica (B)……………………... 18
7 Tomate variedad Beefmaster (A)………………………………………. 19
8 Tomates variedad Silverado F1………………………………………… 19
9 Distribución de tomate alrededor del mundo…………………………… 20
10 Manchas en hojas de tomate causadas por Septoria……………………. 21
11 Sintomatología causada por Alternaria en tomate……………………… 22
12 Marchitamiento causado por Fusarium………………………………… 23
13 Marchitez de hoja y pardeamiento de tubos conductores en tomate,
causados por Verticillium………………………………………………. 23
14 Sintomatología en hojas y plantas causada por Xanthomonas…………. 24
15 Síntomas de infección con virus TMV en plantas de tomate…………... 26
16 Sintomatología ocasionada por potyvirus en plantas de tomate……….. 27
17 Daños en frutos de tomate ocasionados por TSWV……………………. 27
18 Ruta metabólica y biosintética del AS y fenilpropanoides……………... 30
19 Plantas indicadoras de datura (A), nicotiana (B) y tomate Silverado (C)
inoculadas con potyvirus……………………………………………….. 32
20 Fuente de inóculo de TSWV encontrado en el campo (A) e inoculación
de plantas indicadoras de tomate var. Silverado con este inóculo (B)…. 32
21 Plantas indicadoras de tomate Silverado control e infectadas con virus
y tratadas con AAS……………………………………………………. 32
22 Sintomatología de plantas control infectadas con TSWV y plantas
infectadas y tratadas con 25 mM AAS………………………………… 38
23 Sintomatología de plantas infectadas con TSWV tratadas con
tratamientos de 50 y 100 mM AAS……………………………………. 38
viii
INDICE DE CUADROS
Cuadro Pág.
1 Localización de plantaciones de tomate muestreadas el 30 de
noviembre, 2010 para recolección de material infectado…………… 6
2 Cronograma de procedimientos y análisis de laboratorio realizados... 10
3 Porcentajes de inefectividad de distintas plantas indicadoras con
distintos virus y métodos de inoculación……………………………. 31
4 Equivalencias de diluciones en términos decimales………………… 33
5 Carga viral de plantas indicadoras F1 infectadas con TSWV y tratadas
con AAS, evaluación realizada el día 76………………….. 34
6 Resultados de la prueba de ELISA para determinar la presencia de
TSWV en plantas de tomate v. Silverado F1 en el día 100………… 35
7
Puntaje individual y puntaje total de enfermedad (PTE) de plantas de
tomate variedad Silverado F1 control e infectadas con TSWV y
tratadas con AAS (día 76)………………………………………….. 37
8 Resultados de la prueba de ELISA para determinar la presencia de
TSWV en plantas de tomate v. Silverado F2 en el día 121…………. 39
9
Puntaje individual y puntaje total de enfermedad (PTE) de plantas de
tomate variedad Silverado F2 (inoculadas con extracto de plantas
F1)………………………………………………………………… 39
INDICE DE GRAFICAS
Gráfica Pág.
1 Curva de calibración para determinar carga viral de plantas infectadas
con TSWV, realizada el día 76………………………………………….. 33
2 Curva de calibración para determinar carga viral de plantas infectadas
con TSWV, realizada el día 100…………………………………………. 34
3 Actividad de la guayacol peroxidasa (POX) en plantas de tomate
Silverado F1 infectadas con TSWV y tratadas con AAS……………….. 35
4 Actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en plantas de tomate F1
infectadas con TSWV y tratadas con AAS………………………………. 36
5 Actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en plantas de tomate Silverado
F2 inoculadas con material de generación F1 de tomate Silverado……… 36
6 Actividad de la guayacol peroxidasa (POX) en plantas de tomate
Silverado F2 inoculadas con material de generación F1 de tomate
Silverado………………………………………………………………… 37
ix
RESUMEN:
Las virosis en la agricultura generan grandes pérdidas económicas a pequeños
agricultores a lo largo del territorio nacional. Para controlar la propagación de los
vectores responsables de la transmisión de estos patógenos se ha recurrido al uso de
pesticidas químicos, cuyo uso extensivo e indiscriminado ha causado daño ecológico
considerable. Varios investigadores han explorado el uso de los mecanismos de defensa
innatos de la planta como una estrategia de protección contra patógenos, uno de ellos es
la estimulación de la resistencia sistémica adquirida (RSA) de plantas por medio de la
aplicación exógena de ácido salicílico y ácido acetilsalicílico (AAS). Este estudio tenía
como propósito evaluar los efectos de la aplicación de diferentes concentraciones de
AAS (25, 50 y 100 mM) en la RSA de plantas de tomate infectadas con virus. Entre los
objetivos secundarios de la propuesta se encuentra la estandarización de una metodología
basada en ensayos de ELISA que permita cuantificar carga viral en plantas, la
implementación de un sistema de evaluación de sintomatología viral usando una escala
numérica y la evaluación de la RSA por medio de la medición de la actividad enzimática
de dos enzimas antioxidantes: la guayacol peroxidasa (POX) y la polifenol oxidasa
(PPO). Se realizaron varias pruebas con una serie de virus candidatos y métodos de
inoculación para determinar qué virus y qué metodología permitían el mayor porcentaje
de infectividad en plantas de tomate. Media vez se hizo esta selección, se implementaron
métodos de cuantificación de carga viral, escala de sintomatología y actividad enzimática
que permitieron evaluar los efectos del AAS en la RSA del tomate variedad Silverado.
Se determinó que el virus del bronceado del tomate (TSWV) inoculado mecánicamente
es el que mejor porcentaje de infectividad tiene, por lo que este virus y esta técnica
fueron utilizadas en los ensayos posteriores. Otro de los hallazgos fue que el AAS en
concentraciones de 50 mM y 100 mM es capaz de evitar la infección de TSWV
reduciendo la carga viral y la severidad de los síntomas (medidos por escala de
sintomatología), pero es importante hacer notar que se deben seguir haciendo
aplicaciones continuas para conservar el efecto protector. No obstante, el AAS no
elimina completamente el virus de la planta y una planta infectada con el TSWV y
tratada con AAS si es capaz de infectar a otras plantas sanas. En términos de actividad
enzimática, la de la POX, se ve acrecentada en situaciones cuando existe una infección
viral. Aparentemente el AAS no tiene ningún efecto en las actividades de la PPO y la
POX. En general, el uso del AAS podría ser una herramienta para control de virosis, pero
es necesario hacer más estudios que exploren la eficiencia de este producto, así como los
efectos que podría tener en el rendimiento de los cultivos.
x
ABSTRACT:
Plant viruses cause great economic losses to small farmers in Guatemala. Chemical
pesticides have been used to control the vectors responsible for the transmission of these
pathogens, with the downside that their widespread and indiscriminate use has caused
severe ecological damage to local ecosystems. Several researchers have explored the
plant´s innate defense mechanisms as a protection strategy against pathogens. One of
these mechanisms is the stimulation of the plant´s acquired systemic resistance (ASR) by
exogenous applications of salicylic acid and acetylsalicylic acid (ASA). The aim of this
study was to evaluate the effects of the application of different concentrations of ASA
(25, 50 and 100 mM) on the ASR of tomato plants infected with virus. The secondary
objectives included the standardization of an ELISA-based method that would allow
quantifying viral load in plants, the implementation of a numerical scale system to
evaluate viral symptoms, and the evaluation of ASR through the enzymatic activity of
guayacol peroxidase (POX) and polyphenol oxidase (PPO). Several tests were
performed with a series of candidate viruses and inoculation methods to determine which
virus and method would allow the highest infectivity percentage of tomato plants. Once
this was determined, the viral load quantification, symptom scale and enzymatic activity
methods were implemented, allowing the evaluation of the effects of ASA on the ASR of
Silverado tomato plants. Results indicated that the mechanical inoculation of the tomato
spotted wilt virus (TSWV) had the best infectivity percentage, which made this virus
ideal for the rest of assays to be performed. Another finding showed that concentrations
of 50 and 100 mM ASA were capable of reducing the viral load and severity of
symptoms in plants inoculated with TSWV. It is necessary to make continuous
applications of the treatment to extend the protective effects of the ASA. However, AAS
doesn´t eliminate the virus completely and one plant infected with TSWV and treated
with ASA is still capable of infecting other healthy plants. In terms of enzymatic
activity, POX´s is higher during infection. Apparently, the ASA doesn´t have an effect
on PPO and POX activities. In general, the use of ASA might be a valuable tool to
control viral infections in plants, but it is necessary to perform more trials to explore the
efficacy of this product, as well as its effects on yield.
1
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
La economía guatemalteca se basa principalmente en la actividad agropecuaria.
Debido a la variedad de microclimas y la gran biodiversidad que posee el país, es
posible cultivar una amplia gama de cultivos los cuales representan una fuente de
ingresos para la mayoría de la población guatemalteca. Esta gran biodiversidad
también puede ser problemática ya que para cada cultivo que se siembra, hay un gran
número de plagas y enfermedades que los atacan. El uso de pesticidas, fungicidas,
agresivas y resistentes a los métodos tradicionales de control. La tecnología, de la
mano de la ciencia, ha generado maneras creativas y eficientes de tratar con este
problema, pero todavía existen problemas que deben resolverse.
Durante la década de los 90, varios científicos en el extranjero estudiaron los
mecanismos moleculares y fisiológicos de defensa contra patógenos en plantas,
principalmente de tabaco. Sus descubrimientos llevaron a entender los procesos que
se llevan a cabo en las plantas durante ataques de patógenos, especialmente de virus.
Uno de los principales descubrimientos fue la función fisiológica del ácido
acetilsalicílico (AAS) intrínseco en el sistema de resistencia sistémica adquirida
(RSA) de la planta y los efectos positivos de la aplicación externa del AAS. Se
encontró que este compuesto químico estimula la producción de proteínas que le
confieren resistencia a la planta contra infecciones subsecuentes y tiene un profundo
efecto en el sistema antioxidante de la planta, el cual a su vez es vital para la lucha
contra los patógenos invasores. Todavía hay algunas interrogantes que deben
resolverse, ya que la mayoría de estos estudios se llevaron a cabo con plantas de
tabaco y el virus del mosaico de tabaco (TMV). Por esta razón se requiere saber si el
AAS es igualmente eficaz en otros cultivos y por eso se eligió el tomate para la serie
de experimentos en esta propuesta. De igual importancia es la determinación de la
concentración mínima óptima de AAS a usarse ya que esto reducirá costos de
aplicación. También es necesario saber si las plantas que son tratadas con AAS
pueden ser reservorios de virus que pueden contaminar otras plantas y si las cargas
virales de las plantas infectadas se ven reducidas por el tratamiento con AAS. Por
otro lado, este estudio nos dará una mejor visión de los procesos fisiológicos que se
llevan a cabo durante una infección, específicamente de los cambios que ocurren en el
sistema antioxidante de una planta infectada que es tratada con AAS ya que éste
sistema está íntimamente relacionado con la RSA.
Entre los objetivos secundarios de la propuesta se encuentra la estandarización
de una metodología basada en ensayos de ELISA que permita cuantificar carga viral
en plantas, ya que los métodos existentes que utilizan biología molecular son caros y
complicados. También se desea implementar un sistema de evaluación de
sintomatología viral usando una escala numérica. Esto puede ser de gran utilidad a la
hora de evaluar daños causados por patógenos a gran escala en el campo y en el
laboratorio.
Debido a los altos costos de reactivos, no es posible efectuar análisis con todos
los virus que atacan al tomate en Guatemala. Esta es una gran limitante ya que no
podremos determinar la manera en que el tratamiento con AAS altera los ciclos de
vida y la virulencia de todos estos patógenos. Por esta razón se seleccionaron tres
2
tipos de virus, los cuales en la actualidad son los más problemáticos para los
agricultores de tomate. Conscientes de las limitaciones que se puedan tener, aún
creemos que este tipo de estudio nos dará herramientas para continuar explorando este
tema y nos dará información importante y útil.
3
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes
A nuestro conocimiento no hay ningún estudio publicado sobre los efectos del
AAS en el mejoramiento de la resistencia a patógenos bajo condiciones de laboratorio
ni de campo en Guatemala. Nuestra propuesta está basada en los múltiples artículos
publicados por investigadores internacionales que han comprobado los efectos del
AAS en la RSA de plantas (Fodor et al, 1997; Enyedi et al, 1992; Yalpani et al, 1993;
Radwan et al, 2007). En Guatemala, algunas personas involucradas en el área del
manejo integrado de plagas nos han comentado que unos pocos agricultores han
utilizado de forma empírica este compuesto junto con otros compuestos químicos en
sus plantaciones pero sin tener conocimiento de las dosis óptimas a utilizarse ni del
modo de aplicación y su frecuencia. A pesar de que han obtenido resultados positivos,
no son capaces de afirmar si esto se debe al efecto único del AAS o si es resultado de
los planes integrados multi-componentes que aplican. En algunos casos han
combinado el AAS con otros micronutrientes lo que no permite diferenciar el efecto
individual del AAS. Además, estas personas no poseen un conocimiento real de la
eficacia del tratamiento ya que no cuentan con estudios científicos ni estadísticas para
comprobarlo. Por esta razón, es necesario hacer estudios exploratorios bajo
condiciones de invernadero controladas, en donde se midan parámetros cuantificables
que no se vean afectados por otras variables y así poder determinar la verdadera
eficacia de estos tratamientos.
Por otro lado, la técnica por excelencia para el control de plagas es el uso de
pesticidas, los cuales representan un grave peligro para las personas que lo aplican, el
medio ambiente, y el consumidor que sea alimenta con estos productos agrícolas.
Según los estudios científicos efectuados por investigadores en el extranjero (Radwan
et al, 2007; Fodor et al, 1997; Enyedi et al, 1992; Yalpani et al, 1993), las dosis de
AAS necesarias para obtener efectos significativos en la reducción de daño viral son
extremadamente bajas y no representan un peligro para los agricultores que lo
aplicarían ni para el consumidor de estos productos, todo lo anterior hace que este
compuesto sea una solución con mucho potencial de aplicación a gran escala.
4
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación
Las virosis en la agricultura generan grandes pérdidas económicas a pequeños
agricultores a lo largo del territorio nacional. Para controlar la propagación de los
vectores responsables de la transmisión de estos patógenos se ha recurrido al uso de
pesticidas químicos, cuyo uso extensivo e indiscriminado ha causado daño ecológico
considerable. Además es necesario considerar los costos en los que deben incurrir los
pequeños agricultores para adquirir dichos productos.
Las nuevas prácticas agrícolas se enfocan en el manejo de plagas y patógenos
por medio de métodos ecológicos que sean eficientes y que causen el menor daño
posible a los ecosistemas. Con este estudio se desea proponer una estrategia de
reducción de daño causado por virus en cultivos de tomate, utilizando el propio
sistema de resistencia de la planta. La aplicación del ácido acetilsalicílico podría
representar una manera fácil y de bajo costo que podría beneficiar a muchas de las
familias que se dedican al cultivo de tomate en Guatemala. Por otra parte se elimina
el problema cada más frecuente de la resistencia de plagas a los pesticidas que se
utilizan para combatirlos ya que la estrategia de defensa contra el patógeno se basa en
fortalecer el sistema de defensa de la planta contra el virus y no en combatir el vector.
A la vez, este estudio es importante ya que nos dará información básica sobre
los procesos fisiológicos que ocurren en la planta durante un ataque por patógenos, lo
que es útil para aplicaciones futuras a gran escala. Nos permitirá además, estandarizar
y evaluar metodología que se puede usar en otro tipo de estudio o en aplicaciones que
se deriven de este mismo estudio.
5
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General
Evaluar los efectos de la aplicación de diferentes concentraciones de ácido
acetilsalicílico (AAS) en la resistencia sistémica adquirida (RSA) de plantas de
tomate infectadas con virus.
I.3.1.2 Específicos
Realizar pruebas preliminares para determinar cuál es la mejor metodología de
inoculación de virus en plantas de tomate para los fines de este estudio.
Evaluar la capacidad de infección de tres virus que atacan cultivos de tomate
(TMV, TSWV y potyvirus) con el fin de seleccionar un virus que permita
llevar a cabo eficazmente los ensayos posteriores de esta propuesta.
Implementar la metodología para la cuantificación de carga viral en plantas
infectadas con virus.
Evaluar los efectos del ácido acetilsalicílico en la carga viral de plantas de
tomate infectadas.
Determinar la concentración óptima de ácido acetilsalicílico que se debe
aplicar para tener un efecto significativo en la reducción de síntomas de
infección por virus y en la carga viral en la planta.
Evaluar la RSA en plantas indicadoras infectadas con virus por medio de
marcadores de oxidación (enzimas antioxidantes peroxidasa y la polifenol
oxidasa) y registros de aparición de síntomas
Determinar si la aplicación del AAS afecta la capacidad del virus para re-
infectar otras plantas.
6
I.3.2 Hipótesis
La aplicación de ácido acetilsalicílico a plantas de tomate infectadas con virus
disminuirá significativamente el número de lesiones y la severidad de los síntomas
causados por la infección viral.
El efecto de la aplicación previa y posterior de AAS a plantas infectadas por virus
es dosis-dependiente.
La actividad de las enzimas antioxidantes peroxidasa y polifenol oxidasa de las
plantas de tomate infectadas con virus se alterará como resultado de la aplicación
de AAS.
La carga viral de las plantas infectadas se reducirá con la aplicación de
concentraciones de 25 mM de ácido acetilsalicílico.
7
I.4 METODOLOGIA
I.4.1 Localización y condiciones atmosféricas
Los ensayos de laboratorio, las pruebas de infectividad y la evaluación de la
efectividad del tratamiento fueron realizados en las instalaciones del Laboratorio de
Protección Vegetal, Universidad del Valle de Guatemala (UVG), en la ciudad capital.
El mantenimiento de plantas indicadoras e inoculaciones con virus se llevaron a cabo
en invernaderos con temperaturas controladas (18 -20°C) dentro del campus de la
UVG.
Se hizo una gira de campo en la que se colectó material con sintomatología
virótica, el cual fue utilizado para llevar a cabo las pruebas de infectividad, carga
viral, inoculación con virus, ensayos enzimáticos y efectividad de tratamiento. A
continuación se muestra un Cuadro con las características de localización de los sitios
muestreados para este fin.
Cuadro 1: Localización de plantaciones de tomate muestreadas el 30 de noviembre,
2010 para recolección de material infectado
Campo/Finca Localización Altura
Aldea Ramírez Bárcenas, Villa Nueva 1490 msnm
Retana Bárcenas, Villa Nueva 1510 msnm
Colonia 6 de enero Bárcenas, Villa Nueva 1539 msnm
- Villa Canales 1216 msnm
8
Figura 1: Localización geográfica de los lugares de colecta en plantaciones de tomate
muestreadas el 30 de noviembre, 2010 para recolección de material infectado.
(Fuente: FODECYT 033-2009)
I.4.2 Las variables
I.4.2.1 Variables dependientes: Carga viral, actividad enzimática, puntaje de
sintomatología
I.4.2.2 Variables independientes: Tratamientos de ácido acetilsalicílico en tres
distintas concentraciones: 25, 50 y 100 mM
I.4.3 Indicadores: Lecturas de absorbancia para determinación de presencia de
virus y carga viral, actividad enzimática (concentración de producto/ minuto),
presencia e intensidad de síntomas en plantas infectadas con TSWV
I.4.4 Estrategia Metodológica
I.4.4.1 Población y Muestra
La población son las plantas de tomate variedad Silverado y la muestra son los
lotes de plantas de tomate variedad Silverado que serán expuestas a infecciones con
virus y a tratamientos con ácido acetilsalicílico en diferentes concentraciones.
9
I.4.4.2 Localización geográfica del proyecto
El cultivo, cuidado e inoculación con virus de las plantas indicadoras de tomate
se llevó a cabo en los invernaderos de la Universidad del Valle de Guatemala. La
colección de material infectado que será utilizado como control positivo en los
ensayos de laboratorio se realizó en plantaciones en varios puntos de las localidades
de Bárcenas, Villa Nueva y Villa Canales (Ver Cuadro 1). Los ensayos de laboratorio
y pruebas bioquímicas se llevaron a cabo en los laboratorios del Departamento de
Protección Vegetal de la Universidad del Valle de Guatemala.
1.4.5 El Método
I.4.5.1 Muestreo de plantas infectadas con virus
Los muestreos de plantas para encontrar fuentes de inóculos de los virus de
interés se llevaron a cabo en plantaciones de tomate Bárcenas, Villa Nueva y Villa
Canales. Se contactaron a agricultores del área y se tomaron muestras de hojas de
tomate que presentaban la sintomatología característica de los virus a estudiar. Estas
hojas se almacenaron en bolsas plásticas cerradas y rotuladas. Las muestras se
guardaron en hieleras y fueron transportadas a las instalaciones de los laboratorios de
Protección Vegetal en la Universidad del Valle de Guatemala para su análisis
posterior.
También se utilizaron muestras de plantas encontradas en los jardines de la
Universidad del Valle que presentaban sintomatología de potyvirus, así como plantas
que fueron llevadas a los laboratorios del departamento de Protección Vegetal para ser
diagnosticadas.
I.4.5.2 Evaluación preliminar de mecanismos de transmisión y capacidad
de infección de virus
Para seleccionar el virus que sea más fácil de detectar y cuantificar así como el
mejor mecanismo de transmisión fue necesario hacer pruebas preliminares a manera
de optimizar la metodología de estudio. Se hicieron pruebas con varios virus en una
serie de plantas indicadoras. Los virus evaluados fueron el virus del bronceado del
tomate (TSWV), potyvirus, el virus del crisantemo B (CVB), el virus de la aspermia
del tomate (TAV) y el virus del mosaico del pepino (PepMV), virus del anillado de la
papaya (PRSV), virus del moteado verdel del pepino (CGmmV) y virus del mosaico
de la calabaza (SqMV). Originalmente se iban a evaluar únicamente el TSWV,
potyvirus y el virus del mosaico del tabaco (TMV), pero no fue posible encontrar
tejido vegetal infectado con TMV y los otros dos virus estaban siendo difíciles de
inocular por lo que se tuvo que probar con otros virus, otros buffers y otras plantas
indicadoras. Se utilizaron dos buffers de inoculación diferentes: 1. buffer de fosfatos
0.01 M pH 7.0 con 0.2 % de sulfito de sodio y 0.01 M de 2-β-mercaptoetanol y 2.
Buffer de fosfatos 0.001M pH 7.2 (Ver Cuadro 3 de RESULTADOS para las
especificaciones de cada ensayo). Además de plantas de tomate variedad Silverado,
se inocularon plantas de Nicotiana tabacum, N. glutinosa y Datura stramonium
también. Cuando ya se tenía un virus idóneo, se corrieron ensayos de ELISA para
evaluar obtener curvas de calibración lineales para la cuantificación de la carga viral
10
en los ensayos posteriores. Se utilizaron triplicados de todas las plantas por cada
virus que se evaluaba. Ver Anexo1 para metodología de ELISA.
I.4.5.2.1 Inoculación por transmisión mecánica
Para el inóculo se tomaron hojas superiores de plantas infectadas con uno de
los virus estudiados y se maceraron en un mortero con buffer de fosfatos 0.1 M, pH
7.9. Este homogenizado se filtró con gasa y se mantuvo en hielo hasta la inoculación.
Las hojas sanas de las plantas indicadoras se frotaron con carborundum y el
homogenizado de virus y luego se lavaron con agua destilada para evitar quemaduras
químicas. Ver Anexo 1 para procedimiento.
I.4.5.2.2 Inoculación por injerto
Se hizo un corte en forma de punta de una pequeña rama de la planta infectada
que mostraba el mayor daño por virus. El corte debe hacerse con una cuchilla estéril
para evitar infección con otros patógenos. En la planta indicadora sana se hizo otro
corte en forma de cuña y se introdujo la rama de la planta infectada. El injerto se fijó
a la planta indicadora con parafilm hasta que quedó firme.
I.4.5.3 Evaluación de efectos de aplicación de ácido acetilsalicílico (AAS)
en plantas indicadoras de tomate variedad Silverado:
Este fue un estudio de caso control en donde se utilizaron plantas de tomate
susceptibles a virosis de la variedad Silverado y material vegetal infectado con
TSWV, el cual fue seleccionado en base a su capacidad de infección en la fase
preliminar del estudio. El estudio se dividió en dos fases:
Fase 1: En esta fase se evaluaron los efectos de diferentes concentraciones de AAS
(25, 50 y 100 mM) en la capacidad antioxidante, carga viral y aparecimiento de
síntomas viróticos en 15 plantas indicadoras de tomate. Dicho grupo de plantas se
denominó la generación F1.
Fase 2: La segunda parte del experimento, en la cual se evaluó la capacidad del virus
de re-infectar otras plantas, usó otro grupo de 9 plantas provenientes de pilones
comerciales de tomate variedad Silverado; a este grupo se le denominó generación
F2.
11
El diseño experimental se ilustra en la siguiente figura:
Figura 1: Esquema de diseño experimental que incluye inoculación y tratamiento de
plantas indicadoras de tomate
FASE 1:
FASE 2:
(Fuente: FODECYT 033-2009)
I.4.5.3.1 Plantas indicadoras
Pilones de tomate (Lycopersicon esculentum) de la variedad Silverado de 40
días de edad se compraron en una distribuidora de pilones local. Estos se
trasplantaron a bolsas que contenían una mezcla de peet moss, arena blanca cernida y
tierra negra, en proporción 2:2:1. Durante 13 días los pilones se mantuvieron en el
invernadero de crecimiento, el cual se mantiene a temperaturas que varían de 20°C –
38°C. Al final de este período, las plantas se trasladaron al invernadero de
inoculación, el cual posee un sistema de control de temperatura que varía de 18°C a
21°C, con una humedad relativa de 60 – 70%. Las plantas fueron regadas y
fertilizadas por ferti-irrigación con spray con Nutrigold® 0-20-44 y Nutrigold® 9-45-
15 y fertilizadas foliarmente con 20-20-20 soluble. Inicialmente fue necesario hacer
15 plantas F1 de tomate variedad
Silverado en estadío de pilón de
7 días
3 plantas de
tomate (F1)
infectadas con
virus +
100 mM AAS
3 plantas de
tomate (F1)
infectadas con
virus +
50mM AAS
3 plantas de
tomate (F1)
infectadas con
virus +
25 mM AAS
3 plantas de
tomate (F1)
control
infectadas con
virus sin AAS
3 plantas de
tomate (F1)
control sanas
sin virus y sin
AAS
Obtención de hojas de plantas F1
3 plantas de
tomate (F2)
inoculadas con hojas F1
tratadas con
25 mM AAS
3 plantas de
tomate (F2)
inoculadas con hojas F1
tratadas con
50 mM AAS
3 plantas de
tomate (F2)
inoculadas con hojas F1
tratadas con
100 mM AAS
Inoculación con extractos de hojas de
plantas F1 en 9 plantas F2
3 plantas de
tomate (F2)
control sanas sin virus y sin
AAS
3 plantas de tomate (F2)
control
infectadas con
virus sin AAS
12
una aplicación preventiva de fungicida Benomil (Pronto 50 WP®) ya que las
aplicaciones foliares del AAS propiciaban el crecimiento de hongo en las hojas.
I.4.5.3.2 Inoculación con virus y tratamiento con AAS
Para poder evaluar los efectos del tratamiento con AAS fue necesario tomar
plantas de tomate Silverado e inocularlas intencionalmente con el TSWV, luego se les
debían hacer aplicaciones con el tratamiento y finalmente hacer análisis que
permitieran evaluar los efectos del AAS en la carga viral, intensidad de los síntomas
de la infección y la actividad de dos enzimas específicas. Para este fin, después de 7
días de crecimiento, las plantas sanas se separaron en los cinco grupos enumerados en
la sección I.4.4.4. Cada grupo consistió de tres réplicas. Las plantas de tomate de los
grupos control positivo, tratamientos 25, 50 y 100 mM fueron inoculadas
mecánicamente con el virus TSWV (como se explica en la sección I.4.5.2.1). El
grupo control negativo no fue inoculado ni se le aplicó tratamiento con AAS, mientras
que el grupo control positivo si se inoculó con virus pero tampoco se trató con AAS.
Los grupos experimentales inoculados con virus fueron tratados con 25, 50 y 100 mM
AAS por aspersión foliar y aplicación en suelo en tres ocasiones en distintos puntos
del desarrollo de la planta en un lapso de dos semanas:
1. Primera aplicación: 5 cc aplicación foliar + 10 cc aplicación en suelo
2. Segunda y tercera aplicación: 10 cc aplicación en suelo
Se tomaron varias muestras vegetales para análisis bioquímicos y de virología
según el siguiente cronograma:
Cuadro 2: Cronograma de procedimientos y análisis de laboratorio realizados
Día Procedimiento
Análisis de laboratorio a efectuarse
Enzimas
antioxidantes Carga
viral
Evaluación de
síntomas
ELISA
detección
virus
F1 F2 F1 F2 F1 F2 F1 F2
1 Siembra de semillas
de plantas F1
41 Trasplante a bolsa
54 Primera aplicación
AAS X
55 Inoculación de plantas
F1 con TSWV
61 Segunda aplicación
AAS
68 Tercera aplicación
AAS
76
Evaluación F1 e
inoculación de plantas
F2 con material de F1
X X X
100 Evaluación F1 X
121 Evaluación F2 X X
128 Evaluación F2 X
13
I.4.5.4 Análisis de Laboratorio
I.4.5.4.1 ELISA para detección de virus y determinación de carga viral
Se utilizaron kits comerciales de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent
assay) para la detección de virus, marca Agdia® (Elkhart, IN, EEUU). Para la
selección del virus de trabajo, se analizaron plantas para detectar la presencia del virus
del bronceado del tomate (TSWV, no. de catálogo RSA 39300), potyvirus (no. de
catálogo SRA 27200), virus del mosaico del pepino (PepMV, no. catálogo SRA
13000), virus del crisantemo B (CVB, no. catálogo SRA 81000) y virus de la
aspermia del tomate (TAV, no. catálogo SRA 37001). Ver Anexo 2 para
metodología.
Para la elaboración de la curva de calibración se tomó una planta infectada con
TSWV, con sintomatología característica y severa de la enfermedad, y se obtuvo un
extracto de varias hojas. Dicho extracto se diluyó en las siguientes concentraciones:
1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000 y 1:10,000. Estas diluciones usadas para
construir una curva de calibración usando un ELISA, la cual permitió obtener una
escala relativa de concentraciones del control positivo vs. absorbancia. Con esta
curva, se obtuvo una línea de regresión que permitió extrapolar los valores de
absorbancia de las muestras problema y determinar de forma semi-cuantitativa una
concentración aproximada de carga viral en las plantas de estudio. Esta misma planta
se utilizó en todas las determinaciones posteriores y en la obtención de las curvas de
calibración para los ensayos de carga viral.
I.4.5.4.2. Enzimas antioxidantes
La evaluación de la capacidad antioxidante de la planta por medio de enzimas
se llevó a cabo cuantificando las enzimas guayacol peroxidasa (POX) así como la
polifenol oxidasa (PPO).
La actividad de la guayacol peroxidasa se llevó a cabo según el método de
Kiraly et al, 2002 (con algunas modificaciones), el cual consiste en triturar 0.5 g del
material de hojas a 4°C en un mortero con 2 ml de buffer de fosfatos 0.1 M pH 6.0
con 1mM EDTA-Na2. El homogenizado se centrifugó a 6,000 rpm a 4°C por 20
minutos. Los sobrenadantes se colectaron para medir la actividad de la POX y la
PPO. En el caso de la POX, se tomaron 50 µl del extracto y se mezclaron con 2.45 ml
de la mezcla de reacción. La mezcla de reacción contiene fosfato de sodio 0.1M a pH
6.0, guayacol 2 mM, peróxido de hidrógeno 1 mM. La actividad relativa de la POX
se determina como densidad óptica/g peso fresco/hora a 436 nm en un
espectrofotómetro. El incremento en la absorbancia fue medido a medida que el
conjugado se formaba usando un coeficiente de extinción de 26.6 mM-1
cm-1
que se
aplica en la ecuación de Beer-Lambert:
ΔA = abc
Donde:
ΔA = cambio de absorbancia en un minuto
a = absortividad molar
b= longitud del trayecto del haz de luz (1 cm)
c = concentración de producto formado por minuto
14
La medición de la actividad de la PPO se llevó a cabo usando el método
propuesto por Kiraly, et al, 2002 con modificaciones. En este caso se homogenizaron
0.5 g de material de hoja a 0 – 4°C en 2 ml de buffer de fosfato 0.1M a pH 6.0 con
1mM de EDTA-Na2. Los homogenizados se centrifugan a 6000 rpm por 20 minutos a
4°C. La actividad enzimática soluble total se mide espectrofotométricamente en el
sobrenadante a 25°C. La actividad de la PPO se mide en 2.2 ml de una mezcla de
reacción que consiste de 0.1 M de buffer de fosfato de sodio a pH 6.0, EDTA-Na2 1
mM, catecol 20 mM y 200 ul de extracto de hojas. El incremento en la absorbancia a
390 nm se mide a medida que el catecol se oxida. La actividad de PPO se calcula
usando un coeficiente de extinción de 0.95/mM x cm para el producto de la quinona y
la ecuación de Beer-Lambert.
I.4.5.4.3 Evaluación de sintomatología
Se usó un puntaje total compuesto de dos componentes que evalúan la
severidad y tipo de sintomatología, así como el número de plantas que presentan
dichos síntomas. La evaluación de la severidad de síntomas se basa en la escala usada
por Radwan et al, 2007: 0 = no presenta síntomas, 1 = lesiones cloróticas locales y
mosaico leve, 2 = mosaico severo, 3 = malformaciones.
El puntaje total de enfermedad (PTE) se definió como:
PTE = (grado de severidad de síntomas x número de plantas en cada grado)
(Número total de plantas x grado de severidad de síntomas más alto)
El PTE sirve para determinar la severidad de la infección viral así como los
efectos del AAS.
I.4.6 La Técnica Estadística
Se realizaron estadísticas descriptivas para las variables de carga viral, puntaje
de sintomatología y actividad enzimática. Para analizar diferencias en actividad
enzimática, puntaje de sintomatología y en carga viral entre tratamientos se utilizó
una prueba t no apareada. Los resultados se compararán con los controles positivos
y negativos incluidos en el diseño experimental.
15
PARTE II
II.1 MARCO TEÓRICO
II.1.1 Generalidades del tomate
El tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es una solanácea estrechamente
relacionada a otros vegetales como la papa, berenjena y los pimientos. Es una
dicotiledónea perenne que crece anualmente en climas templados. Se originó en
América Central y fue llevada por los exploradores españoles a Europa y
Norteamérica. El tomate es rico en vitaminas A y C, calcio y potasio. (Department of
Horticulture and Landscape Architecture, sin fecha)
El fruto mide de 2 (tomates cherry) a 15 cm (tomates manzano). El color del
fruto va de amarillo a naranja a rojo oscuro (el color rojo se debe a la acumulación del
carotenoide licopeno). La forma del fruto va desde ovoide a tomates con forma de
pera. El sabor puede ser muy dulce a altamente ácido. Puede sembrarse en
invernadero o en condiciones de campo. (Department of Horticulture and Landscape
Architecture, sin fecha)
Figura 2: Tomates en proceso de maduración (A) y flor de tomate (B).
Fuente: Department of Horticulture and Landscape Architecture, sin fecha.
II.1.2 Cultivo de Tomate
El tomate (Lycopersicon esculentum), es una solanácea nativa del continente
americano (Morales y Anderson, 2001), ampliamente cultivada en esta región.
Inicialmente los primeros colonizadores de América creían que era una planta
venenosa y no fue sino hasta los 1800s que se reconoció como un vegetal útil. Este
vegetal crudo o cocinado de varias formas forma parte de la dieta de muchas personas
en el mundo. Cuando se cultivan como plantas en estaca, los tomates requieren
relativamente de espacio pequeño y son capaces de producir entre 8 y 10 libras de
fruto por planta. Los tomates son bajos en calorías y una buena fuente de vitamina C.
(Riofrio, 2000)
A
B
16
II.1.2.1 Requerimientos para cultivo de tomate
Los tomates son plantas de climas cálidos. La temperatura es un factor
importante en la producción ya que son particularmente sensibles a temperaturas
bajas. Pueden crecer en diferentes tipos de suelo, pero un suelo profundo, bien
drenado y con una buena fuente de materia orgánica es el mas adecuado para su
cultivo. Como la mayoría de los vegetales, los tomates crecen mejor en suelos ácidos
con un pH de 6.2 a 6.8. En términos del uso de fertilizantes, el tomate responde bien
a las aplicaciones de fósforo. Un exceso de fertilizantes nitrogenados puede resultar
en plantas extremadamente vigorosas pero con baja producción de frutos. La
aplicación del fertilizante debe realizarse más o menos dos semanas antes de
plantarlos. (Riofrio, 2000)
Los diferentes cultivares tienen diferentes períodos de maduración y pueden
ser clasificados como determinados (D) o indeterminados (I). Las plantas D crecen
hasta cierta altura y luego se detienen. También florecen y desarrollan frutos en un
período de tiempo relativamente corto. Esta es una ventaja si los tomates se cultivan
principalmente para ser enlatados. Otra característica que debe observarse es su
resistencia a enfermedades. Muchos cultivares pueden ser resistentes a Verticillium,
Fusarium o a nematodos. (Riofrio, 2000)
Figura 3: Esquema de características de variedades de tomate determinadas.
Adaptado de:
http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQGfQbYN7A0C1GsxWxMgfX5l3Bd6R
0eVLH3DENjK06NhV-TiS1W
Los brotes terminales
dan fruto y detienen el
crecimiento de la planta. Planta no necesita estaca
Capullos y fruto se
desarrollan aprox. al
mismo tiempo.
Tiempo de cosecha
corto
17
Figura 4: Esquema de plantas de tomate indeterminadas.
Adaptado de: http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRe24-5MuTHi6wtjrq-
kdPbvi8yW6turlTMjitlODTI-sESoaXz
II.1.2.2 Establecimiento de las plantas
Las plantas que se siembran individualmente o en semilleros individuales
experimentan poco estrés de trasplante y se establecen más rápidamente. Se debe
aplicar un fertilizante inicial alto en fósforo a la hora de la siembra. Las plantas sin
estaca usualmente se siembran a 3 pies de distancia en filas a 5 pies de distancia. Las
plantas con estaca se siembran a 2 pies de distancia en filas a 3-4 pies de distancia.
Las estacas se deben colocar a la hora de la siembra para no afectar a las raíces.
Cuando el espacio es limitado y las condiciones del suelo son pobres, las plantas se
pueden sembrar en contenedores libres de enfermedades con una mezcla de suelo.
Cualquier recipiente con un drenaje adecuado es propicio para la siembra del tomate.
(Riofrio, 2000)
Media vez se ha establecido el cultivo, se debe aplicar un medio para
conservar la humedad y suprimir el crecimiento de malezas. Si aparecen malezas,
pueden ser removidas a mano. Una fuente de humedad es importante, especialmente
cuando los frutos empiezan a desarrollarse. Si el suelo se vuelve muy seco, la
pudrición de los retoños puede darse. Si se aplica mucha agua el fruto en maduración
puede partirse. (Riofrio, 2000)
18
Las plantas con estaca usualmente se podan a un tallo único o doble
periódicamente y se ata suavemente a la estaca. La poda debe hacerse removiendo
todas las ramas que crecen de las hojas axilares, dejando únicamente el tallo principal
y una rama adicional cerca de la base. Las plantas sin soporte pueden dejarse sin
poda. Las plantas de tomate podadas y con estaca producen frutos menos abundantes
pero mas grandes que las plantas sin soporte. (Riofrio, 2000)
II.1.2.3 Variedades de tomate
Existen cientos de variedades de tomate disponibles comercialmente. Varían
grandemente en tamaño, forma, color, tipo de planta, resistencia a enfermedades y
época de maduración. Las variedades pueden clasificarse en distintas categorías.
II.1.2.3.1 Rojo temprano primero (60 días o menos para
cosechar)
Estas variedades tienen un crecimiento más compacto y las quemaduras por
sol son un problema en climas cálidos. Estas variedades son mas apropiadas para
áreas al norte, donde las épocas de crecimiento son cortas y los inviernos son mas
fríos. Tienen frutos rojos pequeños a medianos y no se pueden podar. Entre estas
variedades se encuentran: Sub Arctic Plenty (45 días para cosechar, determinado),
Early Cascade (55 días, indeterminado; resistente a Fusarium y Verticillium), Early
Girl (54 días indeterminado; resistente a Verticillium), Quick Pick (60 días, resistente
a Verticillium, Fusarium, Alternaria, Nemátodos, Virus del mosaico del tabaco).
(University of Illinois Extension, 2011).
II.1.2.3.2 Mediano temprano rojo (60 a 69 días)
Estas variedades son intermedias entre lo temprano de las variedades
anteriores y las características de producción de los tipos principales de tomate. El
tamaño del fruto es mejorado así como su calidad. Las variedades principales son:
Champion (65 días para cosecha, indeterminado; resistente a Verticillium, Fusarium,
nematodos y Virus del mosaico del tabaco), Mountain Spring (65 días, determinado,
resistente a Fusarium y Verticillium). (University of Illinois Extension, 2011).
Figura 5: Tomates variedad Mountain Spring.
Fuente: http://www.reimerseeds.com/determinate-tomato_1147.aspx
19
II.1.2.3.3 Cultivo principal rojo (70 días o más)
La mayoría de las variedades tienen un tamaño mediano a grande, un follaje
adecuado y están relativamente libres de rajaduras del fruto y otras deformidades.
Muchas pueden ser podadas y tutoreadas. Tienen una producción superior y mejor
calidad del fruto. Las variedades principales son: Celebrity (70 días para la cosecha,
determinada, resistente a varios patógenos), Mountain Delight (70 días, determinadas,
resistentes a Fusarium y Verticillium), Fantastic (70 días; alta productividad,
indeterminado), Better Boy (72 días, indeterminada, resistente a nematodos,
Verticillium y Fusarium), Mountain Pride (74 días; determinado; resistente a
Verticillium y Fusarium), Floramerica (75 días; determinado; resistente a Verticillium
y Fusarium). (University of Illinois Extension, 2011).
Figura 6: Tomates Mountain Delight (A) y Floramerica (B).
Fuente: http://www.reimerseeds.com/determinate-tomato_1147.aspx
II.1.2.3.4 Extra grande rojo
Estas variedades maduran relativamente tarde. Los frutos pueden ser
extremadamente grandes pero pueden sufrir daños, con tejido cicatrizante en la punta
del retoño. Este tejido debe ser cortado pero las ventajas del tamaño extra grande se
pierden. No tienen buen rendimiento pero tienen un gran tamaño. Las variedades
son: Delicious (OP) (77 días para la cosecha, indeterminado); Supersteak (80 días,
indeterminado; resistente a Verticillium, Fusarium y nemátodos); Beefmaster (81
días, indeterminado; reistente a Verticillium, Fusarium y nemátodos). (University of
Illinois Extension, 2011).
A B
20
Figura 7: Tomate variedad Beefmaster (A) (Tomado de: y Supersteak (B
Fuentes:http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTNp4tvUjtfSUjk58YE-
DJKQsSrVwQ67MDLvQQLO8_kLLaB2LN--w) y Rosehill plantery.com
II.1.2.3.5 Variedad Silverado F1
La variedad Silverado fue desarrollada por la empresa Harris Moran. Esta es
una variedad indeterminada con alto rendimiento de un fruto brillante de madurez
media. Es adecuada para el cultivo en estaca. El fruto es mediano, de forma elongada
y con buena vida de anaquel. (Harris Moran, sin fecha) Por otro lado, esta variedad
es altamente susceptible al ataque por begomovirus transmitidos por mosca blanca
(Mejía, 2003) , lo que causa grandes pérdidas en las cosechas si no se tiene un control
adecuado de plagas.
Figura 8: Tomates variedad Silverado F1.
Fuente: Harris Moran Seed Company, sin fecha.
II.1.2.4 Producción de tomate
El tomate es el segundo vegetal más importante del mundo, después de la
papa. La producción actual mundial es de aproximadamente 100 millones de
toneladas de fruto fresco producidas en 3.7 millones de hectáreas. La producción de
tomate se ha reportado en 144 países, siendo China el mayor productor en ambas
A B
21
hectáreas de producción cosechada (1,255,100 hectáreas) y el peso del fruto
producido (30,102,040 Mt). Los países líderes en rendimiento de fruto por hectárea
son los Países Bajos (4,961,539 Hg/ha) y Bélgica (4,166,667 Hg/ha). Los principales
productores de tomate son los Estados Unidos, China, Turquía, Italia e India.
(Growing Tomatoes, 2005)
Figura 9: Distribución de tomate alrededor del mundo.
Fuente: http://faostat.fao.org/site/336/DesktopDefault.aspx?PageID=336
En Guatemala, la producción anual de tomate ronda alrededor de las 208,377
toneladas métricas, las cuales son cultivadas en una extensión de 4,522 hectáreas de
terreno. Las principales regiones de cultivo se encuentran en las zonas del altiplano,
occidental, oriental y central, así como en el departamento de Baja Verapaz, donde
este cultivo se encuentra ampliamente extendido. (MAGA, 2008)
Respecto a las importaciones que realiza el país, durante el período de 2001-
2007, según estadísticas del BANGUAT, Honduras fue el principal proveedor de
tomate para Guatemala, con un promedio anual de 177 TM. En este mismo período,
Guatemala también realizó importaciones desde El Salvador, México, Nicaragua y
Estados Unidos. En términos de exportaciones, el principal socio comercial de
Guatemala es El Salvador (97.9%), al cual le vende un promedio anual de 24,657 TM,
seguido por Honduras. Lastimosamente, las exportaciones de Guatemala han caído
drásticamente en el período 2001-2007, con una tasa de crecimiento anual de -13.
(MAGA, 2008)
Según los datos del BANGUAT, la producción local de tomate es suficiente
para satisfacer las demandas locales de este producto. El consumo anual nacional de
tomate es de 183,483 TM. Este consumo ha aumentado de 86,7761 TM en 2001 a
268,369 TM en el 2007. (MAGA, 2008)
II.1.3 Patologías del tomate
Existen varias patologías que pueden atacar a los cultivos de tomate, plantados
en exteriores y bajo condiciones de invernaderos.
22
II.1.3.1 Septoria
Esta enfermedad es causada por el hongo Septoria lycopersici, y es una de las
enfermedades foliares más comunes del tomate. Primero aparece como manchas
pequeñas acuosas que pronto se convierten en manchas circulares de
aproximadamente 1/8 pulgadas de diámetro. Las lesiones pronto desarrollan centros
grisáceos con bordes oscuros. Cuando las condiciones son favorables, los cuerpos
fructíferos aparecen como manchas pequeñas negras en el centro de las manchas mas
grandes. Las esporas se propagan a nuevas hojas por medio de la lluvia. Las hojas
muy infectadas se vuelven amarillas, se marchitan y eventualmente se caen. Las
hojas inferiores generalmente se infectan primero y la enfermedad progresa cuando el
clima lluvioso persiste. La defoliación puede ser severa después de períodos
prolongados de calor húmedo. (Gleason y Edmunds, 2006)
El control de esta enfermedad es una combinación de prácticas culturales, las
cuales incluyen: sembrar plantas sanas lo suficientemente separadas para que no
estén muy apretadas cuando crezcan para que el follaje se seque rápidamente, regar
las plantas en la mañana y en la noche para minimizar el tiempo que las hojas están
mojadas, remover los desechos, rotar cultivos para que los tomates sean sembrados
cada 3 ó 4 años, evitar trabajar con las plantas cuando el follaje esté mojado para
evitar la propagación de la enfermedad. (Gleason y Edmunds, 2006)
Figura 10: Manchas en hojas de tomate causadas por Septoria.
Fuente: Gleason y Edmunds, 2006
II.1.3.2 Alternaria
El hongo Alternaria solani, causa una enfermedad caracterizada por la pérdida
prematura de hojas. Aparecen manchas cafés o negras de ¼ a ½ pulgada de diámetro
en las hojas inferiores. Las manchas frecuentemente se fusionan formando manchas
irregulares. Anillos oscuros concéntricos frecuentemente aparecen en las manchas de
las hojas. Las hojas se vuelven amarillas y se secan cuando hay pocas manchas
presentes. El hongo ocasionalmente ataca al fruto, causando hundimiento con anillos
concéntricos y una apariencia aterciopelada. (Gleason y Edmunds, 2006)
23
Los controles químicos y culturales son los mismos que se utilizan con la
Septoria. Adicionalmente, evitar las rotaciones con papa y cosechar todo el fruto
maduro para evitar infectar otros frutos. Existen algunas variedades de tomate que
son resistentes parcialmente a este hongo, como la Mountain Supreme, Pride, Gold,
Fresh y Belle. (Gleason y Edmunds, 2006)
Figura 11: Sintomatología causada por Alternaria en tomate.
Fuente: Gleason y Edmunds, 2006.
II.1.3.3 Fusarium
El Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici ataca únicamente ciertos cultivares
de tomate. Las plantas infectadas muestran amarillamiento de hojas y un proceso de
marchitamiento hacia arriba desde la base del tallo. Inicialmente, una rama o un lado
de la planta se verán afectados. Los síntomas rápidamente se propagan al resto de la
planta. Las hojas marchitas se caen prematuramente y las plantas afectadas mueren
tempranamente y producen poco o ningún fruto. (Gleason y Edmunds, 2006).
Para minimizar las pérdidas por Fusarium, se recomienda utilizar variedades
resistentes. Las variedades resistentes pueden infectarse pero la enfermedad no será
tan severa como en las variedades susceptibles y se obtendrá una producción
razonable. Adicionalmente, se debe utilizar semilla libre de la enfermedad o
trasplantes en medio libre de enfermedad y bien drenado. También se deben hacer
rotaciones de tomate cada cuatro años para reducir las poblaciones en el suelo y se
debe remover y destruir los residuos de plantas infectadas. Para la desinfección se
puede usar vapor. (Gleason y Edmunds, 2006).
24
Figura 12: Marchitamiento causado por Fusarium.
Fuente: Gleason y Edmunds, 2006
II.1.3.4 Verticillium
Verticillium albo-atrum y Verticillium dahliae, los hongos causantes del
marchitamiento por Verticillium, pueden atacar más de 200 especies vegetales,
incluyendo papa, pimientos, berenjena, fresa, sandía y rábano. Esta enfermedad
aparece en las hojas inferiores y progresa hacia arriba de la planta. Se desarrollan
manchas amarillas en las hojas superiores, las hojas rápidamente se tornan
completamente amarillas, se marchitan y caen. Las plantas infectadas pueden
sobrevivir a lo largo de una temporada de siembra, pero están achicadas y su
producción es reducida. Esta enfermedad causa pardeamiento interno del tejido
conductor de agua en los tallos. (Gleason y Edmunds, 2006)
Las medidas de control son similares a las del Fusarium. Existen variedades
resistentes a este hongo en el mercado. Es recomendable rotar cultivos que no
pertenezcan a la familia de las solanáceas, incluyendo pimientos, papa y berenjena por
lo menos en cuatro años. El maíz y el frijol son cultivos adecuados para la rotación.
(Gleason y Edmunds, 2006)
Figura 13: Marchitez de hoja y pardeamiento de tubos conductores en tomate,
causados por Verticillium.
Fuente: Gleason y Edmunds, 2006
25
II.1.3.5 Manchas bacterianas
Esta enfermedad es causada por la bacteria Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria, la cual infecta tanto a tomates como a pimientos. Las manchas que
aparecen en tallos y hojas son pequeñas, circulares e irregulares y tienen una textura
ligeramente grasosa. A medida que las lesiones se agrandan, frecuentemente son
rodeadas por un halo amarillo. Si hay muchas manchas, éstas empiezan a fusionarse.
La sintomatología en el fruto es mas distintiva que en la hoja o tallo. Las manchas en
el fruto verde aparecen como puntos negros elevados rodeados de áreas acuosas. A
medida que las manchas se agrandan, se vuelven grises con centros hundidos.
(Gleason y Edmunds, 2006)
La bacteria generalmente es llevada al campo en trasplantes infectados. El
clima lluvioso y cálido favorece su rápida propagación. Es crucial obtener plantas
libres de la enfermedad ya que la bacteria puede transmitirse a los semilleros por
medio de semillas contaminadas. Se debe evitar hacer rotaciones con pimientos. Se
recomienda no manipular las plantas más de lo necesario (podas y amarres por
ejemplo), ya que las heridas causadas por la manipulación permiten que la bacteria
ingrese a la planta. Tratamientos con productos que contengan cobre pueden reducir
la dispersión de la enfermedad en el jardín cuando aparezcan los primeros síntomas.
(Gleason y Edmunds, 2006)
Figura 14: Sintomatología en hojas y plantas causada por Xanthomonas.
Fuente: Gleason y Edmunds, 2006
II.1.3.6 Geminivirus transmitidos por mosca blanca
Las patologías en el tomate son variadas pero unas de las más difíciles de
controlar son las virosis causadas por los geminivirus transmitidos por la mosca
blanca, principalmente la de la especie Bemisia tabaci.
Existen alrededor de 1140 especies de mosca blanca alrededor del mundo, de
las cuales 724 habitan en zonas tropicales. No todas las especies son pestes agrícolas,
26
únicamente algunas son reconocidas como vectores de virus de plantas, entre las
cuales se encuentran: Bemisia tabaci (Gennadius), Bemisia afer sens lat., Trialeurodes
vaporariorum (Westwood), Trialeurodes abutilonea (Hald.) y (Misra). Solo la
Bemisia tabaci es capaz de transmitir alrededor de 200 virus de plantas capaces de
causar pérdidas millonarias a la agricultura. (Morales, 2007)
La B. tabaci es capaz de causar daños directos e indirectos a cultivos de soya,
distintas variedades de frijol, tomate, chile, ocra, berenjena, camote, yuca, algodón,
tabaco, melón, sandía y cucúrbitas en general. Hasta 1986 solo se conocía un biotipo
de bemisia tabaci, el biotipo A, pero ese año se detectó un nuevo biotipo B, más
agresivo, capaz de adaptarse a nuevos ambientes y de infectar una variedad más
amplia de cultivos que incluyen la alfalfa, tomate, chile pimiento, coliflor y el brócoli.
En la actualidad este biotipo es considerado una peste mundial responsable de grandes
pérdidas agronómicas en Asia, Africa, Europa, el área del Pacífico y América
(Morales, 2007).
El daño directo ocasionado por la mosca blanca ocurre cuando ésta extrae
grandes cantidades de savia de la planta, debilitándola. Los daños indirectos ocurren
cuando grandes poblaciones de mosca blanca inducen el crecimiento de hongos
superficiales encima de secreciones de moscas inmaduras y adultas, reduciendo la
capacidad fotosintética lo que puede causar la muerte de la planta. El otro tipo de
daño es la infección viral, la cual puede causar clorosis, acolochamiento de hojas,
enanismo, y maduración irregular, entre otras. (Morales, 2007)
Los daños causados por geminivirus transmitidos por B. tabaci no solo son
estructurales sino que también afectan el contenido nutricional de los cultivos. En un
estudio por Raj y colegas (2005) se encontró que en los frutos de Momordica
charantia, las concentraciones de carotenoides y vitamina C disminuyeron en un 40%
y 50% respectivamente, mientras que el contenido de fenoles y la capacidad
antioxidante se vieron reducidas en un 50% y 43% respectivamente.
En Centroamérica, el Caribe y México, los cultivos más afectados por los
begomovirus transmitidos por B. tabaco son el frijol común (Phaseolus vulgaris),
chile pimiento y chiles picantes (Capsicum spp), cucúrbitas y el tomate
(Lycompersicon esculnetum). (Morales, 2007).
Alrededor del 90% de los virus transmitidos por B. tabaci pertenecen al género
de Begomovirus, familia de los Geminiviridae. Estos virus consisten de una sola
hebra de ADN encapsulada en dos partículas gemelas casi isométricas. La B. tabaci
también puede transmitir virus de ARN de una sola hebra, los cuales pertenecen a los
géneros Crinivirus, Carlavirus e Ipomovirus. (Morales, 2007)
En el área de México y Centroamérica se han detectado una gran cantidad de
begomovirus que atacan cultivos de tomate, entre ellos se encuentran: el virus del
acolochamiento y amarillamiento de las hojas del tomate (ToYLCV), el virus del
arrugamiento de hojas del tomate (ToLCV), virus del moteado amarillo del tomate
(ToYMoV), virus del moteado dorado del tomate (ToGMoV), virus del moteado leve
del tomate (ToMiMoV), virus del mosaico dorado de chile (PepGMV). (Nakhla, et al,
sin fecha)
27
Estudios científicos han comprobado que los virus de plantas afectan algunos
procesos fisiológicos como la fotosíntesis (reduciéndola según el estado de la
infección), disminuyendo el contenido de pigmentos, contenido de azúcares y
almidones, además de aumentar la tasa de respiración (Radwan et al, 2007).
II.1.3.7 TMV, TSWV y los potyvirus
El virus del mosaico del tabaco (TMV) está distribuido a nivel mundial,
causando grandes pérdidas económicas. Este virus se transmite mecánicamente por
actividades humanas o por medio de semillas en el caso del tomate. Este virus no se
dispersa por insectos. La sintomatología que presenta en el tomate varía de acuerdo a
las condiciones de temperatura y luz, a la variedad, la cepa de virus y el tiempo de
infección. Los síntomas más comunes son el mosaico verde oscuro que presentan las
hojas (ver figura 3). Algunas variedades pueden causar deformación de las hojas. En
términos de la calidad de los frutos, éstos pueden ser reducidos en tamaño y número y
en algunas ocasiones pueden presentar un defecto de oscurecimiento interno.
(Zitter y Providenti, sin fecha)
Figura 15: Síntomas de infección con virus TMV en plantas de tomate.
Fuente: Zitter y Providenti, sin fecha y University of Florida, 2008.
Los virus Y de la papa o potyvirus (PVY) son comúnmente encontrados en el
sur de Estados Unidos y en Centroamérica. Son transmitidos por áfidos y su
sintomatología a veces es confundida con la del TMV. Estos virus pueden causar
distorsión foliar y enanismo en plantas (Ver figura 16). (Zitter y Providenti, sin
fecha)
Figura 16: Sintomatología ocasionada por potyvirus en plantas de tomate.
Fuente: Zitter y Providenti, sin fecha
28
El virus del bronceado del tomate (TSWV) es una especie del género de los
tospovirus, el cual infecta a su más importante vector, Frankliniella occidentalis, o el
trips occidental de flores (WFT) (Medeiros et al, 2004). Este virus causa daños
severos al tomate, resultando en necrosis, mosaico en tallos y pecíolos y moteado
severo del fruto, lo que lo hace imposible de mercadear (ver Figura 17). El control de
vectores por medio de insecticidas para eliminar los trips que lo transmiten es la
manera más común de controlar esta enfermedad.
(Zitter y Providenti, sin fecha)
Figura 17: Daños en frutos de tomate ocasionados por TSWV.
Fuente: Zitter y Providenti, sin fecha
II.1.4 Resistencia Sistémica Adquirida (RSA):
La existencia de la resistencia sistémica adquirida fue demostrada por primera
vez por Ross en 1961, en un experimento en el cual se utilizaron plantas de tabaco
infectadas con virus del mosaico del tabaco (TMV). Ross y sus colegas observaron
que la inoculación de una hoja con el TMV incrementaba la resistencia a infecciones
subsecuentes en hojas remotas al sitio de la primera inoculación, reduciéndose el
número de lesiones locales inducidas por la re-infección con TMV (Kiraly et al,
2002).
En la actualidad se sabe que las infecciones con patógenos necrotizantes como
virus, hongos o bacterias (Enyedi et al, 1992) usualmente conllevan al desarrollo de
resistencia a infecciones subsecuentes (Lee et al, 1992). Esta resistencia adquirida no
se limita al área de infección o entrada del patógeno sino que a toda la planta, de
manera sistémica. A la respuesta que se tiene con este primer contacto entre la planta
y el patógeno se le conoce como “respuesta hipersensible” (RH) (Chen et al, 1995;
Fodor et al, 1997; Barna et al, 2003). La HR restringe la dispersión del virus en la
planta, circunscribiéndola a una pequeña zona alrededor del sito de entrada del virus,
formando una lesión necrótica (Lee et al, 1995). Asociada a la HR se encuentra la
resistencia sistémica adquirida (RSA), la cual provee protección subsecuente a la
planta contra una variedad de patógenos durante varios meses. (Chen et al, 1995)
A principios y mediados de los noventa se llevaron a cabo varios experimentos
(Lee et al, 1992, Chen et al, 1995) con plantas de tabaco y el virus del mosaico de
tabaco (TMV) para estudiar las interacciones planta/patógeno. Los investigadores
observaron que plantas de tabaco presentaban niveles substancialmente mayores de
ácido acetilsalicílico (AAS) después de haber sido infectadas con TMV (Lee et al,
1992, Chen et al, 1995). Esta acumulación se presentaba en el sitio de infección y
luego se detectaba en las partes distales de la planta (Kiraly et al, 2002). A partir de
29
este momento, se dilucidaron los mecanismos moleculares que tenían lugar en la
RSA.
II.1.4.1 Acido salicílico y especies oxigenadas reactivas (EOR)
El ácido salicílico (AS) ha sido usado históricamente para inducir floración,
inhibir la absorción de fosfato y potasio y para inhibir la biosíntesis de etileno (Lee et
al, 1995). No fue hasta los años noventa cuando se empezó a elucidar el papel
regulatorio del AS endógeno en las plantas y su relación con el sistema de defensa
contra patógenos (Lee et al, 1995). El desarrollo de la RSA está asociado con la
expresión de un set de genes encargados del desarrollo de mecanismos de defensa en
la planta (Kiraly et al 2002), estos genes han sido relacionados con la patogénesis
(PR) y son denominados PR-1 y PR-2 (Fodor et al, 1997). Estudios científicos
demostraron que la aplicación exógena de AAS también induce la expresión de los
PR-1 y PR-2, de la misma forma como si fueran inducidos por un reto patológico.
(Kiraly et al, 2002). Al aumentar la expresión de los genes PR-1 y PR-2, aumenta la
síntesis de proteínas relacionada a la patogénesis (PR), lo que crea una mayor
resistencia a re-infecciones por hongos y bacterias así como a necrosis viróticas.
(Fodor et al, 1997; Enyedi et al, 1992; Yalpani et al, 1993)
La infección con patógenos necrotizantes resulta en la acumulación de
especies oxigenadas reactivas (EORs) como el superóxido, el peróxido de hidrógeno,
los radicales hidroxilos y el oxígeno singulete, causando lo que se denomina una
explosión oxidativa (Kiraly et al, 2002). Las EORs son moléculas altamente reactivas
que forman parte del sistema de defensa de las plantas y son liberadas en respuesta a
la invasión por patógenos. Se ha sugerido que estas moléculas están involucradas en
la traducción de señales además de limitar el ingreso de patógenos, pero a la vez
aumentan la necrosis de tejidos vegetales (Barna, et al, 2003). Algunos estudios
también han sugerido que el AAS potencia la explosión oxidativa, aumentando la
muerte celular en combinación con los EORs (Kiraly et al, 2002). La generación
descontrolada de EORs puede ser dañina para la planta y causar estrés oxidativo. Por
esta razón, la planta también cuenta con un mecanismo de defensa compuesto por
antioxidantes y enzimas antioxidantes, entre las cuales se encuentran la glutatión
peroxidasa (GSH), glutatión reductasa (GR) y la glutatión transferasa (GST).
Un incremento en la concentración de EOR estimula la expresión de genes
relacionados con el sistema de defensa de la planta, a la vez, disminuye la actividad
de las enzimas antioxidantes por lo que se reduce la capacidad antioxidante de la
planta. Con la capacidad antioxidante de la planta reducida, aumenta la peroxidación
de lípidos celulares causando apoptosis y consecuentemente necrosis tisular. (Fodor
et al, 1997). Esta serie de eventos ocurre durante la fase inicial de la infección, antes
de la aparición de síntomas y es necesaria ya que evita la propagación del virus al
eliminar las células infectadas con el virus.
Después del aparecimiento de síntomas, las altas concentraciones de ROS
estimulan la actividad de enzimas antioxidantes como la GR, GST, SOD y GSH,
brindando protección contra el daño oxidativo a los tejidos alrededor de las lesiones
necróticas, evitando así que se dispersen a otros sitios en la planta (Fodor et al, 1997).
30
Un estudio por Esmailzadeh y colegas (2008) demostró que las aplicaciones
exógenas de AS reducían la sintomatología causada por Alternaria alternata f. sp
lycopersici en tomate. Los hallazgos indicaron que fue necesario aplicar SA en
concentraciones de 400 uM para lograr un efecto significativo en la reducción del
índice de sintomatología en el tomate. Se encontraron efectos significativos en las
reacciones celulares de la planta en términos del porcentaje de penetración del hongo.
Las plantas que fueron pre-tratadas con AS tenían un mayor porcentaje de necrosis
celular individual (indicador de una respuesta hipersensible), pero menores áreas
dañadas y decoloraciones que las plantas control que no fueron tratadas con AS. Los
pre-tratamientos con AS causaron un aumento en el AS libre endógeno en las hojas de
tomate, lo cual resultó en la inducción de la resistencia sistémica adquirida.
(Esmailzadeh et al, 2008)
II.1.4.2 Biosíntesis del ácido salicílico (AS)
Experimentos realizados en los años sesenta sugieren que el AS es sintetizado a
partir del ácido cinámico por dos vías metabólicas posibles. Una involucra la
descarboxilación de la cadena lateral del ácido cinámico para producir ácido
benzóico, seguido por una hidroxilación del AS. La otra alternativa es que el ácido
cinámico primero podría ser hidroxilado a ácido o-cumárico y luego decarboxilado a
AS. Otros experimentos sugieren que los retoños de tomate infectados con
Agrobacterium tumefaciens sintetizan AS vía la ruta de ácido o-cumárico, mientras
que la ruta del ácido benzóico opera en plantas no infectadas. (Lee et al, 1995)
En el año 93, Yalpani y colegas reportaron estudios concluyentes que
demostraban la ruta biosintética del AS, la cual se muestra a continuación:
31
Figura 18: Ruta metabólica y biosintética del AS y fenilpropanoides.
Fuente: Lee et al, 1995.
II.1.4.3 Inducción de tolerancia a estrés por acción de ácido acetilsalicílico
(AAS)
Se ha demostrado el rol del ácido acetilsalicílico en la inducción de RSA en
varios cultivos. También se ha demostrado que concentraciones activas de AS y sus
derivados, tales como el ácido acetilsalicílico, también muestran tolerancia al estrés
en plantas. Estudios con tomate y frijol demostraron que las aplicaciones de AS y
AAS conferían resistencia a calor, frío y sequía a estos cultivos. Este grupo de
investigadores hipotetizó que estos compuestos tenían un rol de señalización que
llevaba a la expresión de tolerancia en la planta. (Senaratna et al, 2000)
32
PARTE III
III.1 RESULTADOS
III.1.1 Ensayos de infectividad
Cuadro 3: Porcentajes de infectividad de distintas plantas indicadoras con distintos
virus y métodos de inoculación
Plantas indicadoras Virus Método %
infectividad*
Tomate (var. Silverado)
Virus del
crisantemo B
(CVB) Inoculación mecánica
usando buffer de
fosfatos 0.01 M pH
7.2
50%
Virus de la
aspermia del
tomate (TAV)
50%
Virus del
bronceado del
tomate (TSWV)
0%
Nicotiana, tomate (var.
Silverado), glutinosa,
datura
Potyvirus Inoculación mecánica
usando buffer de
fosfatos 0.01 M pH
7.2
0%
Virus del
mosaico del
pepino dulce
(PepMV)
0%
Tomate (var. Silverado)
Virus del
anillado de la
papaya (PRSV) Inoculación
utilizando buffer de
fosfatos 0.01 M pH
7.0 con 0.2 % de
sulfito de sodio y
0.01 M de 2-β-
mercaptoetanol
0%
Virus del
moteado verdel
del pepino
(CGmmV)
0%
Virus del
mosaico de la
calabaza
(SqMV)
0%
Tomate (var. Silverado) TSWV Injerto 0%
Tomate (var. Silverado) TSWV
Inoculación mecánica
con buffer de fosfatos
0.01 M pH 7.2
100%
*El % de infectividad está dado por el porcentaje de plantas que se infectaron exitosamente con el virus
en cuestión
Fuente: FODECYT 033-2009
Dada la eficiencia de infectividad, se seleccionó el virus TSWV para hacer los
ensayos subsecuentes de carga viral, actividad enzimática y puntaje de sintomatología
en tomate variedad Silverado.
33
Figura 19: Plantas indicadoras de datura (A), nicotiana (B) y tomate Silverado (C)
inoculadas con potyvirus.
Fuente: FODECYT 033-2009
Figura 20: Fuente de inóculo de TSWV encontrado en el campo (A) e inoculación
de plantas indicadoras de tomate var. Silverado con este inóculo (B).
Fuente: FODECYT 033-2009
III.1.2 Determinación de carga viral en plantas F1
Figura 21: Plantas indicadoras de tomate Silverado control e infectadas con virus y
tratadas con AAS.
Fuente: FODECYT 033-2009
A B C
A B
34
Cuadro 4: Equivalencias de diluciones en términos decimales
Dilución en
fracción*
Dilución en decimales
1:10 0.1
1:20 0.05
1:50 0.02
1:100 0.01
1:500 0.002
1:1000 0.001
1:10,000 0.0001 *Este es un indicador de la dilución hecha en base a volumen. Por ejemplo: para la dilución 1:10 se
tomó 1 µL de extracto puro de planta infectada y se diluyó en 9 µL de agua destilada, esta dilución
equivale a 0.1.
Fuente: FODECYT 033-2009
Gráfica 1: Curva de calibración para determinar carga viral de plantas infectadas con
TSWV, realizada el día 76. Para construir esta curva se utilizó una planta de tomate
variedad Silverado infectada con TSWV para obtener el extracto y sus diluciones.
Ver Cuadro 1 con el cronograma de procedimientos y análisis de laboratorio
realizados para determinar el día cuando se realizó la prueba.
Fuente: FODECYT 033-2009
35
Cuadro 5: Carga viral de plantas indicadoras F1 infectadas con TSWV y tratadas con
AAS, evaluación realizada el día 76.
ID
planta
Planta
control
sin virus
Planta
control
con virus
Plantas infectadas
con TSWV y
tratamiento AAS
25 Mm
Plantas infectadas
con TSWV y
tratamiento AAS
50 mM
Plantas
infectadas con
TSWV y
tratamiento AAS
100 mM
1 0 0.93 0.95 0 0
2 0 0.92 0.85 0 0
3 0 0.78 0.98 0 0
4 0 0.89 0.97 0 0
5 0 0.91 0.86 0 0
6 0 0.92 0.58 0 0
Media ±
Desv Std
0.00 ±
0.00
0.89 ±
0.05 0.87 ± 0.15 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00
* No hay diferencias significativas entre control + y el tratamiento con 25 mM
AAS, usando un análisis de T de student no apareado
Fuente: FODECYT 033-2009
Gráfica 2: Curva de calibración para determinar carga viral de plantas infectadas con
TSWV, realizada el día 100. Para construir esta curva se utilizó una planta de tomate
variedad Silverado infectada con TSWV para obtener el extracto y sus diluciones.
(Ver Cuadro 1 con el cronograma de procedimientos y análisis de laboratorio
realizados para determinar la secuencia de pruebas realizadas.)
y = 0.5376x + 0.0553R² = 0.8106
-1
0
1
2
3
4
5
6
0 0.0001 0.001 0.002 0.01 0.02 0.05 0.1 1
Ab
sorb
anci
a
Dilución
Fuente: FODECYT 033-2009
36
Cuadro 6: Resultados de la prueba de ELISA para determinar la presencia de TSWV
en plantas de tomate v. Silverado F1 en el día 100
Réplica
de
planta
Control - Control + Tratamiento
25 mM
Tratamiento
50 mM*
Tratamiento
100 mM
1 - + + + -
2 - + + + -
3 - + + + -
Fuente: FODECYT 033-2009
III.1.3 Determinación de actividad enzimática en plantas F1 y F2
Gráfica 3: Actividad de la guayacol peroxidasa (POX) en plantas de tomate Silverado
F1 infectadas con TSWV y tratadas con AAS. Determinación realizada el día 76.
Columnas que comparten la misma letra no difieren estadísticamente entre ellas,
según prueba T de Student no apareada.
a
bb
aa
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
ctrl - ctrl + 25 mM 50 mM 100 mM
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
PO
X(m
M p
rod
uct
o/m
in)
Tratamiento Fuente: FODECYT 033-2009
37
Gráfica 4: Actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en plantas de tomate F1
infectadas con TSWV y tratadas con AAS. Determinación realizada el día 76.
Columnas que comparten la misma letra no difieren estadísticamente entre ellas,
según prueba T de Student no apareada.
a
b
a,b
c
a,c
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
ctrl - ctrl + 25 mM 50 mM 100 mM
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
PP
O(m
M p
rod
uct
o/m
in)
Tratamiento
Fuente: FODECYT 033-2009
Gráfica 5: Actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en plantas de tomate Silverado F2
inoculadas con material de generación F1 de tomate Silverado. Determinación
realizada el día 121. Ninguno de los tratamientos difiere estadísticamente según
prueba de T de Student no apareada.
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
ctrl - ctrl + 25 mM 50 mM 100 mM
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
PP
O(m
M p
rod
uct
o/m
in)
Tratamiento
Fuente: FODECYT 033-2009
38
Gráfica 6: Actividad de la guayacol peroxidasa (POX) en plantas de tomate Silverado
F2 inoculadas con material de generación F1 de tomate Silverado. Determinación
realizada el día 121. Columnas que comparten la misma letra no difieren
estadísticamente entre ellas, según prueba T de Student no apareada.
a
a,cb,c
b,c
b,c
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018
0.02
ctrl - ctrl + 25 mM 50 mM 100 mM
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
PO
X(m
M p
rod
uct
o/m
in)
Tratamiento
Fuente: FODECYT 033-2009
III.1.4 Severidad de infección utilizando escala de sintomatología en
generación F1
Cuadro 7: Puntaje individual y puntaje total de enfermedad (PTE) de plantas de
tomate Silverado F1 control e infectadas con TSWV y tratadas con AAS (día 76)
No. Tratamiento AAS Infección por virus Puntaje* PTE por tratamiento**
1 Control (-) No 0
0 2 Control (-) No 0
3 Control (-) No 0
4 0 mM TSWV 3
1 5 0 mM TSWV 3
6 0 mM TSWV 3
7 25 mM TSWV 3
1 8 25 mM TSWV 3
9 25 mM TSWV 3
10 50 mM TSWV 1
0.83 11 50 mM TSWV 2
12 50 mM TSWV 2
13 100 mM TSWV 0
0 14 100 mM TSWV 0
15 100 mM TSWV 0 * La evaluación de la severidad de síntomas está basada en la escala usada por Radwan et al, 2007: 0 =
no presenta síntomas, 1 = lesiones cloróticas locales y bronceado leve, 2 = bronceado severo, 3 =
malformaciones.
**Se calcula usando la siguiente fórmula:
PTE = (grado de severidad de síntomas x número de plantas en cada grado) (Número total de plantas x grado de severidad de síntomas más alto)
39
Figura 22: Sintomatología de plantas control infectadas con TSWV y plantas
infectadas y tratadas con 25 mM AAS.
Fuente: FODECYT 033-2009
Figura 23: Sintomatología de plantas infectadas con TSWV tratadas con tratamientos
de 50 y 100 mM AAS.
Fuente: FODECYT 033-2009
40
III.1.5 Efectos del AAS en la transmisión del virus a una segunda
generación de plantas (F2)
Cuadro 8: Resultados de la prueba de ELISA para determinar la presencia de TSWV
en plantas de tomate v. Silverado F2 en el día 121
Réplica
de
planta
Control - Control + Tratamiento
25 mM
Tratamiento
50 mM*
Tratamiento
100 mM
1 - - - - +
2 - - - + -
3 - - - + -
Fuente: FODECYT 033-2009
Cuadro 9: Puntaje individual y puntaje total de enfermedad (PTE) de plantas de
tomate variedad Silverado F2 (inoculadas con extracto de plantas F1). Evaluación
realizada el día 128
No.
Tratamiento
AAS Virus Puntaje*
PTE por
tratamiento**
1 Control (-) No 0
0 2 Control (-) No 0
3 Control (-) No 0
4 0 mM TSWV 1
1 5 0 mM TSWV 1
6 0 mM TSWV 1
7 0 mM TSWV trat. 25 mM F2 1
0.67 8 0 mM TSWV trat. 25 mM F2 1
9 0 mM TSWV trat. 25 mM F2 2
10 0 mM TSWV trat. 50 mM F2 1
0.55 11 0 mM TSWV trat. 50 mM F2 3
12 0 mM TSWV trat. 50 mM F2 1
13 0 mM TSWV trat. 100 mM F2 1
1 14 0 mM TSWV trat. 100 mM F2 1
15 0 mM TSWV trat. 100 mM F2 1 * La evaluación de la severidad de síntomas está basada en la escala usada por Radwan et al, 2007: 0 = no presenta síntomas, 1 = lesiones cloróticas locales y bronceado leve, 2 = bronceado severo, 3 =
malformaciones.
**Se calcula usando la siguiente fórmula:
PTE = (grado de severidad de síntomas x número de plantas en cada grado) (Número total de plantas x grado de severidad de síntomas más alto)
Fuente: FODECYT 033-2009
41
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Este estudio podría considerarse un estudio piloto que permitió implementar y
probar metodologías que podrían servir para seguir explorando los efectos de los
tratamientos con ácido salicílico y ácido acetilsalicílico en la resistencia sistémica
adquirida (RSA) de plantas en general. Durante la ejecución de este proyecto resaltó
la importancia de tener métodos confiables y reproducibles para evaluar las variables
experimentales que permitan estudiar los cambios fisiológicos que se llevan a cabo
durante los procesos infectivos en plantas y sus mecanismos de defensa.
El primer reto fue el de encontrar un método de inoculación de plantas
indicadoras y un virus que fuera capaz de infectar plantas de tomate, específicamente
de la variedad Silverado. Esta variedad es altamente susceptible a ataques por
begomovirus transmitidos por mosca blanca (Mejía, 2003), pero no se tiene
información sobre su susceptibilidad a otros virus. La elección de la variedad de
tomate se hizo en base a su susceptibilidad a infecciones y al hecho de que es una de
las variedades que más se cultivan en el país debido a sus propiedades organolépticas.
Después de realizar varias pruebas con distintos virus, distintas variedades de plantas
indicadoras y distintas formas de inoculación, se hizo evidente que la elección del
buffer, las condiciones ambientales, las variedades de plantas indicadoras y el virus en
sí, son factores fundamentales que deben considerarse para realizar una inoculación
de virus exitosa. Fue posible determinar que el tomate v. Silverado no es un buen
hospedero de los virus TAV y CVB, ya que estos tienen porcentajes de infectividad
muy baja. Además, el tomate posiblemente tampoco sea un hospedero de los virus
PepMV, PRSV, CGmmV, SqMV ya que con ninguno de ellos se logró ninguna
infección, lo cual fue confirmado por ensayos de ELISA específicos para cada uno de
estos virus. Lo mismo ocurrió con un potyvirus encontrado en una planta ornamental
de la familia de las leguminosas. En términos de métodos de inoculación, en todas las
pruebas se observó que la inoculación mecánica es más eficiente que los injertos.
Este tipo de inoculación se optimiza aún más cuando se usa un buffer de fosfatos 0.01
M pH 7.2. Finalmente se logró encontrar un virus adecuado, con una infectividad del
100%: el virus del bronceado del tomate (TSWV), el cual puede inocularse
exitosamente mecánicamente pero que no pudo inocularse por medio de injertos
(Cuadro 3). Generalmente, las inoculaciones para este tipo de determinaciones se
hacen por medio de inoculación mecánica usando un abrasivo para introducir las
partículas virales dentro del tejido vegetal de la planta de estudio (Király et al, 2008;
Yalpani et al, 1993; Enyedi et al, 1992). Debido a la alta capacidad de infectividad del
TSWV, se decidió utilizar este virus para realizar todos los ensayos posteriores del
estudio. Se debe mencionar que la elección del TSWV no se hizo únicamente en base
a su capacidad de infectividad bajo condiciones de laboratorio, sino que también fue
uno de los pocos virus que se encontraron en plantaciones de tomate en el campo.
Hay que considerar que las variaciones en poblaciones de vectores, prácticas de
manejo de plantaciones y condiciones ambientales, entre otros, son factores que
determinan cuál o cuáles virus estarán presentes en un cultivo y época determinada.
Los resultados de estas pruebas también revelaron que la variedad de tomate
Silverado es susceptible a infecciones con el TSWV.
En el día 76 del cronograma de trabajo (Cuadro 2) se realizaron las evaluaciones
de sintomatología, carga viral y actividad enzimática de la generación F1 de plantas
de tomate. La Gráfica 1 muestra la curva de calibración realizada para determinar la
42
carga viral de las muestras del estudio. Esta regresión tenía un coeficiente de
correlación (r2) de 0.96, el cual es un indicador de linealidad adecuada que permite
predecir con bastante precisión las concentraciones de las muestras desconocidas.
Este ensayo mostró que las plantas pertenecientes al grupo control positivo
(infectadas con TSWV pero sin tratamiento) y las plantas infectadas y tratadas con
AAS en la menor concentración (25 mM) tenían una carga viral equivalente a la del
extracto de una planta control sin diluir. La carga viral de estos dos grupos no difirió
estadísticamente (p = 0.68). Por el contrario, las plantas tratadas con 50 y 100 mM de
AAS tenían una carga viral de 0, lo que no solo significa que no estaban infectadas
por el TSWV sino que el tratamiento fue sido capaz de evitar la infección con TSWV
inducida por las inoculaciones mecánicas que se le realizaron a estos lotes de plantas.
Radwan y colaboradores encontraron la misma tendencia en su estudio (Radwan et al,
2007). Este grupo hizo una única aplicación de ácido salicílico a 10, 50 y 100 mM en
tres lotes de cucúrbitas (Cucurbita pepo). Sus resultados demostraron que el
tratamiento tenía una menor infección (evaluado con un DAS-ELISA) y que la
concentración más efectiva fue la de 100 mM.
En el día 100 se realizó otra curva de calibración para evaluar la carga viral de
las plantas nuevamente (Gráfica 2), pero en este caso no se obtuvo una buena
linealidad en la curva de regresión (r2 = 0.86). Esto se debió a que la carga viral en la
planta madre que sirvió de fuente de extracto para construir la curva era demasiado
alta y la prueba de ELISA no fue capaz de distinguir entre las 5 diluciones mas
concentradas del extracto lo que hizo que una sección de la curva fuera totalmente
plana, reduciendo así la linealidad de la distribución. Esto no permitió evaluar la
carga viral de las plantas de estudio, pero si se logró determinar que las muestras de
los lotes de control positivo y tratado con 25 mM AAS seguían infectadas. Estos
resultados no permiten la recomendación de este método para determinar la carga
viral de una planta, ya que con altas concentraciones de virus, no se obtienen
resultados confiables. En la actualidad se están desarrollando sistemas para
cuantificación de carga viral con tecnología de punta como el Realtime PCR
(Fundación Ciencia para la Vida, sin fecha), los cuales son altamente sensibles y
específicos pero lamentablemente tienen costos muy elevados. Por otro lado, al
realizar estas pruebas se encontró que el lote tratado con 50 mM AAS desarrolló
infección mientras que el lote tratado con 100 mM AAS siguió sano (Cuadro 6), pero
los títulos de las plantas tratadas con 50 mM AAS eran menores que los del lote de 25
mM AAS. Esto podría ser una indicación de que el tratamiento con AAS a ciertas
concentraciones no elimina el virus completamente y este queda en un estado
“latente” y puede desarrollar una infección si no se siguen haciendo aplicaciones
periódicas del tratamiento.
La actividad enzimática de las plantas del estudio fue medida con el fin de
evaluar uno de los componentes de la resistencia sistémica adquirida (RSA) y
determinar cómo la infección con TSWV y los tratamientos con AAS alteran la
actividad enzimática de la polifenol oxidasa (PPO) y la guayacol peroxidasa (POX).
Los análisis de actividad enzimática se realizaron durante los días 76 al lote de plantas
F1 y en el día 121 a las plantas F2, al igual que la carga viral y escala de
sintomatología. Durante el día 76 se vio una clara diferencia en la actividad
enzimática de la POX entre los grupos control y tratamiento 25 mM y el resto de los
lotes de plantas, ambos grupos además tenían infecciones activas por el TSWV y
cargas virales altas (Gráfica 3). Estos dos grupos presentaron actividades enzimáticas
43
superiores que el resto de lotes y esto se debe probablemente a que durante un proceso
de infección, el sistema de defensa de la planta aumenta la producción de radicales
libres que causarán necrosis en el tejido vegetal con el fin de detener la propagación
de la infección al resto de la planta. Las enzimas antioxidantes son fundamentales
para modular la acción de estos radicales libres ya que en grandes cantidades pueden
causar daños severos a la planta y por eso es posible que sus actividades estuvieran
aumentadas durante este período de infección. Nuestros hallazgos contradicen los
encontrados por Radwan et al (2007), quienes encontraron mayor actividad
enzimática en plantas de calabaza que fueron tratadas con ácido salicílico que sus
controles pero si había una tendencia a que la actividad enzimática se redujera a
medida que aumentaba la concentración del ácido salicílico. Királi y colaboradores
(2002) por otro lado encontraron una reducción en la actividad de la POX en plantas
infectadas y tratadas con AS en comparación con las que no estaban tratadas con este
compuesto, esto apoya nuestros hallazgos.
En cuanto a la PPO, los mismos dos grupos presentaron actividades enzimáticas
significativamente mayores, pero también el grupo control negativo mostró actividad
alta, que no difirió estadísticamente del grupo de 25 mM (Gráfica 4). En este caso el
efecto de infección y tratamiento en la actividad enzimática no es tan claro, lo cual
podría significar que esta enzima no es un buen marcador de actividad enzimática
durante infecciones virales. Aparentemente, la concentración de AAS no altera
significativamente la actividad de estas enzimas, sino que ellas están más
influenciadas por los procesos de infección del virus.
Al realizar las pruebas enzimáticas a las plantas F2, se observaron hallazgos
interesantes. En este caso, no habían diferencias significativas en la actividad de la
PPO entre ninguno de los grupos experimentales (Gráfica 5), mientras que para la
POX únicamente el grupo control negativo era estadísticamente inferior a los otros
cuatro grupos (control positivo, tratamientos 25, 50 y 100 mM AAS), aunque existía
una tendencia a que los grupos de 25 y 50 mM fueran más altos que los demás, lo cual
corresponde al hecho de que estos grupos empezaban a mostrar infecciones activas
con TSWV (Gráfica 6). En base a esto, se hace evidente que la actividad de la enzima
POX es un mejor indicador de los cambios que ocurren durante infecciones virales
que la PPO.
Finalmente se evaluó la severidad de la sintomatología utilizando una puntaje de
severidad propuesto por Radwan et al, 2007. La Cuadro 6 muestra el puntaje
individual y el puntaje total de enfermedad (PTE) del lote de plantas F1, evaluado el
día 76 del estudio. Los resultados muestran que como era de esperarse, los controles
negativos no mostraban ninguna sintomatología, mientras que las plantas del grupo
control positivo si presentaban una fuerte sintomatología grado 3 con malformaciones
en fruto y hojas (Figura 28). Los grupos experimentales de 25, 50 y 100 mM AAS
mostraron un gradiente de sintomatología, es decir, las plantas tratadas con 25 mM
AAS presentaban sintomatología grado 3, mientras que la mayoría de las plantas del
grupo de 50 mM tenían sintomatología grado 2. En el caso del grupo de 100 mM
AAS, las plantas no mostraron ninguna sintomatología (Figura 29) y tenían un PTE de
cero. En el estudio de Radwan et al, 2007, los puntajes de severidad también fueron
inversamente proporcionales a la concentración del tratamiento aplicado, lo que da
mas soporte a los hallazgos encontrados en este estudio. El PTE no resultó ser un
buen indicador ya que no considera el caso en el que todas las plantas del grupo
44
tengan la misma sintomatología ya que algebraicamente este puntaje dará 1, lo que
ocurre en el caso de que todas las plantas tienen sintomatología grados 3, 2 ó 1.
En este estudio también se evaluó la capacidad del virus de infectar otras plantas
que no han sido tratadas con AAS, después de haber estado en un hospedero que si
fue tratado con este químico. Para ello se tomaron muestras del tejido vegetal de las
plantas F1 y se inoculó un nuevo lote de plantas sanas que no fue tratado con AAS.
La evaluación de presencia de virus por medio de ELISA realizada durante el día 121
reveló que algunas de las plantas del grupo tratado con AAS 50 y 100 mM
presentaban infección (Cuadro 8). Posteriormente, en el día 128, se hizo la evaluación
de sintomatología de este lote y se observó que los controles negativos tuvieron un
PTE de cero como era de esperarse, los controles positivos mostraron sintomatología
leve grado 1 pero en esta ocasión, todos los grupos experimentales mostraron
sintomatología como mínimo de grado 1 (Cuadro 9). Esto demuestra que los virus
pueden quedar de forma persistente en el tejido tratado con AAS y son capaces de
infectar otras plantas. El AAS aparentemente disminuye la aparición de síntomas y
reduce la carga viral, pero no es capaz de eliminar el virus por completo de la planta
infectada.
Este estudio evidenció la capacidad del AAS en reducir la carga viral del TSWV
en plantas de tomate Silverado en forma dosis-dependiente por medio de un aumento
en la RSA de la planta. Es importante resaltar que se deben hacer varias aplicaciones
del tratamiento (100 mM es la dosis óptima) a lo largo de todo el desarrollo de la
planta, pero esto podría tener efectos negativos en el rendimiento de la cosecha ya que
un estado permanente de defensa acrecentada podría causar que la planta invierta
recursos en defenderse y no en producir una mayor cantidad de fruto. Otro de los
hallazgos interesantes fue el de la actividad enzimática de la POX, la cual se ve
acrecentada en situaciones cuando existe una infección viral. Aparentemente el AAS
no tiene ningún efecto en las actividades de la PPO y la POX.
45
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES
1. Se realizaron pruebas preliminares para determinar cuál es la mejor
metodología de inoculación de virus en plantas de tomate para los fines de este
estudio y se determinó que la mejor metodología de inoculación de virus en
plantas de tomate era la inoculación mecánica con buffer de fosfatos 0.01 M
pH 7.2.
2. Se evaluó la capacidad de infección de tres virus que atacan cultivos de tomate
(TMV, TSWV y potyvirus) con el fin de seleccionar un virus que permitiera
llevar a cabo eficazmente los ensayos de esta propuesta y se determinó que el
virus del bronceado del tomate (TSWV) es el virus que presentó el mejor
porcentaje de infectividad en plantas indicadoras de tomate variedad
Silverado.
3. Se implementó la metodología para la cuantificación de carga viral en plantas
infectadas con virus, pero esta funciona únicamente cuando la carga viral de la
planta fuente de inóculo no es muy alta.
4. Se evaluaron los efectos del ácido acetilsalicílico en la carga viral de plantas
de tomate infectadas y se observó que el ácido acetilsalicílico es capaz de
reducir la carga viral de plantas de tomate infectadas con TSWV en forma
dosis-dependiente.
5. Se determinó la concentración óptima de ácido acetilsalicílico que se debe
aplicar para tener un efecto significativo en la reducción de síntomas de
infección por virus y en la carga viral en la planta, la cual es de 100 mM.
6. Se evaluó la RSA en plantas indicadoras infectadas con virus por medio de
marcadores de oxidación (enzimas antioxidantes guayacol peroxidasa y
polifenol oxidasa) y se determinó que ésta no se ve alterada por la aplicación
de tratamientos de AAS, pero si por la presencia de infección con el virus
TSWV.
7. Se determinó que la aplicación del AAS no afecta la capacidad del virus para
re-infectar otras plantas
8. Las aplicaciones de AAS disminuyen la aparición de síntomas de TSWV de
forma dosis dependiente, según la escala de puntaje de síntomas utilizada en
este estudio.
46
IV.2 RECOMENDACIONES
1. Después de realizar pruebas preliminares para determinar cuál es la mejor
metodología de inoculación, se hizo evidente que siempre que se hagan
ensayos de inoculación, se deben explorar varias metodologías para optimizar
los porcentajes de infección con virus en plantas indicadoras.
2. Se deben realizar experimentos que midan la capacidad de infección de varios
virus que atacan tomate o estudiar mas a fondo las infecciones mixtas que
podrían atacar al tomate.
3. Es necesario realizar más pruebas de laboratorio para encontrar una
metodología que pueda utilizarse para medir la carga viral de plantas
infectadas con virus, ya que la metodología propuesta no funciona para plantas
que tienen infecciones muy fuertes y cargas virales muy altas.
4. Como futuros proyectos de investigación se recomienda realizar ensayos más
largos con más aplicaciones de tratamiento, lo que permitirá determinar si el
efecto protector del AAS permanece más tiempo y si este tiene efectos en el
rendimiento del cultivo de tomate.
5. Se deberían de evaluar otras enzimas antioxidantes que puedan servir como
biomarcadores de cambios en la RSA de plantas infectadas con virus.
6. Se han estudiado ampliamente los efectos del ácido salicílico en otros cultivos
como tabaco y cucúrbitas, pero existe una gran variedad de cultivos que aún
quedan por evaluar por lo que se recomienda hacer estudios con otros cultivos
que no sean hortalizas, por ejemplo, árboles frutales.
7. Después de haber realizado varios estudios bajo condiciones de invernadero
sería interesante realizar ensayos en campo a gran escala, ya que las
condiciones de invernadero son bastante controladas y no es posible saber cuál
será el efecto que ejerce la presión ambiental en los efectos observados bajo
condiciones de laboratorio.
8. En esta ocasión se realizaron experimentos con un solo virus, pero en el
campo existen infecciones mixtas que podrían ser más difíciles de controlar.
Es necesario explorar los efectos que el ácido salicílico podría tener en
cultivos que presenten infecciones virales mixtas o con otros patógenos.
9. El diseño experimental de este estudio consistió en hacer aplicaciones de AAS
antes de inocular la planta con el virus, pero no se sabe cuáles son los efectos
de tratamiento después de que virus ha infectado planta. Es necesario
determinar si este tratamiento es curativo o preventivo.
47
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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octubre 2008 en:
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ick.
50
IV.4 ANEXOS
51
ANEXO 1: Inoculación mecánica de virus en plantas indicadoras
1. Selección de plantas
indicadoras en estadío
adecuado para inoculación
2. Selección de material
infectado como fuente de
inóculo. Se debe escoger
material que presente la
sintomatología característica
del virus a inocular.
3. Maceración de tejido
infectado con virus de interés,
utilizando buffer de fosfatos
0.01M pH 7. Es importante
utilizar hielo para evitar la
degradación del virus.
4. Inoculación de la planta
indicadora: Se debe agregar
carborundum en la hoja a
inocular y frotar con el pistilo
que contiene la fuente de
inóculo de forma suave,
evitando dañar demasiado la
hoja.
52
(Fotos tomadas de FODECYT 033-2009)
5. Otra opción es utilizar un
hisopo para hacer la
inoculación. Esto es adecuado
cuando se utilizan plantas con
hojas delicadas que pueden
sufrir mucho daño mecánico
al ser inoculadas.
6. Lavar con agua corriente las
hojas recién inoculadas para
eliminar el carborundum
excedente.
53
ANEXO 2: Método de detección de TSWV por medio de ELISA
1. Preparación de soluciones buffer de trabajo:
- Buffer de Extracción General (GEB 1X) Disolver en 1000 mL de buffer PBST 1X: 1.3 g de sulfito de sodio anhidro, 20 g de
polyvinilpirrolidona (PVP), 0.2 g de azida de sodio, 2.0 g de albúmina de huevo
(pollo) Grado II y 20 g de Tween 20. Ajustar el pH a 7.4 y almacenar a 4°C.
- Buffer PBST (buffer de lavado) Disolver en 1000 mL de agua destilada: 8.0 g de cloruro de sodio (NaCl), 0.2 g de
fosfato de potasio anhidro (KH2PO4), 1.15 g de fosfato de sodio dibásico anhidro
(NaHPO4) y 0.2 g de cloruro de potasio (KCl). Ajustar el pH a 7.2 – 7.4. Agregar 0.5
g de Tween 20. Ajustar el pH a 7.4 y almacenar a 4° C.
- Buffer ECI
Disolver en 1000 mL de PBST 2.0 g de albúmina sérica bovina (BSA), 20.0 g de
polivinilpirrolidona (PVP), 0.2 g de azida sódica (NaN3). Ajustar el pH a 7.4.
Almacenar a 4°C.
- Buffer de sustrato PNP (1X)
Disolver en 800 mL de agua destilada: 0.1 g de cloruro de magnesio hexahidratado,
0.2 g de azida de sodio y 97 mL de dietanolamina. Ajustar el pH a 9.8 con HCl.
Aforar a 1000 mL con agua destilada. Almacenar a 4°C.
- Buffer de carbonato de cobertura (1X)
Disolver en 1000 mL de agua destilada 1.59 g de carbonato de sodio anhidro, 2.93 g
de bicarbonato de sodio y 0.2 g de azida de sodio. Ajustar el pH a 9.6 y almacenar a
4°C.
2. Mapa de la placa:
Antes de empezar a trabajar, utilizar el cuadro de abajo para hacer un mapa de la
colocación de las muestras en la placa de ELISA. Todas las muestras, controles y
blanco se trabajan en duplicado. Se pueden trabajar un máximo de 46 muestras por
placa, más los controles positivo y negativo y blanco.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
54
3. Preparación, adición e incubación con anticuerpo de captura:
- Anticuerpo debe ser diluido con buffer de carbonato antes de usarse. Preparar
de la siguiente forma:
Para 96 pozos:
En un beaker de vidrio de 50 ml colocar 10 ml de buffer de carbonato y 50 l de
anticuerpo de detección (Agdia).
Agitar por aproximadamente 10 minutos.
Para un menor número de pozos:
- (número de pozos + 2) x (10 ml/96 pozos)= ml de buffer de carbonato
- (ml de buffer carbonato) x (1/200*)ml x (1000l/1ml)= l de anticuerpo de captura
* Se refiere a la dilución del anticuerpo según casa comercial (puede ser 100 ó 200)
- Agregar 100 uL de anticuerpo de captura por cada pozo.
- Incubar la placa por 4 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C.
4. Lavado de placas
- Remover el tape con cuidado.
- Vaciar la placa (sacudiéndola fuerte pero no bruscamente sobre el lavadero).
- Llenar los pozos de la placa con PBST (buffer de lavado).
- Se sacude y se seca somatando sobre servilletas hasta que quede bien seca.
- Se llena inmediatamente con el reactivo del siguiente paso.
- Se deja 3 minutos entre cada lavado, esto se hace 6 veces más.
5. Preparación de muestras:
Trabajar todas las muestras en duplicado. Se pueden trabajar 46 muestras máximo,
más los controles positivo y negativo.
Preferiblemente tomar muestras con sintomatología. Se pueden analizar muestras
compuestas de hasta 10 hojas por pozo, no obstante, muchas plantas por pozo
pueden reducir la sensibilidad del ensayo.
En un vial de poliestireno de 7 ml pesar 1 g de cada muestra y agregar 10 ml de
buffer de extracción general (GEB). Macerar hasta que el tejido quede homogéneo.
Entre cada muestra lavar el macerador con solución de cloro 10% y desaguar con
agua destilada.
6. Colocación de las muestras:
- Colocar en los pozos A1 y A2 100 μL buffer de extracción indirecto el cual servirá
de blanco.
- Colocar 100μl de control positivo de Agdia® en los pozos A3 y A4 (si no hay
control positivo de Agdia® puede colocar muestra de una hoja infectada). Al
control congelado agregarle 100μl de buffer de extracción directo y resuspenderlo.
- Colocar 100μl control negativo de Agdia® en los pozos A5 y A6 (si no hay control
negativo de Agdia® puede colocar muestra de una hoja no infectada). Al control
congelado agregarle 100μl de buffer de extracción directo y resuspenderlo.
55
- Colocar 100l de cada muestra macerada en los pozos correspondientes. Hacerlo
en duplicado.
- Cubrir con tape
- Incubar 1 hora en cámara húmeda
7. Preparación del conjugado enzimático
Preparar el conjugado dentro de los 10 minutos previos a su uso.
Para 96 pozos:
En un beaker de vidrio de 50 ml colocar 10 ml de buffer ECI y 50 l de conjugado
enzimático (Agdia).
Agitar por aproximadamente 10 minutos.
Para un menor número de pozos:
- (número de pozos + 2) x (10 ml/96 pozos)= ml de buffer ECI
- (ml de buffer ECI) x (1/200*)ml x (1000l/1ml)= l de conjugado enzimático
* Se refiere a la dilución del anticuerpo según casa comercial (puede ser 100 ó 200)
Lavar la placa como se indica en paso 4.
8. Adición de conjugado enzimático:
Agregar 100l de conjugado enzimático en cada pozo y cubrir con tape. Incubar
durante 1 hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
9. Preparación de la solución de PNP:
Unos 15 minutos antes de que termine el período de incubación anterior, agregar una
pastilla de PNP por cada 5ml de buffer de revelado (1 mg/mL) y disolverla hasta que
desaparezca la pastilla.
NOTA: No tocar las tabletas de PNP o exponer la solución de PNP a luz fuerte. Luz
o contaminación pueden causar color de fondo en pozos negativos.
Lavar la placa según se indica en paso 4.
10. Revelado de placa con solución de PNP:
Agregar 100ul de la solución de PNP a cada pozo. Colocar la placa en una cámara
oscura (sin tape) por una hora.
11. Lectura de placa:
Se hacen de dos a tres lecturas (una hora, dos horas o hasta tres horas después de
haber agregado la solución de PNP, siempre y cuando los pozos negativos y del
buffer permanezcan incoloros).
- Encender el lector de placas de ELISA 15 minutos antes de hacer la lectura para
que caliente la lámpara
- Hacer lecturas de absorbancia a 405 nm
NOTA: Las burbujas de aire pueden alterar las lecturas por lo que se recomienda
eliminarlas antes de cada lectura.
56
ANEXO 3: Simposio “Mecanismos de defensa de plantas contra patógenos”
Del 28 al 31 de marzo, 2011 se llevo a cabo un simposio donde varios
expositores trataron temas relacionados a las interacciones patógeno-hospedero y los
mecanismos moleculares y fisiológicos que se llevan a cabo en una planta al ser
atacada por una diversidad de patógenos e insectos. El simposio contó con la
presencia de participantes provenientes de instituciones como el Ministerio de
Agricultura y Ganadería (MAGA), la Facultad de Agronomía de la Universidad de
San Carlos de Guatemala, empresas privadas y estudiantes de distintas carreras de la
Universidad del Valle de Guatemala.
Entre los expositores se encontraban el Ing. Emerson Herrera quién dio una
charla introductoria sobre los procesos de infección en plantas. Posteriormente se
expusieron los resultados del proyecto FODECYT 033-2009 en una plática titulada
“Resistencia Sistémica Adquirida (RSA) en plantas”. La Dra. Krisztina Ríos-
González profundizó en el tema de la protección de las plantas contra el estrés,
enfocándose en el sistema de defensa antioxidante de las plantas. Durante el segundo
día del evento, la Licda. Margarita Palmieri expuso las generalidades de los virus de
plantas. El Dr. Manuel Porres habló del control preventivo de plagas y enfermedades
en varios cultivos de interés en Guatemala, y finalmente la Dra. Mónica Stein expuso
los hallazgos de su tesis doctoral en una charla titulada: “La resistencia “No huésped”
de plantas contra hongos”. En el tercer día del simposio, el Dr. Jack Schuster hizo
una exposición ilustrativa de varios ejemplos de interacciones insecto-hospedero,
posteriormente se tocó el tema de la ingeniería genética y la factibilidad de su
introducción en Guatemala, así como las controversias que esta tecnología presenta.
Las charlas de ese día culminaron con la plática del Ing. Gustavo Alvarez, de la
USAC, quien habló de la fisiopatología de las infeccione por nematodos en plantas.
Finalmente, el evento terminó con dos charlas, una de ellas dada por el Ing. Luis
Fernando Orellana de Bayer CropScience, Guatemala, en donde se expusieron las
nuevas opciones disponibles en el mercado para el control de plagas por medio de
agroquímicos. La plática final fue impartida por la Licda. Margarita Palmieri, quien
expuso la situación actual del país en términos de las plagas y enfermedades vegetales
presentes.
Durante el simposio se dieron coffee breaks cada día del evento y se hizo
entrega de un diploma de participación a todos los asistentes del simposio. Merck
Guatemala hizo una donación de lapiceros y DILABSA de bloques de notas para ser
entregados como material a todos los participantes. Lastimosamente el Dr. Pedro
Ramos del IIFT de Cuba no pudo obtener la autorización de salida a tiempo por lo que
no pudo asistir a la actividad. En su lugar, la Dra. Ríos-González y el Dr. Schuster
dieron pláticas relacionadas al tema general del simposio.
El programa de la actividad se muestra a continuación, junto con algunas
fotografías del evento.
57
PROGRAMA SIMPOSIO “Mecanismos de Defensa de Plantas Contra Patógenos
Lunes 28 de marzo Martes 29 de
marzo
Miércoles 30 de
marzo Jueves 31 de marzo
Generalidades de
los procesos de
infección en plantas Ing. Emerson Herrera,
MSc
Universidad del Valle de Guatemala
Virus de plantas Licda. Margarita Palmieri Universidad del Valle de
Guatemala
Misceláneos sobre
interacciones
insecto-hospedero Dr. Jack Schuster, PhD
Universidad del Valle de Guatemala
Control de plagas
por medio de
agroquímicos Ing. Luis Fernando
Orellana, MSc Bayer CropScience
Guatemala
Coffee Break Coffee Break Coffee Break Coffee Break
Resistencia
Sistémica
Adquirida (RSA)
en plantas Dra. Mónica Orozco, PhD
Universidad del Valle de Guatemala
Control preventivo
de plagas y
enfermedades Dr. Manuel Porres, PhD Universidad del Valle de
Guatemala
¿Es posible
desarrollar
ingeniería genética
agrícola en
Guatemala? Dra. Mónica Stein, PhD Universidad del Valle de
Guatemala
La situación actual
de las plagas en
cultivos de
Guatemala Licda. Margarita Palmieri
Universidad del Valle de Guatemala
Protección Contra
Estrés: Sistema de
Defensa
Antioxidante en
Plantas Dra. Krisztina Ríos-
González
Universidad del Valle de Guatemala
La resistencia "No
huésped" de
plantas contra
hongos biotróficos Dra. Mónica Stein, PhD Universidad del Valle de
Guatemala
Fisiopatología de
las infecciones por
nematodos Ing. Gustavo Alvarez Universidad de San
Carlos de Guatemala
Cierre de la
actividad
58
Presentación dada por el Ing. Emerson Herrera durante el simposio
Fuente: FODECYT 033-2009
Presentación dada por la Dra. Mónica Orozco durante el simposio
Fuente: FODECYT 033-2009
56
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO
AD-R-0013
Nombre del Proyecto:
Numero del Proyecto: 033-2009
Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto: DRA. MÓNICA NINNETTE OROZCO FIGUEROAMonto Autorizado: Q168,685.00
Plazo en meses 12 meses 1a.
Fecha de Inicio y Finalización: 01/06/2009 al 31/05/2010 2a.
Menos (-) Mas (+)
1 Servicios no personales
181
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad 39,300.00Q 37,800.00Q 1,500.00Q
181
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) 8,000.00Q 8,000.00Q
121 Divulgación e información 500.00Q 96.00Q 404.00Q
122 Impresión, encuadernación y reproducción 2,500.00Q 2,000.00Q 247.50Q 4,252.50Q
133 Viáticos en el interior 4,000.00Q 4,000.00Q
163
Mantenimiento y reparación de equipo médico-
sanitario y de laboratorio 5,450.00Q 1,375.00Q 4,075.00Q
185 Servicios de capacitación 28,000.00Q 3,500.00Q 24,500.00Q
2 MATERIALES Y SUMINISTROS
211 Alimentos para personas 231.80Q -231.80 Q
223 Piedra, arcilla y arena 500.00Q 500.00Q
241 Papel de escritoiro 300.00Q 216.00Q 84.00Q
243 Productos de papel o cartón 200.00Q 341.40Q -141.40 Q
249 Otros productos de papel, cartón e impresos 200.00Q 200.00Q
252 Artículos de cuero 109.98Q 109.98Q -Q
261 Elementos y compuestos químicos 40,000.00Q 24,575.95Q 15,912.86Q -488.81 Q
262 Combustibles y Lubricantes 4,000.00Q 524.97Q 3,475.03Q
263 Abonos y fertilizantes 2,500.00Q 2,131.00Q 369.00Q
264 Insecticidas, fumigantes y similares 2,500.00Q 717.50Q 3,217.50Q -Q
267 Tintes, pinturas y colorantes 1,000.00Q 1,000.00Q
268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 3,000.00Q 2,068.57Q 23,088.70Q 1,792.13Q 22,228.00Q
269 Otros productos químicos y conexos 3,000.00Q 3,000.00Q
272 Productos de vidrio 3,000.00Q 3,000.00Q
283 Productos de metal 224.97Q 224.97Q -Q
286 Herramientas menores 400.00Q 1,019.90Q 1,419.90Q -Q
291 Útiles de oficina 500.00Q 1,500.00Q 207.20Q 1,792.80Q
292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 1,000.00Q 569.95Q 430.05Q
295
Útiles menores, médico-quirúrgicos y de
laboratorio 500.00Q 2,300.96Q 3,138.41Q -337.45 Q
297 Útiles, accesorios y materiales eléctricos 2,000.00Q 817.49Q 1,182.51Q
299 Otros materiales y suministros 1,000.00Q 382.37Q 617.63Q
3
PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E
INTANGIBLES
GASTOS DE ADMÓN. (10%) 15,335.00Q 15,335.00Q -Q
168,685.00Q 30,962.01Q 30,962.01Q 85,273.94Q 83,411.06Q
MONTO AUTORIZADO 168,685.00Q Disponibilidad 83,411.06Q
(-) EJECUTADO 85,273.94Q
SUBTOTAL 83,411.06Q
(-) CAJA CHICA
TOTAL POR EJECUTAR 83,411.06Q
PRÓRROGA AL 30/11/2010
FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA
LINEA:
FODECYT
"Evaluación del efecto de la aplicación de ácido acetilsalicílico en el mejoramiento del sistema
de resistencia sistémica adquirida (RSA) de plantas de tomate susceptibles a virus"
Orden de Inicio (y/o Fecha primer pago):
PRÓRROGA AL 31/03/2011
Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion
Presupuestaria
TRANSFERENCIA En Ejecuciòn
Ejecutado Pendiente de
Ejecutar