CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA, UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA,

INFORME FINAL

VARIABILIDAD GENÉTICA, DESARROLLO DE TECNOLOGÍA AGRÍCOLA Y CARACTERIZACIÓN FITOFARMACÉUTICA DE UNA ESPECIE DE VALERIANA (Valeriana prionophylla) NATIVA DE GUATEMALA CON

POTENCIAL COMO SEDANTE NATURAL

Proyecto FODECYT 102-2006.

Armando Cáceres EstradaInvestigador Principal

GUATEMALA, 11 DE DICIEMBRE DE 2009.

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AGRADECIMIENTOS

La rrealización de este trabajo ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Naional de Ciencia y Tecnología (FONACYT), otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT) y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONCYT).

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RESUMEN

Por información etnobotánica y contacto con acopiadores de V. prionophylla, se colectaron 33 muestras de material silvestre y manejado de 9 localidades en el altiplano del país. Se hizo la determinación botánica, se estableció una colección en FAUSAC, se estudio la forma de producir semilla, se ensayaron técnicas de propagación, y se describió el procesamiento y secado de hojas y rizomas. Además, se colectó y evaluó V. deltoidea. Se avanzó en el conocimiento de la biología y aspectos para el manejo, y para el futuro será necesario avanzar en el cultivo de las colectas promisorias.

Se caracterizaron los especímenes colectados, determinándose que todos cumplen con los límites fisicoquímicos de cenizas totales e insolubles en ácido y rendimiento de aceite esencial establecidos para el rizoma de V. officinalis. Las condiciones de cultivo aumentaron el rendimiento de aceite esencial. Su pudo establecer la presencia de valepotriatos, flavonoides y ácidos valerénicos, tanto en hojas como rizomas.

Los parámetros de calidad para extractos y tinturas demuestran que cumplen con los límites de sólidos extraíbles y la presencia de flavonoides, antocianinas, saponinas, aceites volátiles y valepotriatos. La principal diferencia con la especie oficinal es la ausencia de alcaloides. La abundancia de flavonoides fue mayor en el material silvestre; la tintura 1:10 en etanol al 50% extrajo la mayor cantidad. Hallazgos similares, aunque con menor abundancia se encontraron en V. deltoidea, pero no presenta valepotriatos. La abundancia de ácidos valerénicos fue mayor en hojas y rizomas cultivados; la tintura farmacopeica extrajo mayor cantidad de estos metabolitos. En base a cantidad de flavonoides y ácidos valerénicos los especímenes más promisorios son los de Tutuapa, Raxquim y Choanlá, siendo el primero el único que posee los tres ácidos valerénicos.

Por CG se demostró que los metabolitos de interés en los aceites son ácido iso-valérico, ácido 3-metilvalérico, isovalerato de alilo y ácido valérico, formando más del 50% del aceite. Los rizomas cultivados muestran mayor abundancia de éstos metabolitos y contienen otros compuestos de interés como ácido 3-metil-2-oxo valérico, glucurónido de morfina y 3-hidroxybromacepan. La caracterización de aceites volátiles por micro-extracción demostró ser una alternativa viable cuando se cuenta con poca cantidad de muestra. La estabilidad del extracto 1:1 de rizoma de Tutuapa, es de 90 días según el estudio de estabilidad acelerada, lo que concuerda con los 60 días de estabilidad indicada por las farmacopeas para estas preparaciones.

Se demostró una escasa actividad biocida de los extractos del rizoma (B. subtilis, 0.25 mg/ml y S. aureus, 0.50 mg/ml). No se demostró actividad contra levaduras, hongos, nauplios de A. salina y larvas de A. aegypti y A. albimanus. Los modelos animales demostraron que el extracto de Tutuapa presenta actividad sedante, ansiolítica y antidepresiva, pero no presenta actividad anticonvulsivante e hipnótica. Se demostróactividad deletérea sobre la consolidación de la memoria aversiva, que deberá evaluarse.

Se preparó una monografía farmacopéica de V. prionophylla, que puede ser útil a los sectores productivos y reguladores para sistematizar la producción y uso seguro de esta droga vegetal que tiene suficientes elementos para ser considerada equivalente a V. officinalis, pero con características ecológicas propias. Se participó en la formación de recursos humanos y en la difusión de los hallazgos del presente proyecto, para aumentar su impacto e incidir más allá de los resultados directos del proyecto.

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ABSTRACT

By ethnobotanical information and contact with Valeriana prionophylla collectors, 33 samples of wild and managed material were collected in 9 places from the Guatemalan Highland. Botanical determination was done, a collection was established in FAUSAC, the way to produce seeds was studied, several propagation techniques were assayed, and the process and drying of leaves and rhizomes was described. A sample of V. deltoideawas also collected. We advanced in the knowledge on the biology and handling of the specie, and it is necessary in the future to advance in the cultivation of promising samples.

The collected samples were characterized, determining that all are in the physico-chemical limits for total and acid insoluble ashes, and the yield of essential oil for V. prionophylla rhizome was established. The cultivation conditions increase the yield of essential oils. It was demonstrated the presence of valepotriates, flavonoids and valerenic acids, in leaves as well as in rhizomes.

The quality parametrs for extracts and tinctures showed that all are in accordance with de limits for extractable solids and the presences of flavonoids, anthocyanins, saponins, volatile oils and valepotrates. The main difference with V. officinalis is the abscense on alkaloids. The abundance of flavonoids was greater in wild material; the tincture 1:10 en etanol 50% extracted the greatest amount. Similar findings, although ion smaller amount, were found in V. deltoidea, but no valepotriates were found. The abundance of valerenic acids was greater in cultivated leaves and rhizomes; the pharmacopoeic tincture extracted a greater amount of these metabolites. Based on the quantity of flavonoids and valerenic acids the most promising samples are those from Tutuapa, Raxquim and Choanlá, but the first contain the three valerenic acids.

By GC it was demonstrated that the metabolites of interest in the essential oils are isovaleric, 3-methylvaleric, allyl isovaleric and valeric acids, representing more tan 50% of the oil. The cultivated rhizomes showed more abundance of these metabolites and contained other compounds of interest, such as 3-methyl-2-oxo valeric acid, morphineglucuronide and 3-hydroxybromacepam. The characterization of the essential oil by microextraction demonstrated that it could be a viable alternative when the sample is in a small amount. The stability of 1:1 rhizome extract from Tutuapa is 90 days, according to pharmacopeic specifications for these preparations it should be at least 60 days.

It was shown very little biocidal activity of the rhizome extract (Bacillus subtilis, 0.25 mg/ml and Staphylococcus aureus, 0.50 mg/ml). No activity was shown againstyeasts, fungi, Artemia salina nauplii and Aedes aegypti and Anopheles albimanus larvae. By animal models it was demonstrated that the extract of Tutuapa strain has significant sedative, anxiolytic and anti-depressive activity. It was shown deleterious activity on the consolidation of aversive memory, activity that should be investigated.

A pharmacopoeic monograph of V. prionophylla was prepared, this could be useful to productive and regulation sectors for systematization of production and safe use of this vegetal drug which has enough elements to be considered equivalent to V. officinalis, but with particular ecologic characteristics. Human resources were trained and the findings were diffused by several means in order to increase the direct results from the Project. of findings

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BIOGRAFIA ACADÉMICA DE INVESTIGADOR PRINCIPAL

Armando Cáceres Estrada es Químico Biólogo de la Facultad de CCQQ y Farmacia, Universidad de San Carlos (USAC), con estudios de Especialización en Inmunología en las Universidades de Wisconsin, Lausanna, Brasilia y del Valle (Colombia) y entrenamiento en Farmacognosia en la Facultad de Farmacia, USAC y Universidad Kitasato, Japón.

Desde 1972 es Profesor Titular de Inmunología e Inmunopatología, en la Facultad de CCQQ y Farmacia y desde 2004 es Profesor en las Maestría en Plantas Medicinales (Universidad de San Carlos) y Fitoterapia (Universidad de Barcelona).

Es Coordinador del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT) y Director de Investigaciones del Laboratorio de Productos Naturales Farmaya S.A.

Ha sido Asesor, Director de Proyectos y Director Ejecutivo del Centro Mesoamericano de Estudios sobre Tecnología Apropiada (CEMAT) y ha sido Consultor sobre Desarrollo Rural, Salud Ambiental y desarrollo del uso ecológico de plantas medicinales para diversas instancias nacionales e internacionales, y Director Nacional de la Comisión Nacional para Aprovechamiento de las Plantas Medicinales (CONAPLAMED) y Coordinador de la Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO) del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED).

Ha sido asesor de proyectos de etnobotánica, agrotecnología y fitoterapia para organizaciones no gubernamentales y empresas fitoterápicas de Guatemala, Honduras, Costa Rica, Nicaragua, Colombia y Perú.

Ha sido miembro de varias comisiones nacionales e internacionales para la validación, producción, control y equiparación de la fitoterapia en los servicios de salud, y miembro de ocho asociaciones científicas internacionales, del Consejo de Notables del CONCYT y de la Academia de Ciencias Médicas, Físicas y Naturales.

Ha recibido subsidios de investigación nacionales [Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONCYT), Dirección General de Investigación (DIGI) e Instituto de Investigaciones Químicas y Biológicas (IIQB)] e internacionales [Organización Mundial de la Salud (OMS), Sociedad Alemana de Cooperación Técnica (GTZ), Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo (CIID), Agencia Japonesa de Cooperación Internacional (JICA), Organización de los Estados Americanos (OEA) e Institutos Nacionales de Salud (NIH)].

Ha recibido varios premios nacionales e internacionales, particularmente el Premio José Capote Díaz 1989 (Federación Panamericana de Farmacia y Bioquímica), Premio Centroamericano Nestlé de Pediatría 1992, Medalla de Ciencia y Tecnología 1998 y Medalla Universitaria 2000.Autor de más de 200 trabajos y presentaciones en eventos científicos y varios libros especializados en el campo de validación, producción, fitofarmacia y legislación de plantas medicinales y organizador de más de 70 eventos científicos nacionales e internacionales y de transferencia tecnológica al sector productivo sobre los temas de su especialidad.

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OTROS AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo ha sido posible gracias al apoyo logístico y material del Laboratorio de Productos Naturales Farmaya, S.A.

El Investigador Principal desea agradecer la colaboración de las siguientes personas que participaron en alguno de los aspectos de la investigación:

Investigadores Asociados:MSc. Vicente Martínez y Domingo Amador, FAUSACDrs. Oscar Cóbar Pinto, MA. Margarita Paz, Sully M. Cruz y María Eugenia Paredes; yLicdas Aylin Santizo, Isabel Gaitán, María del Carmen Samayoa y Fabiola de Micheo.

Investigadores Colaboradores:Dr. Valdir Cechinel Filho de RIBIOFAR del CYTED y Dra. Márcia Maria de Souza y Iandra Holzmann, Departamento de Farmacología,

Universidad del Valle de Itajaí (UNIVALI), Itajaí, Santa Catarina, Brasil

Auxiliares de investigación:Miguel Angel Chiguichón, Clinton René Pineda, Ana Carolina Valdez y Carmen Lucia

Herrera.

Organizaciones no gubernamentales y grupos proveedoresIntervida (Francisco Teleguario), Grupo de Agricultores Amigos del Campo, Asociación

de Promotores Agropecuarios del Triángulo Ixil (APAPTIX), Asociación Toto Integrado (ATI) (Obispo Gregorio García)

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TABLA DE CONTENIDOS

Agradecimientos iiResumen iiiAbstract ivBiografía académica del investigador principal vOtros agradecimientos viTabla de contenidos viiLista de ilustraciones ixLista de cuadro xLista de abreviaturas xi

PARTE I.I.1 Introducción 1I.2 Planteamiento del problema 3I.2.1 Situación del problema a nivel global 3I.2.2 Antecedentes del problema en Guatemjala 3I.2.3 Justificaciones del trabajo de investigación 4I.3 Objetivos e Hipótesis 5I.3.1 Objetivo general 5I.3.2 Objetivos específicos 5I.3.3 Hipótesis 5I.4 Metodología 5I.4.1 Variables 5I.4.2 Indicadores (verificables) 5I.4.3 Estrategia metodológica 6I.4.4 Métodos 6I.4.5 Técnica estadística 12I.4.6 Instrumentos 13

PARTE II.II.1 Introducción al marco teórico 14II.2 Selección de la droga vegetal 14II.2.1 Valeriana officinalis L. (Valerianaceae) 14II.2.2 Valeriana prionophylla Standl. (Valerianaceae) 16II.3 Procedimientos agrotecnológicos 17II.3.1 Metodología de colecta 17II.3.2 Experimentación de la actividad de propagación 17II.4 Evaluación de la actividad farmacológica 18II.4.1 Actividad biocida in vivo 18II.4.2 Actividad farmacológica in vitro 18II.5 Estudio químico de los extractos 19II.5.1 Esquema extractivo 19II.5.2 Caracterización química 19II.5.3 Cuantificación de las sustancias constitutivas 19

PARTE III.III.1 Objetivo 1 21III.1.1 Localidades muestreadas 21

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III.1.2 Descripción de las localidades y plantas de valeriana encontradas 22III.1.3 Generalidades de los materiales silvestres de valeriana 28III.1.4 Caracterización de los materiales y áreas de establecimiento 29III.1.5 Análisis del suelo para algunas localidades 34III.2 Objetivo 2 36III.2.1 Características de las flores y semillas de valeriana 36III.2.2 Obtención de semilla 37III.2.3 Germinación de semilla 38III.2.4 Desarrollo de técnicas agronómicas para cultivo de valeriana 39III.2.5 Seguimiento de la colección de valeriana 39III.2.6 Información generada de cosecha y secado 40III.3 Objetivo 3 46III.3.1 Características macroscópicas y físicas de los materiales 46III.3.2 Cuantificación de flavonoides en la droga vegetal 46III.3.3 Cuantificación de ácidos valerénicos en la droga vegetal 48III.4 Objetivo 4 51III.4.1 Caracterización fisicoquímica de tinturas y extractos 51III.4.2 Tamizaje fitoquímico de extractos y tinturas 53III.4.3 Tamizaje fitoquímico de aceites volátiles en extractos, tinturas y aceites 60III.4.4 Cuantificación de flavonoides en tinturas y extractos 63III.4.5 Cuantificación de ácidos valerénicos en tinturas y extractos 65III.4.6 Caracterización de aceites esenciales por CG/EM 67III.4.7 Análisis de los aceites esenciales por microextraccción 70III.4.8 Estudio de la estabilidad del extracto 1:1 74III.5 Objetivo 5 76III.5.1 Evaluación de la actividad farmacológica in vitro 76III.5.2 Evaluación de la actividad farmacológica in vivo 78III.6 Objetivo 6 86III.6.1 Fichas agrotecnológicas 86III.6.2 Monografías farmacopeicas 86III.6.3 Capacitación y socialización 86

PARTE IV.IV.1 Conclusiones 87IV.2 Recomendaciones 90IV.3 Referencias bibliográficas 91IV.4 Anexos 96IV.4.1 Ficha Técnica de Cultivo de Valeriana prionophylla 97IV.4.2 Monografía farmacopeica de Valeriana officinalis 100IV.4.3 Monografía farmacopeica de Valeriana prionophylla 108

PARTE VV.1 Informe financiero 121

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Lista de Ilustraciones (Figuras)

1 Mapa de distribución de colectas de valeriana2 Valeriana colectada en Chajul, Quiché3 Valeriana colectada en Nebaj, Quiché4 Valeriana colectada en Cerro Raxquim, Totonicapán5 Material colectado en Panquix, Totonicapán6 Planta con crecimiento vegetativo similar al de valeriana7 Material de valeriana de (a) Tierra Blanca y (b) Joyabaj8 Plantas de valeriana con cierto manejo para su producción9 Valeriana de Chuchucá y Choanlá10 Aspecto general de Choanlá y de las plantas de valeriana11 Población silvestre de valeriana en San José Ojetenan12 Tonalidades de los pétalos de flores de V. prionophylla13 Aspecto general de V. prionophylla (a) inflorescencia y (b) semilla14 (a) Bandejas de plántulas de V. prionophylla y (b) plántulas en almácigo 45 días15 Siembra de material silvestre en FAUSAC16 Raíz de V. prionophylla cosechada y lavada17 Material de V. prionophylla (a) Hojas secas y (b) Raíz picada18 Prueba de la mancha en droga vegetal, según AHP19 Cuantificación de flavonoides (a) estándares, (b) espectrofotómetro, (c) pantalla20 (a) Extracción; (b) equipo HPLC con bomba trifásica y (c) curva por integrador21 Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación en aparato Neocleavenger22 CCF de aceites esenciales23 Equipo de CG/EM y pantalla24 Microextracción de la droga vegetal para análisis por CG/EM25 Estabilidad acelerada del extracto 1:126 Tamizaje in vitro de actividad antibacteriana y antifúngica27 CIM de B. subtilis y S. aureus28 Aparato rotarod para evaluar coordinación sensomotora29 Tiempo de permanencia en segundos30 Aparato de campo abierto y resultados de actividad31 Aparatos de actividad ansiolítica y sedante y resultados32 Tanque de nado forzado33 Resultados de (a) Tiempo de agitación y (b) Tiempo de inmovilidad34 Aparato para medir inhibición de la evasión35 Efecto de diazepam y V. prionophylla sobre la consolidación de la memoria36 Modelo anticonvulsivante37 Latencia por crisis convulsiva por (a) PTZ y (b) estricnina

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Lista de Cuadros

1 Distribución geográfica y variabilidad de valeriana en Guatemala2 Minerales nutritivos presentes en la planta y el suelo de Tierra Blanca3 Minerales nutritivos presentes en la planta y el suelo de cerro Raxquim4 Caracterización organoléptica de la droga vegetal (hoja)5 Caracterización organoléptica de la droga vegetal (rizoma)6 Caracterización fisicoquímica de la droga vegetal (hoja)7 Caracterización fisicoquímica de la droga vegetal (rizoma)8 Contenido de flavonoides de la droga vegetal (hoja) en hiperósido9 Contenido de flavonoides de la droga vegetal (rizoma) en hiperósido10 Contenido de ácidos valerénicos en la droga vegetal (hoja)11 Contenido de ácidos valerénicos en la droga vegetal (rizoma)12 Caracterización fisicoquímica de tinturas y extractos (hoja)13 Caracterización fisicoquímica de tinturas y extractos (rizoma)14 Tamizaje fitoquímico por CCF para caracterizar tintura (hoja)15 Tamizaje fitoquímico por CCF para caracterizar tintura (rizoma)16 Tamizaje fitoquímico por CCF para caracterizar extractos secos (hoja y rizoma)17 Identificación de los componentes de aceites volátiles por CCF (hoja).18 Identificación de los componentes de aceites volátiles por CCF (rizoma).19 Cuantificación de flavonoides en tinturas y extractos (hoja)20 Cuantificación de flavonoides en tinturas y extractos (rizoma)21 Cuantificación de ácidos valerénicos en tinturas y extractos (hoja)22 Cuantificación de ácidos valerénicos en tinturas y extractos (rizoma)23 Caracterización de los aceites esenciales obtenidos en orden de abundancia24 Compuestos de interés por hidrodestilación y microextracción (hoja)25 Compuestos de interés por hidrodestilación y microextracción (rizoma)26 Composición química de aceites obtenidos por microextracción27 Condiciones de almacenamiento de muestras para estudios de estabilidad28 Cuantificación de ácidos valerénicos por curva de calibración29 Promedio de ácidos valerénicos por curva de calibración30 Valores de pH en las pruebas de estabilidad acelerada31 Tamizaje antimicrobiano de extractos de V. prionophylla32 CIM de los extractos con bioactividad en el tamizaje

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Lista de abreviaturas

AGEXPORT Asociación Guatemalteca de ExportadoresAHP American Herbal PharmacopoeiaAPAPTIX Asociación de Promotores del Triángulo IxilATI Asociación Toto IntegradoBHP British Herbal PharmacopoeiaBP British PharmacopoeiaBPA Buenas prácticas de análisisCCF Cromatografía en capa finaCE50 Concentración efectiva mediaCG/EM Cromatografía de Gases/Espectroscopía de MasasCIM Concentración inhibitoria mínimaCL50 Concentración letal mediaCYTED Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el DesarrolloDIGI Dirección General de Investigación, USACDL50 Dosis letal mediaDMSO DimetilsulfóxidoEP European PharmacopoeiaESCOP Cooperativa Europea de Fitoterapia FAUSAC Facultad de Agronomía, USACFDA Food and Drug AdministrationFE Farmacopea EspañolaHPLC Cromatografía Líquida de Alta ResoluciónIP IntraperitonealLIPRONAT Laboratorio de Investigación de Productos NaturalesNBP NitrobencilpiridinaOEA Organización de los Estados AmericanosONG Organización no gubernamentalPEO Procedimiento estandarizado de operaciónPO Per os (Vía oral)PTZ PentilenotetrazolRIBIOFAR Red Iberoamericana de Estudio y Aprovechamiento Sostenible de la Biodiversidad RM Rangos mediosSNC Sistema nervioso centralUNIVALI Universidad del Valle de Itajai, BrasilUSAC Universidad de San Carlos de GuatemalaUSP United States PharmacopoeiaWHO World Health Organization

Dimensionalesµg microgramoscm centímetrosg gramoskg kilogramoskph kilómetros por horam metroM molarmA miliamperiombr milibarrasMeq miliequivalentes

mg miligramosmin minutosmL mililitrosmm milímetrosmsnm metros sobre el nivel del marnm nanómetrosppm partes por millónrpm revoluciones por minutoseg segundoton tonelada

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PARTE I.

I.1 INTRODUCCIÓN

La ansiedad e insomnio, la incapacidad para conciliar o mantener el sueño y lograr que sea reparador, son las causas más frecuentes de desarreglos nerviosos y comorbilidad, problemas que están aumentando entre otras causas por el estrés al que está sometida la población (Roth et al., 2006).

Desde los 70s se han efectuado estudios epidemiológicos a nivel mundial que concluyen que un 30% de la población adulta sufre algún trastorno del sueño (Ohayon & Roth, 2001; Roth & Drake, 2004) y un 15-25% sufren trastornos de ansiedad, considerándose la epidemia silenciosa del siglo XXI (Lieb, Becker & Altamura, 2005), según los datos para Guatemala uno de cada ocho habitantes padece insomnio (Wrongdiagnosis, 2006).

Las secuelas de la guerra fratricida en la que se vio envuelto en país por más de 30 años estan aún vigentes en el país, agravándose por la violencia incontrolada que se vive en la actualidad tanto en el área rural como urbana, tanto por la influencia del narcotráfico, como por la ingobernabilidad que se manifiesta en linchamientos y otras formas de violencia social. Las secuelas post trauma y las enfermedades de alteración nerviosa y ansiedad, son algunas de las patologías más frecuentemente descritas. Estos hechos justifican el creciente consumo de productos sedantes de síntesis y naturales para tratar las diversas afecciones nerviosas, siendo productos con estas propiedades los principales productos fitofarmacéuticos comercializados en el país.

El tratamiento convencional de la ansiedad y el insomnio utiliza fármacos derivados de barbitúricos y benzodiacepínicos, los cuales tienen efectos secundarios que pueden causar otras enfermedades, efectos adversos y adicciones. En los mercados globalizados, la tendencia es volver a los productos naturales. Se busca que los países en desarrollo puedan darle valor agregado a sus productos agrícolas y aumentar así sus ingresos, contando con una ventaja comparativa al tener una materia prima propia y costos laborales y de producción competitivos.

El uso de plantas medicinales con efecto ansiolítico, sedante y antidepresivo es una opción viable que ha tomando auge en los últimos años (Carlini, 2003; Cass, 2004), sobresaliendo el uso del rizoma de Valeriana (Valeriana officinalis L.), una hierba europea que se encuentra descrita en la mayoría de farmacopeas (WHO, 1999; ESCOP, 2003). En el país existen unas 12 especies de género Valeriana, pero ninguna ha sido estudiada científicamente, pero se propone que alguna podría utilizarse como sustituto de V. officinalis, el caso particular de Valeriana prionophylla Standl., además de especies de otras familias que se usan indistintamente.

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Guatemala ha sido proveedor de materia prima y no existe suficiente información sobre el estado actual de la industrialización de las plantas medicinales. No se tienen datos estadísticos confiables sobre la producción y comercialización de estas materias primas y productos derivados. Se han desarrollado técnicas de cultivo o manejo de una veintena de plantas nativas e introducidas, de las cuales se puede obtener un volumen que podría permitir su industrialización, y que podría tener un valor agregado importante. Valeriana es una oportunidad propia que debe desarrollarse.

A pesar de la diversidad biológica del país, se importa materia vegetal y extractos para elaborar la mayoría de los productos fitoterápicos. Según datos no publicados se indica que anualmente la industria farmacéutica nacional importa de 2-3 ton de dichos extractos, una de las razones de dicha importación es la falta de conocimiento de los productos nativos disponibles para su equiparación farmacopeica y su aprovechamiento agroindustrial (Farmaya, 2005).

La valeriana es uno de los principales productos medicinales vegetales consumidos a nivel mundial (Blumenthal, Ferrier & Cavaliere, 2006) y los fitoterápicos que la contienen son los más vendidos en Guatemala. Esto provoca el aumento de la demanda de materiales que no siempre están bien caracterizados, tal es el caso de los agricultores de El Quiché y Totonicapán, que extraen la especie V. prionophylla y especies asociadas de sus áreas silvestres, practicando rudimentarias formas de propagación asexual por raíz, epro en general depredando este importante recurso fitogenético.

La forma más adecuada de propagación es por semilla, pero esta especie no se ha caracterizado agrotécnicamente y como consecuencia no se han desarrollado las técnicasde cultivo y manejo poscosecha. Si su uso se amplia, a través de la disponibilidad de droga vegetal para consumo directo o para elaborar productos fitoterápicos, puede tener ventajas tales como que mayor número de agricultores se vean involucrados en su cultivo, proporcionando ingresos al área rural y los industriales la utilicen como materia prima, disminuyendo las importaciones.

Para esto es preciso contar con el conocimiento técnico-científico de los principales componentes de la cadena productiva como son la variabilidad genética y el estado de sus poblaciones naturales, el conocimiento de su diversidad biológica, el desarrollo de las técnicas de propagación, cultivo y poscosecha, la caracterización fisicoquímica de sus cultivares, el establecimiento de parámetros de control de calidad de la materia prima y productos terminados, la formulación experimental de productos fitoterápicos y los ensayos de bioactividad por los modelos específicos.

La presente investigación pretende colectar materiales silvestres y manejados de especies de V. prionophylla para su caracterización integral, lo que permitirá escoger el cultivar más promisorio, que luego de someterse a actividades de propagación y cultivo pueda servir como materia prima para la elaboración de productos fitofarmacéuticos.

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Situación del problema a nivel global

El insomnio y la ansiedad son patologías de ritmo creciente en nuestra sociedad. Los principales sedantes y ansiolíticos disponibles en el mercado son de origen sintético (benzodiacepínicos, barbitúricos), son sus efectos secundarios y adicciones. La opción vegetal, particularmente V. officinalis tiene un amplio uso a nivel mundial. En Guatemala se comercializan fitoterápicos conteniendo el extracto estandarizado, pero generalmente este se importa, es producido de material silvestre o en muchas ocasiones es un error taxonómico.

Se define como problema la creciente demanda de sedantes naturales, la presión sobre el recurso fitogenético y la escasez de materia prima y tecnología que nos permita generar productos fitoterápicos nativos provenientes de cultivo, pero que tengan un valor agregado. Para abordaje del problema se opta por dos vías con un enfoque multidisciplinario, el Componente Agrícola que propiciará la tecnología de producción de semilla y los procedimientos de cultivo, manejo y poscosecha, y el Componente Fitofarmacéutico que caracterizará la droga vegetal y los extractos obtenibles, propondrá metodologías de análisis y valores para estandarización de los productos derivados, confirmará la actividad por bioensayos específicos y desarrollará un procedimiento de transformación y control de calidad que pueda ser rentable y competitivo.

Para disponer de un material vegetal en cantidad y calidad que permita realizar ensayos preclínicos y clínicos, así como abastecer el mercado primario y de transformación, es necesario establecer procedimientos de propagación, manejo, cultivo, cosecha y poscosecha de la droga vegetal en forma técnica, así como caracterizar los extractos obtenibles de su rizoma con las metodologías analíticas específicas para equipararlos a los obtenidos de la droga estándar (V. officinalis).

El desarrollo de la agrotecnología de cultivo y procesamiento fitofarmacéutico podrá ofrecer nuevas opciones tanto para los agricultores de las zonas rurales del altiplano nacional, como para los industriales que tendrían una fuente de materia prima de calidad para sus productos fitoterápicos en forma natural y sostenible.

I.2.2 Antecedentes del problema en Guatemala

En Guatemala se han realizado varios estudios sobre la actividad sedante de las especies nacionales, sin embargo no se han publicado ninguno de los resultados. En Guatemala el material comercializado como V. officinalis es importado o bien son especies silvestres que en algunos casos son de la familia Valerianaceae (Mellen, 1974; Nicolas, 1999), pero que en otros no, pudiendo ser Chaptalia nutans L., Perezia nudicaulis Gray. o Vetiveria zizianoides L. (Cruz A., 2005).

El material de V. prionophylla comercializado en el país proviene de poblaciones silvestres del altiplano del país, y algún material que proviene de áreas de El Quiché y San Marcos donde se practica un cierto manejo de las poblaciones silvestres, aunque no se han seleccionado los cultivares por algún marcador específico. La validación preliminar de V. prionophylla indica que tiene una composición y actividad farmacológica similar a V. officinalis por lo que su uso podría ser equivalente.

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El extracto etanólico de V. prionophylla es antioxidante y vasorelajante (Picinelli et al., 2004). Una investigación por estudiantes de Farmacología III de la Escuela de Química Farmacéutica demostró que la infusión de raíz es sedante, lo que fue confirmado por las pruebas de la placa agujereada y de la chimenea (Roca, 2005). El proyecto FODECYT 12-04, confirma estos hallazgos en modelos animales de sedación, por lo que se propone realizar actividades para su desarrollo agrotecnológico y fitofarmacéutico.

Estudios clínicos preliminares demuestran que en 28 pacientes mayores de 40 años con diagnóstico de insomnio, la administración de la tintura 1:5 fue más efectiva que la técnica de relajación en disminuir la etapa de latencia del sueño, el número de veces que las personas despertaron y mejora la calidad del sueño (Cruz E., 2005).

Respecto a su composición química existe muy poca información. La hoja y rizoma han demostrado que contienen iridioides monoterpénicos (valtrato, isovaltrato, homovaltrato, didrovaltrato) (Chavadej, Becker & Weberling, 1985) e iridoides (7,9’:7’,9-diepoxiglicano) (Piccinelli et al., 2004). En un estudio de especiespopularmente llamadas valeriana en Guatemala se demostró que posee una diversidad de derivados de valepotriatos (Cruz A., 2005), encontrándose por CCF que al menos dos compuesto son similares a los de V. officinalis (de la Cruz, 2005).

I.2.3 Justificaciones del trabajo de investigación

I.2.3.1 Las afecciones nerviosas y los estados patológicos derivados de la violencia que azota al país, son una importante causa de morbilidad en Guatemala, tanto en el área urbana como en el área rural.

I.2.3.2 Las opciones preventivas y terapéuticas para el tratamiento de estas afecciones tienen efectos adversos y secundarios, por lo que la búsqueda de opciones naturales es una alternativa viable para el desarrollo de productos naturales.

I.2.3.3 En Guatemala se utilizan varias especies de Valeriana como sustituto de la V. officinalis, sin embargo ninguna ha sido estudiada científicamente, por lo que no se puede indicar que su uso sea similar o equivalente.

I.2.3.4 La especie que ha demostrado mejor actividad en forma empírica y con algunos datos de laboratorio es V. prionophylla, que se encuentra distribuida en varios departamentos del altiplano del país, pero no se ha caracterizado en una forma integral.

I.2.3.5 La validación de la especie V. prionophylla y su eventual equiparación a la especie V. officinalis podría tener una aplicación interesante, tanto porque genera trabajo rural, como porque podrían producirse extractos que sustituyan importaciones.

I.3.3.6 Es necesario estudiar la especie V. prionophylla desde el punto de vista biológico, agronómico, químico y farmacológico con el fin de describir la especie integralmente y poder elaborar una monografía farmacopeica que permita su utilización por los diferentes sectores productivos y médicos del país.

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I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivo general

Generar información biológica, agronómica, fitoquímica y farmacológica de V. prionophylla para producir semilla que pueda ser cultivada por grupos campesinos y generar materia prima para caracterización y aprovechamiento por la industria fitoterápica.

I.3.2 Objetivos específicos

I.3.2.1 Recolectar la mayor variabilidad de esta especie a través de trabajos de campo en tres departamentos donde se ha reportado que crecen silvestremente.

I.3.2.2 Generar información de la biología floral en su ambiente silvestre y cultivadopara establecer los pasos críticos en la propagación, producción, procesamiento y control para obtener semilla que permita desarrollar su cultivo y una droga vegetal de calidad.

I.3.2.3. Caracterizar por métodos farmacobotánicos, fisicoquímicos y organolépticos los especímenes obtenidos de la droga vegetal silvestre y cultivada.

I.3.2.4. Caracterizar fitoquímicamente los extractos obtenibles del material cultivado para definir los productos con mayor potencial de desarrollo y establecer su estabilidad.

I.3.2.5. Evaluar farmacológicamente los extractos más promisorios para comprobar su actividad en modelos experimentales in vitro e in vivo.

I.3.2.6. Elaborar una ficha agrotecnológica y una monografía farmacopéica de la droga vegetal para orientar su producción, estandarización y uso medicinal.

I.3.3 Hipótesis

Por ser un trabajo de descripción y caracterización no se presenta una hipótesis.

I.4 METODOLOGÍA

I.4.1 Variables

I.4.1.1 Variables dependientes

Valores de respuesta de la adaptación y composición química de las diferentes muestras estudiadas, silvestre o cultivada de V. prionophylla.

I.4.1.2 Variables independientes

Genética de cada cultivar y de sus diferentes partes.

La localidad (altura sobre el nivel del mar) que se encuentra el área de colecta.

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I.4.2 Indicadores (verificables)

I.4.2.1 Comunidades contactadas para colecta de material silvestre y cultivado

I.4.2.2 Colección de campo de 10 accesiones en terrenos de FAUSAC

I.4.2.3 Material botánico depositado en Herbario de FAUSAC

I.4.2.4 Datos del seguimiento fenológico de especies silvestres y cultivadas

I.4.2.5 Semilla colectada en poblaciones silvestres y cultivadas

I.4.2.6 Datos de cosecha, poscosecha y secado de especies cultivadas

I.4.2.7 Datos de laboratorio de los nutrientes del suelo y plantas

I.4.2.8 Datos de las características organolépticas y fisicoquímicas de la droga vegetal

I.4.2.9 Datos de características fisicoquímicas cuantitativas de las tinturas y extractos

I.4.2.10 Datos de la actividad farmacológico in vitro e in vivo

I.4.1.11 Ficha agrotécnica de V. prionophylla

I.4.2.12 Monografías farmacopeicas de V. officinalis y V. prionophylla

I.4.3 Estrategia metodológica

I.4.3.1 Colectar variedades de V. prionophylla silvestres y bajo manejo, describir su morfología macro y microscópica, conocer su fenología y describir procedimientos de propagación y cultivo.

I.4.3.2 Caracterizar cualitativa y cuantitativamente las poblaciones silvestres y cultivadas para desarrollar la droga vegetal y los extractos derivados, para así apoyar el desarrollo de estos productos.

I.4.3.3 Evaluar por procedimientos in vitro e in vivo las propiedades farmacológicas de los diferentes cultivares.

I.4.4.4 Preparar las correspondientes Fichas agrotécnicas y Monografías farmacopeicas de V. prionophylla para difundir la información obtenida y propiciar el desarrollo de esta droga vegetal.

I.4.4 Métodos

I.4.4.1 Metodología agrotecnológica

I.4.4.1.1 Recolección de variabilidad: Se realizaron recorridos por las principales áreas donde crece silvestremente V. prionophylla en los departamentos de Quiché, San Marcos, Sololá y Totonicapán. Los recorridos se establecieron de acuerdo a los agricultores contactados por Laboratorio Farmaya que han sido sus proveedores, buscando las épocas de floración y fructificación para obtener semilla. El modelo de muestreo fue de tipo estratificado, preferencial y por conveniencia. Los estratos (asociaciones vegetales aparentemente homogéneas) se definen por exploraciones de campo y coordinación de las actividades con los productores. En cada localidad se recolectó material de propagación (raíz y semilla), se llenó una boleta con información botánica y ecológica. Se recolectó otra especie del género Valeriana (V. deltoidea F. G. Meyer) encontrada en Choanlá.

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I.4.4.1.2 Siembra de material de experimentación: Para iniciar la producción de semilla se establecieron lotes de siembra, en condiciones de campo y en invernadero en FAUSAC. Se llevó un registro de la fenología y de los trabajos realizados, que será anotado en una boleta elaborada para este fin. En estos lotes se espera producir semillas que serán utilizados para los trabajos que se describen en los pasos siguientes. Los resultados se analizarán por comparación del comportamiento entre plantas y una descripción detallada de su fenología. El resultado cuantificable de esta actividad es que se tendrá un lote de siembra en el campo y otra replica en invernadero, la cual produce una cantidad de semilla que se utiliza para otros trabajos del proyecto.

I.4.4.1.3 Estudios de biología floral: Esta actividad se realizó en los invernaderos de FAUSAC a partir del primer año. Para ello se marcaron y aislaron plantas para llevar el control desde la fase vegetativa. Con los resultados se pretende plantear una metodología para la obtención adecuada de semilla. Para la toma de datos se elaboró una boleta específica. Los resultados se expresan por medio de dibujos y esquemas y a través del análisis de los datos medidos. El resultado cuantificable de esta actividad es la obtención de datos que representen la forma en que se lleva a cabo la polinización, formación de frutos y producción de semillas.

I.4.4.1.4 Estudio anatómico y morfológico de raíces, frutos y semillas: En los laboratorios de FAUSAC y Citohistología, se hizo un estudio anatómico y morfológico de las semillas de las diferentes colectas con el fin de detectar situaciones claves que deben superarse en la producción de semilla de calidad. Los resultados se documentan por medio de fotografías al microscopio, dibujos y esquemas obtenidos con su correspondiente descripción e interpretación. La micrografía anatómica descriptiva de la especie contribuye a la elaboración de una Monografía Farmacopeica.

I.4.4.1.5 Estudios sobre trillado de semilla: Se estableció un procedimiento de trillado y obtención de semilla de calidad, de acuerdo con el tipo de infrutescencia, tipo de fruto y tamaño de semilla. Se esperaba encontrar la mejor manera de obtener la mayor cantidad y la mejor calidad de semilla. Se emplearon diferentes técnicas recomendadas en la literatura. El resultado cuantificable es contar con una técnica fácil y barata de procesamiento de semilla.

I.4.4.1.6 Manejo de factores para la producción de semilla: Con base en la literatura hay varios métodos para provocar una mejor formación de semilla (Hartmann & Kester,1980). Se establecieron a nivel de invernadero varios tratamientos para comparar la forma más adecuada de producir más y mejor semilla. Entre estos tratamientos está el manejo de la fertilización, temperatura y humedad. Se establecieron ensayos en invernadero utilizando como factores aquellas condiciones que afecten la formación y producción de semilla de calidad. El resultado cuantificable es definir la manera en que los principales factores ambientales afectan la producción de semilla.

I.4.4.1.7 Determinación de la fracción vacía de las semillas: A las colectas iniciales de la semilla de poblaciones silvestres se les hizo una prueba para determinar las semillas vanas. A cada tratamiento de los ensayos establecidos, se les hizo una prueba similar a modo de comparar el grado de avance en el mejoramiento de la calidad de la semilla. Para esto se hicieron ensayos a nivel de laboratorio utilizando fuentes de luz y químicas que muestren el grado de llenado de las semillas.

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I.4.4.1.8 Pruebas de germinación, viabilidad y latencia: En cámaras de germinación, se realizaron pruebas a cada uno de los tratamientos de los ensayos de campo e invernadero. Se montaron ensayos a nivel de laboratorio para aclarar cuáles son las condiciones de luz y humedad necesarias para este proceso. Se comprobó la vialidad de la semilla, para lo cual se utilizaron pruebas de tetrazolio a cada uno de los tratamientos cosechados en los ensayos realizados. Se determinó si existe latencia de la semilla y la forma de romperla; se establecieron ensayos de acuerdo a lo recomendado en la literatura para obtener una germinación uniforme. El resultado cuantificable de la calidad de semilla es el establecimiento de protocolos para la realización de pruebas de calidad.

I.4.4.1.9 Estudios sobre las condiciones adecuadas para la germinación: Tomando como base los resultados de las pruebas de germinación en laboratorio, se realizaron pruebas a nivel de campo con la semilla obtenida de los ensayos para determinar la manera más sencilla de reproducirlas y obtener plántulas de calidad. Para esto se realizaron prueba de sustratos y de condiciones ambientales. El resultado cuantificable es tener el protocolo para producir plántulas vigorosas y de calidad.

I.4.4.2 Metodología fitoquímica

I.4.4.2.1 Diversidad fitoquímica. Con metodologías establecidas en LIPRONAT por ejecución de proyectos similares para desarrollar tecnología de cultivo y caracterización de extractos de varias especies (Smilax y Lippia con fondos de la OEA; Piper con fondos de la DIGI y Phlebodium con fondos AGROCYT) se hizo la caracterización físico-organoléptica de la droga vegetal. Esta consistió en un paquete de técnicas que incluye: porcentaje de humedad medido en balanza de humedad, cenizas medidas por ignición en una mufla y sólidos extraíbles por evaporación y cuantificación gravimétrica, rendimiento de aceite esencial por Neoclevenger (BHP, 1996) y pruebas cualitativas por CCF para demostrar la presencia de los metabolitos secundarios de interés (Sherma & Fried, 2003; Solís, Guerrero de Solis, Gatusso & Cáceres., 2005).

Para la realización de CCF para valepotriatos se usaron estándares derivados del ácido valerénico disueltos en metanol; la muestra se extrajo con diclorometano y el residuo se redisuelve en acetato de etilo. Se aplican 10 μl en una placa de sílica gel 60 F254 (Merck), se corrió con fase móvil de tolueno:acetato de etilo (75:25) y las bandas se detectaron por UV-254 o 365 o se desarrollaron con ácido clorhídrico:ácido acético (8:2).Se observaron bandas azules para valtrato y para el dihidrovaltrato zonas cafés en luz visible (Wagner & Bladt, 1996). Estas técnicas analíticas se basan en procedimientos estándar establecidos de acuerdo a los internacionalmente aceptados (Bruneton, 1995; BHP, 1996; WHO, 1998) y que se ejecutan en LIPRONAT en el marco de BPA y PEO.

I.4.4.2.2 Estudio de las características físico-organolépticas del material cultivado. Con las mismas pruebas y métodos, se evaluó el material cultivado, pero tomando como factor diferencial los tratamientos y características del cultivo experimental.

I.4.4.2.3 Caracterización de los extractos del material con mejores rendimientos. De acuerdo con los procedimientos descritos en las farmacopeas para los extractos de V. officinalis (Upton, 1999; ESCOP, 2003) y según el disolvente que extrae mayor cantidad de solutos (etanol 70%), se prepararon tinturas 1:5 y 1:10, así como extracto fluido (1:1), blando (2:1), duro (3:1) y seco (5:1), para ello se efectuaron extracciones por percolación

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y se concentraron en rotavapor a presión reducida, para luego ser caracterizadas desde el punto de vista fisicoquímico (Sharapin, 2000).

Una fase crítica de esta actividad son los análisis específicos para caracterización de valeriana, como son la prueba de la mancha, CCF para valepotriatos y cuantificación de los metabolitos secundarios en las tinturas y extractos por técnicas de HPLC (European Pharmacopoeia, 1998; Upton, 1999).

Para el análisis por HPLC se corrieron tres derivados del ácido valerénico (ácidos valerénico, hidroxivalerénico y acetoxivalerénico) que sirvieron de patrones; las condiciones analíticas mínimas incluyen fase reversa (Columna Agilent Eclipse XDB-C18, 5μm x 250 mm) y fase móvil de metanol:ácido fosfórico al 5%. Por la disponibilidad en Guatemala se trabajó con un detector de UV que es el más usado para estas mediciones (Gao & Björk, 2000) acoplado a cromatógrafo líquido de alta presión Hewlett Packard serie 1050 con integrador HP3396 Serie II. También se describió el perfil de glicósidos de flavonoides, por espectrometría UV-VIS ya que a estos también se les atribuyen propiedades sobre el sistema nervioso (Marder et al., 2003; Fernández,Wasowski, Paladini & Marder, 2004; Fernández et al., 2006). La composición de los aceites se estableció utilizando una columna HP5 de 25 cm de largo, 0.2 mm de diámetro interno y espesor del film de 0.33 μm en un cromatógrafo de gases HP 5890 serie II acoplado a espectrómetro de masas

I.4.4.2.4 Caracterización química: En el caso de extractos crudos se procedió a su caracterización (perfil químico o huella digital) para lo cual se utilizaron las técnicas convencionales de análisis químico orgánico y de selección fitoquímica (tamizaje fitoquímico a escala semimicro, aplicable a todo tipo de producto natural) (Bruneton,1999) en combinación con técnicas de CCF (Wagner & Bladt, 1996). Las pruebas de tamizaje químico se fundamentan en la reacción selectiva de grupos funcionales específicos con reactivos capaces de formar complejos visibles por el desarrollo de coloraciones características o por la formación de precipitados. La presencia de estándares conocidos de grupos funcionales se utiliza como medio de comparación.

I.4.4.3 Pruebas farmacológicas in vitro. Usando bioensayos micrométricos in vitroestablecidos desde hace varios años en el Laboratorio de Bioensayos se estudió la actividad biocida contra bacterias, levaduras, hongos, larvas de Aedes aegypti y Anopheles albimanus y nauplios de Artemia salina de cada uno de los extractos obtenidos(Cáceres et al., 1998; 2001). Los procedimientos resumidos para cada una de estas determinaciones se detallan a continuación:

I.4.4.3.1 Actividad antimicrobiana: El procedimiento se realizó según Mitcher et al.(1972) en agar Mueller Hinton conteniendo el extracto (500 g/mL), se sembraron las cepas y controles y se incubaron a 36C por 24-48 horas. El bioensayo incluyó bacterias Grampositivo (Bacillus subtilis, Gardnerella vaginalis Staphylococcus aureus), bacterias Gramnegativo (Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi),micobacteria (Mycobacterium smegmatis) y levaduras (Candida albicans, Cryptococcus neoformans). Se interpretó como actividad negativa el crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo; como actividad positiva la falta de crecimiento; y, como contaminación lapresencia de microorganismos fuera del inóculo. Para determinar la CIM se usaron placas cuadriplate, preparando 3 de las secciones con una dilución (250, 125 y 62.5 g/mL) del

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extracto y la cuarta sección como control de crecimiento; la inoculación, incubación y lectura son similares al tamizaje.

I.4.4.3.2 Actividad antifúngica: El procedimiento se realizó en agar Sabouraud conteniendo el extracto (500 g/mL), se abrieron agujeros, se sembraron las cepas de hongos filamentosos (Aspergillus flavus, A. fumigatus y A. niger) y hongos dermatofitos (Micosporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes y T. rubrum) en cuadruplicado y se incubaron a 27C por 21 días hasta obtener un crecimiento homogéneo; se midió el diámetro de la colonia en mm. Se calculó el porcentaje de inhibición comparando el extracto que reduce el diámetro de la colonia en un 75% (Brancato & Golding, 1953).Para la determinación de la CIM se procedió en forma similar, pero utilizando placas con una dilución seriada del extracto vegetal. La inoculación, incubación y lectura es similar al procedimiento de tamizaje.

I.4.4.3.3 Otras técnicas: Para completar el espectro de organismos ensayados por bio-ensayos micrométricos in vitro, se determinó la actividad contra nauplios de A. salina, que consiste en eclosionar huevos, cultivar nauplios y retarlos con concentraciones variables de los extractos (Solis, Wright, Anderson, Gupta & Phillipson, 1993) y larvas de A. aegypti y A. albimanus. La CL50 se calculó mediante regresión no paramétrica usando un programa Finney.

I.4.4.4 Pruebas farmacológicas in vivo.

Inicialmente se planificó usar las pruebas establecidas en el Bioterio del Departamento de Farmacología y Fisiología de la Facultad, con personal entrenado para su ejecución e interpretación y basados en las pruebas estándar reconocidas (Saravia,2005). Sin embargo al iniciar el proyecto se recibió la noticia del cierre del Bioterio por razones de riesgo de la infraestructura, por lo que se buscó apoyo en el exterior. Se recibió apoyo de RIBIOFAR del CYTED, quienes a través del Dr. Valdir Cechinel Filho y de la Dra. Marcia María de Souza del Departamento de Farmacología de UNIVALI, realizaron los ensayos in vivo con los siguientes procedimientos.

I.4.4.4.1 Evaluación de la coordinación sensomotora (prueba del rotarod): El parámetro evaluado es el tiempo de permanencia en el aparato. Las sustancias que ejercen actividad depresora inespecífica sobre el SNC disminuyen el tiempo de permanencia en el aparato, cuando se comparan con el control negativo. El diazepam es el medicamento de elección porque afecta directamente la coordinación sensomotora de los animales. Para evaluar la capacidad depresora del extracto sobre el sistema sensomotor de los animales, se seleccionaron con 24 horas de anticipación aquellos animales que mostraron la capacidad para permanecer en el rotarod (barra de 2.5 cm de diámetro, subdividida en seis compartimientos a 25 cm de altura) a 22 rpm, durante al menos dos períodos consecutivos de 1 min. A cada uno de estos grupos se les administró el extracto PO en dosis de 50, 100 y 150 mg/kg. El fármaco de referencia fue diazepam en dosis 2.0 mg/kg para el grupo control positivo y al grupo control negativo se le administró el vehículo (DMSO 2%). Al transcurrir 60 min de la administración se sometió a cada animal a la prueba en el rotarod.

I.4.4.4.2 Evaluación de la actividad hipnótica (inducción de sueño por barbitúricos): Elmétodo fue desarrollado por Dandiya y Columbine en 1959 y evidencia posible actividad depresora del SNC de las sustancias a evaluar. El parámetro a evaluar es el tiempo de latencia para el sueño (tiempo que tarda el animal en conciliar el sueño) y el tiempo total

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de sueño. Las sustancias con actividad hipnótica disminuyen el tiempo de latencia para el sueño y aumentan el tiempo total de sueño. El extracto fue administrado a tres grupos de animales en dosis de 50, 100 y 150 mg/kg; se administró lorazepam (0.75 mg/kg) como fármaco de referencia al grupo control positivo, el grupo control negativo recibió vehículo (DMSO 2%). Después de 60 min, se administró a todos los grupos pentobarbital en dosis de 50 mg/kg. Inmediatamente después de la administración del barbitúrico, los animales fueron observados para cronometrar el tiempo de latencia de sueño y el tiempo total de sueño. Se considera que el animal ha finalizado el período de sueño, cuando recupera el reflejo postural (Devi, Sreepriya, Devaki & Balakrishna, 2003).

I.4.4.4.3 Evaluación de la actividad antidepresiva (prueba de nado forzado): El modelo fue desarrollado por Porsolt y colaboradores (Porsolt, Anton, Blavet & Jalfre, 1977). La comparación que se hace con la depresión en este modelo es el estado de inmovilidad que adoptan los animales cuando perciben que no pueden escapar del ambiente en que se encuentran. El parámetro a evaluar es la duración del período de inmovilidad. Las drogas con efecto antidepresivo disminuyen el tiempo de inmovilidad comparados con el control negativo. El extracto de rizoma fue administrado, por vía oral a tres grupos de ratones albinos macho de 24-28 g de peso en dosis de 50, 100 y 150 mg/kg. El grupo control positivo recibió imipramina (5 mg/kg) y al grupo control negativo se le administró el vehículo (DMSO 2%). 60 min después de la administración del extracto, cada animal fueforzado a nadar en un tanque con agua a 24-26ºC. La duración de la inmovilidad total se mide durante los últimos 4 min de una única sesión de 6 min. Se consideró que un ratón está inmóvil cuando no hace movimientos con la intención de escapar, únicamente los movimientos necesarios para mantener su cabeza sobre el agua (Sánchez-Mateo, Bonkanka, Prado & Rabanal, 2005; da Silva et al., 2006).

I.4.4.4.4 Evaluación de la actividad ansiolítica (prueba de laberinto en cruz elevado): El procedimiento fue descrito por Pellow y colaboradores en 1985 y Lister 1987. El aparato consiste en dos recorridos, uno abierto (30 cm de largo y 5 cm de ancho) y uno cerrado en sus extremos (30 cm de largo, 5 cm de ancho y paredes de 15 cm de alto). Se forma una cruz en la intersección de ambos recorridos, en donde posee una plataforma central (5x5 cm). Los extremos abiertos y cerrados están dispuestos de forma opuesta entre sí y todo el aparato se eleva a 40 cm de alto, de forma que el animal no puede escapar. Las drogas con actividad ansiolítica aumentan el tiempo de permanencia y la frecuencia de entradas en los recorridos abiertos del aparato comparado con el control negativo. El extracto se administró PO a tres grupos de ratones albinos macho de 24-28 g de peso en dosis de 50, 100 y 150 mg/kg. El grupo control positivo recibió diazepam (0.75 mg/kg) y al grupo control negativo vehículo (DMSO 2%) vía IP. 60 min después de la administración de las sustancias en estudio, cada animal fue colocado en el cuadrado central del aparato, de frente a uno de los brazos del recorrido cerrado. Se le deja explorar el aparato libremente, durante 5 min, mientras se registra su comportamiento en video. Posteriormente un observador en ciego calcula el tiempo y número de entradas en cada tipo de recorrido. Una entrada se define como la colocación de las cuatro patas del animal dentro del mismo. Para evitar sesgos y desarrollo de tolerancia, cada animal fue sometido a la prueba una vez. Después de cada prueba, todo el aparato se lavó cuidadosamente, utilizando soluciones detergentes (Da Silva et al., 2006; Hattesohl et al., 2008).

I.4.4.4.5 Evaluación del efecto sobre la consolidación de la memoria en ratón (prueba de inhibición de la evasión). Desarrollada por Cammarota y colaboradores en 1998 para

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evaluar la inhibición de la evasión del comportamiento explorador natural de un animal. Se utiliza un aparato consistente en una caja automatizada de 50x25x25 cm, con una cara frontal con vidrio (Albarsch). El piso es una malla de alambre de bronce de 1 mm de diámetro separado 1 cm, a través del cual se aplica un diferencia de potencial de 0-1 mA sobre el que se pone una plataforma de madera. Después de entrenamiento los animales se colocan sobre la plataforma, cronometrándose el tiempo que tarda en descender de la plataforma, momento en el que se aplican choques de 0.4 mA/seg hasta que el animal vuelva a la plataforma. Para probar el efecto de la planta sobre la consolidación de la memoira, los animales son entrenados, se administra PO el extracto (50-150 mg/kg) y 24 h después se repite el entrenamiento, pero sin electrochoques. Durante la prueba el tiempo máximo permitido para cada animal para permanecer en la plataforma es de 180 seg. La diferencia entre el tiempo en bajar para la prueba y el entrenado se considera el índice de retención de memoria. Los grupos control positivo (diazepam 0.75 mg/kg ip) y negativo (DMSO 2%) fueron sometidos al mismo modelo (Cammarota, Bevilaqua, Köhler, Medina & Izquierdo, 2005; da Silva et al., 2006).

I.4.4.4.6 Evaluación de la actividad sedante (prueba de campo abierto). Originalmente desarrollada por Hall en 1934. Se llevó a cabo en una superficie cuadrada con pared perimetral de 30 cm de alto, cuya base está dividida en 9 secciones iguales. Las drogas con actividad sedante disminuyen el número de cruzamientos de las líneas divisorias de la base, la actividad exploratoria, la defecación y el acicalamiento en relación al control negativo. El extracto fue administrado PO a tres grupos de ratones albinos macho de 24-28 g de peso en dosis de 50, 100 y 150 mg/kg. El grupo control negativo recibió vehículo (DMSO 2%); 60 min después de la administración de las sustancias en estudio, cada animal fue colocado en la sección central del aparato. Se le deja explorar el aparato libremente, durante 5 min, mientras se registra su comportamiento en video. Posteriormente un observador en ciego calculó el número de cruzamientos, actividad de exploración, defecación y acicalamientos de cada animal en este período. Después de cada prueba, todo el aparato se lavó cuidadosamente, utilizando soluciones detergentes (Da Silva et al., 2006; Hattesohl et al., 2008)

Entre otras pruebas realizadas, se encuentra la actividad anticonvulsivante, usando el modelo de convulsión inducida por PNZ y estricnina originalmente descrito porMeunier y col. en 1963 (Saravia, 2005). Los fármacos anticonvulsivantes como el fenobarbital aumentan el tiempo de latencia para la crisis convulsiva (Nguelefack et al., 2006). Además se realizó una prueba preliminar para establecer el mecanismo de acciónpor el cual el extracto ejerce su actividad sobre el SNC.

I.4.5 Técnica estadística

La información generada se registró utilizando cuadernos foliados por páginas, en los cuales se lleva el registro cronológico de las actividades realizadas y los resultados obtenidos. Los resultados fueron tabulados en un sistema columnar, ordenados de acuerdo a conveniencia y procesados electrónicamente. Los resultados fueron organizados, resumidos y presentados mediante estadística descriptiva (promedio y desviación estándar) y fueron analizados e interpretados mediante técnicas de inferencia estadística.

Dependiendo de la naturaleza de los ensayos fitoquímicos o farmacológicos se utilizaron diseños completamente aleatorizados o de bloques completos al azar. La

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presentación de los resultados se hace mediante estadística descriptiva. En las pruebas farmacológicas se compararon los resultados de los ensayos con los controles positivos y negativos, inicialmente por prueba de ANDEVA, seguido de un análisis de Kruskal-Wallis entre ensayos y una prueba de Mann-Whitney entre grupos.

La interpretación de los resultados se realiza mediante inferencia estadística, haciendo uso de técnicas paramétricas y no paramétricas; entre las primeras, el análisis de varianza (una o dos vías), las pruebas de intervalos de Duncan y de comparaciones de Dunnett; entre las no paramétricas se utilizó la regresión no paramétrica para la estimación de CE5500.

I.4.6 Instrumentos

I.4.6.1 Equipo:

Las tres instituciones participantes cuentan con sistemas de comunicación y computación para archivos de la información, desarrollo de los análisis e impresión de los informes, además, aportaron el siguiente equipo:

I.4.6.1.1 El LIPRONAT está equipado para realizar secado (horno de convección), molienda, extracción (percoladores, neoclevenger, Soxhlet), concentración (rotavapores Bucchi, enfriadores, desecadores, hornos) y análisis (potenciómetro, balanzas analíticas y de humedad, espectrofotómetro UV/Vis, asperjadores y computadora).

I.4.6.1.2 El Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistología de la Escuela de Química Biológica esta equipado para concentración (rotavapores, desecadores) y realización de bioensayos (incubadoras, congeladoras, campanas de flujo laminar, micro-espectrofotómetro, fluorómetro, sonicador, centrífuga).

I.4.6.1.3 El Departamento de Toxicología de la Escuela de Química Farmacéutica, esta equipado para realizar análisis cuantitativo (HPLC y GM/EM).

I.4.6.1.4 La FAUSAC aportó un invernadero y áreas de cultivo, vehículo, germinador, microscopios, estereoscopios, hornos de secado y balanzas.

I.4.6.1.5 El Laboratorio de Productos Naturales Farmaya aportó el material de su Centro de Información especializado, los contactos de su red de proveedores rurales, secadores, herbario, incubadoras, rotavapores, autoclave, balanza de humedad, mufla para cenizas y campana microbiológica.

I.4.6.1.6 El Departamento de Farmacología de UNIVALI que colaboró en los ensayos farmacológicos, cuenta con aparatos especializados y los equipos complementarios para realizar los ensayos farmacológicos, particularmente para demostrar la actividad sobre el sistema nervioso.

I.4.6.2 Materiales:

Para la mayoría de procedimientos que se desarrollaron en el proyecto cada una de las instituciones participantes tenía la cristalería (vasos de precipitar, pipetas, matraces, refrigerantes), los materiales (guantes, puntas plásticas descartables, microplacas) y los reactivos (disolventes, estándares, medios de cultivo) necesarios que fueron repuestos o complementados con el material adquirido con los fondos del proyecto.

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PARTE II. MARCO TEORICO

II.1 INTRODUCCION AL MARCO TEORICO

El uso de plantas medicinales con efecto ansiolítico y sedante es una opción que ha tomando auge en los últimos años (Carlini, 2003; Cass, 2004), sobresaliendo el uso de Valeriana (V. officinalis), una hierba perenne de origen; aunque se cultiva en algunas partes de América, no es el caso de Guatemala, de manera que lo que se comercializa a nivel nacional es importado, es un sustituto o un engaño. La especie está ampliamente estudiada farmacológica, química y clínicamente y se encuentra en la mayoría de farmacopeas. Su química es compleja y es reconocida por su uso como ansiolítico,sedante, analgésico y espasmolítico. En el país existen unas 12 especies de género, algunas se utilizan como sustituto de V. officinalis, especialmente Valeriana prionophylla, que pareciera tener componentes similares a la especie europea y tiene una acción farmacológica equivalente, por lo que puede ser un sustituto de la misma. A continuación se presenta la información preliminar sobre ambas especies, y en los Anexos 2 y 3 se presenta las monografías farmacopeicas actualizadas de ambas especies.

II.2 SELECCION DE LA DROGA VEGETAL

II.2.1Valeriana officinalis L. (Valerianaceae)

II.2.1.1 Descripción y Hábitat: Hierba perenne, vivaz, rizoma con estolones y múltiples raíces; tallo acanalado. Hojas imparipinadas, 7-21 segmentos dentados, márgenes dentados. Tallo floral surge al segundo año, redondo, estriado. Flores en umbelas, cáliz 5-lobulado, pequeñas, tubulares, blancas o rosadas. Frutos en aquenio coronado de un vilano plumoso. Nativa de Europa y Asia, naturalizada en el noreste de América, se encuentra en lugares húmedos y umbrosos, silvestre o cultivada en clima templado o de montaña, en bosques hasta 2,100 msnm (Upton, 1999).

II.2.1.2 Obtención: El cultivo está bien descrito y requiere suelo fértil, en lugares frescos y húmedos. Se propaga por semilla o división de raíz; la semilla germina en un 65%; la raíz da 10-20 plantas; el trasplante requiere cuidado, humedad y abono. No se le conocen mayores plagas o enfermedades. Las raíces se cosechan a los dos años y se secan lentamente (<40°C) (Hornok, 1992).

II.2.1.3 Usos y propiedades medicinales: Es una de las plantas de más antiguo uso medicinal; Dioscórides y Galeno la conocían como Phu, nombre derivado del latin valere“estar sano”. Referida en la Biblia; usada en la Edad Media para tratar epilepsia (Font Quer, 1976). Se dice que el flautista de Hamelin no solo encantó a los ratones con su música sino también usó Valeriana; figuró en la USP de 1820 a 1942 y en el National Formulatory de 1942-50 (Kowalchik & Hylton, 1987). La tintura se usa en afecciones nerviosas, broncoespasmo y cardiopatías (Alonso, 2004). La decocción se aplica

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tópicamente en compresa para contusiones, heridas, resolver tumores y oftalmías; administrada como enema se usa en afecciones intestinales (Cáceres, 1996; Upton, 1999). Se le atribuye propiedad antibacteriana, anodina, calmante, espasmolítica, hipnótica, hipotensora, relajante, sedante y tranquilizante (Vanaclocha & Cañigueral, 2003).

II.2.1.4 Farmacología: Los valtratos son citotóxicos en células de hepatoma de rata in vitro y el didrovaltrato administrado por vía IP a ratones con tumor ascítico produce remisión significativa; en íleon y estómago de cobayo es espasmolítico. La infusión o tintura es sedante en varios modelos animales (Duke, 1985). En 8 voluntarios con insomnio, un estudio doble-ciego al azar en tres grupos demostró una disminución significativa en la latencia del sueño contra el placebo; las dosis más altas no produjeron mejora (Leathwood & Chauffard, 1985). En ensayos clínicos en individuos sanos muestra aceptación y puede evitarse el sesgo por el olor (Gutierrez, Ang-Lee, Walker & Zacny,2004). Existen múltiples estudios clínicos que demuestran resultados variables que dependen de los extractos usados y el diseño experimental (Stevinson & Ernst, 2000), su uso en el manejo del sueño es avalado por las principales fuentes internacionales, inclusive como tratamiento complementario en la epilepsia (Spinella, 2001).

II.2.1.5 Composición: La raíz contiene <1% de aceite esencial (acetato de bornilo, β-cariofileno, - y β-pineno, valeranona, valeranal, isovalerato de eugenilo, valerianol, alcohol patchouli, borneol, canfeno, β-bisaboleno, ledol, ácido isovalérico, terpinoleno), alcaloides (actinidina, valerianina, valerina), iridoides (valepotratios, didrovaltratos, isovaltratos), metil-2-pirrolilcetona, ácidos caféico y clorogénico, β-sitosterol, taninos y gomas (Cañigueral, 1998; Vanaclocha & Cañigueral, 2003).

La actividad sedante fue atribuida inicialmente al aceite esencial (Houghton, 1997). Los componentes sedantes son derivados del ácido valerénico, alcoholes y ésteres del kessano-2, valerenal y elemol (Upton, 1999). La valeranona potencializa la actividad febrífuga y previene la úlcera gástrica; los derivados de kessano son potenciadores del sueño (Hobbs, 1989). Los iridoides son sedantes, en gatos no disminuye la actividad pero si la ansiedad y agresividad; el baldrial y homobaldrial tienen efecto en la motilidad espontánea. Recientemente se han indicado algunos flavonoides (6-metilapigenina, hesperidina, linarina) como responsables de la actividad sedante (Marder et al., 2003; Fernández, Wasowski, Paladini & Marder, 2004), particularmente los glicósidos (Fernández et al., 2006).

II.2.1.6 Toxicología: La DL50 del extracto por vía IP en ratón es 30 mg/kg y en rata 15 mg/kg; la DL50 del isovaltrato por vía IP en ratón es 30 mg/kg y en rata 15 mg/kg; la DL50

del didrovaltrato por vía IP en ratón es 45 mg/kg y en rata 25 mg/kg (Cáceres, 1996). El extracto etanólico por vía PO en conejas y ratas embarazadas no es teratogénico ni embriotóxico, ni inhibidor de la ovulación. Administrados a ratas por 30 días los valepotriatos no producen cambios en la longitud del ciclo, el número de fases estrogénicas durante el ciclo ni en el índice de fertilidad; no se manifestaron signos de fetotoxicidad, salvo un aumento en el número de osificaciones retardadas en la dosis más alta, la vía PO es más segura que IP (Tufik, Fujita, Seabra & Lobo, 1994). No interacciona con otras drogas por inhibición de citocromos (Gurley et al., 2005).

II.2.1.7 Indicaciones terapéuticas: Es oficinal en muchos países, se encuentra en la mayoría de farmacopeas (BHP, 1996; WHO, 1999; Upton, 1999; ESCOP, 2003). Se

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comercializan preparados como infusión, jarabe, extracto, cápsula, tintura y polvo. Su uso como alimento está aprobado por la FDA. En los últimos años ha alcanzado amplio uso, al crecer un mercado que huye de los efectos secundarios y de la habituación de los ansiolíticos de síntesis, además que la toxicidad del alcohol aumenta con los barbituratos, pero no con los valepotriatos. Por su actividad calmante, anodina, sedante, espasmolítica e hipotensora, su uso oral está indicado en el tratamiento de ansiedad, tensión, cólicos, convulsiones, depresión, epilepsia, excitabilidad, histeria, insomnio, migraña, taquicardia y dolores articulares (Cáceres, 1996; ESCOP, 2003; Vanaclocha & Cañigueral, 2003).

II.2.1.8 Otras Valerianas: Solamente dos especies americanas tiene una actividad biológica y composición equivalente a V. officinalis, estas son V. edulis que ha sido estudiada en México (Herrera et al., 2001) y Alemania (Francis & Dempster, 2002) y V. walichii que ha sido estudiada en Argentina (Marder et al., 2003).

II.2.2 Valeriana prionophylla Standl. (Valerianaceae)

II.2.2.1 Descripción y Hábitat: Hierba perenne erecta a menudo bifurcada, tallos de 10-80 cm de alto, los que a su vez se dividen, formando panículas florales compuestas de pequeñas flores amarillo-liláceas. Hojas numerosas, oblongo-linear a espatuladas con los márgenes aserrados, basales o que no tienen pecíolo por lo que parecieran que se encuentran sentadas en la base del tallo. Inflorescencia largamente pedunculada. Frutos en aquenio de 2-3 mm de longitud. Raíces de 12-20 cm de largo y grosor de 4-5 cm, fuertemente olorosas que al secar se hace más intenso. Se localiza de México a Costa Rica, en Guatemala se ha descrito en Chimaltenango, Huehuetenango, Quetzaltenango, Quiché, Sacatepéquez, San Marcos, Sololá y Totonicapán (Nash & Dieterle, 1976).

II.2.2.2 Obtención: En Guatemala el material comercializado es importado o bien son especies silvestres que en algunos casos son de la familia Valerianaceae (Mellen, 1974; Nicolas, 1999), pero en otros no, pudiendo ser Chaptalia nutans L., Perezia nudicaulisGray. o Vetiveria zizianoides L. (Cruz A., 2005). El material de V. prionophyllacomercializado proviene de áreas del Quiché donde se practica cierto manejo de poblaciones silvestre.

II.2.2.3 Usos y propiedades medicinales: Los usos tradicionales en el país son similares a los de V. officinalis, particularmente como espasmolítica, sedante, tranquilizante, anticonvulsiva, antipirética y vermífuga (Mellen, 1974; Cáceres, 1996; Nicolas, 1999).

II.2.2.4 Farmacología: El extracto etanólico es antioxidante y vasorelajante (Picinelli etal., 2004). Una investigación por estudiantes de Farmacología III de la Escuela de Química Farmacéutica demostró que la infusión de raíz es sedante, lo que fue confirmado por las pruebas de la placa agujereada y de la chimenea (Roca, 2005). El proyecto FODECYT 12-04, confirma estos hallazgos en modelos animales, por lo que se proponesu desarrollo agrotecnológico y fitofarmacéutico. En 28 pacientes mayores de 40 años con diagnóstico de insomnio, la administración de la tintura 1:5 fue más efectiva que la técnica de relajación en disminuir la etapa de latencia del sueño, el número de veces que las personas despertaron y mejora la calidad del sueño (Cruz E., 2005).

II.2.2.5 Composición: La hoja y rizoma contienen iridoides monoterpénicos (valtrato, isovaltrato, homovaltrato, didrovaltrato) (Chavadej, Becker & Weberling, 1985) e iridoides (7,9’:7’,9-diepoxiglicano) (Piccinelli et al., 2004). En un estudio de especies

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popularmente llamadas valeriana en Guatemala se demostró que posee una diversidad de derivados de valepotriatos (Cruz A., 2005), encontrándose por CCF que al menos dos compuesto son similares a los de V. officinalis (de la Cruz, 2005).

II.2.2.6 Toxicología: La administración oral a ratones del elixir de una mezcla vegetal que incluye V. prionophylla no mostró signos de toxicidad a 1,200 mg/kg durante 8 días (DL50 >1,200 mg/kg) (Roca, 2005). En 28 pacientes con insomnio que tomaron tintura 1:5 no se observaron efectos secundarios (Cruz E., 2005).

II.2.2.7 Indicaciones terapéuticas: Por su uso tradicional y los hallazgos farmacológicos y fitoquímicos preliminares puede indicarse un uso similar a V. officinalis. Aunque aún falta información, esta especie es usada en el país como sustituto de la valeriana europea, particularmente por algunos sectores campesinos y la industria de productos fitoterápicos, a pesar que su uso no está plenamente validado.

II.3 PROCEDIMIENTOS AGROTECNOLÓGICOS

II.3.1 Metodología de colecta

Se colectaron materiales silvestres y cultivados, utilizando como metodología la asistencia de grupos colaboradores, en especial aquellos que eran atendidos por Intervida, no fue posible realizar un muestro en todas las áreas reportadas en los herbarios, porque en algunas ya no existía y en otras no se tenían contactos que pudieran acompañar, en especial en áreas de conflicto social por las hidroeléctricas y la minería. En cada lugar se procuró tomar datos de las plantas de valeriana, aunque ya no fue posible contrastar esto con datos de la biología floral bajo cultivo porque las inflorescencias no llegan a cumplir su ciclo. En algunas localidades se tomaron muestras para análisis químico del suelo.

II.3.2 Experimentación de las actividades de propagación

Se hicieron observaciones de campo sobre el comportamiento de la biología floral, se realizaron varias colectas de semillas y se efectuaron pruebas de germinación en diferentes épocas del año. Se hicieron observaciones en la colección establecida en los campos de FAUSAC. El sustrato para establecer la colección se elaboró con una mezcla de gallinaza (10%), broza (45%) y arena (45%) para brindar humedad, anclaje, nutrientes y drenaje a las plantas. Se sembró en un umbráculo de sarán para tener condiciones controladas de sombra. Se sembraron hijuelos (macollas) y plantas jóvenes de los materiales, silvestres y domesticados, que se colectaron en las exploraciones. En el momento de la siembra se podaron para estimular el crecimiento vegetativo de la especie. El distanciamiento de siembra fue de 0.4 m. Antes de la siembra se desinfectaron los materiales vegetales con un fungicida de contacto (Miregefe 75 WP (procloraz).

El número de plantas de cada material varía por la disponibilidad a la hora de la colecta. Los porcentajes de enraizamiento (pegue) fueron del 50.70%. Para la adaptación de las plantas se suministra riego constante, logrando que la humedad se mantenga en el sustrato que sostiene los materiales. Se realizaron constantes deshierbes para evitar que las plantas no deseadas compitan por espacio, humedad y luz, con los materiales establecidos. Solamente el material de Tierra Blanca no soportó la adaptación, por lo que se colectó nuevo material. La cosecha de material se hace por poda de hojas y extracción

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de raíces, se lavan hojas y raíces, picadas antes de colocarlas en bandejas en el secador solar. El material para procesado estuvo en el secador cerca de 20 días.

II.4 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD FARMACOLOGICA

II.4.1 Actividad biocidas in vitro:

Las bacterias y levaduras son organismos que tienen curvas de crecimiento de 24-72 horas en medios artificiales específicos. En el tamizaje se evidencia la inhibición del crecimiento por una concentración determinada (500 g/mL) de un extracto vegetal(Mitcher et al., 1972). Los hongos tienen curvas de crecimiento de 7-28 días en medios artificiales específicos. El tamizaje consiste en poner de manifiesto la inhibición del crecimiento del hongo en condiciones estándar con una concentración predeterminada (500 μg/mL) de un extracto obtenidos de una droga vegetal (Brancato & Golding, 1953).

II.4.2 Actividad farmacológica in vivo:

Las pruebas farmacológicas in vivo se basan en la habilidad de los animales experi-mentales de realizar pruebas estandarizadas. La prueba de rotarod determina el tiempo que un ratón entrenado se mantiene sobre un eje que gira a una velocidad estándar en un cilindro que da vuelta a 22 rpm; la administración de un inhibidor nervioso provoca cambios en la coordinación produciendo la caída más o menos rápida. Se determina el porcentaje de animales caídos en menos de 3 min, calculándose la DE50 (Saravia, 2005).

En la evaluación de la actividad hipnótica (inducción de sueño por barbitúricos) se evidencia una posible actividad depresora del SNC de las sustancias a evaluar. El parámetro a evaluar es el tiempo de latencia para el sueño (tiempo que tarda el animal en conciliar el sueño) y el tiempo total de sueño. Las sustancias con actividad hipnótica disminuyen el tiempo de latencia para el sueño y aumentan el tiempo total de sueño.

En la prueba de la actividad antidepresiva el parámetro de comportamiento a evaluar en los sujetos experimentales es el tiempo de agitación y de inmovilidad. Se basa en la depresión de respuestas o inmovilidad que presenta los animales cuando perciben que no pueden huir del ambiente en que se encuentran (Porsolt et al., 1978).

En la prueba de la actividad anticonvulsivante, los fármacos específicos aumentan el período de latencia entre una crisis convulsiva y la siguiente; las caídas acompañadas de sacudidas o temblores se consideran el inicio de un ataque; un animal que no presenta ninguna crisis durante este período se considera protegido (Nguelefack et al., 2006).

En la prueba de actividad ansiolítica (laberinto en cruz elevado) los fármacos con actividad ansiolítica aumentan el tiempo de permanencia y la frecuencia de entradas en los recorridos abiertos del aparato. Se considera una entrada cuando el animal coloca las cuatro extremidades en un recorrido (Hattesohl, et al., 2008).

En la actividad sedante (prueba de campo abierto) los parámetros a evaluar son el número de cruzamientos, de actividades exploratorias, de defecaciones y de acicalamientos. Los fármacos sedantes disminuyen la frecuencia de todas éstas actividades (Hattesohl, et al., 2008).

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Se estableció el efecto del extracto en la consolidación de la memoria. Los fármacos con actividad facilitadora de la memoria aumentan el tiempo de permanencia en la plataforma; mientras, los que poseen actividad amnésica disminuyen el tiempo de permanencia (Cammarota, Bernabeu, Levi de Stein, Izquierdo & Medina, 1998)

II.5 ESTUDIO QUÍMICO DE LOS EXTRACTOS

II.5.1 Esquema extractivo

El término extracción se refiere a la separación de porciones farmacológicamente activas provenientes de tejidos vegetales de aquellos componentes de interés por el uso de disolventes. Los productos obtenidos son líquidos, semisólidos y sólidos y pueden usarse para la fabricación de diversos preparados galénicos. El esquema extractivo conforme a protocolos internacionales, en términos generales se puede definir como una liberación extractiva fraccionada mediante un gradiente de polaridad ascendente. Mediante el uso de este diseño se pretende aprovechar la selectividad y especificidad de los disolventes(Wrigley, Hayes, Thomas & Chrystal, 1999).

II.5.2 Caracterización química

En el caso de extractos crudos, se procede a su caracterización (perfil químico o huella digital) para lo cual se utilizarán las técnicas convencionales de análisis y de selección fitoquímica (tamizaje fitoquímico a escala semimicro, aplicable en general a todo tipo de producto natural) en combinación con técnicas de CCF. Las pruebas de tamizaje químico se fundamentan en la reacción selectiva de grupos funcionales específicos con reactivos capaces de formar complejos visualizables por el desarrollo de coloraciones características o por la formación de precipitados (Bruneton, 1995; Wagner & Bladt, 1996). La respuesta reactiva de estándares conocidos de grupos funcionales particulares se utiliza frecuentemente como medio de comparación.

Entre los métodos de separación y aislamiento de metabolitos secundarios, la cromatografía es una de las técnicas más útiles. De estas técnicas tres son de especial importancia: cromatografía en columna, CCF y HPLC. Los principios en que se basan estas técnicas son los fenómenos de adsorción, partición, intercambio iónico y exclusión de tamaño. La cromatografía se puede definir como la distribución de los componentes de una muestra en dos fases: una móvil (gas o líquido) y una fija o estacionaria (sólida que actúe por adsorción, partición, intercambio iónico o exclusión de tamaño, o líquida impregnada en una matriz inerte que actúe por partición).

II.5.3 Cuantificación de substancias constitutivas

II.5.3.1 Cromatografía de gases (CG)

En CG la muestra se volatiliza e inyecta en la cabeza de una columna cromato-gráfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito, su única función es la de transportarlo a través de la columna. Los tiempos de retención deberían servir para la identificación de los componentes de una mezcla, sin embargo está limitado por un número de variables que deben ser controlados para obtener resultados reproducibles (Skoog, Holler & Nieman, 2001)

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II.5.3.2 Espectroscopía UV-VIS

La espectroscopía UV-VIS permite determinar la absorción de luz en una muestra, en el intervalo de longitudes de onda comprendido entre 190 y 700 nm. Los instrumentos para medir la absorción de radiación UV, visible y en el infrarrojo cercano están compuestos por uno o más de los siguientes componentes: fuentes, selectores de longitud de onda, recipientes para la muestra, detectores de radiación, procesadores de señal y dispositivos de lectura. Las aplicaciones de los métodos de absorción UV/visible cuantitativas no sólo son numerosas sino que abarcan todos los campos en los que se demanda información química cuantitativa (Skoog, Holler & Nieman, 2001).

II.5.3.3 Cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC)

La HPLC es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada por su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen aminoácidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas y una variedad de sustancias inorgánicas (Skoog, Holler & Nieman, 2001).

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PARTE III. RESULTADOS

III.1 OBJETIVO 1.

Recolectar la mayor variabilidad de esta especie a través de trabajos de campo entres departamentos donde se ha reportado que crecen silvestremente.

III.1.1 Localidades muestreadas

En el Cuadro 1 se muestran las localidades donde se recolectó material vegetal de cuatro departamentos del país y el número en el Herbario Bigu de la Facultad de CCQQ y Farmacia, USAC, en la Figura 1 se muestra la distribución aproximada de las colectas.

Cuadro 1. Distribución geográfica y variabilidad de valeriana en Guatemala

Departamento Municipio Aldea Lugar Crecimiento No. Hebr.

El Quiché

Chajul Chacalté Caserío Xetenám, Xexube Silvestre 49181Joyabaj Chaquil Caserío Tzajmá, huerto grupal Cultivada 49183Nebaj Tzalbal Caserío Chuché, comuna Patzité Silvestre 49180Nebaj Cantón Jolopxan, colección Cultivada 49179

TotonicapánTotonicapán Caserío Chaculjuyup CultivadaTotonicapán Panquix Altar SilvestreTotonicapán Vásquez Cerro Raxquím Silvestre 49182

San MarcosConcepción Tutuapa Tierra Blanca Huerto grupal Cultivada 49184San José Ojetenam Choanlá Ladera de cerro Silvestre

Chimaltenango Patzún Chuchucá Alto Centro de Acopio Silvestre 49185

Figura 1. Mapa de distribución de colectas de Valeriana.

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III.1.2 Descripción de las localidades y plantas de valeriana silvestre encontradas

III.1.2.1 Xetenám, Xexube (Chajul, Quiché)

En este sitio se encontraron poblaciones silvestres de valeriana. Su ubicación geográfica es: latitud 15° 28’ 43.1”, longitud 91° 02’ 09.2”, a una altura de 1,990 msnm. La actividad se hizo en la primera semana de mayo. La topografía general de la zona es montañosa y forma parte de la Sierra de los Cuchumatanes. Corresponde a la zona de vida bosque muy húmedo montano bajo (bmh-MB), con una precipitación anual promedio de 2,730 mm, y biotemperaturas de 12.5-18.6°C. Dentro de su vegetación indicadora se encuentran Cupressus lusitanica, Pinus ayacahuite y P. hartwegii.

Las características del sector de crecimiento de valeriana, son las de un potrero con superficie ondulada. Presenta un suelo arcilloso de color café oscuro con una profundidad superior a los 20 cm y una baja pedregosidad. La especie se distribuye en todo el potrero que colinda con la carretera de terracería. A veces forma grupos densos que en promedio tienen una separación de 40 cm entre plantas. Se observó que la mayoría de plantas estaba en etapa vegetativa y que presentaban escaso desarrollo en su follaje. Pero al momento de cosechar una muestra de plantas se observó que sus raíces pivotantes cuentan con un importante desarrollo. Esta particularidad indica que las plantas fueron podadas en un tiempo cercano al momento de la caracterización, por el pastoreo de animales. Esta situación puede repetirse eventualmente, sin embargo no ha interferido en el desarrollo de las raíces. En cuanto a extracciones de materiales, el sector parece no sufrirlas.

Las características botánicas son las de una hierba perenne de numerosas hojas basales, puede formar macollas que le dan una apariencia cespícola (césped), sus hojas están divididas a lo largo y tienen una forma de espátula con bordes crenados. Las dimensiones de sus hojas van de 14.0-28.2 cm de largo y de 1.8-3.0 cm de ancho. Cada planta está formada por 3-6 macollas, cada una con 8-16 hojas. Presenta una raíz principal pivotante que puede medir hasta 54.0 cm de largo y 2.6 cm de diámetro en su parte media, con olor moderado cuando está fresca. No se presentan datos de flores porque al momento de la caracterización estaba en otra etapa fenológica. Preliminarmente se considera que es V. prionophylla. El resumen de la información es el siguiente.

Largo de raíz (cm) 54Grosor de raíz (cm) 2.6 en su parte mediaOlor de la raíz fresca; y seca Moderada; y fuerteCantidad de macollas/planta 3 a 6Características de la hoja Basal y de forma espatularCantidad de hojas/macolla 8 a 16Dimensiones (cm) de largo; y ancho Largo: 14-28.2; Ancho: 1.8-3.0Tipo de margen de la hoja Crenado

En éste sector se cosecharon plantas silvestres y se realizó la separación de la parte vegetativa para establecerla en la colección de la FAUSAC. La raíz se usó para iniciarestudios de la poscosecha en los procesos de lavado, cortado, secado y almacenaje.

Para la obtención de 1 kg de plantas frescas se tuvo que cosechar siete ejemplares completos, teniendo cada cual un peso promedio de 155.33 g. De este peso, sólo el 41.35% corresponde a la raíz. En el proceso de lavado y limpieza para 1 kg de plantas frescas se invierte un tiempo aproximado de 8.5 min. El lavado se realiza para separar las

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partículas de suelo que están adheridas al cuerpo de la raíz. Después del lavado se realizó el procedimiento de cortado o picado y en este se cortaron las raíces en forma laminar con aspecto de hojuela. El tiempo invertido para picar 1 kg de raíces fue de 2.2 horas.

El material obtenido se sometió al proceso de secado, para lo cual se utilizaron dos tratamientos. Primero se colocó en un secador solar por espacio de 4 días en los cuales perdió un 75.24% de su peso inicial, esta actividad se desarrolló en la primera quincena de mayo. Luego se utilizó un horno de laboratorio para incrementar esta pérdida, después de pasar por espacio de 4 horas se obtuvo un valor final de 77.65%. La relación de peso fresco a seco, para las raíces, es de 4.5:1. Expresando este resultado en peso tenemos que 1 kg de raíces picadas frescas se reduce a 223.5 g de materia seca.

El proceso de secado también se aplicó a las hojas. En este caso se estimó que estas pierden un 95% de su peso inicial. Para el almacenamiento de los productos secos se utilizaron bolsas plásticas. En la Figura 2 se puede apreciar estos materiales.

Figura 2. Valeriana colectada en Chajul, Quiché.

III.1.2.2 Patzité o Xetix (Nebaj, Quiché)

Dentro de esta área comunal se encontró un sitio con crecimiento silvestre de valeriana. Su ubicación geográfica: latitud 15° 26’ 20”, longitud 91°14’58.4”, a una altura de 3,080 msnm. Esta actividad se efectuó en la primera semana de mayo. Para realizarla se contó con la colaboración de la asociación APAPTIX de Nebaj, quienes facilitaron la intervención de uno de sus asociados, el señor Pedro Cobo.

La topografía general de la zona es montañosa y forma parte de la Sierra de los Cuchumatanes. La zona de vida a la que corresponde es bosque muy húmedo montano bajo (bmh-MB). Esta es la misma zona en la que está el lugar explorado en Chajul, y su descripción aparece en ese mismo apartado.

El sector donde crece la valeriana silvestre es una cumbre con crecimiento de matorrales y regeneraciones de pino. Anteriormente, este sector estaba ocupado por un bosque maduro de pinos, pero a consecuencia de un incendio forestal, ocurrido según el guía en la década de los 90s, el área quedó despejada o abierta. Para llegar a este sector se necesita caminar aproximadamente 10 km por senderos escarpados. En su superficie y subsuelo es frecuente encontrar materiales rocosos de considerables tamaños. El suelo es de textura franco-arcilloso, con una coloración café y de escasa profundidad.

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La valeriana se distribuye en todo el sector, creciendo muchas veces entre los espacios formados por las rocas. En algunas partes se observan altas densidades de plantas jóvenes. Es frecuente observar la presencia de valeriana en un radio de 30 m. Este sector no muestra señales de extracciones de materiales vegetales de valeriana.

Respecto al crecimiento de las plantas, se observó que presentan regulares a abundantes desarrollos en el follaje. En cuanto al crecimiento de sus raíces, se observó que la mayoría de plantas está formada por raíces de mediano tamaño. Un reducido número estaba en la etapa fenológica de floración, presentando formación o crecimiento de eje con flores cimosas densas. Al momento de la caracterización se observó que en una planta estaba sólo la estructura del eje floral, por lo que se considera que en días anteriores se dispersaron sus semillas.

Las características botánicas son las de una hierba perenne de numerosas hojas basales, puede formar macollas que le dan una apariencia cespícola (césped), sus hojas están divididas a lo largo y tienen una forma de espátula con bordes crenados o aserrados. Las dimensiones de sus hojas van de 8.0-25.0 cm de largo y de 0.7-2.5 cm de ancho. Cada planta puede estar formada por 2-14 macollas, teniendo cada una de 6-30 hojas. Presenta una raíz principal pivotante que puede llegar a medir hasta 66.0 cm de largo y hasta 3.5 cm de diámetro en su parte media, con olor moderado cuando está fresca. Flores cimosas y su eje floral es vacío en la parte central y puede alcanzar una altura de 50.0 cm. El eje de la flor puede estar emergiendo de entre los hijuelos, o en la parte media de cada hijuelo. El color de sus flores es blanco con segmentos púrpuras en sus pétalos y cáliz. Se determinó que es V. prionophylla. El resumen de la información es el siguiente:

Largo de raíz (cm) 66Grosor de raíz (cm) 3.5 en su parte mediaOlor de la raíz fresca; y seca Moderada; y fuerteCantidad de macollas/planta 2 a 14Características de la hoja Basal y de forma espatularCantidad de hojas/macolla 6 a 30Dimensiones (cm) de largo; y ancho Largo: 8-25; Ancho: 0.7-2.5Tipo de margen de la hoja Crenados o aserrados.

De los materiales caracterizados se observó una planta que estaba formada por siete hijuelos y en cinco de ellos crecieron ejes florales. También se encontró una planta que superaba a todas, en tamaño y desarrollo, con los siguientes datos: 24.0-44.0 cm de largo de hoja y anchos de 1.1-2.0 cm, 6 macollas (hijuelos) con 12-16 hojas cada una, 1.7 m de largo en su eje floral, 60.0 cm de largo de raíz con un diámetro de 2.6-5.0 cm y un peso fresco de 255.6 g.

En este sector se cosechó un lote de plantas silvestres, del cual se separó la parte vegetativa para establecerla en la colección de la FAUSAC y las raíces se usaron en los procesos de poscosecha. Para obtener 1 kg de plantas frescas se cosecharon 17 ejemplares completos, en aproximadamente 1.4 horas, teniendo cada planta un peso promedio de 64.0 g. De este peso, la raíz representa un 54%. Para el proceso de lavado y limpieza de 1 kg de plantas frescas se invirtió un tiempo aproximado de 29 min. Luego, se realizó el proceso de cortado, en el cual se invirtió 1 hora en picar 1 kg de raíces frescas. Este tiempo es menor al invertido en las raíces de Chajul debido a que la mayoría del lote presentaba raíces blandas de mediano largo y ancho, facilitándose con ello el corte.

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Para el proceso del secado se utilizaron los tratamientos de secador solar y horno de laboratorio. Con el primer tratamiento se perdió un 78.6% de su peso inicial, el secado se realizó en la primera quincena de mayo por espacio de 4 días. Con el uso del horno de laboratorio se alcanzó una pérdida total de 80.6%, respecto a su peso inicial. La relación de peso seco, para las raíces, es de 4.5:1.

En el secado de las hojas se calculó que pierden un 85% de su peso inicial. Este porcentaje es distinto al resultado de Chajul y se debe a que las hojas de este lote eran más consistentes y también a que en el proceso se utilizó una muestra más grande que originó resultados más precisos. Para el almacenamiento se utilizaron bolsas plásticas. En la Figura 3 se observan las características de este material y del sector de crecimiento.

Figura 3. Valeriana colectada en Nebaj, Quiché.

III.1.2.3 Cerro Raxquím (Totonicapán, Totonicapán)

En un sitio explorado de este cerro se encontraron poblaciones silvestres de valeriana. El tipo de tenencia de la tierra es comunal. Su ubicación geográfica es en las siguientes coordenadas: latitud 14° 49’ 59.1”, longitud 91° 23’ 31.4”, a una altura de 3,221 msnm. Esta actividad se efectuó en la primera quincena de abril.

La topografía general de la zona es montañosa. La zona de vida es la de bosque muy húmedo montano bajo (bmh-MB). Esta es la misma zona en la que se encuentran los lugares con crecimiento silvestre localizados en Quiché. La descripción de esta zona aparece en el apartado de la exploración de Chajul. El sector donde crece la valeriana silvestre es ondulado con inclinaciones suaves. Presenta un suelo franco arenoso de color café oscuro con una profundidad superior a los 20 cm, libre de pedregosidades y con altos contenidos de materia orgánica.

La valeriana crece dentro de un bosque ralo de pino, en cuyo sotobosque abunda el pajón colorado; puede crece en sectores donde el pajón es denso o ralo. En ocasiones se observan agrupamientos de plantas que parecieran estar formados por plantas individua-les, sin embargo, son macollas que se han prolongado desde una misma raíz hospedada en suelo firme, debido a que en la superficie se aloja una abundante capa de materia orgánica en descomposición. La consistencia de las prolongaciones es distinta a la de la raíz.

En este sector parece que suceden extracciones moderadas de material de valeriana, ya que se observó que son frecuentes los agujeros profundos y la acumulación de tierra a la par de estos. Dentro de la vegetación que abunda cerca de este bosque se observó: pino, arrayán, pajonales, melena de león (C. jalapensis), tabaco chocón (N. rustica).

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Las características botánicas son las de una hierba perenne de hojas basales, puede formar macollas que le dan una apariencia cespícola (césped), sus hojas están divididas a lo largo y tienen una forma de espátula con bordes glabros crenados. Las dimensiones de sus hojas son de 20-35 cm de largo y de 2.0-3.0 cm de ancho. Cada planta puede estar formada por 2-6 macollas, teniendo cada una de 10-20 hojas. Presenta una raíz pivotante que puede medir hasta 45.0 cm de largo y 7.32 cm de diámetro en la parte más cercana a la superficie y 2.5 cm de diámetro en su parte media. Presenta olor moderado cuando está fresca y sus pesos frescos van de 56.8-340.8 g, con un valor promedio de 166.0 g. No presenta datos de sus flores debido a que al momento de caracterizarla estaba en otra etapa fenológica. Preliminarmente se considera que es V. prionophylla. El resumen de la información es el siguiente:

Largo de raíz (cm) 45Grosor de raíz (cm) 2.5 en su parte mediaOlor de la raíz fresca; y seca Moderada; y fuerteCantidad de macollas/planta 2 a 6Características de la hoja Basal y de forma espatularCantidad de hojas/macolla 10 a 20Dimensiones (cm) de largo; y ancho Largo: 20-35; Ancho: 2-3Tipo de margen de la hoja Crenado y glabro

Se cosechó un lote de plantas silvestres y se realizó la separación de la parte vegetativa para establecerla en la colección de la FAUSAC. La raíz se usó para los estudios poscosecha en los procesos de lavado, cortado, secado y almacenaje.

Para obtener 1 kg de plantas frescas se tuvo que cosechar cinco ejemplares completos, invirtiendo en esta actividad aproximadamente 40 min. Cada planta registró un peso promedio de 202.2 g. Para el proceso de lavado y limpieza de 1 kg de plantas frescas se invierte un tiempo aproximado de 10 min. Luego, en el proceso de cortado y picado se estimó que para cortar 1 kg de raíces se necesita 1.5 horas.

En el proceso de secado se utilizó dos tratamientos, por medio de un secador solar y un horno de laboratorio. Primero, las raíces perdieron un peso inicial del 82%, en unos siete días, este tratamiento se realizó en la segunda quincena de abril. El peso final que perdieron, después de pasar por el horno, fue del 83%. La relación de peso fresco a seco, para las raíces, es de 6:1. Para el almacenamiento de los productos se utilizaron bolsas plásticas. En la Figura 4 se observan las características de este material.

Figura 4. Valeriana colectada en el Cerro Raxquím, Totonicapán.

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III.1.2.4 Panquix (Totonicapán, Totonicapán)

En esta aldea se exploró un sitio en donde crecen poblaciones silvestres. Esta actividad se efectuó en la última semana de abril gracias a la ayuda del señor Obispo Gregorio García, que colaboró como guía y que forma parte de ATI. Según él, la planta es conocida como valeriana. Mencionó que tiene sembradas unas plantas en el patio de su casa, las cuales colectó en este lugar. Esto le ha permitido agenciarse de materia primapara la elaboración de jarabes, que mezcla con otras plantas. Este medicamento lo recomiendan para el control del sistema nervioso.

La ubicación geográfica es: latitud 14° 52’ 38.6”, longitud 91° 19’ 41.0”, a una altura de 2,898 msnm. La topografía general de la zona es montañosa y forma parte de la sierra Parraxquim. Está comprendida dentro de la zona de vida de bosque muy húmedo montano (bmh-M), la cual presenta precipitaciones totales anuales de 2,500 mm, con una biotemperatura de 11°C. La vegetación natural que predomina es del género Pinus.

El sector en donde crece se caracteriza por ser un paredón ligeramente inclinado, en el que se han formado peldaños que permiten la acumulación de materia orgánica. En algunos de estos peldaños se encontró creciendo en bajas densidades a la valeriana, la cual presentaba un escaso follaje y una raíz delgada pivotante. Una de las causas puede ser la intensa extracción de estos materiales. Se observaron indicios de perforaciones y fabricación de escalinatas sobre el paredón para alcanzar peldaños inaccesibles.

En otro lugar, cercano al paredón, se encontraron poblaciones densas de plantas jóvenes creciendo dentro de una franja habitada por pinos. Estas plantas, al momento de la exploración, presentaban un crecimiento vegetativo similar al de valeriana. Este atributo incidió en que se colectara junto con las plantas que presentaban raíces delgadas pivotantes, considerando que se trataba de la misma especie. Sin embargo, a medida que el lote se fue adaptando al establecimiento en la colección de materiales vegetales, se observaron características botánicas distintas.

Existe similitud entre el material con raíces pivotantes y V. prionophylla, ya que en el desarrollo vegetativo y radicular presenta un comportamiento parecido. Varían con respecto a las hojas, ya que el material de esta zona presenta hojas más delgadas y afelpadas, respecto a las características de la flor no se tienen evidencias (Figura 5).

Figura 5. Material colectado en Panquix, Totonicapán.

En cuanto al material de las plantas jóvenes, se ha observado que presenta otras características botánicas. Dentro de éstas se tiene que las plantas desarrollan estolones en su parte vegetativa, sus sistemas radiculares son fibrosos y diferencian un eje floral con

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una flor de pétalos amarillos. Por sus características florales se puede considerar que pertenece a las asteráceas. En la Figura 6 se puede observar el crecimiento vegetativo joven, similar al de valeriana, y sus otras variables.

Figura 6. Planta con crecimiento vegetativo similar al de valeriana.

Como se ha explicado, ambas especies se colectaron sin distinción, presumiendo que se trataba de la misma. A medida que crecían, se notaba que presentaban caracte-rísticas distintas. Se llegó a pensar que también las plantas que se colectaron con raíces pivotantes, desarrollarían estolones y flores amarillas. Esto se fue desvirtuando y en estos momentos se considera que las plantas con raíces pivotantes pueden ser V. prionophylla.

Otra situación que incrementó la duda del lote colectado fue de que se tuvo la oportunidad de visitar las plantas del señor Obispo Gregorio, quién mencionó que las trasladó desde el lugar silvestre al patio de su casa. En esta visita se observó que el comportamiento vegetativo es como el de V. prionophylla, y por lo que este señor menciona, la planta sí desarrolla raíces pivotantes.

III.1.3 Generalidades de los materiales silvestres de valeriana

La valeriana crece de forma silvestre en lugares donde las condiciones de humedad son altas y las temperaturas se mantienen de frías a frescas, según se puede deducir de la información de las zonas de vida en las que se encuentran los lugares localizados. Su preferencia de crecimiento es en sectores abiertos, aunque también crece dentro de bosques de baja densidad (ralos). Aunque por las características de las zonas de vida en las que crece, pueden estarse formando ambientes sombríos y húmedos.

Se encontró presente en áreas montañosas con alturas que van desde los 1,990 a los 3,221 msnm. Los suelos donde crece pueden estar libres o con presencia de piedras, con altos contenidos de materia orgánica.

El desarrollo de flores en estas áreas es desconocido. Únicamente se tienen algunos registros de que en algunas plantas ha finalizado la etapa de liberación de semillas por los meses de diciembre y mayo, y en este último mes el número es aún más reducido. Mientras que para ambos meses también existen plantas que están desarrollando flores,siendo más frecuente durante mayo.

Los rendimientos de raíces frescas a secas son de 4.5:1 o de 6:1. Esta proporción se ve incrementada cuando se emplean raíces que no han alcanzado una mayor madurez y desarrollo, por lo que sus contenidos de humedad son mayores. También se puede

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incrementar cuando se procesan las elongaciones que las plantas forman desde su raíz para desarrollar su parte vegetativa.

En los procesos de la cosecha y poscosecha existen algunos que necesitan de una mayor cantidad de tiempo, especialmente la cosecha y el corte o picado. El primero se puede mejorar con el uso de piochas medianas que permiten una mayor remoción de suelo para despejar el espacio que ocupa la raíz. El proceso de corte se puede facilitar con un instrumento que funcione como una guillotina con varias hojas afiladas.

III.1.4 Caracterización de los materiales domesticados y sus áreas de establecimiento

En el occidente del país existen tres ONG que trabajan en la domesticación de la valeriana. Todas presentan algunas coincidencias para el manejo de la especie, el cual está, en términos generales, en un nivel inicial debido a distintas razones. Las instituciones que compartieron sus experiencias en la domesticación de valeriana fueron: ATI (Totonicapán) APAPTIX (Nebaj), Intervida (Quetzaltenango). De éstas, sólo Intervida promueve la siembra de este vegetal en de comunidades rurales. Mientras que en el caso de APAPTIX, han establecido una siembra dentro de su colección de plantas medicinales, la cual está por alcanzar un año de ser sembrada. En relación a ATI, es un asociado que se ha preocupado por mantener algunas plantas dentro del patio de su casa.

III.1.4.1 Experiencias de Tzajmá, Joyabaj y Tierra Blanca, Concepción Tutuapa.

Estas localidades han recibido el apoyo de Intervida para el establecimiento de huertos comunales con siembras de varias especies medicinales y árboles frutales. El objetivo primordial es que estas comunidades cuenten con materias primas vegetales para la elaboración de medicamentos. En todos estos procesos de producción reciben asistencia por parte de la institución. En estos huertos se implementan prácticas de conservación de suelo y del medio ambiente, con el uso de productos orgánicos.

En el departamento de San Marcos se visitó el huerto del grupo de agricultores Amigos del Campo. Este grupo radica en la aldea Tierra Blanca, Concepción Tutuapa. La ubicación geográfica del huerto es: latitud 15° 14.808’, longitud 91° 55.430’. Esta actividad se realizó en la primera quincena de marzo. La topografía es montañosa. Pertenece a la zona de vida de bosque muy húmedo montano bajo (bmh-MB), cuya descripción ya se ha presentado.

El sector donde está la valeriana se caracteriza por contar con terrazas fabricadas en una parte donde la pendiente es leve. El suelo es de textura franca, con una profundidad superior a los veinte centímetros y superficie libre de piedras.

Respecto a las características del material vegetal propagado, se mencionó que se desconoce la procedencia exacta, pero se supone que proviene de alguna área de Quiché.Al momento de reconocer el área se observó que sobrevivían pocas plantas, por la escasez de agua, según mencionó el encargado del huerto. Las plantas sobrevivientes fueron sembradas en mayo 2006, con la entrada del invierno. En esa fecha, inicialmente se realizó la cosecha de raíces y posteriormente se sembraron los brotes para la nueva plantación. Para la preparación del terreno hacen volteo del suelo. Los brotes son sembrados con un distanciamiento de 40 cm, en forma de cuadro, en agujeros de 10 cmde profundidad. Los porcentajes de pegue son bajos debido a la escasez de agua.

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En la fertilización de las plantas incorporan 0.5 kg de estiércol ovino en cada una. No conocen de algún daño ocasionado por plagas y han notado que en la cosecha algunas plantas presentan una coloración negra en el centro de la raíz. Han calculado que las plantas cosechadas pueden tener un peso fresco de 0.5 kg aproximadamente.

Las características botánicas de este material son las de una hierba perenne. Forma una raíz pivotante de hasta 50 cm de largo, con un diámetro de 10 cm en su parte cercana a la superficie, y presenta un olor moderado cuando está fresca. Sus hojas son basales de forma espatular, con largos de 25-30 cm y anchos de 1.8-4.9 cm, con márgenes glabros, crenados o levemente aserrados. Mencionan que la flor produce tonalidades moradas en sus pétalos. También han observado que las plantas desarrollan sus flores después de un año de ser sembradas. En este momento es cuando han notado que la raíz presenta un importante tamaño. Algunas plantas han liberado semillas que ha ocasionado que nazcan algunas plantas en los linderos de las terrazas.

Estos trabajos de establecimiento también se han llevado a cabo en el huerto grupal del caserío Tzajmá, Aldea Chaquil, municipio de Joyabaj, Quiché. El huerto se ubica en: latitud 15° 03’ 23.1”, longitud 90° 46’ 14.4”, a una altura de 2,062 msnm. Esta visita se realizó en la segunda quincena de abril.

La topografía del lugar es montañosa y forma parte de la sierra de Chuacús. Pertenece a la zona de vida de bosque húmedo montano bajo (bh-MB), la cual tiene un promedio de 1344 mm de precipitación anual, con biotemperaturas de 15-23°C. Dentro de su vegetación típica están los géneros Quercus y Pinus.

El sector donde se encuentra establecida la valeriana es en un huerto que tiene edificadas terrazas de conservación de suelo debido a las fuertes pendientes. El suelo es de color café claro, con profundidades mayores a los 20 cm, de textura arenosa y con alguna presencia de piedras en su superficie. En la preparación del terreno se incorpora gallinaza. El distanciamiento de siembra que utilizan es de 25 cm entre plantas y 75 cmentre calles. Tienen acceso a miniriego. Realizan fertilizaciones con broza del bosque. Mencionan que no tienen problemas por plagas o enfermedades.

Algunas de las características del material vegetal son las siguientes. Es una hierba perenne de hojas basales de forma espatular. El largo de sus hojas puede alcanzar los 18 cm y el ancho los 2.3 cm, los márgenes son aserrados y glabros. Se desconocen las características de la flor debido a que la siembra es reciente. En la Figura 7 se muestran los materiales y las áreas de Tierra Blanca y Joyabaj.

Figura 7. Materiales de valeriana de (a) Tierra Blanca y (b) Joyabaj.

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III.1.4.2 Experiencias en la colección de plantas medicinales de APAPTIX

La colección se encuentra en del área que ocupa la sede de APAPTIX en el cantón Jolopxan, Nebaj, Quiché. Sus coordenadas geográficas son: latitud 15° 24’ 02.3”, longitud 91° 08’ 49.6”, a una altura de 1,910 msnm. Esta colección se visitó en dos oportunidades, la primera en diciembre del 2006, y la última en mayo del 2007.

La siembra está establecida en un terreno inclinado que cuenta con terrazas de conservación de suelo, el cual es de textura arcillosa y superficie libre de piedras. A esta valeriana se le conoce según la traducción al castellano, como lengua de venado. La fuente del material sembrado es silvestre y la forma de propagación utilizada es vegeta-tiva. Los distanciamientos utilizados son de 40 cm entre plantas y 60 cm entre calles.

En la preparación del suelo es incorporada materia orgánica. La siembra recibe riegos frecuentes. No realizan ningún tipo de control fitosanitario, ya que mencionan que no han observado ningún problema ocasionado por plagas o enfermedades. La fuente del material sembrado es de las montañas del caserío Chuché, Nebaj.

III.1.4.3 Experiencias en el manejo de valeriana realizado en ATI

Estos trabajos de domesticación han sido realizados por el señor Obispo Gregorio, en ATI. Como se mencionó anteriormente, este realizó una colecta de este material en la aldea Panquix, Totonicapán. El material lo mantiene sembrado en el patio de su casa, la cual se ubica en el caserío Chuculjuyup, Totonicapán. Las coordenadas geográficas son: latitud 14° 53’ 24.3”, longitud 91° 22’ 51.0”, a una altura de 2,534 msnm.

El manejo de este material le permite obtener las raíces que prepara para la elaboración de medicamentos. Para la siembra voltea el terreno y le incorpora broza. Utiliza distanciamientos de 25-50 cm entre plantas. En la siembra utiliza las secciones vegetativas con un corte de raíz de 10 cm.

La cosecha de raíces la realiza conforme necesita materia prima, pero considera que después de la floración ésta puede ser cosechada. Se calcula que la planta necesita de aproximadamente un año para producir flores y estas se pueden observar por el mes de octubre. En la Figura 8 se muestran las condiciones de esta siembra. En estas también se puede observar que el desarrollo vegetativo de las plantas es muy similar al de V.prionophylla. Este dato ha sido importante para diferenciar las especies que se colectaron en el sector silvestre. Ya que, como se mencionó anteriormente, se colectó una planta que presentaba un crecimiento vegetativo similar, en su etapa inicial, al de valeriana.

Figura 8. Plantas de valeriana con cierto manejo para su producción.

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III.1.4.4 Choanlá, San José Ojetenam, San Marcos

Esta localidad se encuentra en el camino de Ixchiguán a San José Ojetenam, a unos 4 km del cruce de la carretera asfaltada. El lugar se encuentra en una pendiente con orientación hacia el sur, al parecer la distribución natural es amplia pero ha quedado cortada por la carretera que en ese lugar empieza a descender hacia San José Ojetenam y por lo tanto tiene varios cortos en la pendiente. Los datos ambientales del lugar son:latitud N 1512´45”; longitud W 9157´29” a una altura de 3,507 msnm; temperatura ambiente 15.5C, humedad relativa 66.7% y presión atmosférica 669.8 mbr.

Se seleccionó algunas plantas para su cosecha, en realidad se trata de una macolla compuesta por varias plantas unidas. Para la cosecha de las plantas se utilizó una coba con el fin de extraer toda la raíz. Después de extraídas fue necesario quitar todo el suelo en exceso, aprovechando para separar las raíces, trabajo que es bastante laborioso.

Una vez limpiada y picada la raíz de valeriana se tuvo un peso fresco de 6.7 kg y en seco se obtuvo 1.16 kg, con esto se tiene una relación peso fresco a seco de 5.86:1. El tiempo de secado fue de 8 días.

III.1.4.5 Chuchucá, Patzún, Chimaltenango

Esta población está ubicada a unos 15 km de Patzún en camino de terracería que sube hacia las montañas del lado sur. El lugar está ubicado en una bifurcación de dos caminos donde convergen los vendedores mayoristas de hortalizas del área. La población está bastante deteriorada ya que a la par se trabajó con maquinaria la cual hizo un corte de unos 2 m para aplanar el área, de tal forma que solo quedó resto de lo que fue esta población. Estaba compuesta de aproximadamente 10 macollas, cada una con una gran cantidad de hijuelos. Los datos ambientales del lugar son: latitud N 14 39´; longitud W 91 02´, una altitud de 2501 msnm, temperatura de 12.9C, humedad relativa 72%, velocidad del viento de 6.2 kph y presión atmosférica de 757.6 mbr. La Figura 9a muestra un aspecto de este sitio.

Figura 9. Valeriana de Chuchucá, Patzún, Chimaltenango a la izquierda y valeriana de Choanla, San José Ojetenam, San Marcos en la derecha.

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III.1.4.6 Seguimiento de población silvestre de Choanlá, San José Ojetenan, SM

De septiembre de 2007 a noviembre de 2008 se estuvo monitoreando la población silvestre de Chonlá, San José Ojetenan (Figura 9b). En octubre se colectaron muestras para herbario de las especies acompañantes encontrándose entre las principales. Se encontraron cuatro especies de Asteraceae y una de Poaceae que no pudieron se determinadas, las que si se determinaron son: Ranunculus giodes HBK (Ranunculaceae), Buddleja magalocephala Donn-Sm. (Loganiaceae), Eryngium cimosum Delar.(Apiaceae), Lupinus montanus HBK (Fabaceae) y Castilleja tapeinoclada Loes.(Scrophulariaceae)

En marzo 2008 se pudo notar que producto de las heladas, e incluso en este lugar cayo nieve en el mes de diciembre, la vegetación herbácea estaba completamente quemada, únicamente se veían las gramíneas con un color café. Por otra parte la época seca contribuye a que no haya rebrotes. En el caso de la valeriana, la parte vegetal aun no ha empezado a brotar, pero por abajo del suelo se encuentran las raíces en forma latente.

En abril se pudo notar que con las lluvias esporádicas que se han sucedido en el mes, ya es posible observar las hojas nuevas de las rosetas de las plantas, aunque el aspecto general de la población aun es dominado por tallos de gramíneas secas como puede verse en la fotografías siguientes.

En agosto se le encontró en estado fenológico de plena floración y algunas en inicio de fructificación, en esa ocasión se pudo sentir el aroma agradable del aceite esencial de las inflorescencias. Se colecto una buena cantidad de inflorescencias para secarlas y entregarlas para un análisis de aceite esencial. No se logro colectar semilla madura, porque la mayoría aun estaba en estado inmaduro (Figura 10).

Figura 10. Aspecto general del área de Choanlá y de las plantas de valeriana.

En septiembre se observó que las inflorescencias (ahora infrutescencias) ya estaban casi maduras. En el año anterior se colectaron infrutescencias completas y se notó que hubo muy bajo porcentaje de germinación, por eso ahora se optó por recolectar solo aquella semilla que estaba a punto de desprenderse, esto se realizó con la ayuda de una bolsa en la cual se introducía la infrutescencia y por medio de golpes se soltaba la semilla. Con dos personas en 2 horas de colecta se logró obtener cerca de 3 g de semilla madura.

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En la visita a la población silvestre en agosto se encontró a V. prionophylla asociada otra especies de valeriana que solo produce hojas y flores en la época de lluvia y luego desaparece sobreviviendo por sus tubérculos, se trata de V. deltoidea, la cual fue recolectada, determinada en el herbario y se trajo material para siembra.

Se colectó muestra para herbario y para siembra de V. deltoidea. Esta especie no aparece en la vegetación que existe en la época seca en la población silvestre de V. prionophylla. En el mes de julio empieza a producir sus hojas a partir de plantas en estado latente en forma de tubérculos en el suelo y posiblemente desaparecerá en el mes de noviembre. La altura en estado vegetativo no pasa de 15 cm, cuando produce inflorescen-cia alcanza 50-60 cm. La inflorescencia es muy parecida a la de V. prionophylla y la única diferencia en el campo es porque están partiendo de plantas más pequeñas. En este mes es cuando se logró colectar la mayor cantidad de semilla (Figura 11).

En octubre se notó que las infrutescencias ya habían dispersado la mayoría de semillas, solo se logró cosechar unas cuantas infrutescencias. El aspecto de la población eran plantas con hojas en roseta e infrutescencias ya sin frutos de un color rojizo.

En noviembre por los vientos fuertes que dominaron el área y las bajas temperaturas, el aspecto general del área es el de plantas de color café, sólo las rosetas de valeriana sobrevivieron a la época.

Figura 11. Población silvestre de valeriana de Choanlá, San José Ojetenan en octubre 2008.

III.1.5 Análisis de suelo para algunas localidades

Se obtuvo información de los niveles minerales presentes en una muestra de suelo y en una planta de valeriana, de dos localidades, por medio de análisis efectuados en el laboratorio de suelo-planta-agua Salvador Castillo Orellana de la FAUSAC. Las localidades evaluadas fueron: Tierra Blanca, lugar en el que se han establecido siembras de valeriana, y, Cerro Raxquím, en donde la valeriana crece de forma silvestre.

Para el análisis de las plantas se eligió una de cada localidad, que presentaba una raíz desarrollada, considerándose que por su formación podía ser una planta adulta o cerca de serlo. En cuanto al desarrollo vegetativo presentaban una regular cantidad de hojas, y ambas no presentaban indicios de diferenciación floral.

Los datos obtenidos se pueden utilizar para compararlos con los que se puedan obtener de una planta que ha recibido un mejor manejo agrotecnológico. Este tipo de análisis también puede realizarse durante las distintas etapas de crecimiento de la valeriana, para así determinar los momentos en los que necesita una mayor disponibilidad de elementos minerales nutritivos (curvas de demanda).

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En el Cuadro 2 se presenta la información de los niveles minerales del suelo y de la planta proveniente de Tierra Blanca. Los datos de la planta son muy específicos para la etapa en la que se realizó el análisis, por lo que al estudiarlos en conjunto con los del suelo, sólo se puede precisar si los nutrientes presentes en el suelo están en los niveles recomendados para la mayoría de cultivos y de ser así, se puede tomar como dato óptimo el nivel que se obtenga en la planta.

Cuadro 2. Minerales nutritivos presentes en la planta y el suelo del área de Tierra Blanca.

Análisis químico del suelo

Identificaciónppm Meq/100 g ppm %

pH P K Ca Mg Cu Zn Fe Mn M.O.Rango medio 12-16 120-150 6-8 1.5-2.5 2-4 4-6 10-15 10-15

Resultado 6.0 3.17 270 12.48 1.69 0.10 3.50 4.00 19.50 7.36

Análisis químico de la planta

Identificación% ppm

N P K Ca Mg Na Cu Zn Fe Mn

Follaje 1.00 0.22 2.50 0.88 0.13 300 5 15 130 40

Raíz 0.38 0.18 2.44 0.63 0.24 325 5 20 145 35

Fuente: FODECYT 102-2006

El pH del suelo es 6, indicando que la mayoría de elementos estará disponible para ser absorbidos por la planta, siempre y cuando estén presentes en el suelo. El análisis de los macronutrientes primarios, que la mayoría de plantas requiere en mayores cantidades demostró que el nivel de N (nitrógeno) en la raíz y follaje lo obtiene en parte del 7.36% del contenido de materia orgánica. El nivel de P (fósforo) es bajo de acuerdo a los RM, aunque la cantidad en el follaje es mayor que en la raíz y puede deberse a que el follaje lo requiere más en este momento. El nivel de K (potasio) del suelo supera el RM, mientras que en la planta se observa que sus cantidades son similares.

En cuanto a los macronutrientes secundarios, los que la planta necesita en menores cantidades, el Ca (calcio) y Mg (magnesio) están dentro de los valores del RM, por lo que las cantidades registradas en su follaje y raíz deben ser las adecuadas para la etapa en la que se cosechó. De los micronutrientes, el Cu (cobre) y el Fe (hierro) están en niveles inferiores al RM y esto puede indicar que estén deficientes en la planta. Respecto al Zn (zinc) y Mn (manganeso) presentan valores que están cerca o por encima del RM, respectivamente, y al compararlo con los resultados de la planta de la otra localidad, se aprecia que al existir mayor disponibilidad en el suelo de estos elementos, la planta absorbe mayores cantidades. Aunque esto solo sirve de ejemplificar, ya que no se sabe si las plantas analizadas pudieran tener una edad similar. La presencia del Na (sodio), conocido como elemento benéfico, es importante por qué puede suplir la ausencia o bajo nivel de algunos elementos para que algunas funciones secundarias puedan realizarse.

En el Cuadro 3 se presenta la información de los análisis químicos del suelo realizados para la localidad del Cerro Raxquím. La edad de la planta utilizada no se puede precisar, únicamente se puede asumir que por el desarrollo presentado puede ser una planta adulta.

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Cuadro 3. Minerales nutritivos presentes en la planta y el suelo del cerro Raxquím.

Análisis químico del suelo

Identificación ppm Meq/100 g ppm %pH P K Ca Mg Cu Zn Fe Mn M.O.

Rango medio 12-16 120-150 6-8 1.5-2.5 2-4 4-6 10-15 10-15Resultado 6.0 2.25 2.83 8.11 1.69 0.10 9.00 7.00 25.50 19.89

Análisis químico de la planta

Identificación% ppm

N P K Ca Mg Na Cu Zn Fe MnFollaje 1.36 0.21 3.38 0.75 0.31 275 5 20 235 70Raíz 1.03 0.27 2.50 0.63 0.44 450 10 30 120 40

Fuente: FODECYT 102-2006

Esta planta crece en un suelo de pH 6, en el que la mayoría de elementos necesarios para el crecimiento están disponibles, siempre y cuando estén presentes. La demanda vegetal de N es alta y en buena parte lo obtiene de la materia orgánica que presenta un alto contenido (19.89%). Para los otros macronutrientes, P y K, están en niveles inferiores al RM, especialmente el P. El K presente en el suelo es escaso, pero sin embargo en la planta parece estar cerca de los mismos valores que la otra planta analizada.

De los valores de los macronutrientes secundarios el Ca y Mg están dentro del RM, por lo que los niveles en la planta se pueden considerarse adecuados para esta etapa de crecimiento. Los niveles en el suelo de Cu y Fe están por debajo del RM; mientras que los del Zn y Mn, están por encima del RM, por lo que los niveles en la planta también son mayores si se comparan con la de Tierra Blanca. En cuanto al Na se observa que está presente en la planta y puede contribuir en algunos procesos secundarios.

III.2 OBJETIVO 2.

Generar información de la biología floral en su ambiente silvestre y cultivado para establecer los pasos críticos en la propagación, producción, procesamiento y control para obtener semilla que permita desarrollar su cultivo y una droga vegetal de calidad.

III.2.1 Características de las flores y semillas de valeriana.

Se observó que los pétalos de sus flores son blancos con algunos tonos morados. En el proceso de adaptación se notó que algunas plantas desarrollan flores que presentanpétalos completamente blancos. Ambas variaciones se presentan en la Figura 12.

Figura 12. Tonalidades de los pétalos de las flores de V. prionophylla.

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En las distintas exploraciones realizadas, las personas que conocen la valeriana mencionan que esta florea en septiembre y octubre. Sin embargo, se ha observado que en diciembre y mayo se pueden encontrar algunas floreando. Este dato únicamente ha sido notado en el área de Nebaj.

Durante el establecimiento de las secciones vegetativas, se notó que algunas desarrollan eje floral. Esto puede ser como resultado de que la planta había alcanzado una edad adecuada para este efecto, por lo que la planta cuenta con la información necesaria para completar su ciclo. La planta desarrolla prolongados ejes florales hasta de 1.5 m que deben favorecer la dispersión de sus semillas. La dispersión también se asegura por unas estructuras que presentan las semillas, que son limbos del cáliz y que en conjunto se les conoce como vilano. Las semillas de esta especie son en forma de aquenio. La cantidad de semillas de V. prionophylla presentes en 0.5 g es de 1,300 unidades.

III.2.2 Obtención de semilla

La época de mayor producción de semilla al parecer es en agosto y septiembre. La obtención de semilla presenta el inconveniente que los frutos (aquenios) tienen un pappus el cual facilita, con la ayuda del viento, desplazarse de la planta madre. Por otra parte, la maduración de la infrutescencia no es uniforme, por lo tanto, se debe buscar aquellas infrutescencias que estén cercanas a la madurez fisiológica pero que aun no han empezado a esparcir sus frutos. En la primera obtención de semilla se cosecharon infrutescencias completas, lo cual dio lugar a tener mucha semilla vana.

En la colección de la FAUSAC, se han recolectado aquellos frutos que están listos para dispersarse, labor que se realiza todas las mañanas. La población de Chajul fue la que produjo flores y frutos primero. Una vez obtenidas las infrutescencias, se pusieron a secar para que sea más fácil del desprendimiento del fruto, teniendo cuidado de evitar las corrientes de viento (Figura 13). Luego se aporrean y después se separa el pappus del fruto que toma una consistencia algodonosa y por lo tanto la labor es bastante tediosa.

Figura 13. Aspecto general de (a) inflorescencia y (b) semilla de V. prionophylla

III.2.3 Germinación de la semilla

En diciembre 2007 se establecieron pruebas de germinación preliminares con se-millas de la población silvestre de Totonicapán obtenida en septiembre. Se encontró que muy pocas semillas son las que emergieron, notando que muchas semillas están vanas. Se obtuvieron cerca de 20 plántulas, tres de ellas son las más vigorosas. A los 60 días se

38

tenían 21 plántulas de 0.5 cm. Se realizó una prueba de germinación de semilla que había sido colocada sin seleccionar en agua y después de un día se sembró la semilla que quedoen el fondo del recipiente, asumiendo que por el peso es la que tiene embrión. Pero no se obtuvo germinación. Con la semilla de la población silvestre de Choanlá se sembró en abril 2008, una charola de 20x10 cm. De donde se obtuvo sólo una plántula.

En junio se volvió a hacer una siembra con semilla obtenida en agosto de 2007 de la población de Totonicapán. Esta vez la bandeja se cubrió con plástico procurando que las gotas de lluvia no le dañen y que esto provoque una mayor temperatura, para notar si de esa manera si hay germinación, pero no se obtuvo ninguna plántula.

En septiembre 2008 se obtuvo semilla de la población silvestre de Choanlá y se sembró inmediatamente, con lo que se obtuvo germinación a partir del quinto día, teniendo a los 20 días una cantidad considerable de plántulas. A los 30 días fueron sembradas en bolsas obteniéndose 300 plantas en bolsa y otras más fueron sembradas directamente en tablones, a todas estas se les está observando su comportamiento. Serealizó una prueba de germinación con esta semilla, se obtuvo un porcentaje de germinación de 93%, en lectura realizada a los 15 días después de la siembra (Figura 14).

Figura 14. (a) Bandeja de germinación con plántulas de V. prionophylla; y, (b) Plantas en almacigo a los 45 días.

III.2.4 Desarrollo de técnicas agronómicas para cultivo de valeriana.

Este objetivo se cumplió a través de diferentes observaciones realizadas en la colección de valeriana que se estableció en los campos de la FAUSAC. En el caso del establecimiento de la colección se elaboró un sustrato con una mezcla de materia orgánica tal como gallinaza (10%), broza (45%) y arena (45%) con lo que se procuró brindarhumedad, anclaje, nutrientes y drenaje a las plantas. Se sembró en un umbráculo de sarán para tener condiciones controladas de sombra.

Se sembraron hijuelos (macollas) y plantas jóvenes de valeriana de los materiales, silvestres y domesticados, que se colectaron en las distintas exploraciones. En el momento de la siembra se podaron las hojas presentes, acción permite estimular el crecimiento vegetativo de la especie. El distanciamiento de siembra empleado fue de 0.4 m. Al momento de ser realizada la siembra, se procedió a desinfectar los materiales vegetales con un fungicida de contacto de nombre Miregefe 75 WP (procloraz).

39

El número de plantas de cada material varía, debido a la disponibilidad que se encontró a la hora de la colecta. Los porcentajes de enraizamiento (pegue) estuvieron entre 50-70 %. Para la adaptación de las plantas se ha suministrado riego constante, logrando que la humedad se mantenga en el sustrato que sostiene los materiales vegetales. Se han realizado constantes deshierbes para evitar que plantas no deseadas compitan por espacio, humedad y luz, con los materiales establecidos en la colección. De los materiales establecidos, sólo el que proviene de Tierra Blanca no soportó la adaptación, por lo que se tuvo que hacer una nueva visita al lugar para obtener material.

La cosecha de material se llevó a cabo mediante la poda de hojas y luego la extracción de raíces, posteriormente se realizó un lavado de hojas y raíces, estas últimas fueron picadas antes de colocarlas en bandejas en el secador solar. El material para secado estuvo cerca de 20 días.

III.2.5 Seguimiento a colección de valeriana

Se dio seguimiento fenológico en la colección. A finales de enero 2008 el aspecto general mostró que las hojas inferiores de las rosetas se van secando, poniéndose primero de un color amarillo y luego de color café. Se notó que las hojas viejas tienen manchas blanquecinas posiblemente por el hongo Oidium y las más inferiores presentan manchas del hongo Cercospora. En general se nota que todas las plantas han producido varios hijos, consecuencia de que se ha mantenido el riego durante los meses sin precipitación.

En diciembre aparecieron inflorescencias en varias plantas de la colecta de Ixchiguan ha desarrollada hasta cerca de 1.5 m, sin embargo se nota que los frutos no llegan a formarse normalmente, esto posiblemente sea por la época en que están creciendo. El 25 de enero se notó el inicio de una nueva inflorescencia a la cual a partir de aquí se le calculará el número de días que se lleva para producir fruto. De marzo a abril no hay cambios sustanciales en el aspecto. En mayo apareció una inflorescencia en lapoblación de Nebaj. Con el inicio de las lluvias se ha notado una alta producción de follaje y producción de plantas hijas en la base de las plantas de casi todas las colectas. En junio aparecieron otras dos nuevas inflorescencias.

De las plantas sembradas en la colección de la FAUSAC a partir de hijuelos que se produjeron cuando se realizó la cosecha (Figura 15), se ha notado que en los materiales provenientes de Chajul y Nebaj, por haberse sembrado plantas casi completas, el porcentaje de pegue es de un 40%, en tanto que los materiales de Joyabaj y de APAPTIX tuvieron poco pegue. En primer lugar porque se sembraron hijuelos más pequeños y luego que al sustrato le faltó materia orgánica, lo que ha incidido para que solo se tengan cuatro plantas de cada materia, que corresponde a un porcentaje de pegue del 10%.

Figura 15. Siembra de material silvestre a partir de la colección de valeriana en la FAUSAC.

40

III.2.6 Información generada de cosecha y secado

El material de raíz fresca de Chajul fue de 2,502 g (Figura 16), procedente de 10 plantas, aunque en realidad no se puede cuantificar objetivamente porque las plantas cuando se sembraron eran de diferentes edades. En algunas raíces se notó un daño interno aunque la corteza si fue aprovechable, posiblemente se deba a insectos minadores.

Figura 16. Raíz de V. prionophylla cosechada y lavada, previo a picarla para su secado.

En agosto se participó en el traslado y cosecha de los materiales de APAPTIX y Joyabaj. En la hoja se notó que la población de APAPTIX tuvo un mejor rendimiento, porque cada planta tenía hojas de más de 30 cm. En el caso de la raíz en ambos materiales se notó la proliferación de raíces delgadas, dando una apariencia general de una escoba, es importante hacerlo notar porque en las plantas silvestres este tipo de raíces son escasas.

De material silvestre de Choanlá se tuvo un tiempo de secado de cuatro días en el secador solar y luego de tres horas un horno con ventilación forzada a 35°C. La raíz se colocó cortada en trozos delgados y duro para su secado ocho días. En las Figuras 17 se muestra el aspecto de ambos materiales en proceso.

Figura 17. Material de V. prionophylla (a) Hoja seca y (b) Raíz picada

De las cosechas realizadas en la FAUSAC se obtuvo del secador solar la raíz y hojade valeriana seca de los materiales de Joyabaj peso seco hoja 158.3 g y raíz 435 g y APAPTIX (2006) hoja 425 g y raíz 319 g. Con una relación peso fresco a seco de 7.6:1

Se cosechó hoja y raíz de V. prionophylla de Raxquim. Se obtuvieron ll raíces grandes y 4 pequeñas. Las raíces grandes de un diámetro de 30 cm con 10-12 hijos, se sembraron 83 plántulas en el mismo lugar donde se arrancó. En la nueva colección se noto poco pegue de plántulas pequeñas de la siembra anterior.

41

III.3 OBJETIVO 3.

Caracterizar por métodos farmacobotánicos, fisicoquímicos y organolépticos los especímenes obtenidos de la droga vegetal silvestre y cultivada.

III.3.1 Características macroscópicas y físicas de materiales silvestres y cultivados

En los Cuadros 4 y 5 se muestran los resultados de la caracterización organoléptica y macroscópica de las muestras silvestres y cultivadas obtenidas durante el proyecto.

Cuadro 4. Caracterización organoléptica de la droga vegetal (hojas).

No. Lugar de Colecta Color Olor Descripción Macroscópica

0Valeriana officinalisBarcelona, España

AHP, El rizoma es de color café-amarillento a café obscuro.

AHP, leve aroma a ácido valérico que se

intensifica por la hidrólisis enzimática

de los ésteres de valepotriatos.

AHP, cada quimiotipo posee ligeras diferencias. En general la hoja es basal, caulina, opuesta, entera o dentada. El

rizoma contiene numerosos nudos de donde se desprenden raicillas de color café claro a obscuro. La raíz es

longitudinal, rugosa de 50mm de largo x 10 mm de ancho.

1Hm1Concepción Tutuapa, San Marcos. Manejo Intervida

Camaleón J4-I2, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas, bordes aserrados y glabros de 25-30 cm de largo x 1.8-4.9 cm de ancho; trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

1Hm2Concepción Tutuapa, San Marcos (Vista Hermosa)

Sushi K4-I2, CI06 pág 135 Característico Trozos irregulares de mesh #5 Se reciben ya tamizadas.

2Hc1Nebaj, Quiché. Apaptix 2006 cultivada CEDA.

Sushi K4-I2, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas, borde crenado de 15-20 cm de largo x 2-3 cm de ancho; son trozos irregulares de mesh #5después de tamizadas.

2Hs2Nebaj, Quiché. Silvestre colectada 2006

Sushi K4-I2, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas, borde crenado de 10-25 cm de largo x 0.7-2.5 cm de ancho; son trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

2Hc4 Nebaj. Cultivada USAC NR NR No se recibió muestra de este órgano en este espécimen.

2Hc5Nebaj, Quiché. "B" Cultivada FAUSAC

Nopal K4-14, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas, borde crenado de 20-30 cm de largo y 1.8-3.0 cm de ancho. Son trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

3Hs1Chajúl, Quiché. Silvestre colectada 2006

Sushi K4-I2, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas, borde crenado de 14.0-28.2 cm de largo y 1.8-3.0 cm de ancho. Son trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

3Hc2Chajúl, Quiché. Cultivada FAUSAC

Marañón J3-13, AM36 pág 145 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas borde glabro y crenado de 20-35 cm de largo x 2-3 cm de ancho; son trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

4Hs1

Cerro Raxquim, Totonicapán. Silvestre colectada 2006

Alcaparra K4-I2, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas borde glabro y crenado de 20-35 cm de largo x 2-3 cm de ancho; son trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

4Hs2

Cerro Raxquim. Silvestre colectada 2007, tesis MUPLAN.

Alcaparra K4-I2, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas borde glabro y crenado de 20-35 cm de largo x 2-3 cm de ancho; son trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

4Hc3

Cerro Raxquim, Totonicapán. Cultivada FAUSAC

Olmo J4-14, AM41 pág 140 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas borde glabro y crenado de 15-20 cm de largo x 2-3 cm de ancho; son trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

6Hs1

Choanlá, San José Ojetenam, San Marcos. Silvestre colectada 2007

Sushi K4-I2, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas, borde crenado y glabro de 10-25 cm de largo x 2-3 cm de ancho;son trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

6Hc3

Choanlá, San José Ojetenam, San Marcos. Cultivada FAUSAC

Alcaparra K4-I2, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusascrenado y glabro no mayores a 25 cm de largo x 2-3 cm de ancho; trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

7Hc1Joyabaj, Quiché. Cultivada FAUSAC

Sushi K4-I2, CI06 pág 135 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas, borde crenado y glabro de 20-30 cm de largo x 2-3 cm de ancho; trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

8Hc1

Chuchucá, Patzún, Chimaltenango. Cultivada FAUSAC

Eucalipto L-09, CI42 pág 99 Característico

Hojas basales oblonolineares a espatuladas, obtusas, borde crenado y glabro no mayores a 25 cm de largo x 1-2cm de ancho; trozos irregulares de mesh #5 después de tamizadas.

9Hs1Valeriana deltoidea. Silvestre colectada 2008.

Kiwi K3-14, CI11 pág 130 Característico

Hoja peciolada opuesta de 2.5 cm de largo x 1.8 cm de ancho; que se convierten en trozos irregulares de mesh # 5 después de tamizadas.

Fuente: FODECYT 102-2006

42

Cuadro 5. Caracterización organoléptica de la droga vegetal (rizomas).No. Lugar de Colecta Color Olor Descripción Macroscópica

0Valeriana officinalisBarcelona, España

AHP, El rizoma es de color café-amarillento a café obscuro.

AHP, leve aroma a ác. valérico se inten-sifica por la hidrólisis de los ésteres de valepotriatos.

AHP, cada quimiotipo posee ligeras diferencias. En general la hoja es basal, caulina, opuesta, entera o dentada. El

rizoma contiene numerosos nudos de donde se desprenden raicillas de color café claro a obscuro. La raíz es

longitudinal, rugosa de unos 50 x 10 mm.

1Rm1Concepción Tutuapa, San Marcos. Manejo IV

Arrachera G4-I4, NA06 pág 215

Característico más intenso y picante que en las hojas Gránulos de diversos tamaños de mesh.

1Rm2

Concepción Tutuapa, San Marcos. Manejo en Vista Hermosa

Jabalí I4-O9, AM07 pág 174

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos cilíndricos longitudinales, irregulares de rizoma; < 1.5 cm de largo; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias.

2Rc1

Nebaj, Quiché. Apaptix 2006 Cultivada FAUSAC.

Ébano H4-10, NA 42 pág 179

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 2.0 cm de largo y de 1.0-1.5 cm de ancho; con restos longitudinales cilíndricos de raicillas o raíces secundarias.

2Rs2Nebaj, Quiché. Silvestre colectada 2006

Bellota I4-I2, AM06 pág 175

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma de aproximadamente 1cm de largo x 0.5 cm de ancho; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias.

2Rc3

Nebaj, Quiché. Apaptix cultivada en Quetzaltenango

Bellota I4-I2, AM06 pág 175

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos longitudinales de rizoma de aproximadamente 3cm de largo x 0.5 cm de ancho; con restos cilíndricos alargados de raicillas o raíces secundarias.

2Rc4Nebaj, Quiché. Silvestre cultivada FAUSAC

Nopal K4-14, CI06 pág 135

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 2.8cm de largo y 2.0cm de ancho, con abundantes fibras alargadas de raíces secundarias.

2Rc5Nebaj, Quiché. "B" Cultivada FAUSAC

Habano H4-I2, NA41 pág 180

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 2.8cm de largo y 2.0cm de ancho, con abundantes fibras alargadas de raíces secundarias de 8.5 cm.

3Rs1Chajúl, Quiché. Silvestre colectada 2006

Habano H4-I2, NA41 pág 180

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma de aproximadamente 1cm de largo x 0.5 cm de ancho; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias.

3Rc2Chajúl, Quiché. Cultivada FAUSAC

Camello H4-11, NA42 pág 179

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma de unos 2.8cm de largo y diferentes anchos, de 1.0cm y 0.2cm de espesor, con abundantes fibras alargadas de raíces secundarias

4Rs1Raxquim, Totonicapán. Silvestre colectada 2006

Ocote H4-I4, NA41 pág 180

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 1.5cm de largo y diferentes anchos; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias.

4Rs2

Raxquim. Silvestre colectada tesis MUPLAN.

Ocote H4-I4, NA41 pág 180

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 1.5cm de largo y diferentes anchos; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias.

4Rc3Raxquim, Totonicapán. Cultivada FAUSAC

Cartón H4-09, NA42 pág 179

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 2.0 cm de largo y diferentes anchos; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias no mayores a 7.0 cm.

5Rm1Panquix, Totonicapán. Manejo ATI

Arrachera G4-I4, NA06 pág 215

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 1 cm de largo; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias.

6Rs1

Choanlá, San José Ojetenam, San Marcos. Silvestre colectada 2006

Habano H4-I2, NA41 pág 180

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 1.5 cm de largo y diferentes anchos; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias.

6Rs2

Choanlá, San José Ojetenam, San Marcos. Silvestre (abril 2007)

Habano H4-I2, NA41 pág 180

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 1.5 cm de largo y diferentes anchos; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias.

6Rc3

Choanlá, San José Ojetenam, San Marcos. Cultivada FAUSAC

Camello H4-11, NA42 pág 179

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 1.6 cm de largo y diferentes anchos; con restos cilíndricos longitudinales de raíces secundarias de aproximadamente 4.5 cm.

7Rc1Joyabaj, Quiché. Cultivada FAUSAC

Cartón H4-09, NA42 pág 179

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 2.0 cm de largo y aproximadamente 1.0 cm de ancho; con restos longitudinales cilíndricos de raicillas o raíces secundarias.

8Rc1

Chuchucá, Patzún, Chimaltenango.Cultivada FAUSAC

Cartón H4-09, NA42 pág 179

Característico más intenso y picante que en las hojas

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 2.0 cm de largo y unos 0.6 cm de ancho; con restos longitudinales cilíndri-cos de raicillas o raíces secundarias no mayores a 8.5 cm.

9Rs1Valeriana deltoidea. Silvestre colectada 2008.

Piloncillo G4-13, NA06 pág 215 Característico

Trozos irregulares de 2.0x0.6 cm; con restos longitudinales cilíndricos de raíces secundarias.

6Fs2Choanlá. Silvestre (abril 2008)

Marañón J3-13, AM36 pág 145

Característico, menos intenso que la hoja. Inflorescencia terminal umbeliforme de color blanco.

6Fs2Choanlá. Silvestre (abril 2008)

Marañón J3-13, AM36 pág 145

Característico, menos intenso que la hoja. Inflorescencia terminal umbeliforme de color blanco.

Fuente: FODECYT 102-2006

43

Los especímenes silvestres y cultivados de V. prionophylla poseen coloraciones y olores parecidos a la especie oficinal. Las coloraciones son de la gama amarillo-café y amarillo-verdoso. Los colores de las hojas y rizomas silvestres son bastante parecidos entre sí, a pesar de provenir de diferentes ambientes. La gama de colores es más amplia en las hojas y rizomas cultivados en FAUSAC. El color fue establecido por tres personas con ayuda de una bombilla de 50 watts con el fin de minimizar los sesgos. No se observaron diferencias importantes entre las hojas de los especímenes silvestres y los cultivados, a pesar de que poseían diferentes grados de madurez. El olor proveniente de V. deltoidea es ligeramente diferente y menos ofensivo que el de V. prionophylla. Existen claras diferencias en las características macroscópicas de ambas especies. En los Cuadros 6 y 7 se describen las características fisicoquímicas de hojas y rizomas.

Cuadro 6. Caracterización fisicoquímica de la droga vegetal (hojas)

No. Final

Promedio cenizas totales Descripción cenizas totales

Promedio cenizas

insolubles

% Rendimiento extracto seco

% Rendimiento Aceite esencial

Identificación. presencia de

valepotriatos.*

0

AHP, EP, BP, FE no

más de 12%.

Cenizas de color blanco con ausencia de carbòn negro o partículas negras,

según BP

FE, BP y EPno más del 5%. Según WHO,

no más del 7%.

No especificado en

las farmacopeas consultadas

AHP; 0.1-0.6% bs y 0.25% bf. EF 0.3% v/p.WHO

>0.5% v/p, puede variar de 0.2-2.8%

AHP. Coloración azul en presencia de

trazas de valepotriatos.

1Hm1 11.25Masa color verde cenizo con algunos

trozos blancos 0.85 28.52 0.66 ++

1Hm2 5.85

Trozos aciculares de 1-2 mm de largo de color blanco con trazas de

verde cenizo. 0.23 NR NR ++

2Hc1 12.42

Escamas blancas sueltas, no se observan cenizas negras y se

aprecian hebras naranjas. 4.45 47.21 0.08 ++

2Hs2 7.15Pequeñas partículas blancas con

trozos amarillos. 0.49 37.71 0.17 ++2Hc4 NR NR NR NR NR NR2Hc5 NR NR NR NR 0.0418 ++

3Hs1 8.27Pequeñas partículas blancas con

trozos amarillos. 1.43 43.50 0.07 ++

3Hc2 9.21

Escamas blancas sueltas, no se observan cenizas negras y se

aprecian hebras verdes y marrones. 1.4 NR NR ++

4Hs1 7.71

Masa compacta en el fondo de color verde cenizo con partes blancas y

amarillas 0.00 NR 0.12 ++

4Hs2 7.71

Masa compacta en el fondo color verde cenizo con partes blancas y

amarillas 0.00 NR 0.04 ++

4Hc3 10.29Hebras blancas largas, con vetas

naranjas y verdes. 3.97 34.16 0.02 ++

6Hs1 6.11

Masa compacta en el fondo de color verde cenizo con partes blancas y

amarillas 0.90 31.53 0.11 ++

6Hc3 8.55Hebras blancas con vetas naranja, no

se observan restos negros. 4.16 NR NR +

7Hc1 10.28Pequeñas partículas aciculares

blanco-grisaceas con orillas naranja 2.51 NR 0.12 ++

8Hc1 7.56Hebras blancas con vetas naranja, no

se observan restos negros. 2.05 NR NR ++

9Hs1 8.43Hebras blancas con vetas naranja, no

se observan restos negros. 2.74 NR 0.03 ++

Fuente: FODECYT 102-2006* El número de signos indica la intensidad del color; NR: No se realizó; bs: base seca; bf: base fresca

44

Cuadro 7. Caracterización fisicoquímica de la droga vegetal (rizomas)

No.

Promedio cenizas totales Descripción cenizas totales

Promedio cenizas

insolubles

% Rendimiento extracto seco

% Rendimiento aceite esencial

Identificación. presencia de

valepotriatos*

0

AHP, BP, FE no más

de 12%.

Cenizas blancas con ausencia de carbón negro o partículas negras, según

BP

FE, BP y EP no más del 5%.

WHO, no más del 7%.

No especificado

en las farmacopeas consultadas

AHP; 0.1-0.6% bs y 0.25% bf. EP 0.3% v/p.

WHO >0.5% v/p, pero puede variar

de 0.2-2.8%

AHP. Coloración

azul en presencia de

trazas de valepotriatos.

1Rm1 8.62

Pequeñas partículas en forma de agujas blancas con gran cantidad de cenizas

negras diseminadas en la muestra. 0.79 19.00 0.76 + + +

1Rm2 5.96

Trozos blanco grisáceo de 4 mm de lado los más grandes, algunos con

orilla amarillo-naranja. 0.21 NR 0.24 + + +2Rc1 NR NR 0.81 36.12 0.36 + +2Rs2 12.56 Polvo fino color amarillo mostaza. 1.89 48.75 0.89 + + +

2Rc3 5.46

Trozos pequeños blancos con rastros verde cenizo y orillas naranjas. No se

observan puntos negros. 0.67 NR 0.39 + + +

2Rc4 9.01

Trozos blancos hasta de 6 mm, algunos tubulares, otros con orillas naranja y

otros con vetas verde claro. No se observan cenizas negras. 0.96 35.56 0.20 + +

2Rc5 13.62

Escamas blancas sueltas, no se observan cenizas negras y se aprecian

hebras naranja, café y marrón 6.34 28.67 0.25 + + +

3Rs1 6.15Trozos blancos con un ligero color

amarillento en las orillas. 0.53 33.50 0.38 + + +

3Rc2 9.10

Trozos blancos hasta 6 mm, unos tubulares, otros con orillas naranja y

otros con vetas verde claro. No se observan cenizas negras. 0.52 37.41 0.32 + + +

4Rs1 6.53Trozos blancos carbonizados con pocas

partículas negras. 0.39 42.58 0.20 + + +4Rs2 NR NR NR NR 0.22 + + +

4Rc3 10.71

Trozos blancos hasta de 6 mm, unos tubulares, otros con orillas naranja y otros con vetas verde claro. Raices

secundarias color amarillo pardo. No se observan cenizas negras. 1.14 30.95 0.22 + +

5Rm1 6.93 Trozos blancos con orilla amarilla 0.57 21.58 0.61 NR

6Rs1 4.13Trozos blancos con un ligero color

amarillento en las orillas. 0.52 48.35 0.39 + + +

6Rs2 4.46Trozos blancos con ligero color

amarillento en las orillas. 0.99 40.01 0.16 +6Rc3 NR NR NR NR NR +

7Rc1 9.62

Trozos blancos de 6 mm los más grandes y hebras blancas con orillas

café-rojizas y vetas verdes. 0.29 37.81 0.36 + +8Rc1 NR NR NR NR NR + +9Rs1 NR NR NR NR NR +6Fs2 NR NR NR NR 0.08 NR

Fuente: FODECYT 102-2006* El número de signos indica la intensidad del color; NR: No se realizó; bs: base seca; bf: base fresca

Los parámetros teóricos para comparar los resultados experimentales corresponden al rizoma de V. officinalis. En el caso de las cenizas totales de los rizomas silvestres (6.77±3.40%) y cultivados (8.78±2.51%) se observó que ambos cumplen con el límite farmacopeico para la especie oficial, por lo que en este parámetro son similares. Ambos datos superan el valor reportado en estudios anteriores para rizoma de V. prionophylla(7.42%) (De la Cruz, 2005), pero debe tomarse en cuenta que los datos consideran toda la variabilidad colectada y no solamente una procedencia, por lo que son más significativos.

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No existen datos teóricos en las farmacopeas sobre las cenizas totales de las hojas de V. officinalis. Las hojas de V. prionophylla silvestre (7.39±0.82%) y cultivada (9.43±2.10%) también cumplen con el parámetro farmacopeico establecido para el rizoma.

Los valores de cenizas insolubles en ácido de los rizomas silvestres (0.86 ±0.61%) y cultivados (1.23±1.82%), así como para hojas silvestres (0.56±0.61%) y cultivadas (1.23±1.82%) están por debajo de lo establecido en las farmacopeas para el rizoma de la especie oficinal. Esto indica que en el proceso de cosecha y secado, se retiraron las impurezas que pudiera interferir en esta prueba. Además es un indicador indirecto de la cantidad de pesticidas y abono utilizados durante el cultivo; al no exceder el límite puede inferirse que las cantidades aplicadas no afectaron la calidad de la droga vegetal. Esto último se com-prueba al observar que los valores obtenidos en la hoja y rizoma silvestres son menores a los cultivados. Los valores obtenidos para V. deltoidea también cumplen con los límites establecidos para la especie oficial en el caso de cenizas totales e insolubles en ácido.

El rendimiento de aceite esencial de las hojas silvestres es de 0.1±0.05% y de las cultivadas 0.18±0.27%, mientras que en el rizoma es de 0.37±0.27% en las silvestres y 0.37±0.18 en las cultivadas. Las hojas cultivadas presentaron un rendimiento mayor de aceite esencial que las silvestres. El rendimiento obtenido en hojas cultivadas cumple con los parámetros de la AHP (Upton, 1999) y los del rizoma los de las farmacopeas para el rizoma de V. officinalis (WHO, 1999). Aparentemente las condiciones de cultivo a las que se sometieron estos especimenes elevaron la cantidad de aceite esencial de las hojas.

Los rizomas cultivados también poseen una cantidad de aceite ligeramente mayor a los silvestres, y cumplen con los parámetros farmacopeicos establecidos para la especie oficinal. El porcentaje de aceites obtenido es mayor al reportado en investigaciones previas para hoja (0.13%) y rizoma (0.19%) (Piedrasanta, 2007). En el caso de V. deltoidea no se obtuvo muestra suficiente para realizar la extracción de aceite, pero en el caso de las hojas el rendimiento (0.03%) es bastante inferior al de V. prionophylla.

Respecto al porcentaje de rendimiento del extracto seco, las hojas silvestres (30.89±7.30%) y las cultivadas (36.63±9.59%) superan al porcentaje obtenido de los rizomas cultivados (30.89±7.30%). Esta diferencia podría deberse a que no se elaboró extracto seco de la mayoría de especímenes por contar con poca droga vegetal, además las plantas cultivadas eran más jóvenes que algunos de los especímenes silvestres (42.64±6.33%).

Estos parámetros son útiles para establecer la época de cosecha ideal; por ejemplo, en el caso del rizoma colectado en Ixchiguán, cuando se cosecha en noviembre se obtiene un mayor rendimiento de aceite esencial y extracto seco. Existe gran variación en este parámetro de calidad, ya que depende de muchos factores como: edad de la planta, clima, riqueza del suelo, buenas prácticas de cosecha, secado y almacenamiento. Los datos obtenidos para la inflorescencia son muy parecidos a los de la hoja, este aceite es más claro y con un olor más agradable.

Los especímenes más promisorios según los parámetros fisicoquímicos de porcentaje de rendimiento de aceite esencial es hoja 1Hm1 y rizoma 1Rm1 en el caso de los cultivados. En el caso de silvestres son 2Hs2 y 2Rs2. En cuanto a porcentaje de rendimiento del extracto seco; fueron 2Hc1, para hojas cultivadas, 7Rc1 para rizomas cultivados; 2Rs2 para rizomas silvestres y 3Hs1 para hojas silvestres. Sin embargo, es necesario realizar la caracterización de las drogas vegetales colectadas para seleccionar

46

los más promisorios en base al contenido de metabolitos de interés como ácidos valerénicos y flavonoides. La prueba de la mancha (Figura 18), aseguró que todos los especimenes en estudio poseen valepotriatos y por tanto pertenecen al género Valeriana.

Figura 18. Prueba de la mancha en la droga vegetal, coloración azul evidencia presencia de valepotriatos, según AHP.

III.3.2 Cuantificación de flavonoides en las drogas vegetales:

Se cuantificaron los flavonoides por espectrofotometría, según el método para la droga vegetal de FE 2002, que permite la extracción y aislamiento por disolventes afines. Es sensible para establecer su presencia en porcentajes >0.1, como hiperósido. Los Cuadros 8 y 9 presentan el porcentaje p/p (en mg%) de flavonoides en la droga vegetal. Se ajustaron los límites a mg de flavonoides en 100 g de materia vegetal para visualizar e interpretar los resultados.

Figura 19. Cuantificación de flavonoides en droga vegetal (a) extracción de la droga vegetal con diclorometano; (b) evaluación por espectrofotómetro UV-VIS; y, (c) pantalla de lectura.

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Cuadro 8. Contenido de flavonoides de la droga vegetal (hojas) en hiperósido

No. Lugar de colecta Droga vegetal (mg%)0 Valeriana officinalis, Barcelona, España Nef

1Hm1 Tutuapa, San Marcos. Manejo Intervida 1197.371Hm2 Tutuapa, San Marcos (Vista Hermosa) 1124.272Hc1 Nebaj, Quiché. Apaptix 2006 cultivada FAUSAC NR2Hs2 Nebaj, Quiché. Silvestre colectada 2006 551.852Hc4 Nebaj, Quiché. Silvestre cultivada FAUSAC NR2Hc5 Nebaj, Quiché. "B" Cultivada FAUSAC NR3Hs1 Chajúl, Quiché. Silvestre colectada 2006 32.003Hc2 Chajúl, Quiché. Cultivada FAUSAC NR4Hs1 Raxquim, Totonicapán. Silvestre colectada 2006 739.194Hs2 Raxquim, Totonicapán. Silvestre colectada 2007. NR4Hc3 Raxquim, Totonicapán. Cultivada FAUSAC 251.206Hs1 Choanlá, San Marcos. Silvestre (2007) 855.116Hc3 Choanlá, San Marcos. Cultivada FAUSAC 644.807Hc1 Joyabaj, Quiché. Cultivada FAUSAC NR8Hc1 Chuchucá, Patzún. Cultivada FAUSAC NR9Hs1 Valeriana deltoidea. Silvestre colectada 2008. NR

Fuente: FODECYT 102-2006

Cuadro 9. Contenido de flavonoides de la droga vegetal (rizomas) en hiperósido

No. Lugar de colecta Droga vegetal (mg%)0 Valeriana officinalis. Barcelona, España Nef

1Rm1 Tutuapa, San Marcos. Manejo Intervida NC1Rm2 Tutuapa, San Marcos. Manejo en Vista Hermosa NC2Rc1 Nebaj, Quiché. Apaptix 2006 Cultivada FAUSAC. NR2Rs2 Nebaj, Quiché. Silvestre colectada 2006 NC2Rc3 Nebaj, Quiché. Apaptix cultivada en Quetzaltenango NC2Rc4 Nebaj, Quiché. Silvestre cultivada FAUSAC 3.832Rc5 Nebaj, Quiché. "B" Cultivada FAUSAC NR3Rs1 Chajúl, Quiché. Silvestre colectada 2006 NC3Rc2 Chajúl, Quiché. Cultivada FAUSAC NC4Rs1 Raxquim, Totonicapán. Silvestre colectada 2006 NC4Rs2 Raxquim, Totonicapán. Silvestre tesis MUPLAN. NR4Rc3 Raxquim, Totonicapán. Cultivada FAUSAC NC5Rm1 Panquix, Totonicapán. Manejo ATI NC6Rs1 Choanlá, San Marcos. Silvestre 2007 NC6Rs2 Choanlá, San Marcos. Silvestre 2008 NC6Rc3 Choanlá, San Marcos. Cultivada CEDA 2.707Rc1 Joyabaj, Quiché. Cultivada FAUSAC NR8Rc1 Chuchucá, Patzún. Cultivada FAUSAC NR9Rs1 Valeriana deltoidea. Silvestre colectada 2008. NR

Fuente: FODECYT 102-2006

Los flavonoides son más abundantes en las hojas que en el rizoma, éstos resultados son consistentes con los obtenidos para otras especies nativas de la región, como

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Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger (García, 2008) y Polypodium triseriale Sw. (Matias, 2008).

En el Cuadro 9 se observa claramente que los especimenes más promisorios en cuanto a la cantidad de flavonoides presentes en la droga vegetal, son los de Tutuapa, Raxquim y Choanlá. Es recomendable considerar la unificación de droga vegetal o losextractos para aprovechar integralmente el contenido de la planta.

Se calculó el intervalo de confianza del 95% (IC95%) para las medias poblacionales de la cantidad de flavonoides en mg% de rizomas y hojas, tanto silvestres como cultivadas. Este dato permite asegurar con un 95% de confianza que la cantidad de flavonoides en hojas silvestres se encontrará entre 605.37-825.39 mg%, mientras que en las hojas cultivadas se encontrará entre 599.05-1,075.37 mg%. Es decir, que los especimenes cultivados tienen mayor cantidad de flavonoides que los silvestres. La amplitud de los intervalos indica que existe gran dispersión en los resultados obtenidos; la dispersión se debe precisamente a la variedad de procedencias, fechas de colecta, madurez de la planta, etc., que corresponden al objetivo principal de este estudio.

III.3.3 Cuantificación de ácidos valerénicos en la droga vegetal:

Se cuantificaron los ácidos valerénicos por HPLC usando el procedimiento de la Farmacopea Española (2002), las condiciones de operación descritas por la AHP y un integrador para obtener las concentraciones relativas de cada uno de los compuestos (Figura 20). Se evaluó el porcentaje de ácidos sesquiterpénicos reales y el porcentaje calculado como ácido valerénico.

Figura 20. (a) Extracción por reflujo; (b) Equipo HPLC marca HP con bomba cuatrifásica; y, (c) curva graficada en el integrador

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En los Cuadros 10 y 11 se muestran el porcentaje en mg% promedio de los ácidos valerénicos cuantificados. Se modificaron los límites farmacopeicos expresados en porcentaje g/100 g a mg/100 g para apreciar mejor los resultados obtenidos.

Cuadro 10. Contenido de ácidos valerénicos de la droga vegetal (hojas)

No. Lugar de Colecta Droga vegetal Ácidos valerénicos

0 Valeriana officinalis, Barcelona, EspañaEP >100 mg%; BP >170% de ácidos sesquiterpénicos

Nef. Se comparan los límites como ácido valerénico

1Hm1 Tutuapa ( Intervida) 10.00 9.00

1Hm2 Tutuapa (Vista Hermosa) 20.00 15.51

2Hc1 Nebaj 2006 cultivada CEDA. 35.14 18.56

2Hs2 Nebaj. Silvestre 2006 10.00 13.40

2Hc4 Nebaj. Silvestre cultivada CEDA NR NR

2Hc5 Nebaj. "B" Cultivada FAUSAC 21.99 12.15

3Hs1 Chajúl. Silvestre colectada 2006 40.00 20.00

3Hc2 Chajúl. Cultivada FAUSAC 29.64 16.04

4Hs1 Raxquim. Silvestre 2006 30.00 21.56

4Hs2 Raxquim. Silvestre 2007, tesis. 30.00 21.56

4Hc3 Raxquim. Cultivada FAUSAC 87.78 48.16

6Hs1 Choanlá,Silvestre 2007 10.00 6.00

6Hc3 Choanlá. Cultivada FAUSAC 50.99 25.11

7Hc1 Joyabaj, Quiché. Cultivada FAUSAC 32.55 17.90

8Hc1 Chuchucá. Cultivada FAUSAC 26.67 12.76

9Hs1 Valeriana deltoidea. Silvestre 2008. 4.58 2.11

Fuente: FODECYT 102-2006

Cuadro 11. Contenido de ácidos valerénicos de la droga vegetal (rizomas)

No. Lugar de Colecta Droga vegetal Ácidos valerénicos

0 Valeriana officinalis, Barcelona, EspañaEP >100 mg%; BP >170% de ácidos sesquiterpénicos

Nef. Se comparan los límites como ácido valerénico

1Rm1 Tutuapa. Manejo Intervida 40.00 43.091Rm2 Tutuapa. Manejo (VH) 10.00 8.092Rc1 Nebaj. Apaptix 2006 Cultivada CEDA. NC NC2Rs2 Nebaj, Quiché. Silvestre 2006 NC 5.002Rc3 Nebaj. Cultivada Quetzaltenango NC 5.002Rc4 Nebaj. Silvestre cultivada FAUSAC 1.98 1.892Rc5 Nebaj. "B" Cultivada FAUSAC 1.22 1.453Rs1 Chajúl. Silvestre colectada 2006 NC 5.003Rc2 Chajúl. Cultivada FAUSAC 1.23 1.214Rs1 Raxquim. Silvestre 2006 NC 6.004Rc3 Raxquim. Cultivada FAUSAC 1.28 1.105Rm1 Panquix, Totonicapán. Manejo ATI NR NR6Rs1 Choanlá. Silvestre 2007 NC 3.006Rs2 Choanlá. Silvestre abril 2008 10.00 5.006Rc3 Choanlá. Cultivada FAUSAC 6.31 6.057Rc1 Joyabaj, Quiché. Cultivada FAUSAC 1.96 1.978Rc1 Chuchucá. Cultivada FAUSAC NC NC9Rs1 Valeriana deltoidea. Silvestre 2008. 1.19 0.216Fs2 Choanlá. Silvestre abril 2008 1.48 1.34

Fuente: FODECYT 102-2006

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En la columna de la derecha se muestra el porcentaje real de ácidos valerénicos presentes en la droga, calculados en base a curvas de calibración de ácidos valerénico, hidroxivalerénico y acetoxivalerénico, construidas diariamente en las mismas condiciones de operación. Este proceso es costoso, por lo que la mayoría de farmacopeas opta por reportar su contenido total como ácido valerénico, que es la información de la tercera columna.

Al analizar estos resultados se observa que existe cierta desviación en los mismos, ya que se asume que todos los ácidos valerénicos presentan un pico máximo de la misma altura y definición en el cromatograma obtenido por HPLC, situación que no se observa en la práctica. Esto provocó que en varios casos de rizoma no se estableciera el contenido real de metabolitos y se sobrevalorara el contenido real de las hojas. Para evitar este sesgo se construyeron las curvas de calibración para cada día a fin de obtener resultados objetivos.

La mayoría de hojas analizadas poseen ácidos valerénicos en porcentajes desde un décimo hasta un cuarto del mínimo establecido para V. officinalis; la presencia de estos en las hojas permitirá aprovechar integralmente la planta. El IC95% para las hojas silvestres es de 5.25-22.96% y para las cultivadas de 11.79-19.97%. Nuevamente los especímenescultivados presentan ventaja sobre los silvestres ya que el intervalo más estrecho indica que la variabilidad será menor y se obtendrán cantidades de ácidos valerénicos más reproducibles.

En el caso de los rizomas el IC95% para los silvestres (1.82-6.25) y los cultivados (1.12-5.57) se encuentra muy por debajo del límite establecido para la especie oficial; lo cual puede deberse a que el metanol no es el disolvente ideal para la extracción de ácidos valerénicos en esta especie. Sin embargo, el rizoma 1Rm1 muestra ácidos valerénicos en cantidades considerables (43.09 mg%). Este rizoma además, es el único de los estudiados que posee los tres ácidos (hidroxivalerénico, acetoxivalerénico y valerénico), caracterís-tica propia, única y distintiva de V. officinalis, por lo que se perfila como el más promisorio para obtener el extracto oficial y la fabricación de fitomedicamentos. Además, sus hojas poseen el más alto contenido de flavonoides.

51

III.4 OBJETIVO 4

Caracterizar fitoquímicamente los extractos obtenibles del material cultivado para definir los productos con mayor potencial de desarrollo y establecer su estabilidad.

III.4.1 Caracterización fisicoquímica de tinturas y extractos

No existen datos de referencia en las farmacopeas consultadas sobre las características fisicoquímicas de los extractos. En los Cuadro 12 y 13 se describen las características fisicoquímicas de los extractos y tinturas de hojas y rizomas, incluyendo el promedio y la desviación estándar para cada parámetro.

Cuadro 12. Caracterización fisicoquímica de tinturas y extractos (hojas).

No. Final

pH Tinturas 1:5 en EtOH 70% a 20°C

Sólidos Extraíbles Tinturas 1:5en EtOH al 70%

Densidad Tinturas 1:5 en EtOH 70% a

20°C

pH Tinturas 1:10 en EtOH 50% a 20°C

Sólidos Extraíbles

Tinturas 1:10 EtOH 50%

Densidad Tinturas 1:10 en EtOH 50% 20°C

Sólidos Extraíbles

Extracto Seco EtOH 50%

NEFAHP > 3.0% p/p

en 3.0 g de tintura NEF Nef NEF NEF NEF1Hm1 5.60 2.73 0.882 5.66 2.43 0.938 78.71Hm2 5.34 NR 1.088 5.20 3.54 0.944 NR2Hc1 NR NR NR 6.16 2.75 0.940 80.72Hs2 NR NR NR 5.64 3.61 0.940 82.52Hc4 NR NR NR NR NR NR NR2Hc5 5.93 NR 1.097 5.83 2.79 1.143 NR3Hs1 NR NR NR 5.66 3.25 0.942 48.133Hc2 NR NR NR 5.61 2.84 1.141 NR4Hs1 NR NR NR 5.54 3.34 0.945 NR4Hs2 NR NR NR 5.54 NR 0.945 NR4Hc3 6.35 3.3 1.093 6.07 2.74 0.940 NR6Hs1 5.54 4.71 0.895 5.67 3.01 0.947 52.16Hc3 5.76 3.89 0.900 5.75 2.99 0.944 NR7Hc1 5.98 NR 1.093 5.85 2.64 0.938 NR8Hc1 NR NR NR 5.76 2.55 0.941 NR9Hs1 6.01 3.49 1.086 6.07 2.41 1.132 NR

Cuadro 13. Caracterización fisicoquímica de tinturas y extractos (rizomas).

No. Final

pH Tinturas 1:5 EtOH

70% a 20°C

Sólidos Extraíbles

Tinturas 1:5 EtOH 70%

Densidad Tinturas 1:5 EtOH 70% 20°C

pH Tinturas

1:10 EtOH 50% 20°C

Sólidos Extraíbles Tinturas

1:10 EtOH 50%

Densidad Tinturas

1:10 EtOH 50% a 20°C

pH Extracto 1:1 EtOH

50% a 20°C

Sólidos Extraíbles Extracto 1:1 EtOH

50%

Densidad Extracto 1:1 EtOH

50% a 20°C

Sólidos Extraíbles Extracto

Seco EtOH50%

0 NEF

AHP >3.0% p/p en 3.0 g de tintura NEF NEF NEF NEF NEF NEF NEF NEF

1Rm2 5.73 NR 1.092 5.51 2.73 0.941 NR NR NR NR2Rc1 NR NR NR 5.88 2.33 0.942 NR 31.0 NR 84.22Rs2 6.08 NR NR 5.39 4.70 0.932 5.21 38.7 1.09 83.52Rc3 5.68 6.67 1.115 5.82 3.88 0.937 NR NR NR NR2Rc4 5.94 NR 1.083 6.02 1.92 0.937 NR NR NR 86.32Rc5 6.11 NR 1.089 6.00 1.56 0.934 NR NR NR NR3Rs1 5.39 NR NR 5.14 3.93 0.949 5.17 28.29 1.06 62.393Rc2 NR NR NR 5.53 1.95 0.936 NR NR NR 86.744Rs1 NR NR NR 5.72 2.38 1.135 5.24 33.01 1.07 75.24Rc3 5.92 3.73 0.898 5.72 2.21 0.940 NR NR NR NR5Rm1 NR NR NR 5.38 2.10 0.940 5.11 17.49 1.05 62.36Rs1 5.75 5.22 0.909 5.30 4.46 0.950 4.92 33.11 1.12 39.46Rs2 NR NR NR 5.50 3.39 0.935 5.40 NR 1.08 53.926Rc3 6.18 3.80 0.898 6.26 1.68 0.936 NR NR NR NR7Rc1 5.85 NR 1.082 5.59 2.26 0.941 NR 44.130 NR 78.908Rc1 NR NR NR 5.81 1.83 NR NR NR NR NR9Rs1 6.06 8.21 1.125 5.73 4.31 1.133 NR NR NR NR

Fuente: FODECYT 102-2006. NEF: No especificado en farmacopeas consultadas. NR No se realizado..

52

Las farmacopeas consultadas no establecen límites para la mayoría de parámetros. Al realizar la prueba de sólidos extraíbles en la droga vegetal, el etanol al 50% reportó la mayor cantidad de sólidos, por lo que se consideró el mejor disolvente extractivo y se elaboraron las primeras tinturas en relación 1:10 con este disolvente. Estos resultados concuerdan con los obtenidos previamente (De la Cruz, 2005).

De todos los especímenes silvestres colectados se elaboraron tinturas 1:10 y extractos secos; en el caso de los rizomas se obtuvo además el extracto 1:1 y 2:1 siempre que la cantidad de droga vegetal lo permitió. Al realizar la caracterización de tinturas 1:10 se decidió conveniente realizar las tinturas 1:5 en etanol al 70% de los especimenes más promisorios, como lo establecen las farmacopeas consultadas para la especie oficinal, a fin de establecer de mejor manera la similitud entre la especie nativa y la oficinal.

Del porcentaje de sólidos extraíbles de las tinturas 1:5 en etanol al 70%(denominadas en adelante como farmacopeicas) de las hojas cultivadas (3.31±0.58%) y silvestres (4.71%), y rizomas cultivados (4.73±1.68%) y silvestres (5.22%), se obtienen valores que cumplen con los establecido por la farmacopea para el rizoma de la especie oficinal (>3%). Las tinturas de hoja y raíz de V. deltoidea también cumplen con los límites farmacopeicos.

En las tinturas 1:10 en etanol al 50%, se obtuvo un promedio de 2.81±0.32% para las hojas cultivadas y 3.30±0.20% para las silvestres, y 2.22±0.64% para los rizomas cultivados y 3.77±0.93 para los silvestres. Los especímenes silvestres reportaron porcen-tajes mayores a los cultivados, posiblemente porque la madurez de las plantas silvestres era mayor a las cultivadas y éste parámetro se ve influenciado por factores como riqueza del suelo, condiciones climáticas, etc. (WHO, 1999).

De los extractos fluidos 1:1 preparados a partir de rizomas cultivados se obtuvo un porcentaje de sólidos extraíbles de 30.87±13.32% y de 33.28±4.26% para los silvestres. No se observan diferencias significativas entre ambos grupos.

En la mayoría de los especímenes cultivados y en algunos silvestres, la cantidad de droga vegetal fue tan pequeña que se decidió caracterizar las tinturas y aceites en lugar de obtener una pequeña cantidad de extracto seco que sería insuficiente para realizar la misma. Es por ello que los resultados de sólidos extraíbles para extracto seco son tan escasos y se observa una amplia variabilidad en los mismos.

Los valores de pH para tinturas farmacopeicas de hojas cultivadas (5.83±0.35) y silvestres (5.54%) es cercano y presenta poca variación. En las tinturas 1:10 de hojas cultivadas (5.77±0.28) y silvestres (5.61±0.06) se observa el mismo comportamiento.

En los rizomas, las tinturas farmacopeicas de los especímenes cultivados (5.92±0.18) y silvestres (5.74±0.35), así como en las tinturas 1:10 de rizomas cultivados (5.77±0.26) y silvestres (5.41±0.22) los valores son bastante similares a los de las hojas. En todos los casos, las tinturas de especímenes silvestres son ligeramente más ácidas que las de cultivados. Las tinturas de V. deltoidea son menos ácidas que las obtenidas para toda la variabilidad de V. prionophylla.

En los rizomas se observa que los valores de pH del extracto 1:1 de los especímenescultivados (5.11) y silvestres (5.19±0.17) son ligeramente más ácidos que la tintura 1:10 y ésta a su vez es ligeramente más ácida que la tintura1:5; por lo que puede sospecharse que

53

este parámetro es dependiente de la concentración de alcohol y directamente proporcional a la cantidad de droga vegetal presente en el extracto o tintura.

En cuanto a la densidad de las tinturas y extractos 1:1 analizados se puede señalar que los valores permanecen constantes ya que la desviación de los datos entre sí, en todas las situaciones es pequeña. Es mayor en los extractos farmacopeicos y aumenta con la concentración, como se esperaba, en el caso de las tinturas y extractos en etanol al 50%.

En todos los parámetros fisicoquímicos evaluados, se observa que no existe una diferencia marcada entre los resultados obtenidos de hojas y rizomas, así como para los especimenes silvestres y los cultivados. Las tinturas farmacopeicas cumplen con el parámetro de sólidos totales establecido para la especie oficinal. Esto permite inferir que los extractos y tinturas obtenidos de las diferentes procedencias, podrían unificarse para la fabricación de extractos oficiales de Valeriana.

III.4.2 Tamizaje fitoquímico de extractos y tinturas.

Se realizó el tamizaje fitoquímico de las tinturas y de los extractos secos obtenidos, por CCF, para la identificación de metabolitos secundarios presentes en los mismos, como puede observarse a continuación, tanto para las tinturas de hojas (Cuadro 14) y rizomas (Cuadro 15), como de los extractos secos de rizoma.

Los resultados obtenidos para los extractos secos, se presentan en el Cuadro 14; en donde se confirmó la presencia de algunos metabolitos secundarios detectados en las pruebas en tubo, tales como: flavonoides y antocianinas, saponinas y cumarinas. Las sesquiterpenlactonas no están presentes en los extractos estudiados, a pesar de haber reaccionado en las pruebas en tubo. Se estableció la presencia de valepotriatos, principios amargos, cardenólidos y bufadienólidos.

En los Cuadros 14 y 15, se incluye el tamizaje fitoquímico de las tinturas farmacopeicas (1:5 en etanol 70%) y 1:10 (etanol 50%) elaboradas a partir de hojas y rizomas, respectivamente. En estos cuadros se puede observar las diferencias y similitudes entre los especímenes silvestres y cultivados, ya que se analizó toda la variabilidad colectada, incluída la V. deltoidea.

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Cuadro 14. Tamizaje fitoquímico por CCF para caracterización de tinturas (hojas)

Final AlcaloidesFlavonoides Antocianinas Antraquinonas Cumarinas

Cardenólidos Bufadienólidos Saponinas Principios Amargos Valepotriatos

Ac.Volátiles Espc. Tinturas

STD

Papaverina: 0.41, naranja; atropina: 0.17,

naranja; reserpina: 0.32,

naranja.

Rutina: 0.33, 0.43, 0.68; quercetina: 0.82;

hiperósido: 0.65; ác. clorogénico: 0.54.

fluorescencia amarillas y naranjas

Sen: 0.56, fluorescencia naranja;

0.91, fluorescencia amarilla

Cumarinas: 0.48, fluorescencia

amarilla; ácido p-cumárico: 0.11;

umbeliferona: 0.085 fluorescencia azul

Digoxina: 0.63, morado

Saponina 0.1%: 0.78,

mancha violeta

Neurolena lobata (Nl): 0.24 violeta;

0.49 azul; 0.68 azul; 0.85 azul; 0.93

violeta

Rizoma de V. officinalis (Vo): 0.46

café; 0.57café.

Terpineno azul y morado; terpineol azul; cariofileno

fusia y eucaliptol azul.

0

Zonas cafés o naranjas

inestables en visible, con reactivo de

Dragendorff.

Manchas de color con fluorescencia amarilla,

azul o verde a 365nm con NP/PEG

Zonas rojas en visible y fluorescencia roja en UV 365 nm, con

solución etanólica de KOH 5%

UV 365 nm fluorescencia azul o verde con solución

etanólica de KOH 5%

Cardenólidos zonas rosa o azul violeta en visible con reactivo de

Kedde.

Zonas azules violetas y

amarillentas con Vainillina-

H2SO4

Zonas rojas-violetas, café-rojas y azules verdes con reactivo

de Vainillina- H2SO4.

Zonas azules (valtratos, aceval.),

zonas cafés (dihidroval) HCl-

AcOH glacial

Zonas azules, verdes, rojo-café en visible con

anisaldehído-H2SO4.

OF 1:10 ——Lig. fluorescencia: 0.51

amarilla ——

cumarinas 0.49 fluorescencia verde

amarilla —— ——

0.1 violeta; Nl 0.50 azul; 0.56 violeta;

0.74 azul; 0.91 violeta ——

0.08 café; 0.13 morado; 0.27 morado

FAROF ——Lig. fluorescencia: 0.51

amarilla ——0.13 fluorescencia

azul —— ——

0.12, 0.51, 0.57 violeta; Nl 0.92

violeta ——

0.07, 0.09 café; 0.15, 0.27, 0.44 morado; 0.52

azul; 0.6, 0.72, 0.77, 0.85 morado; 0.91 fucsia.

FAR1Hm1 ——

0.58 ligera fluorescencia amarilla

0.40 leve fluorescencia amarilla

0.059 fluorescencia ligeramente azul —— ——

0.26, 0.38, 0.62 azul; 0.70, 0.81 violeta; 0.96 azul verdoso ——

0.11 café; 0.21 morado; 0.31 morado

1Hm1 ——

Lic. fluorescencias: Rutina 0.43 naranja; ac.

clorogénico 0.54 amarilla0.39 leve

fluorescencia amarilla0.074 fluorescencia

ligeramente azul —— —— 0.46, azul ——0.11 café; 0.2 morado;

0.76 café.

1Hm2 ——

Lig. fluorescencia: rutina 0.42 naranja; 0.52

amarilla; 0.67 naranja; 0.77, 0.91 amarilla

0.39 leve fluorescencia amarilla

0.074 fluorescencia ligeramente azul —— —— 0.42, azul ——

0.10 café; 0.2 morado; 0.76 café.

2Hc1 ——Lig. fluorescencias: 0.41

azul; 0.49 naranja ——0.074 fluorescencia

ligeramente azul —— ——0.38, 0.47 azul; 0.93

azul verdoso ——0.09 café; 0.17 morado;

0.53 café; 0.76 café.

2Hs2 ——

Fluorescencia: Ac. clorogénico 0.54 amarilla; hiperósido 0.65 naranja; 0.78 lig amarillo; 0.91

amarillo0.37 leve

fluorescencia amarilla —— —— ——0.35, 0.42 azul; 0.93

azul verdoso ——0.10 café; 0.26 morado;

0.76 café.

2Hc3 ——Lic. fluorescencia: Rutina

0.42, azul; 0.5, naranja0.36 leve

fluorescencia amarilla0.074 fluorescencia

azul —— ——0.30 azul; 0.38 azul;

0.93 azul verdoso ——0.10 café, 0.20 morado;

0.53, 0.74 café.2Hc4 NR NR NR NR NR NR NR NR NR

2Hc5 ——

Fluorescencia: Rutina 0.42 azul intenso; 0.51 lig.

naranja; 0.78 lig. azul0.36 leve

fluorescencia amarilla

0.074 fluorescencia azul; 0.045

fluorescecia amarilla —— ——0.30, 0.35 azul; 0.93

azul verdoso ——0.10 verde; 0.19 morado; 0.53, 0.73 café.

55

3Hs1 ——

lig fluorescencias: 0.41 azul; 0.5 amarilla; 0.78

azul0.36 leve

fluorescencia amarilla0.074 fluorescencia

azul —— ——0.28 azul, 0.35 azul;

0.93 azul verdoso ——0.09 verde; 0.19, 0.26

morado; 0.51 café.

3Hc2 ——fluorescencia: 0.41, azul;

0.51, naranja0.36 leve

fluorescencia amarilla

0.074, fluorescencia azul; 0.46

fluorescencia amarilla —— —— 0.29 azul —— 0.09 verdeFAR4H

s1 ——Fluorescencia: 0.45 lig

azul, 0.51 amarilla0.36 leve fluores-cencia amarilla

0.074 fluorescencia azul —— —— 0.33, 0.42 azul ——

0.09 verde; 0.17, 0.26 morado

4Hs1 ——

Fluorescencia: 0.45 azul; ac. clorogénico 0.54,

amarilla ——0.070 fluorescencia

ligeramente azul —— —— 0.62 violeta —— 0.09 café; 0.7 café.

4Hs2 ——

Lig. fluorescencia: Ac. clorogénico 0.53 naranja;

0.58 amarilla ——0.088 fluorescencia

azul —— —— 0.5 violeta —— 0.09 café

4Hc3 ——Lig. fluorescencia: 0.52

amarilla ——0.063 fluorescencia

ligeramente azul —— —— 0.47 violeta —— 0.09 café; 0.73 café.

FAR6Hs1 ——

Lig. fluorescencia: Rutina 0.43 naranja; ac.

clorogénico 0.54 amarilla; flúorescencia: 0.70

naranja0.34 leve

fluorescencia amarilla0.070 fluorescencia ligeramente verde —— ——

0.12, 0.26, 0.44 violeta; 0.53 azul; 0.74, 0.80 violeta ——

0.10 café; 0.17 morado; 0.21 verde; 0.26 morado.

6Hs1 ——

Lig. fluorescencia: rutina 0.43 azul; fluorescencias:

ác. clorogénico 0.54 amarilla; rutina 0.69

naranja0.34 leve

fluorescencia amarilla0.070 fluorescencia ligeramente verde —— ——

0.11, 0.22, 0.40, violeta; 0.49 azul; 0.71 violeta; 0.78 violeta ——

0.10 café; 0.17 morado; 0.26 morado.

FAR 6Hc3 ——

Lig. fluorescencia: 0.41 azul; fluorescencia: 0.51

naranja0.34 leve

fluorescencia amarilla0.070 fluorescencia ligeramente verde —— —— 0.15 violeta ——

0.1 verde; 0.20 morado; 0.27 morado; 0.73 café.

6Hc3 ——Fluorescencia: 0.41 azul;

0.51 amarilla0.34 leve

fluorescencia amarilla0.070 fluorescencia ligeramente verde —— ——

0.14 café; 0.33 violeta ——

0.11 verde; 0.21 morado; terpineol 0.30 morado;

0.80 café.

7Hc1 ——

Fluorescencia: 0.41 azul intenso; 0.49 amarillo;

0.79 azul0.32, leve

fluorescencia amarilla

Umbeliferona 0.085 fluorescencia azul; 0.48 fluorescencia

amarilla —— —— 0.32 violeta ——

0.10 verde; 0.20 morado; terpineol 0.29 morado;

0.73 café.

8Hc1 ——

Lig. fluorescencia: 0.41 azul; fluorescencia: 0.51

amarilla; 0.79 azul0.31, leve

fluorescencia amarilla —— —— —— 0.35 violeta ——0.09 café; 0.19, 0.27 morado; 0.74 café.

9Hs1 ——

Fluorescencia: 0.40 naranja; 0.52 amarilla; hiperósido 0.66 naranja —— —— —— —— 0.41 violeta 0.23 café

0.09 café; 0.19 morado; terpineol 0.29 morado;

0.73 café.

6Fs2 ——

Fluorescencia: 0.41 naranja; 0.53 amarilla; 0.67 naranja intenso

0.32 leve fluorescencia amarilla

0.077 fluorescencia ligeramente azul; 0.48 fluorescencia

amarilla —— —— 0.31 violeta —— 0.09, 0.73 café.

Fuente: FODECYT 102-2006.

56

Cuadro 15. Tamizaje fitoquímico por CCF para caracterización de tinturas (rizomas)

No. Alcaloides Flavonoides Antocianinas Antraquinonas CumarinasCardenólidos

Bufadienólidos Saponinas Principios Amargos Valepotriatos Ac.Volátiles Espc. Tinturas

Estándar

Manchas naranja con papaverina:

0.40; atropina: 0.24; reserpina: 0.38.

Fluorescencias amarillas y naranjas: rutina: 0.45, 0.83;

hiperósido: 0.69; ác. clorogénico: 0.52.

Sen: 0.42 fluorescencia naranja;

0.93 fluorescencia amarilla.

Cumarinas: 0.56 fluorescencia

amarilla; fluorescencia azul ác.

p-cumárico: 0.15; umbeliferona: 0.12.

Digoxina: 0.63 morado

Saponina 0.1%: 0.78

mancha violetaNl: 0.24 violeta; 0.4, azul; 0.68 azul; 0.83 azul; 0.91 violeta

Rizoma de Vos: 0.46 café; 0.57café.

Terpineno azul y morado; terpineol azul; cariofileno fucsia y eucaliptol

azul.

0

Zonas café o naranja inestables

en visible, con reactivo de

Dragendorff.

Manchas de color con fluorescencia amarilla, azul o verde a 365nm con NP/PEG

Zonas rojas en visible y fluorescencia roja en

UV 365 nm, con KOH 5% etanólica

UV 365 nm fluorescencia azul o verde con solución

etanólica de KOH 5%

Cardenólidos zonas rosa o azul violeta en visible con reactivo de

Kedde.

Zonas azules violetas y

amarillentas con Vainillina-

H2SO4

Zonas rojas-violetas, café-rojas y azules verdes con reactivo de

Vainillina-H2SO4.

Zonas azules (valtrato, aceval), zonas cafés

(dihidroval) con HCl-AcOOH glacial

Zonas azules, verdes, rojo- café en visible con anisaldehído-H2SO4.

Estándares: terpineol, cariofileno y eucaliptol.

1:10 50% ——

Lig. fluorescencia: 0.56amarilla ——

Fluorescencia: 0.57amarilla verde —— —— 0.41 violeta; 0.90 violeta ——

0.10 café; 0.41, 0.46 morado; 0.63 morado; 0.76 café.

FAROF ——

Ligera fluorescencia: 0.56amarilla ——

fluorescencia: 0.54azul —— ——

0.096, 0.40 violeta; Nl 0.68 azul; 0.81 violeta; 0.61violeta 0.46, 0.57 café.

0.07, 0.09 café; 0.15, 0.27, 0.44morado; 0.52 azul; 0.60, 0.72, 0.77, 0.85 morado; 0.91 fucsia.

FAR 1R —— —— —— —— —— ——

0.16 café; 0.60 violeta; 0.71 azul; 0.77 café

0.15, 0.18 café; Vo0.46 café; 0.62,

0.66 café oscuro, 0.74 café; 0.88 café

amarillentoVo 0.07, 0.11 café; 0.20

morado; Vo 0.27, 0.41 morado.

1Rm1 —— —— —— —— —— —— 0.17, 0.51 violeta 0.16 caféVo 0.07 café; 0.11 morado;

0.17 fucsia; 0.74 café.

1Rm2 ——Lig. fluorescencia: 0.51

amarilla —— —— —— ——0.17 violeta; 0.47 azul; 0.91café

0.15 café; Vo 0.57, 0.72 café 0.10 café; 0.17 fucsia.

2Rc1 —— —— —— —— —— —— 0.18 violeta; 0.43 azul 0.5, 0.59, 0.73 café0.10 café; 0.17 fucsia; 0.41

morado; 0.74 café.

2Rs2 ——Lig. fluorescencia: ac.

clorogénico 0.53 amarilla —— —— —— ——0.15 azul; 0.31 café rojizo; 0.41 violeta; 0.5 azul 0.14, 0.59 café

0.10 café; 0.17 amarillo; 0.74 café.

2Rc3 ——Lig. fluorescencia: ac.

clorogénico 0.53 amarilla —— —— —— ——0.5 café rojizo, 0.19 violeta; 0.44 azul; 0.93 café

0.14, 0.5, 0.59, 0.73 café

0.10 café; 0.17 morado; 0.41 morado; 0.76 café.

2Rc4 ——Lig. fluorescencia: 0.52

amarilla —— —— —— ——

0.18 café rojizo; 0.32 violeta; 0.40 azul; Nl 0.92café 0.14, 0.5, 0.59 café

0.10 café; 0.41 morado; 0.76 café.

2Rc5 ——Lig. fluorescencia: ac.

clorogénico 0.53 amarilla —— —— —— ——0.16 café rojizo; 0.32 violeta; 0.53 azul; 0.91 café

0.14, 0.49 café; Vo0.58, 0.72 café 0.10 café; 0.17, 0.41 morado.

3Rs1 ——Lig. fluorescencia: ac.

clorogénico 0.54 amarilla —— —— —— ——0.15 café rojizo; 0.32 violeta; 0.37 azul

0.13 café; Vo 0.57café

0.13 café; 0.21 morado; 0.40 fucsia; 0.77 morado;

cariofileno, 0.89 fucsia.

3Rc2 ——Lig. fluorescencia: 0.51

amarilla —— —— —— ——0.13 café rojizo; 0.26 violeta; 0.32 azul

0.14 café; Vo 0.57café

Vo 0.09 café, 0.10 morado; Vo terpineol 0.28 morado; 0.40 fucsia; Vo eucaliptol 0.72 morado; cariofileno 0.89

fucsia.

57

Fuente: FODECYT 102-2006

FAR 4Rs1 ——

Lig. fluorescencia: 0.51amarilla —— —— —— ——

0.125 café; 0.26, 0.30 azul; 0.59, 0.88 café

0.13, 0.49, 0.57 café oscuro, 0.71

café

Vo 0.09 café; 0.19 morado;Voterpineol 0.27 morado; Vo,

eucaliptol 0.72 morado;cariofileno 0.89 fucsia.

4Rs1 ——Lig. fluorescencia: ac.

clorogénico 0.53 amarilla —— —— —— —— 0.60 violeta; Nl 0.93 café0.57, 0.72 café

amarillo

Vo 0.09 café; 0.19 morado; Voterpineol 0.28 morado; Voeucaliptol 0.72 morado; cariofileno 0.89 fucsia.

4Rs2 ——Lig. fluorescencia: 0.51

amarilla —— —— —— —— 0.60 violeta; 0.91 café0.46, 0.71 café;

0.70 café amarillo

0.09 café; 0.19 morado; Vo, terpineol 0.28 morado; Vo,

eucaliptol 0.72 morado; cariofileno 0.89 fucsia.

FAR 4Rc3 —— —— —— —— —— ——

0.11, 0.28 café; 0.31 azul; 0.57 café; 0.82 café rojizo; 0.87 café

0.15, 0.24, 0.40café; 0.49, 0.57,0.71 café oscuro

Vo 0.07, 0.11 café; 0.20 morado; Vo terpineol 0.28, 0.41 morado; Vo eucaliptol 0.72 morado; Vo terpineno 0.91 fucsia.

4Rc3 —— —— —— —— —— —— 0.55 violeta; 0.91 café Vo 0.57 café

Vo 0.09 café; 0.19, 0.40 morado; Vo eucaliptol 0.72

morado; terpineno 0.92 fucsia.

5Rm1 —— —— ——

Fluorescencia:cumarina 0.47

amarilla —— ——0.18 azul; 0.40, 0.51, 0.62violeta Vo 0.57 café

0.09 café; 0.19, 0.40 morado;Vo eucaliptol 0.72 morado; Vo

terpineno 0.91 fucsia.

FAR6Rs1 ——

Lig. fluorescencia: 0.51 amarilla; 0.90 amarilla —— —— —— ——

0.17 café; 0.24 azul; 0.28, 0.5 violeta; 0.58 azul; 0.65 café; 0.77 violeta; 0.81, 0.88 café; Nl 0.93 café.

0.15, 0.25, 0.38café; Vo 0.47 café oscuro; 0.54, 0.73

café; 0.72 café amarillo

0.08, 0.13 café; 0.19 morado; Vo terpineol 0.28, 0.40 morado;

Vo, eucaliptol 0.72 morado; cariofileno 0.89 fucsia

6Rs1 ——Lig. fluorescencia: 0.51amarilla; 0.91 amarilla —— —— —— —— 0.15 café ——

0.09 café; 0.19 morado; 0.40 morado; Vo eucaliptol 0.72

morado, terpineno 0.91 fucsia.

6Rs2 ——Lig. fluorescencia: 0.52 amarilla; 0.91 amarilla —— —— —— ——

0.125 café; 0.21 café; 0.375 violeta; 0.81 café; 0.90 café

0.15 café; 0.38 café; 0.48 café;

0.54 café; Vo 0.57 café; 0.72 café

0.05, 0.09 café; 0.19 morado; Vo terpineol 0.27, 0.40 morado; Vo eucaliptol 0.72 morado; Vo,

terpineno 0.91 fucsia.

FAR6c3 ——

Ligera fluorescencia: 0.51amarilla —— —— —— ——

0.16, 0.26 café; 0.47 violeta; 0.54 azul; 0.60 café; 0.75 violeta; 0.80, 0.87 café; Nl 0.93 café

0.15, 0.25, 0.38café; V. 0.47 café oscuro; 0.54, 0.73

café; 0.72 café amarillo

0.07, 0.11 café; 0.19 morado;Vo terpineno 0.28, 0.40

morado; Vo eucaliptol 0.72 morado; Vo terpineno 0.91

fucsia.

6Rc3 —— —— —— —— —— ——0.16 café; 0.32 violeta; 0.76, 0.90 café

0.38, 0.48 café; Vo0.57 café; 0.72 café 0.19 morado

7Rc1 ——Ligera fluorescencia: 0.52

amarilla —— —— —— ——0.15 café; 0.30 azul; 0.72, 0.90 café

0.48 café; Vo 0.58café 0.20 fucsia; Vo 0.44 fucsia.

8Rc1 ——Lig. fluorescencia: ac.

clorogénico 0.54 amarilla —— —— —— ——0.15 café; 0.31 azul; 0.71, 0.90 café

0.51, 0.59, 0.74café 0.19 fucsia; 0.43 fucsia.

9Rs1 ——Lig. fluorescencia: ac.

clorogénico 0.54 amarilla ——Fluorescencia: Vo0.54 lig. amarilla —— —— 0.32 azul —— 0.19 fucsia; 0.43 fucsia.

58

Cuadro 16. Tamizaje fitoquímico por CCF para caracterización de extractos secos.

No AlcaloidesFlavonoides Antocianinas

Antraquinonas CumarinasCardenólidos

BufadienólidosSaponinas Principios amargos

Glicósidos cianogénicos

Sesquiterpen-lactonas

ValepotriatosAceites volátiles

general

0

Zonas cafés o naranjas

inestables en visible, con reactivo de

Dragendorff.

Manchas de color con fluorescencia amarilla, azul o

verde a 365nm con NP/PEG

Zonas rojas en visible y

fluorescencia roja en UV 365

nm, con solución etanólica de

KOH 5%

UV 365 nm fluorescencia azul o verde con solución etanólica de KOH

5%

Cardenólidos zonas rosa o azul violeta

en visible con reactivo de Kedde.

Zonas azules violetas y amarillentas con vainillina- H2SO4

Zonas rojas-violetas, café-rojas y azules

verdes con reactivo de vainillina-H2SO4

Zonas azules, verdes, rojas, cafés

en visible con anisaldehído-

H2SO4 ó Vainillina-H2SO4

Manchas rojas, verdes, amarillas, marrones o azules

después de calentar a 105ºC con Vainillina

al 1% en etanol

Zonas azules (valtratos, acevaltratos), zonas

cafés (dihidrovaltratos) con HCl-COOH glacial

Zonas azules, verdes, rojo-café em

visible com anisaldehído-

H2SO4. Estandar: Citronelal,

limoneno, citral

1Hm1 Ausente

Ac.clorogénico 0.49 verde; rutina

0.57 naranja, 0.86 azul

AusenteUmbeliferona

0.07 azul0.39 verde; 0.87

azul

Quilaya (Q) 0.19 marrón; 0.29 amarillo; 0.48

marrón; 0.88 verde

0.32 rojo café; N. lobata 0.62 azul

Ausente Ausente0.10 café; 0.14 café;

0.38 café

0.13 rojo-café; 0.77 café, citronelal

2Hs2 AusenteAc. clorogénico 0.49 verde; 0.79 verde; 0.86 azul

AusenteUmbeliferona

0.07 azul0.39 verde

Q 0.19 marrón; 0.30 amarillo; 0.48 marrón; 0.61 rojo;

0.71 rojo; 0.90 verde

0.32 rojo café; N. lobata 0.62

azul;0.65 rojo violeta

Ausente Ausente 0.38 café0.13 café; 0.28 rojo-café; 0.77 café, citronelal

3Hs1 Ausente

Ac. clorogénico 0.49 verde; rutina

0.57 naranja; hiperósido 0.69

naranja; ac. clorogénico 0.79 verde; 0.86 azul

AusenteUmbeliferona

0.07 azul

0.31 azul; 0.39 verde; 0.50 azul; 0.58 azul; 0.87

azul.

0.19 marrón; 0.29 amarillo; 0.48

marrón; 0.59 rojo; 0.71 rojo; 0.88

verde

0.32 rojo café;0.62 azul;0.65 rojo

violeta; 0.92 verdeAusente Ausente

0.10 café; 0.14 café; 0.38 café; 0.56 café

0.10 café; 0.14 café; 0.38 café;

0.56 café

6Hs1 Ausente

Ac. clorogénico 0.49 verde; rutina

0.57 naranja; hiperósido 0.69

naranja; ac, clorogénico 0.79 verde; 0.86 azul

AusenteUmbeliferona

0.07 azul

0.11 verde; 0.21 verde; 0.35

verde; 0.50 azul; 0.58 azul; 0.87

azul.

Q 0.19 marrón; 0.29 café; 0.48

marrón; 0.59 rojo; 0.74 verde

0.11 verde azul; 0.32 rojo café; N. lobata 0.62 azul; 0.65 rojo violeta;

0.92 verde

Ausente Ausente0.10, 0.14, 0.38, 0.56, 0.61, 0.93

café.

0.13 café; 0.28 rojo-café; 0.77

café, cintronelal; 0.98 rojo-café

1Rm1 Ausente 0.33 azul Ausente Ausente AusenteQ 0.19 marrón;

0.30 amarillo; 0.61 rojo; 0.91 café

0.86 verde Ausente Ausente0.13, 0.30, 0.38, 0.43, 0.47, 0.51, 0.57, 0.68 azul.

0.25 café

2Rs2 Ausente 0.33 azul Ausente Ausente AusenteQ 0.19 marrón;

0.61 rojo.0.86 verde Ausente Ausente 0.38 azul Ausente

3Rs1 Ausente 0.33 azul Ausente Ausente AusenteQ 0.19 marrón;

0.32 amarillo; 0.62 rojo.

0.86 verde Ausente Ausente 0.38 azul; 0.43 café Ausente

4Rs1 Ausente 0.33 azul Ausente Ausente AusenteQ 0.19 marrón;

0.64 rojo.0.86 verde Ausente Ausente

0.13, 0.38, 0.43 azul;0.68 azul.

0.25 café.

5Rm1 Ausente 0.33 azul Ausente 0.33 verde Ausente 0.32 amarillo 0.86 verde Ausente Ausente Ausente 0.01 morado

6Rs1 Ausente 0.33 azul Ausente Ausente Ausente0.14 gris; Q 0.19

girs; 0.62 rojo; 0.91 naranja.

0.86 verde Ausente Ausente0.13, 0.30, 0.38, 0.43, 0.47, 0.68

azul.0.25 café

Fuente: FODECYT 102-2006l

59

En el análisis de las tinturas farmacopeicas (1:5) y experimentales (1:10) obtenidas de las hojas silvestres y cultivadas (Cuadro 15), no se evidenció la presencia de valepotriatos, saponinas, cardenólidos y bufadienólidos, metabolitos que sí se identificaron en los extractos secos. Probablemente la concentración de los mismos era muy pequeña y el método no fue lo suficientemente sensible como para detectar su presencia. Es por ello que lo ideal es realizar el tamizaje en el extracto seco de la planta, ya que es el concentrado del contenido total de la planta.

En las mismas tinturas se evidenció la presencia de flavonoides, antraquinonas, cumarinas y principios amargos. No se observan diferencias entre los especímenes culti-vados y los silvestres. En algunos casos, el metabolito está presente en la tintura farma-copeica y no en la tintura 1:10, por lo que puede inferirse que en estos casos aislados la tintura farmacopeica extrajo una cantidad de metabolito detectable por el método. En las tinturas farmacopeicas de hojas de V. deltoidea se evidenció la presencia de flavonoides, principios amargos y valepotriatos. No se observó la presencia de cumarinas.

Aunque se reportan valores de Rf para las manchas observadas en la prueba de antraquinonas, el color de las mismas no corresponde al reportado en la literatura, por lo que se asume que no están presentes; dato que concuerda con el obtenido para los extractos secos.

El tamizaje fitoquímico de los extractos secos (Cuadro 16) reveló la presencia de flavonoides y antocianinas, saponinas, principios amargos y valepotriatos; tanto en hojas y rizomas silvestres como en cultivados. Además, las hojas silvestres y cultivadas presentaron cumarinas, cardenólidos y bufadienólidos.

La presencia de valepotriatos en las hojas silvestres y cultivadas se evidencia en la prueba de la mancha (Cuadro 6), específica para detectar trazas de dichos metabolitos a partir de droga vegetal, en donde se emplea un sistema de extracción anhidro, ya que dichas moléculas son poco solubles en agua y se degradan rápidamente en presencia de humedad (Upton, 1999). Aunque se sospecha que poseen acción terapéutica, también son tóxicos, por lo que su ausencia en las tinturas obtenidas de las hojas (Cuadro 15) no afectasu aplicación y uso.

En el caso de las tinturas obtenidas de rizomas silvestres y cultivados, se observó la presencia de valepotriatos, flavonoides, antocianinas y principios amargos. A excepción de las saponinas, se identificaron todos los metabolitos presentes en los extractos secos de los mismos especímenes. La única diferencia notoria entre los especímenes silvestres y cultivados es la presencia de cumarinas en una muestra de rizoma cultivado y la ausencia de flavonoides en casi la mitad (47%) de las tinturas de este grupo de rizomas.

Es de señalar que tanto en las tinturas de rizomas silvestres como cultivados se observa mayor abundancia de bandas o compuestos del grupo de principios amargos y valepotriatos en las tinturas farmacopeicas en relación a las tinturas 1:10. Por lo que podría recomendarse la elaboración de las mismas cuando se tenga especial interés en investigar la contribución de estos metabolitos al efecto terapéutico de la planta, que es producto de la actividad acumulativa de varios constituyentes (Upton, 1999).

El rizoma de V. deltoidea contiene flavonoides, cumarinas y principios amargos. No presenta valepotriatos. La principal diferencia entre la variabilidad de V. prionophylla

60

y la especie oficial es la ausencia de alcaloides, presentes en la mayoría de especies del género (Upton, 1999).

III.4.3 Tamizaje fitoquímico de aceites volátiles en extractos, tinturas y aceites

Usando la metodología de CCF establecida en LIPRONAT, se realizó el tamizaje fitoquímico de los aceites volátiles obtenidos por hidrodestilación en Neoclevenger (Figura 21) y por CCF se identificaron los aceites volátiles volátiles generales (Estándares: Citronelal, limoneno y citral) y específicos (Estándares: Terpineol, cariofileno y eucaliptol) (Figura 22).

Figura 21. Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación en aparto Neoclevenger

Figura 22. CCF de aceites esenciales. En el lado derecho se observaran los estándares usados que de derecha a izquierda son eucaliptol, terpineol, terpineno y cariofileno; siendo este último el que posee mejor separación y puede observarse su presencia

fácilmente en la mayoría de aceites ensayados.

61

Como puede apreciarse en los Cuadros 17 (hojas) y 18 (rizomas), todos los aceites analizados poseen como denominador común el cariofileno, uno de componentes más reportados en la composición del aceite esencial de V. officinalis, según las farmacopeas consultadas. Se identificó en algunos aceites, tanto de hoja como de rizoma, la presencia de otros compuestos reportados en la literatura, como el terpineol y el terpineno. El cariofileno mostró en la cromatoplaca dos bandas que pueden ser de utilidad para la identificación de aceites en las especies en estudio. La caracterización de aceites volátiles con estándares generalmente usados contribuye poco en la identificación de los aceites de valeriana, sugiriéndose el empleo de estándares específicos

Cuadro 17. Identificación de componentes de los aceites volátiles (hojas).

No. Aceites Volátiles Específicos Caract. Ac. Volátiles Gral.

0Zonas azules, verdes, rojo-café en visible con anisaldehído-

H2SO4. Estándares: Terpineol, cariofileno y eucaliptol

Zonas azules, verdes, rojo-café en visible con anisaldehído-

H2SO4. Estándares:citronelal, limoneno, citral

1Hm1

0.2 fucsia; 0.3 azul; terpineol 0.37, 0.42, 0.49 morado;terpineno 0.53 fucsia; 0.59 azul; 0.63 fucsia; cariofileno

0.96 fucsia NR1Hm2 NR NR

2Hc10.19 morado; 0.30 morado; 0.34 zul; 0.53 azul; 0.59

morado; 0.64 azul; 0.77 fucsia; 0.88 fucsia; 0.97 fucsia NR

2Hs2Terpineno 0.19, 0.29 morado; 0.33 azul; 0.47 fucsia; 0.52

azul; cariofileno 0.56 fucsia; cariofileno 0.96 fucsia

0.17 café citral; 0.28 rojo-café; 0.42 rojo-café; 0.77 café

citronelal, citral; 0.96 morado.2Hc4 NR NR

2Hc5Terpineno 0.25, 0.41 morado; terpineno 0.47 fucsia; 0.51 azul; cariofileno 0.56 morado; 0.62 azul; 0.70, 0.93 fucsia NR

3Hs10.1 lila; 0.22 morado, terpineol; 0.36 lila; 0.4 fucsia,

cariofileno; 0.47, 0.68 morado; 0.96 fucsia, cariofileno NR3Hc2 NR NR

4Hs1

0.22 morado; 0.31 azul; terpineol 0.36, 0.38 morado; 0.49 fucsia; terpineno 0.53 azul; cariofileno 0.57 fucsia; 0.63

morado; 0.67, 0.77 morado; cariofileno 0.97 fucsia.0.17 café citral; 0.28 café; 0.42

rojo-café; 0.96 morado.

4Hs2

0.22 morado; 0.31 azul; terpineol 0.36, 0.38 morado; terpineno 0.49 fucsia; terpineno 0.53 azul; cariofileno 0.57

fucsia; 0.63, 0.67, 0.77 morado; cariofileno 0.97 fucsia. NR

4Hc3Terpineno 0.20, 0.29 morado; 0.33 azul; 0.45 morado; 0.51

azul; 0.55 morado; 0.60 azul; 0.67, 0.86 morado. NR6Hs1 0.22 morado; terpineno 0.53 azul; cariofileno 0.96 fucsia. 0.96 rojo-café.6Hc3 NR NR

7Hc1

0.23 morado; terpineol 0.38 azul; terpineno 0.53 azul; cariofileno 0.57 fucsia; 0.62, 0.74 morado; cariofileno 0.96

fucsia. NR8Hc1 NR NR

9Hs1

0.22 morado;terpineol 0.37 azul; terpineno 0.47 fucsia; terpineno 0.52 azul; 0.55 fucsia; 0.60, 0.64 morado; 0.93

fucsia NR

Fuente: FODECYT 102-2006

62

Cuadro 18. Identificación de componentes de los aceites volátiles (rizomas).

No. Aceites Volátiles Específicos Caract. Ac. Volátiles Gral.

0Zonas azules, verdes, rojo-café en visible con anisaldehído-H2SO4.

Estándares: Terpineol, cariofileno y eucaliptol

Zonas azules, verdes, rojo-café en visible con anisaldehído-

H2SO4. Estándares: Citronelal, limoneno, citral

1Rm1

Terpineol 0.19 azul; 0.29 fucsia; terpineol 0.36 azul; 0.42 morado; 0.51 fucsia; cariofileno 0.56 azul; 0.78 morado; cariofileno 0.96

fucsia.

0.31 rojo-café, citronelal; 0.42 rojo-café; 0.77 café citronelal,

citral; 0.96 rojo-café.

1Rm20.26 lila, terpineol; 0.39 morado, terpineol; 0.47 morado; 0.57

fucsia, terpineno; 0.96 fucsia, cariofileno NR

2Rc10.16, 0.26 azul, terpineol; 0.39 morado, terpineol; 0.48 morado; 0.59 fucsia, eucaliptol; 0.76 morado; 0.84 café; 0.96 fucsia, cariofileno. NR

2Rs20.26 lila; 0.37, 0.40 fucsia, cariofileno; 0.67 morado; 0.96 fucsia,

cariofileno.

0.22 café, mezcla aceites; 0.31 rojo-café, citronelal; 0.42 rojo-

café; 0.77 café, citronelal, citral; 0.96 rojo-café.

2Rc30.21, 0.35, 0.39, 0.43 morado; 0.55 fucsia; 0.85 morado; eucaliptol

0.93 fucsia.

0.31 rojo-café, citronelal; 0.42 rojo-café; 0.77 café citronelal,

citral; 0.96 rojo-café.

2Rc40.39 morado, terpineol; 0.49 morado; 0.59 fucsia, eucaliptol; 0.76

morado; 0.84 café; 0.96 fucsia, cariofileno. NR

2Rc5Terpineol 0.13, 021 azul; terpineol 0.31, 0.44 morado; 0.57 fucsia; cariofileno 0.64, 0.68 morado; 0.80 fucsia; eucaliptol 0.93 fucsia NR

3Rs10.26 lila; 0.39 fucsia, cariofileno; 0.68 morado; 0.96 fucsia,

cariofileno.

0.22 café, mezcla aceites; 0.31 rojo-café, citronelal; 0.42 rojo-

café; 0.77 café, citronelal, citral; 0.96 rojo-café.

3Rc20.16 azul; eucaliptol 0.25, 0.36 azul; terpineno 0.47 morado; 0.59

fucsia; cariofileno 0.65, 0.84 morado; cariofileno 0.95 fucsia. NR

4Rs1Terpineol 0.13 azul; eucaliptol 0.24, 0.39, 0.44 azul; 0.55, 0.59 fucsia; cariofileno 0.64, 0.77 morado; cariofileno 0.95 fucsia. 0.42 rojo-café; 0.96 morado.

4Rs2Terpineol 0.13 azul; eucaliptol 0.24, 0.39, 0.44 azul; 0.55, 0.59 fucsia; cariofileno 0.64, 0.77 morado; cariofileno 0.95 fucsia. NR

4Rc3Terpineol 0.13 morado; 0.21 azul; 0.29, 0.41 morado; 0.51 fucsia;

cariofileno 0.64 azul; 0.77 morado; eucaliptol 0.93 fucsia. NR

5Rm10.17 azul; eucaliptol 0.25 azul; terpineol 0.32, 0.41 morado; 0.45

fucsia; cariofileno 0.53 fucsia. 0.42 rojo-café; 0.96 morado.

6Rs10.29 azul; 0.36 morado, 0.47 fucsia; eucaliptol 0.51 azul; 0.71

morado; cariofileno 0.95 fucsia.

0.27 rojo-café, limoneno; 0.31 rojo-café, citronelal; 0.42 rojo-

café; 0.77 café, citronelal, citral; 0.96 morado.

6Rs20.4 morado, terpineol; 0.49 morado; 0.57 fucsia, terpineno; 0.96

fucsia, cariofileno.0.31 rojo-café, citronelal; 0.42

rojo-café; 0.96 rojo-café.6Rc3 NR NR

7Rc1Terpineol 0.13, 0.21 azul; 0.28 fucsia; 0.33, 0.41 morado; eucaliptol

0.51 fucsia; 0.55, 0.61, 0.76 morado; eucaliptol 0.93 fucsia. NR8Rc1 NR NR9Rs1 NR NR

6Fs20.39 morado, terpineol; 0.49 morado; 0.61 azul, cariofileno; 0.75

morado. NR

Fuente: FODECYT 102-2006

63

La presencia de aceites volátiles fue más abundante en las tinturas que en el extracto seco, debido a que el extracto seco se obtiene por destilación a presión reducida, proceso térmico que puede provocar la pérdida de algunos compuestos volátiles. También se observan más bandas en las tinturas farmacopeicas y no se evidencian diferencias en estos aspectos entre los especímenes silvestres y los cultivados. Los Rf de los diferentes compuestos aislados en las tinturas corresponden con los obtenidos para V. officinalis, lo cual permite inferir la similitud en composición del aceite esencial de ambas especies.

Los aceites esenciales de los extractos secos fueron identificados utilizando la metodología general establecida en LIPRONAT, mientras que las tinturas y aceites volátiles fueron caracterizados utilizando estándares de componentes identificados por CG, por lo que se adaptó la metodología especial para la especie en estudio.

La cantidad de bandas (riqueza del aceite volátil) parece ser mayor en los aceites obtenidos por hidrodestilación de las hojas que en los de rizomas, pero realmente los rizomas presentan una composición más compleja de los componentes de interés. No se observan diferencias en composición entre los especímenes silvestres y cultivados. En este caso, fue posible identificar la presencia de cariofileno, en la mayoría de las muestras, seguido por la presencia de terpineno y terpineol, todos componentes del aceite de V. officinalis en las farmacopeas consultadas.

III.4.4 Cuantificación de flavonoides en tinturas y extractos

Se cuantificaron los flavonoides en tinturas farmacopeicas, tinturas 1:10 y algunos extractos secos, adaptando la metodología propuesta por la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (2001), en donde se reportan los resultados como rutina (Cuadros 19 y 20).

Cuadro 19. Cuantificación de flavonoides en tinturas y extractos de interés (hojas).

No. Final Lugar de Colecta

Tintura 1:10 EtOH 50%. mg%

como rutina

Tintura 1:5 EtOH 70%. mg% como

rutina

Extracto 1:1 EtOH 50%. mg%

como rutina

Extracto Seco EtOH 50%.

mg% como rutina

1Hm1 Tutuapa. Manejo Intervida 348.09 244.66 NR 56.751Hm2 Tutuapa. Manejo en Vista Hermosa 1,277.54 907.57 NR NR2Hc1 Nebaj, Apaptix 2006 FAUSAC. 328.67 NR NR NR2Hs2 Nebaj, colectada 2006 819.51 NR NR NR2Hc4 Nebaj, cultivada FAUSAC NR NR NR NR2Hc5 Nebaj. "B" Cultivada FAUSAC NR 149.57 NR NR3Hs1 Chajúl, Quiché. Silvestre 2006 925.84 NR NR NR3Hc2 Chajúl, Quiché. Cultivada FAUSAC NR NR NR NR4Hs1 Raxquim. Silvestre 2006 NR 240.58 NR NR4Hc3 Raxquim. Cultivada FAUSAC 212.39 298.71 NR NR6Hs1 Chonlá. Silvestre 2007 596.06 1130.16 NR 109.506Hc3 Chonlá. Cultivada FAUSAC 536.61 371.31 NR NR7Hc1 Joyabaj, Quiché. Cultivada FAUSAC 371.16 277.07 NR NR8Hc1 Chuchucá- Cultivada FAUSAC 430.22 NR NR NR9Hs1 Valeriana deltoidea. Silvestre 2008. 229.21 927.67 NR NR

Fuente: FODECYT 102-2006

64

Cuadro 20. Cuantificación de flavonoides en tinturas y extractos de interés (rizomas).

No. Lugar de Colecta

Tintura 1:10 EtOH 50%. mg% como rutina según

FM

Tintura 1:5 EtOH 70%. mg% como rutina según FM

Extracto 1:1 EtOH 50%. mg% como rutina según

FM

Extracto Seco EtOH 50%.

mg% como rutina según FM

1Rm1 Tutuapa. Manejo Intervida 579.06 16.79 NR 10.341Rm2 Tutuapa. Manejo en Vista Hermosa 98.03 5.55 NR NR2Rc1 Nebaj Apaptix 2006 FAUSAC. 16.66 NR NR NR2Rs2 Nebaj. Silvestre 2006 226.60 NR NR NR2Rc3 Nebaj. Cultivada en Quetzaltenango 164.49 31.28 NR NR2Rc4 Nebaj. Silvestre FAUSAC 144.17 NR NR NR2Rc5 Nebaj. "B" Cultivada FAUSAC 48.07 NR NR NR3Rs1 Chajúl, Quiché. Silvestre 2006 10.16 NR NR NR3Rc2 Chajúl, Quiché. Cultivada FAUSAC 189.89 NR NR NR4Rs1 Raxquim. Silvestre 2006 2,326.22 50.51 NC 20.804Rs2 Raxquim. Silvestre, tesis MUPLAN NR NR NR NR4Rc3 Raxquim. Cultivada CEMA 104.62 32.71 NR NR5Rm1 Panquix, Totonicapán. Manejo ATI 49.68 NR NR NR6Rs1 Choanlá. Silvestre colectada 2007 208.65 81.84 NC 30.836Rs2 Choanlá. Silvestre abril 2008 162.85 NR NC 9.746Rc3 Choanlá. Cultivada FAUSAC 15.09 41.98 NR NR7Rc1 Joyabaj. Cultivada FAUSAC 110.93 NR NR NR8Rc1 Chuchucá. Cultivada FAUSAC 55.10 NR NR NR9Rs1 Valeriana deltoidea. Silvestre 2008 30.75 18.11 NR NR

Fuente: FODECYT 102-2006. NR: No se realizó; NC: No cuantificable

Las adaptaciones al método permitieron cuantificar los flavonoides en mg% en tinturas farmacopeicas, tinturas 1:10 en etanol al 50% de hojas y rizomas. Los datos son muy dispersos, porque dependen de aspectos como condiciones del cultivo, edad de la planta, fecha de colecta, etc. (WHO, 1999). Estos aspectos explican la abundancia de flavonoides en los especímenes silvestres de ambos órganos en relación a los cultivados. Los datos numéricos incluidos evidencian claramente este comportamiento.

Las tinturas 1:10 en etanol al 50% (hojas cultivadas 500.67±356.49; hojas silvestres 780.47±168.32, rizomas cultivados 131.32±151.80 y rizomas silvestres 586.90±976.03) contienen la mayor cantidad de flavonoides de todos según el promedio y desviación estándar en relación a las tinturas farmacopeicas (hojas cultivadas 374.82± 270.87; hojas silvestres 685±625.03; rizomas cultivados 25.66±14.41 y rizomas silvestres 66.17±22.15). La concentración de droga vegetal es menor en la tintura 1:10, pero la afinidad entre los flavonoides y el disolvente es mayor, por lo que se logra una mayor extracción.

Con un IC95%, la media poblacional de hojas silvestres se encuentra entre 417.39-3,063.41 y posee un límite superior mayor al de las tinturas farmacopeicas (436.34-1984.04). Para hojas cultivadas el IC95% es de (6594.2-17363.29) mayor al obtenido paratinturas farmacopeicas (156.17-1620.32). El espécimen más promisorio de hojas, es el manejado proveniente de Vista Hermosa, seguido del silvestre proveniente de Chajul y Tutuapa. Las hojas de V. deltoidea también contienen este metabolito y la tintura 1:10 (2921.12) posee mayor cantidad del mismo en relación a la tintura farmacopeica (972.67).

La media poblacional para las tinturas 1:10 de rizomas silvestres con un IC95% es de 452.42-1440.83; mientras que para la tintura farmacopeica se encuentra entre 127.98-

65

599.05. En el caso de los rizomas cultivados la media poblacional de la tintura 1:10 se ubica entre 36.26-232.28 y de la farmacopeica es de 4.93-36.14. El rizoma más promisorio es el silvestre de Raxquim, seguido del rizoma de Tutuapa. El rizoma de V. deltoidea presenta los mismos comportamientos en cuanto a tinturas discutidas con anterioridad, pero no posee el metabolito en abundancia comparable a la variabilidad estudiada para V. prionophylla.

Con base en lo observado puede inferirse que la concentración a temperatura y presión reducida afecta el contenido de flavonoides, ya que la concentración disminuyeen todos los casos y no son cuantificables en los extractos 1:1 y secos. En el caso de las tinturas, también se observa mayor cantidad de flavonoides en las hojas que en los rizomas, lo que concuerda con otros estudios de plantas nativas. Este comportamiento permite utilizar la planta completa en la obtención de productos fitoterapéuticos.

Si se desean aprovechar los efectos ansiolíticos de los flavonoides es recomendable utilizar la tintura de hojas 1:10 en etanol al 50% y no los extractos más concentrados. Esto es conveniente para la disminución de costos de elaboración del producto final y se traduce en una ventaja para el consumidor, sobre todo tomando en cuenta que la hoja, es un desecho, ya que no es considerada como materia vegetal valiosa para obtener productos fitoterapéuticos en las farmacopeas consultadas.

III.4.5 Cuantificación de ácidos valerénicos en tinturas y extractos

Se cuantificaron los ácidos valerénicos en las tinturas y extractos por HPLC, según el procedimiento de la FE y las condiciones de operación de la AHP y se preparó el POE de dicha determinación. En los Cuadros 21 y 22 se muestran los ácidos sesquiterpénicos en tinturas y extractos, tanto en hojas como en rizomas.

Cuadro 21. Cuantificación de ácidos valerénicos en las tinturas y extractos (hojas)

No. Final Lugar de Colecta

Tintura 1:5 EtOH 70% sumatoria de ácidos valerénicos

identificados.

Tintura 1:10 EtOH 50%

sumatoria de ácidos valerénicos

Extracto 1:1 EtOH 50% sumatoria de ácidos valerénicos

Extracto seco EtOH 50%

sumatoria de ácidos valerénicos

0 Valeriana officinalis

NE. EP >15mg% calculado como ácido valerénico.

NE. Se podría asumir >7.5 mg% como ácido valerénico.

NE. EP >100 mg% p/p; FB > 170% p/p como ácido valerénico

NE. FE > 250mg% como ácido valerénico.

1Hm1 Tutuapa. Manejo IV 20.32 11.18 NR 60.761Hm2 Tutuapa. Manejo VH NR 4.53 NR NR2Hc1 Nebaj. Apaptix 06 FAUSAC NR 45.07 NR NR2Hs2 Nebaj. Silvestre colectada 2006 NR 25.24 NR NR2Hc4 Nebaj. Silvestre FAUSAC NR NR NR NR2Hc5 Nebaj. "B" Cultivada FAUSAC NR NR NR NR3Hs1 Chajúl. Silvestre colectada 2006 NR 15.91 NR NR3Hc2 Chajúl. Cultivada FAUSAC NR 15.74 NR NR4Hs1 Raxquim. Silvestre 2006 5.10 2.53 NR NR4Hs2 Raxquim. Silvestre 2007. 5.10 2.53 NR NR4Hc3 Raxquim. Cultivada FAUSAC NR NR NR NR6Hs1 Choanlá. Silvestre 2007 6.21 11.05 NR 155.256Hc3 Choanlá. Cultivada 2.75 NR NR NR7Hc1 Joyabaj. Cultivada FAUSAC NR 5.60 NR NR8Hc1 Patzún. Cultivada FAUSAC NR NR NR NR9Hs1 V. deltoidea. Silvestre 2008 NR 15.15 NR NR

Fuente: FODECYT 102-2006

66

Cuadro 22. Cuantificación de ácidos valerénicos en las tinturas y extractos (rizomas)

No. Final Lugar de Colecta

Tintura 1:5 EtOH 70% sumatoria de ácidos valerénicos

identificados.

Tintura 1:10 EtOH 50%

sumatoria de ácidos valerénicos

Extracto 1:1 EtOH 50%

sumatoria de ácidos valerénicos

Extracto seco EtOH 50%

sumatoria de ácidos valerénicos

0 Valeriana officinalis

NE. F.Eur > 15mg% calculado como ácido valerénico.

NE. Se podría asumir > 7.5 mg% como ácido valerénico.

NE. FE >100 mg% p/p; FB > 170% p/p como ácido valerénico

NE. FE > 250mg% como ácido valerénico.

1Rm1 Tutuapa. Manejo en IV 48.17 11.46 88.90 311.141Rm2 Tutuapa. Manejo en VH NR 11.96 NR NR2Rc1 Nebaj-Apaptix 06 Cultivada CEDA NR 4.43 NR NR2Rs2 Nebaj. Silvestre colectada 2006 NR 12.72 NR NR2Rc3 Nebaj-Apaptix cultivada en Quetzalt NR NR NR NR2Rc4 Nebaj. Silvestre cultivada CEDA NR 11.87 NR NR2Rc5 Nebaj, "B" Cultivada CEDA NR NR NR NR3Rs1 Chajúl,. Silvestre colectada 2006 NR 6.52 NR NR3Rc2 Chajúl, Quiché. Cultivada FAUSAC NR 5.52 NR NR4Rs1 Raxquim. Silvestre 2006 4.00 4.05 28.28 71.604Rc3 Raxquim. Cultivada CEDA 13.41 NR NR NR5Rm1 Panquix, Totonicapán. Manejo ATI NR 7.19 NR NR6Rs1 Choanlá. Silvestre 2007 13.95 4.74 47.37 486.286Rs2 Choanlá. Silvestre 2008 NR 17.71 NR NR6Rc3 Choanlá. Cultivada 39.47 NR NR NR7Rc1 Joyabaj, Quiché. Cultivada CEDA NR NR NR NR8Rc1 Patzún. Cultivada CEDA NR NR NR NR9Rs1 Valeriana deltoidea. Silvestre 2008 NR NR NR NR6Fs2 Choanlá, Silvestre, 2008 NR NR NR NR

Fuente: FODECYT 102-2006. NR: No se realizó

Las tinturas farmacopeicas de las hojas silvestres (5.47±0.64 mg%) y cultivadas (11.54±12.42 mg%) no cumplen con el porcentaje establecido por la EP (>15 mg%) para la especie oficinal, aunque éste límite está establecido para los rizomas y no para las hojas, por lo que la presencia de éstos metabolitos permite aprovecharlas en la fabricación de productos fitoterápicos. Las tinturas 1:10 contienen mayor cantidad de ácidos valeré-nicos en los especímenes cultivados (16.42± 16.63 mg%) que en los silvestres (11.45± 9.61 mg%) y mas que la tintura farmacopeica. Este dato, permite ahorrar en el costo al utilizar un extractor más económico y fácil de incorporar en un producto farmacéutico destinado a un fitoterápico. Los datos obtenidos para extracto seco son muy escasos como para establecer alguna comparación pero no cumple con lo establecido por la EF.

Las medias poblacionales de las hojas silvestres en el caso de tinturas fármaco-peicas se encuentra con un IC95% entre 3.88-7.05, mientras que aumenta para las tinturas 1:10 con un IC95% de 2.91-21.23. En el caso de hojas cultivadas la media poblacional de las tinturas farmacopeicas se encuentra entre 100.09-123.16 y en las tinturas 1:10 entre4.23-37.08 mg%, es decir, que las hojas de poblaciones cultivadas poseen mayor probabilidad de cumplir con el porcentaje establecido por la FE. Los especímenes de hojas más promisorios en cuanto al contenido de los ácidos valerénicos son los de Nebaj silvestres y cultivados en FAUSAC, así como las manejadas provenientes de Tutuapa.

El comportamiento de los rizomas, con respecto a este parámetro es diferente al de las hojas; en este caso, las tinturas farmacopeicas (33.69±18.09 mg%) elaboradas de los

67

rizomas cultivados, cumplen con lo establecido por la farmacopea para la especie oficinal. Las tinturas 1:10 (8.74±3.43 mg%) cumplen con el límite que puede asumirse en base a los datos farmacopeicos (7.5 mg%). Esto indica que el manejo y cultivo permite aumentar el contenido de estos metabolitos de interés tanto en las hojas, como en el rizoma.

En el caso de los rizomas silvestres, las tinturas farmacopeicas (8.98±7.04) no cumplen con el límite establecido por EP para la especie oficinal. Se observa el mismocomportamiento que en la hojas, ya que la tintura 1:10 posee un mayor porcentaje de ácidos valerénicos (9.15±5.88) y si cumplen con el límite calculado en base a los datos farmacopeicos (7.5 mg%).

El IC95% de las medias poblacionales de rizomas cultivados en el caso de tinturas farmacopeicas se encuentra entre 11.24-78.62 mg% y para tinturas 1:10 entre 5.13-12.34 mg%. En el caso de tinturas farmacopeicas para rizomas silvestres se encuentre entre 54.26-72.21 mg% y las tinturas 1:10 entre 1.84-16.45 mg%. Estos datos demuestran que las tinturas farmacopeicas cumplen con la cantidad de ácidos valerénicos establecido para la especie oficinal por la EF; sin importar si son rizomas silvestres o cultivados.

Los extractos fluidos de los rizomas silvestres y cultivados no cumplen con lo establecido por la EF para ácidos valerénicos en la especie oficinal. Sin embargo la mayoría de los extractos secos analizados si cumplen con dicho límite, por lo que puede asumirse, que en promedio cumplirían con dicho parámetro, con una amplia dispersión, como han mostrado en el resto de pruebas. En el caso de los rizomas los especímenes promisorios en base a la abundancia de ácidos valerénicos son el material manejado proveniente de Tutuapa y el material cultivado y silvestre proveniente de Choanlá.

III.4.6 Caracterización de los aceites esenciales por CG/EM

Se caracterizaron los aceites esenciales obtenidos por hidrodestilación a través de CG/EM (Figura 23). En el caso del aceite de la hoja de Tutuapa los iones de tolueno no permitieron la observación de los metabolitos de interés y la materia vegetal colectada no fue suficiente para obtener más aceite, por lo que se presenta el resto de información obtenida. En el Cuadro 24 se muestra la composición de los aceites obtenidos, en orden de abundancia, mostrando los porcentajes de los metabolitos de interés. Se excluyen los compuestos con abundancia <0.50%. En base a esta caracterización, puede asegurarse que todos los aceites analizados, poseen los metabolitos de interés farmacológico.

Figura 23. Equipo de CG/EM y pantalla usados para caracterizar los aceites esenciales.

68

Cuadro 23. Caracterización de los aceites esenciales obtenidos en orden de abundancia.

No.Caracterización de aceites volátiles por cromatografía de

gases en orden de abundanciaTiempos de retención de interés

Abundancia total

0

AHP contiene: mono y sesquiterpenos; hidrocarburos acíclicos, monociclicos y biciclicos con predominancia de acetato de bornilo, isovalerato, valerianol, valeranona (0.005-40%), criptofauronol y valerenal. Ácidos valerénico,acetoxivalerénico e hidroxivalerénico son característicos. Derivados oxigenados como alcoholes, aldehídos, centonas, fenoles óxidos y ésteres. Principales compuestos secundarios: isoborneol, borneol, acetato de isobornilo, isovalerato de isobornilo, isovalerato-isoeugenilo, terpinoleno, α-pineno (6.76%), camfeno (16%), β-pineno (6.5%), β-cariofileno, limoneno (1-2%), acetato de carveilo (5%), acetato de dihidrocarveilo (1-2%). WHO, principales componentes acetato de bornilo e isovalerato de bornilo.

1Hm1

β-cariofileno, α-zingibereno, δ-cadineno, α-copaeno, curcumeno, eremofileno, -bisabolol, nerolidol, zingibereno, isoterpinoleno, germacreno-D, β-selineno, α-selineno,farnesol, ester metílico de ácido hexanóico y capróico.

NR

2Hs2

Acido isovalérico (37.12%), ácido3-metilvalérico (34.84%), hexilisovalerato (0.29%); 2,6,10-trimetilneofitadieno; seycheleno, δ-guaieno, α-patchouleno,transcariofileno, inalool; tetradecanal, ácido 1,2-dicarboxilbencenico

Acido isovalérico(5.90), ácido 3-metil-valérico (7.07-7.29), hexilisovalerato (9.56)

72.25

3Hs1

Acido isovalérico (20.48%), ácido 3-metilvalérico (8.22%); 2,6,10-trimetilneofitadieno, ácido1,2-dicarboxilbencénico, espatulenol, heneicosano,14-β-H-pregna, docosano, fitol, tricosano, alcohol patchouli, β-bisaboleno, 1-heneicosano, eicosano, α-patchouleno, seycheleno, β-elemeno, éster metílico de ácido hexanóico, tetracosano, etil-linoleolato, δ-guaieno, α-longipineno, n-dodecanal, miristato de isopropil-tetradecano, n-nonadecano, α-neoisomentol, n-pentacosano, δ-cadineno.

Acido isovalérico (6.17-6.31), Acido 3-metilvalérico (7.22)

28.7

4Hs1

Acido isovalérico (43.02%), acido 3-metilvalérico (19.37%), eicosano, heneicosano, docosano, neofitadieno, β-bisaboleno, ácido 1,2-dicarboxilbencenico, n-nonadecano.

Acido isovalérico (5.69), ácido 3-metil-valérico (6.86)

62.39

6Hs1

Acido isovalérico (56.14%), ácido 3- metilvalérico (30.93%), heptadecano, eicosano, docosano, neofitadieno, pentacosano.

Acido isovalérico(6.11), ácido 3-metil-valérico (7.13-7.71)

87.07

1Rm1

Acido isovalérico (43.10%), ácido 3-metilvalérico (39.20%); trans-cariofileno, seycheleno, 1,7-triciclo-heptano; α-patchouleno, δ-guaieno, trans-α-bergamoteno, acido hexanóico.

Acido isovalérico(5.96-6.21), Acido 3-metilvalérico (6.94-7.32)

82.3

2Rs2

Acido 3-metilvalérico (54.91%), ácido isovalérico (37.73%), isovalerato de alilo (1.62%); seycheleno, trans-γ-bisaboleno, trans-β-cariofileno, δ-guaieno.

Acido 3-metilvalérico (7.38), ácido isovalé-rico (6.15), isovalerato de alilo (12.67)

94.26

3Rs1

Acido 3-metilvalérico (41.66%), ácido isovalérico (37.35%), isovalerato de alilo (5.81%); alcohol patchouli, β-bisaboleno, seycheleno, δ-guaieno, α-patchouleno.

Acido 3-metilvalérico (7.31), ácido isovalérico (6.15), isovalerato de alilo (12.68)

84.82

69

4Rs1

Acido 3-metilvalérico (21.26%), ácido isovalérico (20.09%); 2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, glucurónido de morfina, ácido hexadecanoico, dioctilester de ácido hexanedioico, 1-metiletiltetradecanoato, ácido 9-octadecenoico, transcariofi-leno, ácido1,2-dicarboxilbencénico, ácido octadecanoico, ácido 9-hexadecenoico, seycheleno, ácido 2-propenoico, δ-guaieno, α y β-patchouleno,1-octadeceno, 3-hidroxibroma-cepam.

Acido 3-metilvalérico (7.32), Acido isovalérico (6.15-6.20)

41.35

5Rm1

Acido 3-metilvalérico (53.67%), ácido isovalérico (20.14%), ácido valérico (0.35%); farnesol, δ-guaieno, α-patchouleno, trans y β-cariofileno, seycheleno, alcohol patchouli, elemol, δ-cadineno, elemeno, 1,7-tricicloheptano.

Acido 3-metilvalérico (7.07), ácido isovalérico (5.69), ácido valérico (9.30)

74.16

6Rs1

Acido isovalérico (53.07%), ácido 3-metilvalérico (30.85%); trans-β-cariofileno, n-heneicosano, eicosano, α-eudesmol, n-docosano, seycheleno, nonadecano, alcohol patchouli, α-patchouleno, 1,7-tricicloheptano.

Acido isovalérico (6.76), ácido 3-metilvalérico (7.74)

83.92

6Rs2

Ácido isovalérico (38.57%), ácido 3-metilvalérico (23.82%), transcariofileno, seycheleno, α-patchouleno, 1,7-triciclohep-tano, tetradecano, δ-guaieno, pentadecano, n-eicosano, 1-metilpirrolidina.

Ácido isovalérico (5.91), ácido 3-metil-valérico (7.17)

62.39

2Rc3

Acido isovalérico (52.60%), ácido 3-metilvalérico (26.24%); alcohol patchouli, seycheleno, α-patchouleno, δ-guaieno, α-selineno, ácido 1,2-dicarboxilbencenico; allo-aromadendreno,2,6-bis (1,1-dimetiletil)-fenol, acetato de bornilo.

Acido isovalérico (6.89), ácido 3-metilvalérico (7.81)

78.84

1Rm2

Acido isovalérico (41.89%), ácido 3-metilvalérico (28.57%); β-sesquifelandreno, heneicosano, docosano, n-eicosano, seycheleno, tricosano, ácido 3-metil-2-oxovalérico (2.15%), 1,7-tricicloheptano; α-patchouleno, δ-guaieno, ácido α-camfolónico, ácido hexadecanoico, nonacosano, pentacosano.

Acido isovalérico (5.93), ácido 3-metilvalérico(7.20), ácido 3-metil-2-oxo-valérico (13.26)

72.61

Fuente: FODECYT 102-2006. Se excluyeron aquellos compuestos que se encontraban con < 0.50% de abundancia

En el caso de aceites obtenidos de hojas, éstos metabolitos poseen una abundancia de 62.6±24.77%; siendo el aceite de Nebaj (87%) el más promisorio y el de Chajul (28%) el más pobre. Los aceites obtenidos de rizomas poseen una abundancia promedio superior con menor desviación (74.75±15.23%), siendo nuevamente el de mejor perfil cuantitativo Nebaj (92%) y el menos abundante el de Raxquim (41%). Entre los rizomas cultivados existe poca variación entre los resultados obtenidos, pero el espécimen de Tutuapa es el que posee mayor abundancia de metabolitos de interés (82%).

Como puede observarse, en las hojas silvestres el componente mayoritario es el ácido isovalérico, seguido por el ácido 3-metilvalérico. En el caso de los rizomas silvestres existe mayor diversidad, ya que en algunas muestras es más abundante el ácido 3-metilvalérico y se observa la presencia de otros componentes de interés como isovale-rato de alilo y ácido valérico. En el caso de los rizomas cultivados, el ácido isovalérico es el más abundante, seguido del ácido 3-metilvalérico.

En todos los aceites obtenidos por hidrodestilación se identificó la presencia de abundantes sesquiterpenos, hidrocarburos, y compuestos oxigenados (alcoholes, cetonas, aldehídos, etc.). Se han reportado más de 150 compuestos en los aceites obtenidos de la especie (Upton, 1999). La composición general establecida para los aceites de V. prionophylla es similar a la reportada para V. officinalis. Entre los compuestos específicos que poseen en común se pueden mencionar el cariofileno y acetato de bornilo, β-pineno,

70

canfeno, farnesol y β-bisaboleno reportados en varias de las farmacopeas. La presencia de compuestos oxigenados es importante, pues se sospecha que participan en el efecto sedante del aceite esencial (Hendriks, Bos, Allersma, Malingré & Koster, 1981)

El aceite esencial del rizoma de Nebaj es además rico en su composición cualitati-va, ya que posee otros metabolitos de interés como el hexilisovalerato y el isovalerato de alilo; el aceite de Chajul, posee este compuesto en un porcentaje más elevado. El aceite del rizoma cultivado en ATI posee ácido valérico, mientras que el cultivado en Vista Hermosa, presenta ácido 3-metil-2-oxovalérico. A simple vista pareciera que el aceite delrizoma de Raxquim posee desventaja frente a los demás, llama la atención la presencia de compuestos como glucurónido de morfina y 3-hidroxibromacepam, moléculas con com-probado efecto relajante muscular, depresor del SNC, hipnótico y sedante. Estas leves diferencias comprueban la riqueza y diversidad en la composición del aceite esencial de valeriana, para el que han sido reportados más de 150 constituyentes (Upton, 1999).

III.4.7 Análisis de los aceites esenciales por microextracción

Con el fin de optimizar los procedimientos analíticos, se adquirió un soporte para microdestilación y análisis por CG. Se extrajeron los compuestos volátiles y semivolátiles (C3-C20, peso molecular de 40-275g) presentes en la droga vegetal por la técnica de microextracción usando una fibra 50/30 μm SPME (Figura 24) para evaluar la potenciali-dad del método, sobre todo cuando se realizan tamizajes extensos, o se cuenta con una escasa cantidad de muestra. Se realizaron pruebas con la droga vegetal más promisoria, particularmente rizoma de Concepción, para establecer las condiciones (temperatura, tiempo de exposición de la fibra a la muestra y de la fibra en el puerto de inyección) en las que se obtiene el mejor perfil cromatográfico (mayor cantidad de compuestos).

Figura 24. Microextracción de la droga vegetal (a) Insumos utilizados, (b) Prueba preliminar sin calor y (c) Exposición de la DV y la fibra al calor.

En los Cuadros 24 y 25 se compara la abundancia de los compuestos en el aceite esencial obtenido por hidrodestilación y los compuestos extraídos con la fibra descrita.

71

Cuadro 24. Compuestos de interés por hidrodestilación y microextracción (hoja).

No. ProcedenciaCondiciones del

ensayoComponentes de

interés

Abundancia total ME

(%)

Abundancia total DEST

(%)

1Hm1Tutuapa. Manejo IV

Droga vegetal (DV) caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 37.95% y ácido 3-metilvalérico 19.50% 57.45

Resultados no válidos por

interferencia con tolueno

4Hs1Raxquim. Silvestre 2006

DV caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto. NR NR 62.39

4Hc3

Raxquim. Cultivada FAUSAC

DV caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 66.81% y ácido 3-metilvalérico 18.74% 85.55 NR

6Hs1Choanlá. Silvestre 2007

DV caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 65.72% y ácido 3-metilvalérico 23.16% 88.88 87.07

6Hc3Choanlá. Cultivada

DV caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 42.15% y ácido 3-metilvalérico 11.60% 53.75 NR

Cuadro 25. Compuestos de interés por hidrodestilación y microextracción (rizoma).

No. Procedencia Condiciones de ensayo Componentes de interés% Total

ME% Total DEST

1Rm1Tutuapa. Manejo IV

DV sin calor, contacto con la fibra durante 5 min y 1 min en el puerto

Ácido isovalérico 4.47%; ácido valérico 3.83% y ácido 3-metilvalérico 1.89% 10.19 NR

1Rm1Tutuapa. Manejo IV

DV caliente a 80°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 27.99% y ácido 3-metilvalérico 20.50% 48.49 NR

1Rm1Tutuapa. Manejo IV

DV caliente a 30°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 47.58%, ácido 3-metilvalérico 15.31% y alilisovalerato 2.17% 62.89 NR

1Rm1Tutuapa. Manejo IV

DV caliente 40°C, fibra expuesta durante 2 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 35.30% y ácido 3-metilvalérico 32.95% 68.25 NR

1Rm1Tutuapa. Manejo IV

DV caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 45.33% y 3-metilvalérico 27.92%. 73.25 82.30

1Rm2Tutuapa. Manejo en VH

DV caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 43.02% y ácido 3-metilvalérico 16.45%. 59.47 72.61

4Rs1Raxquim. Silvestre 2006

DV caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 61.88% y ácido 3-metilvalérico 23.26%. 85.14 41.35

4Rc3

Raxquim,. Cultivada CEDA

DV caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 65.83% y ácido 3-metilvalérico 19.99%. 85.82 NR

6Rs1

Choanlá. Silvestre colectada 2007

DV caliente a 40°C, fibra expuesta durante 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 29.31% y ácido 3-metilvalérico 13.49%. 42.80 83.92

6Rc3Choanla. FAUSAC

DV a 40°C, fibra expuesta 1 min y 1 min en puerto.

Ácido isovalérico 47.92% y ácido 3-metilvalérico 9.98%. 57.90 NR

Fuente: FODECYT 102-2006. ME: Microestracción. DEST: Hidrodestilación NR: No se realizó por carecer de DV.

72

En la penúltima columna de la derecha se observa el porcentaje de abundancia obtenido por microextracción en fase sólida, utilizando la fibra para compuestos volátiles y semivolátiles de los especímenes más promisorios. Fue especialmente útil en los casos en que no se contaba con droga vegetal suficiente para realizar la extracción por hidro-destilación (hoja y rizoma Choanlá, cultivado FAUSAC). Como puede observarse en el cuadro anterior, fue necesario realizar varias pruebas con el rizoma más promisorio, para establecer las condiciones óptimas para la microextracción en fase sólida.

El componente mayoritario de los metabolitos de interés, en los aceites esenciales obtenidos por microextracción, fue el ácido isovalérico. En el caso de las hojas las cantidades obtenidas son comparables entre las técnicas ensayadas. El promedio de abundancia de los metabolitos de interés para las hojas cultivadas fue de 65.58±17.39%. Este dato no pudo obtenerse por hidrodestilación por carecer de droga vegetal suficiente.

En el caso de los rizomas de origen silvestre la abundancia de estableció en 64.07± 30.08, mayor a la obtenida por hidrodestilación; los rizomas cultivados presentaron una abundancia por microextracción de 69.30±13.57 menor a la obtenida por hidrodestilación. Puede asumirse que parte de los compuestos volátiles de interés se pierden durante la hidrodestilación.

Cuadro 26. Composición química de aceites obtenidos por microextracción (>0.5%)

Clave Procedencia Composición según abundancia

Tiempos de retención de

interésAbundancia

total

1Rm1

Tutuapa. Prueba sin calor, fibra expuesta durante 5 min

2,4,6-tri-secbutilfenol; androstano; ác. isovalérico(4.47%); 1-octadecenilmetileter; ác. valérico (3.83%); 6,7-dietil-1,4-metanonaftaleno; camferenona; undecano; biciclocamferenona; pentadecano; hahnfett; ác. 3-metil-valérico (1.89%); bergamoteno; fenol, ác. octanóico, nonilaldehido, 2-metildecano, D-homoandrostano.

ác. isovalérico(5.85-6.42); ác.valérico (6.54) y ác. 3-metil-valérico (7.24-7.47). 10.19

1Rm1

Tutuapa. Fibra expuesta durante 1 min en muestra a 80°C.

ác. isovalérico (27.99%); ác. 3-metilvalérico (20.50%); cis-cariofileno; seychelleno; 5-hidroximetilfurfural; 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil; δ-guaieno; triciclo (2,8)-decan-4-ona; 1,7-triciclo (2,6) heptano; 2-furancarboxi-aldehído; α-patchouleno, alcohol patchouli, undecano, γ-gurjuneno, 7-epi-α-selineno, propil 3-acetilpropa-noato, ác. benzóico, ác. 2-furanil-3-metilbutanóico.

ác. isovalérico(6.08 -7.57) y ác.3-metilvalérico (8.00-8.47). 48.49

1Rm1

Tutuapa. Fibra expuesta durante 1 min en muestra a 30°C.

ác. isovalérico (47.58%); ác. 3-metilvalérico (15.31%); 5-butildihidro-2(3H)-furanona; 2-furancarboxaldehído; undecano; isovalerato de alilo (2.17%); pentadecano; 1-fenoxipropal-2-ol; 3-aromadenedradieno; β-sesquifelan-dreno; ác. benzoico; ác. hexanóico, δ-guaieno, etilciclo-pentenolona; ác. octadecanoico, cis-mentol, Hanfett

ác. isovalérico (6.48); ác. 3-metilvalérico (7.41) e isovalerato de alilo (13.22). 65.06

1Rm1

Tutuapa. Fibra expuesta durante 2 min en muestra a 40°C.

ác. isovalérico (35.3%); ác. 3-metilvalérico (32.95%); cis-cariofileno; seycheleno; 1,7-triciclo (2,6) heptano; α-patchouleno; δ-guaieno; 5-nonanona; triciclo (2,8)-decan-4-ona; α-bergamoteno; alcohol patchouli; β-cube-beno; β-elemeno, viridiflorol, 2-etoxi-1-oxaciclohexano.

ác. isovalérico(6.74 -7.29) y ác.3-metilvalérico (8.16- 8.23). 68.25

1Rm1

Tutuapa. Fibra expuesta durante 1 min en muestra a 40°C.

ác. isovalérico (45.33%); ác. 3-metilvalérico (27.92%); β-bisaboleno; seycheleno; α-patchouleno; δ-guaieno; 1,7-triciclo (2,6) heptano; isovalerato de alilo (1.77%); trans-4-metoxi-3-buten-2-ona; α-bergamoteno; β-elemeno; 7-epi-α-selineno, triciclo (2,8)-decan-4-nona

ác. isovalérico (7.08); ác. 3-metilvalérico (7.97) e isovalerato de alilo (13.22). 75.02

73

1Hm1Tutuapa. Intervida*

ác. isovalérico (37.95%); 1,8-cineol; ác. 3-metilvalérico (19.5%); α-pineno; undecano; trans-cariofileno; aroma-dendreno; seycheleno; dl-limoneno; δ-guaieno; ácido nonanoico; α-patchouleno; isopentanoato de alilo; α-gurjuneno; α-terpiniacetato.

ác. isovalérico(6.66) y ác. 3-metilvalérico (7.58-7.62). 57.45

4Hc3

Raxquim.Cultivada FAUSAC*

ác. isovalérico (66.81%); ác. 3-metilvalérico (18.74%); β-bisaboleno; seycheleno; δ-guaieno; 1-metiletil-1-metil-3-benceno; α-copaeno; n-undecano; ác. nonanoico; 7-epi-α-selineno; ác. octanoico; timol.

ác. isovalérico(6.70) y ác. 3-metilvalérico (7.52). 85.55

6Hs1Choanlá. Silvestre 2007*

ácido isovalérico (65.72%); ác. 3-metilvalérico (23.16%); β-bisaboleno; seycheleno; δ-guaieno; ác.decanoico; undecano; ácido octanoico; α-copaeno.

ác. isovalérico(6.81) y ác. 3-metilvalérico (7.64) 88.88

6Hc3

Choanlá. Cultivada FAUSAC*

ác. isovalérico (42.15%); para-cimeno; ác. 3-metil-valérico (11.60%); γ-terpineno; transcariofileno; α-ter-pineno; mirceno; 1,8-cineol; seycheleno; α-patchouleno; linalool; δ-guaieno; timol; α-felandreno; α-pineno; 1,7-triciclo (2,6) heptano, 2-β-pineno, α-terpinoleno; ác. nonanóico.

ác. isovalérico(6.65) y ác. 3-metilvalérico (7.50). 53.75

4Rs1

Raxquim. Silvestre colectada 2006*

ác. isovalérico (61.88%); ác. 3-metilvalérico (23.26%); β-bisaboleno; seycheleno; 1,7-triciclo (2,6) heptano; α-patchouleno; δ-guaieno; α-copaene; isovalerato de alilo (0.20%); alcohol patchouli.

ác. isovalérico (6.96); ác. 3-metilvalérico (7.75) e isovalerato de alilo (13.21). 85.34

4Rc3

Raxquim. Cultivada FAUSAC*

ác. isovalérico (65.83%); ác. 3-metilvalérico (19.99%); β-bisaboleno; seycheleno; α-patchouleno; δ-guaieno; 1,7-triciclo (2,6) heptano; β-elemeno; ácido nonanoico; undecano; 7-epi-α-selineno; alcohol patchouli.

ác. isovalérico(6.86) y ác. 3-metilvalérico (7.65). 85.82

6Rs1

Choanlá. Silvestre colectada 2007*

ác. isovalérico (29.31%); trans-β-cariofileno; ácido 3-metilvalérico (13.49%); seycheleno; 1,7-triciclo (2,6) heptano; α-patchouleno; α-bergamoteno; δ-guaieno; β-patchouleno; 7-epi-α-selineno; patchouleno.

ác. isovalérico(5.82-6.93) y ác. 3-metilvalérico (7.79). 42.8

6Rc3

Choanlá. Cultivada FAUSAC*

ác. isovalérico (47.92%); β-bisaboleno; ácido 3-metilvalérico (9.98%); seycheleno; α-patchouleno; 1,7-triciclo (2,6) heptano; δ-guaieno; camfeno; β-elemeno; α-bergamoteno; 7-epi-α-selineno; α-pineno.

ác. isovalérico(6.67) y ác. 3-metilvalérico (7.49). 57.9

1Rm2

Tutuapa. Manejo en Vista Hermosa*

ác. isovalérico (43.02%); ác. 3-metilvalérico (16.45%); cis-cariofileno; seycheleno; 1,7-triciclo (2,6) heptano; α-patchouleno; δ-guaieno; α-zingibereno; camfeno; β-elemeno; 7-epi-α-selineno; ácido nonoico; α-pineno.

ácido isovalérico(6.96) y ác. 3-metilvalérico (7.57-7.78). 58.48

8Rc1

Cuchucá. Cultivada FAUSAC*

trans-cariofileno; camfeno; seycheleno; α-patchouleno; δ-guaieno; 1,7-triciclo (2,6) heptano; α-pineno; 2-β-pineno; ácido isovalérico (4.93%); β-elemeno; α-bergamoteno; 7-epi-α-selineno; sabineno; isovalerato de alilo (1.04%); tricicleno, dl-limoneno.

ác. isovalérico (6.33-6.39) e isovalerato de alilo (13.21). 5.97

Fuente: FODECYT 102-2006.

Con base en lo anterior puede afirmarse que la técnica de microextracción en fase sólida acoplada a gases puede ser una alternativa confiable para caracterizar los compuestos volátiles presentes en la droga vegetal de V. prionophylla, cuando se necesite optimizar el tiempo de análisis o la muestra no se suficiente para una hidrodestilación.

74

III.4.8 Estudio de la estabilidad del extracto 1:1

Se estudió la estabilidad del extracto 1:1 del espécimen más promisorio en cuanto al contenido de ácidos valerénicos (Tutuapa). Las condiciones ideales de almacenamiento para el extracto mencionado, es en frasco de vidrio ámbar, bien cerrado y a 5±3°C; por lo que se monitoreará el pH y el contenido de ácidos valerénicos a los 30, 60 y 90 días. Las condiciones de almacenamiento se monitorean todos los días según el Cuadro 27.

Cuadro 27. Condiciones de almacenamiento de muestras para estudio de estabilidad

Codificación Muestra Condiciones de Almacenamiento1A, 1B, 1C Alícuota de extracto 1:1 de

Concepción TutuapaEn refrigeradora a 5±3ºC

2A, 2B, 2C Alícuota de extracto 1:1 de Concepción Tutuapa

25±2°C y 65±5% de humedad relativa, que son las condiciones que exige la normativa centroamericana.

3A, 3B, 3C Alícuota de extracto 1:1 deConcepción Tutuapa

37±2ºC y 60±5% de humedad relativa, que son las otras condiciones extremas a las cuales se está sometiendo.

Fuente: FODECYT 102-2006

En el Cuadro 28 se muestran los contenidos de ácidos valerénicos en mg% durante los 90 días de la evaluación de estabilidad por curvas de calibración; el Cuadro 29 semuestra el promedio de los ácidos valerénicos obtenidos a lo largo de los 90 días de duración del estudio. En la Figura 25 se puede observar la estabilidad acelerada del extracto fluido (1:1).

Cuadro 28. Cuantificación de ácidos valerénicos (mg%) por curvas de calibración.

Condiciones Lote 0 días 30 días 60 días 90 días

5±2°C 1 A 145.83 133.16 153.28 136.181 B 145.83 92.52 131.71 124.281 C 145.83 147.55 127.27 133.93

25±2°C y 65±5 %HR

2 A 145.83 118.63 115.39 96.702 B 145.83 120.11 139.87 107.372 C 145.83 106.63 116.85 66.45

37 ± 2 °C y 75±5 %HR

3 A 145.83 37.01 20.19 03 B 145.83 42.41 19.74 0

3 C 145.83 36.72 27.01 5.213 D 145.83 17.33 22.49 6.01

Fuente: FODECYT 102-2006

Cuadro 29. Promedio de ácidos valerénicos (mg%) por curvas de calibración.

Condiciones 0 días 30 días 60 días 90 días

5±2°C 145.83 124.41 137.42 131.47

25±2°C y 65±5 %HR

145.83 115.12 124.04 90.17

37±2°C y 75±5 %HR

145.83 33.37 22.36 5.62

Fuente: FODECYT 102-2006

75

Figura 25. Estabilidad acelerada del extracto 1:1

Estabilidad 5±2°C

145.83

133.16

153.28

136.18

145.83

92.52

131.71124.28

145.83 147.55

127.27133.93

70.0080.0090.00

100.00110.00120.00130.00140.00150.00160.00170.00

0 30 60 90

tiempo (días)

mg

% 1A

1B

1C

Estabilidad T ambiente (25±2°C)

145.83

118.63 115.39

96.70

145.83

120.11

139.87

107.37

145.83

106.63

116.85

66.45

50.0060.0070.0080.0090.00

100.00110.00120.00130.00140.00150.00160.00

0 30 60 90

tiempo (días)

mg

% 2A

2B

2C

Estabilidad 37±2°C145.83

42.41

19.7436.7227.01

5.21

145.83

17.3322.49

6.02

145.83

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

0 30 60 90

tiempo (días)

mg

% 3A

3B

3c

3D

Comparacion estabilidades en distintas condiciones

145.83

124.41

137.42131.47

145.83

115.12124.04

90.17

145.83

33.3722.36

5.62

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

0 30 60 90

tiempo (días)

mg

%

5°C promedio

25°Cpromedio

37°Cpromedio

Fuente: FODECYT 102-2006

En los cuadros anteriores puede observarse que el extracto 1:1 pierde una cantidad considerable de metabolitos de interés a los 30 días, disminución inversamente propor-cional a la temperatura, como se esperaba. Sin embargo, a los 60 días, se establece un aumento en la concentración de ácidos en los lotes sometidos a 5ºC y a 25ºC y 65±5 %HR. Se revisaron los cálculos y resultados para asegurar la exactitud de los mismos y éste fue el comportamiento observado.

El ácido valerénico se descompone en acetoxivalerénico e hidroxivalerénico; estos se degradaron de forma significativa a los 30 días de iniciado el estudio, mientras la con-centración del ácido valerénico se degrada de manera más sostenida hasta desaparecer a los 90 días. El primer ácido en desaparecer del extracto es el acetoxivalerénico.

El estudio evidenció que a 37ºC y la humedad de 75±5%, ejercen un efecto drástico en la degradación del extracto. Esto concuerda con la bibliografía consultada, en donde se especifica que en V. officinalis algunos metabolitos como los valepotriatos se degradan con la humedad y temperaturas superiores a 40ºC (Upton, 1999).

Al realizar los cálculos propuestos para establecer la fecha de vencimiento de pro-ductos químicos, se concluye que la reacción de degradación es de orden cero; velocidad de reacción independiente de la concentración de los principios activos (Wagner & Pernarowski, 1971), lográndose una estabilidad de 91 días si se almacena a 5±2ºC. Estos resultados de estabilidad acelerada deberán confirmarse con un estudio de estabilidad a

76

largo plazo, con una duración mínima de 12 meses (RTCA, 2005). La fecha de vencimiento se fijará entonces según el tiempo en que el producto llega al 80%. Al finalizar el estudio de estabilidad acelerada, el extracto estudiado aún poseía el 90% de los principios activos.

En el Cuadro 30 se muestran los valores de pH en las pruebas de estabilidad acelerada en 90 días y tres condiciones de temperatura.

Cuadro 30. Valor de pH en las pruebas de estabilidad acelerada

Condiciones Lote 0 días 30 días 60 días 90 días5 ±2°C 1 A 5.14 5.06 5.11

5.084.84

1 B 5.14 4.98 5.08 4.851 C 5.14 4.92 5.09 4.84

25 ±2°C y 65± 5 %HR

2 A 5.14 4.95 5.01 4.782 B 5.14 4.90 5.04 4.732 C 5.14 5.00 5.03 4.77

37 ± 2 °C y 75 ± 5 %HR

3 A 5.11 4.90 4.93 4.783 B 5.11 4.88 4.96 4.763 C 5.11 4.95 4.97 4.763 D 5.11 4.86 4.96 4.77

Fuente: FODECYT 102-2006

Los valores del pH se mantienen constantes a lo largo del estudio en todas las condiciones de almacenamiento; por lo que se infiere que no se ve afectado drásticamente por las diferentes condiciones de almacenamiento. Además no alcanza un valor que afecte la estabilidad de las substancias activas en estudio, que según la literatura se degradan rápidamente en valores de pH menores a 3 (Upton, 1999).

Según los resultados discutidos anteriormente, será necesario indicar en la etiqueta condiciones especiales de almacenamiento en climas cálidos y con elevado % de humedad que descompone rápidamente los metabolitos de interés.

III.5 OBJETIVO 5

Evaluar farmacológicamente los extractos más promisorios para comprobar su actividad en modelos experimentales in vitro e in vivo.

III.5.1 Evaluación de la actividad farmacológica in vitro

Se realizó el tamizaje antimicrobiano in vitro contra bacterias (B. subtilis, E. coli, G. vaginalis, P. aeruginosa, S. typhi, S. aureus), micobacteria (M. smegmatis), levaduras (C. albicans, C. neoformans), hongos filamentosos (A. flavus, A. niger, A. fumigatus) y dermatofitos (M. gypseum, T. rubrum, T. mentagrophyte,) (Figura 26, Cuadro 31), usando metodologías establecidas en el Laboratorio de Bioensayos.

77

Figura 26. Tamizaje in vitro de la actividad antibacteriana y antifúngica

Cuadro 31. Tamizaje antimicrobiano en extractos de V. prionophylla

No. Procedencia Parte A B C D E F G H I J K L M N O1 Ixchiguán Hoja − − − − − − − − − − − − − − −2 Ixchiguán Rizoma − − + − − − − − − − − − − − −3 Nebaj Hoja + − − − − − − − − − − − − − −4 Nebaj Rizoma − − − − − − − − − − − − − − −5 Concepción Tutuapa Hoja − − − − − − − − − − − − − − −6 Concepción Tutuapa Rizoma − − + + − − − − − − − − − − −7 Chajul Hoja − − − − − − − − − − − − − − −8 Chajul Rizoma − − − + − − − − − − − − − − −9 Cerro Raxquin Rizoma − − + + − − − − − − − − − − −10 ATI-Totonicapán Rizoma + − − − − − − − − − − − − − −

A: S. aureus; B: S. typhi; C: M. smegmatis; D: B. subtilis; E: P. aeruginosa; F: C. albicans; G: C. neoformans; H: E. coli; I: G. vaginalis; J: A. fumigatus; K: A. niger; L: A. flavus; M: T. rubrum;N: T. mentagrophytes; O: M. gypseum (+) Actividad positiva a 1mg/mL; (-) Actividad negativa a 1mg/mL

Fuente: FODECYT 102-2006

A los extractos con actividad positiva en las prueba de tamizaje se les determinó su CIM (Figura 27), haciendo diluciones seriadas del extracto en placas cuadriplate y enfrentando a cada uno de los extractos con las bacterias que habían demostrado actividad preliminar (Cuadro 32).

78

Figura 27. CIM de B. subtilis y S. aureus

Cuadro 32. CIM de los extractos con bioactividad en el tamizaje (mg/mL)

Extracto Procedencia A B C1 Ixchiguan Hoja − − −2 Ixchiguan Rizoma − 1 −3 Nebaj Hoja 1 − −4 Nebaj Rizoma − − −5 Concepción Tutuapa Hoja − − −6 Concepción Tutuapa Rizoma − 0.5 0.257 Chapul Hoja − − −8 Chapul Rizoma − − 0.259 Cerro Raxquin Rizoma − 1 0.510 ATI-Totonicapán Rizoma 1 − −

A: Staphylococcus aureus, B: Mycobacterium smegmatis, C: Bacillus subtilis.

Fuente: FODECYT 102-2006

La mejor actividad antibacteriana se obtuvo con el extracto del rizoma de Tutuapa, el cual inhibió B. subtilis (0.25 mg/ml) y M. smegmatis (0.5 mg/ml). Estos hallazgos son bastante modestos, toda vez que las CIM son relativamente altas y contra bacterias de poca significancia clínica.

No se encontró ninguna actividad contra levaduras y hongos filamentosos o dermatofitos. Asi mismo, usando una dosis de 1 mg/mL no se encontró ninguna actividad citotóxica contra nauplios de A. salina ni contra los primeros cuatro estadios de larvas deA. aegypti y A. albimanus.

III.5.2 Evaluación de la actividad farmacológica in vivo

El equipo del profesor Valdir Cechinel Filho y la Dra. Marcia María de Souza del Departamento de Farmacología de UNIVALI, Brasil, realizó la evaluación del extracto seco del rizoma más promisorio (Tutuapa), a través de diversos ensayos farmacológicos en modelos experimentales in vivo usados para la evaluación de la actividad de drogas vegetales sobre el sistema nervioso.

79

III.5.2.1 Evaluación de la coordinación sensomotora (prueba del rotarod).

El parámetro evaluado es el tiempo de permanencia en el aparato. Las sustancias que ejercen actividad depresora inespecífica sobre el SNC disminuyen el tiempo de permanencia en el aparato cuando se comparan con el control negativo. Con el objetivo de evaluar la capacidad depresora del extracto sobre el sistema sensomotor, se selecciona-ron con 24 horas de anticipación aquellos que mostraron la capacidad para permanecer en el rotarod (barra de 2.5 cm de diámetro, subdividida en seis compartimientos a 25 cm de altura) a 22 rpm, durante al menos, dos períodos consecutivos de 1 min (Figura 28). A cada uno de estos grupos se les administró el extracto, PO en dosis de 50, 100 y 150 mg/kg. El fármaco de referencia fue diazepam en dosis 2.0 mg/kg para el grupo control positivo y al grupo control negativo se le administró el vehículo (DMSO 2%). Al transcurrir 60 min de la administración se sometió a cada animal a la prueba en el rotarod.

Figura 28. Aparato rotarod para evaluar coordinación sensomotora

Como se observa en la Figura 29, el extracto de V. prionophylla no afecta la coordinación sensomotora de los animales según la prueba del rotarod. Se observa claramente la diferencia, entre el efecto del diazepam, con comprobada actividad depresora de la coordinación sensomotora y el extracto analizado. Este resultado es bastante positivo una vez que se observe la misma tendencia en los demás modelos de comportamiento utilizados. Cualquier alte-ración en la coordinación sensomotora en los otros modelos, puede comprometer los resultados obtenidos.

Estos resultados no concuerdan con los reportados para V. officinalis, ya que el extracto de rizoma muestra disminución en la coordinación sensomotora en este modelo (Upton, 1999). Sin embargo son consistentes con estudios recientes, en donde no se ha evidenciado dicha actividad utilizando el mismo modelo (Hattesohl et al., 2008).

Figura 29. Tiempo de permanencia en segundos

Controle 50 100 150 DZP0

30

60

ValerianaVeículo

***

Diazepam

Performance Motora- Teste do Rota rod

Tratamento (mg/Kg, v.o)

Tem

po

de

per

man

ênci

a (s

)P

erfo

rman

ce M

oto

ra

80

III.5.2.2 Evaluación de la actividad sedante (Prueba del campo abierto)

El parámetro evaluado son los cruzamientos, actividad exploratoria, bolo fecal y autolimpeza del ratón al administrar 50, 100 y 150 mg/kg, comparado contra control y vehículo (Figura 30).

Figura 30. Aparato de campo abierto y resultados de la actividad sedante

6´

30´

Grupos de animais (tratamento)

Extrato( 50, 100 y 150 mg/Kg),

Controle Negativo

Open

81

Ninguna de las dosis administradas produjo un efecto sedante significativo en ninguno de los parámetros evaluados comparado con el control, lo cual concuerda con los resultados obtenidos recientemente para V. officinalis por Hattesohl et al. (2008). Aunque si puede sospecharse cierta actividad antiespasmódica, por la disminución de bolos fecales en dosis de 50 y 100 mg/Kg; lo cual concuerda con lo reportado en las farmacopeas para la especie oficial.

III.5.2.3 Evaluación de ansiedad y actividad hipnótica (Prueba de inducción del sueño)

El extracto se administró a tres grupos de ratones en dosis de 50, 100 y 150 mg/kg; se administró lorazepam (0.75 mg/kg) al grupo control positivo y vehículo (DMSO 2%) al grupo control negativo. A los 60 min, se administró a todos los grupos, pentobarbital (50 mg/kg). Inmediatamente después de la administración del barbitúrico, los animales fueron observados para cronometrar el tiempo de latencia de sueño y el tiempo total de sueño. Se considera que el animal ha finalizado el período de sueño cuando recupera el reflejo postural (Figura 31).

Figura 31. Aparatos para actividad ansiolítica e hipnótica y resultados de latencia de sueño y tiempo total de sueño

Latência para o Sono - Indução do Sono por barbitúricos

controle 50 100 150 LOR0

200

400

600

800

1000

1200

ControleValeriana prionophylaLorazepam

Tratamento (mg/Kg, v.o.)

****

****

A

Lat

ênci

a p

ara

son

o (

s)

Latência para o Sono - Indução do Sono por barbitúricos

controle 50 100 150 LOR0

600

1200

1800

2400

3000

3600

Controle

Valeriana prionophyla

Lorazepam

Tratamento (mg/Kg, v.o.)

** **** **B

Tem

po

de

So

no

(s)

82

Con relación al efecto sobre el sueño (actividad hipnótica), se observa que el extracto promueve de forma significativa y dosis-dependiente la disminución del tiempo de latencia del sueño, aunque el tiempo total de sueño fue igual para todas las dosis administradas. Los efectos del extracto en el modelo de inducción del sueño, son semejantes a los obtenidos lorazepam, que se utiliza en el tratamiento del insomnio. Por lo que se puede inferir que posee efecto favorable en la disminución de tiempo de latencia y en la duración total del sueño. Esto concuerda con la actividad reportada para la especie oficinal, que provoca disminución en el tiempo de latencia del sueño en estudios in vivo. En individuos sanos tiene el mismo efecto, aumentando además la calidad del sueño; pero no tiene efecto sobre el tiempo total de sueño, el número de despertares o los movimien-tos normales del sueño (Upton, 1999; European Pharmacopoeia, 2001).

Con respecto a la actividad ansiolítica, el extracto mostró actividad en todos los parámetros estudiados, con diferencia significativa solamente en dosis de 150 mg/Kg. El comportamiento del extracto se asemeja al mostrado por el diazepam que posee efectos ansiolíticos comprobados. Estos resultados concuerdan con los reportados para la especie oficinal en las farmacopeas consultadas. Estudios recientes, también evidencian que el extracto de la especie oficinal a dosis de 100 mg/Kg presentan un elevado efecto ansiolítico que no se incrementa al incrementar la dosis (Hattesohl et al., 2008) y se cree que los flavonoides como la 6-metilapigenina son los responsables de dicha actividad por su afinidad al receptor (Marder et al., 2003).

III.5.2.4 Evaluación de la actividad antidepresiva (Prueba del nado forzado).

El extracto fue administrado PO a tres grupos de ratones albinos macho de 24-28 g de peso; en dosis de 50, 100 y 50 mg/kg. El grupo control positivo recibió imipramina en (5 mg/kg) y al grupo control negativo se le administró el vehículo (DMSO 2%), vía IP. 60 min después de la administración de las sustancias en estudio, cada animal es forzado a nadar en un tanque con agua a 24-26ºC (Figura 32). La duración de la inmovilidad total se mide durante los últimos 4 min de una única sesión de 6 min. Se consideró que un ratón está inmóvil cuando no hace movimientos con la intención de escapar; únicamente los movimientos necesarios para mantener su cabeza sobre el agua. Las drogas con efecto antidepresivo disminuyen el tiempo de inmovilidad comparados con el control negativo (Sánchez-Mateo et al., 2005).

Figura 32. Tanque para nado forzado

83

Figura 33. Resultados de (a) Tiempo de agitación y (b) Tiempo de inmovilidad.

El extracto de rizoma de V. prionophylla de Tutuapa, produjo un efecto antidepresivo evidenciado por dos parámetros de comportamiento observados en la prueba del nado forzado: aumento del tiempo de la agitación de los animales, como se observa en la Figura 33A, y disminución del tiempo de inmovilidad de los mismos en la segunda fase del experimento, como se observa en la Figura 33B. Como puede apreciarse, el extracto produce estos efectos en forma dosis-dependiente y estadísticamente significativa. Estos resultados también concuerdan con lo especificado en la literatura para la especie oficinal (Upton, 1999).

Se efectuó una prueba con la finalidad de dilucidar el mecanismo de acción de la actividad antidepresiva, presentada por el extracto en esta prueba. Se sospecha que puede estar actuando por la vía de antagonismo en los receptores de la dopamina. Se administró a los animales haloperidol como fármaco de referencia, ya que es un antagonista dopaminergico no selectivo; pero el extracto no mostró actividad antidepresiva de forma estadísticamente significativa.

III.5.2.5 Evaluación del efecto sobre la consolidación de la memoria en ratas (Prueba de inhibición de la evasión)

Evalua la inhibición de la evasión en el comportamiento explorador natural de un animal. Los sujetos en estudio son entrenados en el aparato que dispara electrochoques de 0.1 mA en cierta sección, se cronometra el tiempo que tardan en llegar a esta sección. Luego se les administra el extracto PO en dosis de (50, 100 y 150 mg/Kg); el grupo control negativo recibió (DMSO 2%) y el control positivo (diazepam 0.75 mg/Kg IP y galantamina). Los animales son sometidos al mismo aparato 24 horas después; pero sin descargas eléctricas, también se cronometra el tiempo que tarda en llegar a la sección de las descargas (Figura 34). La diferencia entre el tiempo en bajar para la prueba y en el entrenamiento se considera el índice de retención de memoria. se repite el entrenamiento, pero sin electrochoques.

Tempo de Agitação- Teste do Nado Forçado

C 50 100 150 Imi0

25

50

75

100

125

Controle

Valeriana prionophyla

Imipramina

Tratamento (mg/Kg, v.o.)

****

**

***A

Te

mp

o d

e A

git

açã

o (

s)Tempo de Imobilidade- Teste do Nado forçado

C 50 100 150 Imi0

25

50

75

100

125

ControleValeriana prionophylaImipramina

Tratamento (mg/Kg, v.o.)

**

****

**

B

Tem

po

de

Imo

bili

dad

e (s

)

84

Figura 34. Aparato para medir la inhibición de la evasión

Figura 35. Efecto de diazepam y V. prionophylla sobre la consolidación de la memoria

Como puede observarse en la Figura 35, el extracto posee un efecto amnésico parecido al del diazepam, es decir que dismiunye el tiempo que la rata permaneció en la plataforma libre de descargas, en comparación con el entrenamiento graficado en negro, con un valor p<0.05 obtenido por ANOVA, seguido de Kruskal-Wallis entre los resultados del entrenamiento y de la prueba Mann-Whitney entre los dife-rentes grupos. La dosis de 100 mg/Kg posee un efecto muy similar al fármaco de referencia utilizado en la prueba, en donde el efecto amnésico es más pronunciado.

En estudios desarrollados en humanos, la especie oficinal ha reportado mejorar la concentración en pruebas escritas (Upton, 1999) y no ha mostrado efecto significativo en la memoria de búsqueda y la memoria matemática (Kennedy, Little, Haskell & Scholey,2006); por lo que podría sospecharse que este efecto amnésico no sea extrapolable a los humanos, pero no puede asegurarse hasta realizar los estudios clínicos necesarios. Además, por el tipo de ensayo realizado se asume que inhibe la memoria aversiva.

85

III.5.2.6 Evaluación de la actividad anticonvulsivante (Modelo de convulsión inducida por pentilenotetrazol o estricnina).

El extracto se administró PO, a tres grupos de ratas albinas Wistar de 150-200 g y ambos sexos, en dosis de 50, 100 y 150 mg/kg. El grupo control negativo recibió vehículo (DMSO 2%) PO y se utilizó fenobarbital (100 mg/kg) como fármaco de referencia en el grupo control positivo (Figura 36). Después de 60 min de la administración del extracto y fármaco se administra PTZ, en dosis de 100 mg/kg para inducir la convulsión. Después de administrar PTZ, cada animal es observado en la hora siguiente para determinar el tiempo de latencia, es decir el tiempo que tarda en iniciar la primera crisis convulsiva, se establece el tipo de crisis y el número de las mismas.

Figura 36. Modelo anticonvulsivante

Figura 37. Latencia para crisis convulsiva por (A) pentilenotetrazol y (B) estricnina.

Controle 50 100 150 Fen0

400

800

1200

1600

Valeriana prianophilaVeículo

***

Fenobarbital

Atividade anticonvulsivante: Teste da estricnina

Tratamento (mg/Kg, v.o)

Latê

ncia

par

aC

rise

Con

vuls

iva

(s)

En los modelos de convulsiones inducidas por PTZ o estricnina, el extracto no aumentó de forma significativa el tiempo de latencia entre convulsiones. Como se aprecia en la Figura 37, su comportamiento es muy parecido al que presenta el grupo control negativo, el cual recibió únicamente vehículo. A ninguna de las tres dosis evaluadas se observó el efecto anticonvulsivante. Como prueba de validación metodológica se demostró que los resultados obtenidos con fenobarbital demuestran que el trabajo experimental se llevó a cabo de manera correcta, evitando sesgos en los resultados. En estudios con la especie oficial, obtuvieron el mismo resultado, ya que fue capaz de mostrar efecto anticonvulsivante contra la picrotoxina, pero no contra el pentilenotetrazol; lo cual puede estar relacionado con la farmacodinamia del extracto (Upton, 1999).

Controle 50 100 150 Fen0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Valeriana prianophilaVeículo

***

Fenobarbital

Atividade anticonvulsivante: Teste do pentilenotetrazol

Tratamento (mg/Kg, v.o)

Lat

ênci

a p

ara

Cri

se C

on

vuls

iva

(s)

86

III.6 OBJETIVO 6

Elaborar una ficha agrotecnológica y una monografía farmacopéica de la droga vegetal para orientar su producción, estandarización y uso medicinal.

III.6.1 Fichas agrotecnológicaBasados en la propuesta de la AGEXPORT para la información agrotencológica de

especies con posibilidades de desarrollo agrícola y mercado potencial, se preparó una Ficha Agrotecnológica de V. prionophylla (Anexo 1), que se presentó a un grupo de unos 60 agricultores en el Encuentro de Diversificación Agrícola en San Marcos.

Este documento será muy útil para campesinos que deseen iniciar la propagación y cultivo de V. prionophylla, aunque algunos datos tendrán que adaptarse a las condiciones particulares de cada lugar.

III.6.2 Monografías farmacopeicasUsando la información encontrada en la literatura nacional e internacional,

principalmente sobre V. officinalis y la información generada en este proyecto sobre V. prionophylla se prepararon sendas monografías de las especies de interés, usando como modelo el esquema propuesto por ESCOP y usado previamente por nuestro equipo para elaborar monografías farmacopeicas de especies nativas con fondos de la OEA (Cáceres et al., 2006). En el Anexo 2 se presenta la monografía de V. officinalis elaborada según los datos de la literatura internacional y el Anexo 3 muestra la monografía de V. prioophyllaelaborada en base a los escasos datos de la literatura internacional, pero con un fuerte componente de los datos generados en este proyecto.

III.6.3 Capacitación y socializaciónSi bien no era un objetivo específico, se considera muy importante la capacitación y

difusión de la información generada con diferentes sectores.

La ejecución del proyecto permitió apoyar a un grupo de 5 tesistas de la Maestría Multidisciplinaria en Producción y Uso de Plantas Medicinales (MUPLAM) de la Escuela de Posgrado de la Facultad de CCQQ y Farmacia, con quienes se realizaron ensayos preliminares de evaluación de la concentración o de la actividad de dos de las colectas que estábamos estudiando. Los estudios versaron sobre: a) rendimiento y caracterización por TLC del aceite esencial de hoja y raíz (Piedrasanta, 2007) y análisis por HPLC de acidos valerénicos (Garrido, 2007) y por espectrofotomería UV-Vis de los niveles de isovaltrato en extractos (Riquett, 2007) de hoja y raíz de de Raxquim y Tutuapa; b) Tamizaje antibacteriano in vitro de tres extractos etanólicos de tres localidades (Tutuapa, Nebaj, Raxquim) (Can, 2007); y, c) Ensayo clínico de una tintura farmacopeica (1:5) en 40 pacientes con ansiedad que estaban en tratamiento por cáncer de mama en el Instituto de Cancerología (Quiñonez, 2007). Varios de estos resultados se integraron a la monografía farmacopéica que se estaba elaborando.

Los resultados del proyecto se presentarán en una Mesa Redonda el próximo 20 de mayo en el III Curso Internacional de Fitoterapia a realizarse en el Iglú de la Ciudad Universitaria zona 12. En vista de los resultados interesante, xiste el compromiso con UNIVALI de terminar los análisis fitoquímicos y farmacológicos para su publicación en una revista internacional.

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PARTE IV.

IV.1 CONCLUSIONES

1. El material vegetal obtenido de valeriana proviene de dos fuentes. La silvestre de varias localidades del occidente en donde aun hay poblaciones silvestres de V. prionopylla, que han subsistido por el poco acceso a los lugares y porque son los pobladores locales que conocen su utilización. La segunda cultivada por algunos grupos organizados que han empezado a cultivar esta especie, pero sin ninguna tecnología que les asegure una adecuada producción.

2. La fenología de las poblaciones silvestres está asociada a la época lluviosa, se nota que la planta sobrevive de un año a otro a partir de su sistema radical profundo y grueso. La floración es de julio a agosto y la producción de semillas de agosto a septiembre.

3. La obtención de la semilla es un proceso que debe estudiarse a mayor profundidad dado que presenta varias dificultades. De este estudio se puede indicar que la obtención debe ser en el mes de septiembre procurando seleccionar en el campo aquellas semillas maduras. La producción de semilla bajo las condiciones del valle de Guatemala no fue posible, si se producen inflorescencias pero no semilla optima.

4. La propagación de la valeriana se puede llevar a cabo vegetativamente y por semilla. En el primer caso por medio de plantas madre haciendo una separación de hijuelos. En el segundo caso por semilla que debe propagarse en el corto tiempo después de obtenida.

5. La cosecha debe realizarse por medio del corte de hojas y luego extracción de raíces, lavarse y picarse raíces para su secado. No se encontró mayor dificultad en este proceso.

6. Los especímenes silvestres y cultivados de V. prionophylla poseen coloraciones y olores parecidos a la especie oficinal en la gama amarillo-café y amarillo-verdoso. No se observaron diferencias , a pesar de tener diferentes grados de madurez y procedencia.

7. Los especimenes estudiados cumplen con los límites fisicoquímicos de cenizastotales, cenizas insolubles en ácido y rendimiento de aceite esencial establecidos por las farmacopeas para el rizoma de la especie oficial. Las condiciones de cultivo aumentaron el rendimiento de aceite esencial en los especimenes cultivados en FAUSAC.

8. El rendimiento del extracto seco de las hojas silvestres y las cultivadas superan al porcentaje obtenido de los rizomas cultivados. Esta diferencia podría deberse a que las plantas cultivadas eran más jóvenes que algunos de los especimenes silvestres.

9. En V. deltoidea el olor es diferente y menos ofensivo que el de V. prionophylla, los valores obtenidos cumplen con los límites fisicoquímicos y aunque no se obtuvo suficien-te rizoma para analizar el aceite, el rendimiento de las hojas es bastante inferior.

10. La caracterización de la droga vegetal permitió establecer la presencia de valepotriatos, flavonoides y ácidos valerénicos. Los flavonoides y ácidos valerénicos son

88

más abundantes en las hojas que en los rizomas. El rizoma de Tutuapa es el más promisorio ya que posee la mayor cantidad de ácidos valerénicos y además posee los tres ácidos valerénicos, característica distintiva de V. officinalis.

11. Se establecieron los parámetros de calidad fisicoquímicos para los extractos y tinturas elaborados con etanol al 50%. Las tinturas 1:5 en etanol al 70% de especimenes silvestres y cultivados cumplieron con los límites de sólidos extraíbles establecidos en las farmacopeas para la especie oficial (>3%). Las tinturas de hoja y raíz de V. deltoideatambién cumplen con estos límites.

12. En el tamizaje fitoquímico por CCF de extractos secos se estableció la presencia de flavonoides y antocianinas, saponinas, principios amargos, aceites volátiles y valepotriatos. En las hojas también se evidenció la presencia de cumarinas, cardenólidos y bufadienólidos. La principal diferencia entre la variabilidad de V.prionophylla y la especie oficinal es la ausencia de alcaloides, presentes en la mayoría de especies del género. Es necesario realizar la CCF en el extracto seco, pues las tinturas no presentaron cardenólidos, saponinas ni valepotriatos en algunos casos. A excepción de la caraterización de aceites volátiles, que debe realizarse en tinturas 1:5 en etanol al 70%, por ser el preparado que mostró mayor cantidad de bandas en las pruebas realizadas.

13. La abundancia de flavonoides fue mayor en los especimenes silvestres, ya que depende de factores como la edad de la planta, condiciones de cultivo, fecha de colecta, etc. La tintura 1:10 en etanol al 50% extrajo la mayor cantidad de flavonoides tanto en especimenes silvestres como en cultivados. La tintura proveniente de hojas es la preparación de elección cuando se desea aprovechar el efecto ansiolítico reportado para estos metabolitos.

14. Las tinturas farmacopeicas de hojas de V. deltoidea evidencian la presencia de flavonoides, principios amargos y valepotriatos, no se observó la presencia de cumarinas; el rizoma contiene flavonoides, cumarinas y principios amargos, no presenta valepotriatos.

15. La abundancia de ácidos valerénicos en las tinturas y extractos estudiados, fue mayor para las hojas y rizomas cultivados, a pesar que eran plantas mucho más jóvenes que las silvestres, lo que indica que el cultivo puede aumentar la cantidad de los mismos. En el caso de las hojas, el etanol al 50% extrajo mayor cantidad de éstos metabolitos; mientras que en los rizomas, la tintura farmacopeica presentó valores superiores, que cumplen con el parámetro farmacopeico establecido para la especie oficinal. Los extractos secos de rizomas son la mejor fuente de estos metabolitos. En base a cantidad de flavonoides y ácidos valerénicos los especimenes más promisorios son los provenientes de Chajul, Raxquim, Choanlá y Tutuapa. Siendo este último el único que posee simultáneamente los tres ácidos valerénicos, característica exclusiva de V. officinalis.

16. La CCF de los aceites esenciales demuestra que todos poseen como denominador común el cariofileno, uno de componentes más reportados en V. officinalis. Se identificó en algunos aceites, tanto de hoja como de rizoma, la presencia de otros compuestos, como el terpineol y el terpineno. El cariofileno mostró en la cromatoplaca dos bandas que pueden ser de utilidad para la identificación de aceites en las especies en estudio.

17. Los metabolitos de interés identificados en los aceites por CG son el ácido isovalérico, el ácido 3-metilvalérico, el isovalerato de alilo y el ácido valérico, formando

89

más del 50% del aceite. No existe diferencia apreciable entre la abundancia de los mismos presente en las hojas silvestres y las cultivadas. Los rizomas cultivados si muestran mayor abundancia de éstos metabolitos con respecto a los silvestres y además contienen otros compuestos como ácido 3-metil-2-oxo valérico, glucurónido de morfina y 3-hidroxybromacepan, llama la atención los últimos compuestos con comprobado efecto relajante, depresor del SNC, hipnótico y sedante. Otros componentes del aceite esencial, reportados para la especie oficinal son: cariofileno, acetato de bornilo, β-pineno, canfeno, farnesol, β-bisaboleno y compuestos oxigenados. Estos últimos se cree que participan en la actividad sedante del aceite esencial. Estas diferencias comprueban la riqueza y diversidad del aceite esencial de V. prionophylla.

18. La caracterización de aceites volátiles por microextracción es una alternativa cuando se cuenta con poca cantidad de muestra, ya que evidencia los componentes mayoritarios casi en la misma proporción que la observada en los aceites y permite seleccionar los especimenes más promisorios para extracción de aceites por hidrodestilación.

19. La estabilidad del extracto 1:1 de rizoma de Tutuapa, es de 90 días según el estudio de estabilidad acelerada, lo que concuerda con los 60 días de estabilidad reportada por las farmacopeas para las preparaciones de la especie oficinal. Es necesario indicar que debe almacenarse bien cerrado y a temperturas de refrigeración. Debe realizarse un estudio de estabilidad a largo plazo, para establecer el tiempo en el que alcanza el 80% de concentración de los principios activos.

20. Se tenían datos preliminares de actividad biocida de los extractos del rizoma sobre microorganismos de importancia médica, pero no se demostró una actividad importante, apenas tres extractos presentaron una moderada actividad contra B. subtilis (CIM 0.25 mg/ml) y S. aureus (0.50 mg/ml). No se demostró actividad contra levaduras, hongos filamentosos, dermatofitos, nauplios de A. salina y larvas de A. aegypti y A. albimanus.

21. Los modelos animales usados demostraron que el extracto de Tutuapa presenta actividad sedante, ansiolítica y antidepresiva, pero no presenta actividad en los modelos para medir actividad anticonvulsivante e hipnótica. La actividad antidepresiva no se lleva a cabo por antagonismo con la dopamina. No mostró actividad anticonvulsiva ni sedante y tampoco provocó disminución en la coordinación sensomotora. El hallazgo de actividad deletérea sobre la consolidación de la memoria aversiva requiere más investigación para saber su verdadero significado en el uso a mediano y largo plazo.

22. Se presenta una primera versión de una monografía farmacopéica de V. prionophylla, que puede ser útil a los sectores productivos y reguladores para sistematizar la producción y uso seguro de esta droga vegetal que tiene suficientes elementos para ser considerada equivalente a V. officinalis, pero con características ecológicas propias.

23. Se ha participado en la formación de recursos humanos y en la difusión de los hallazgos del presente proyecto, para aumentar su impacto e incidir más allá de los resultados directos del proyecto.

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IV.2 RECOMENDACIONES

1. Mantener e incrementar la colección del germoplasma colectado para hacer las selecciones necesarias para el mejoramiento de la especie.

2. Continuar con los estudios de propagación vegetativa y por semilla para incrementar el conocimiento sobre su propagación y aumentar la disponibilidad de plántulas para ensayos agrotécnicos.

3. Ensayar con grupos de campesinos los principales especímenes de interés para documentar sus variables en el escalamiento a nivel comercial y promover el cultivo sustentable, pues se ha demostrado que el cultivo aumenta la cantidad y calidad del aceite esencial obtenido.

4. Considerar la unificación de la droga vegetal (hojas y rizomas) o los extractos para aprovechar integralmente el contenido de la especie, o bien desarrollar diversos productos basados en la composición química y actividad farmacológica de hojas y rizomas.

5. La caracterización de aceites volátiles con los estándares generalmente usados contribuye poco en la identificación de los aceites de valeriana, sugiriéndose el empleo de estándares específicos.

6. Establecer la actividad in vivo de aceites y tinturas 1:5 (etanol 70%) y 1:10 (etanol 70%) de los especimenes más promisorios para proponer un producto fitoterápico sencillo y barato que pudiera aplicarse con seguridad.

7. Continuar los estudios farmacológicos y toxicológicos del extracto seco de los especímenes promisorios para preparar un artículo científico que sea aceptado en una revista internacional indexada.

8. Realizar el estudio de estabilidad a largo plazo para las tinturas 1:10 en etanol al 50% y para las tinturas 1:5 en etanol al 70%, ya que mostraron mayor cantidad de flavonoides y ácidos valerénicos que los extractos secos.

9. Realizar ensayos clínicos en diversas poblaciones para comprobar los hallazgos farmacológicos de los ensayos preclínicos.

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IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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96

IV.4 ANEXOS

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IV.4.1 FICHA TECNICA DE CULTIVO DE Valeriana prionophylla

1. GENERALIDADES DEL CULTIVO:

Origen: Mesoamérica (de México a Costa Rica). En Guatemala se ha descrito en Chimaltenango, Huehuetenango, Quetzaltenango, Quiché, Sacatepéquez, San Marcos, Sololá y Totonicapán.

Descripción botánica: Hierba perenne erecta a menudo bifurcada, tallos de 10-80 cm de alto, los que a su vez se dividen, formando panículas florales compuestas de pequeñas flores amarillo-liláceas. Hojas numerosas, oblongo-linear a espatuladas con los márgenes aserrados, basales o que no tienen pecíolo por lo que parecieran que se encuentran sentadas en la base del tallo. Inflorescencia largamente pedunculada. Frutos en aquenio de 2-3 mm de longitud. Raíces de 12-20 cm de largo y grosor de 4-5 cm, fuertemente olorosas que al secar se hace más intenso (Nash & Dieterle, 1976).

Taxonomía: Famila: ValeraniaceaeGénero: ValerianaEspecie: prionophyllaNombre científico: Valeriana prionophylla Standl.

Usos y propiedades: De acuerdo con los estudios fitoquímicos iníciales y del saber popular, tiene usos y propiedades similares a Valeriana officinalis L. La infusión y tintura de raíz se usan en afecciones nerviosas (ansiedad, epilepsia, histeria, insomnio, nerviosismo, neuralgia), fiebre, broncoespasmo, reumatismo y cardiopatías (Alonso, 1998). La decocción se aplica tópicamente en compresa para contusiones, heridas, llagas, resolver tumores y oftalmías; administrada como enema se usa en afecciones intestinales (Cáceres, 1996; Upton, 1999). Se le atribuye propiedad antibacteriana, anodina, calmante, espasmolítica, hipnótica, hipotensora, relajante, sedante, sudorífica y tranquilizante (Cáceres, 2006).

2. REQUERIMIENTOS CLIMÁTICOS Y DE SUELO:

Temperatura: Temperaturas promedio de 12-18°C, soporta heladas.

Riego: No se tiene información, sin embargo en los experimentos se ha notado que con riego se puede tener follaje durante todo el año, lo que puede permitir aprovechar como materia medica el follaje.

Altitud: 2,000-3,000 msnm

Luminosidad: Crece a pleno solo, en las condiciones de ambientes nubosos.

Viento: Hasta 10 kmh. La presencia de vientos ayuda a la dispersión de semillas, las plantas no son del todo afectadas por su habito en roseta.

Humedad relativa: 40-50% en época seca y 85% o más en época lluviosa.

Suelos: Franco arenosos, sueltos. Bajo cultivo se ha notado que responde bien a una mezcla de 1:1:1 de suelo franco, materia orgánica y arena blanca.

pH: No se tiene información

Materia orgánica: En condiciones silvestres crece en suelos ricos en materia orgánica. Bajo cultivo se ha notado una buena respuesta a la aplicación de broza.

3. VARIEDADES QUE SE PRODUCEN EN GUATEMALA:

No se tienen generadas variedades.

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4. ESTABLECIMIENTO Y MANEJO DE LA PLANTACIÓN:

Propagación:

- Asexual: La planta produce hijuelos, los cuales pueden separarse de la planta madre por medio de cortes con herramientas debidamente desinfectadas. Cada planta madre de dos años puede producir hasta 20 hijuelos, sin embargo se ha notado que los mas pequeños tienen bajo porcentaje de pegue. Antes de trasplantarlos se les debe aplicar un enraizador. El porcentaje de pegue obtenido en ensayos a la fecha es de 50-60%.

- Sexual: La planta fructifican entre agosto y septiembre, produce infrutescencias con abundante cantidad de semillas pequeñas, cada una de 2-3 mm de largo por 1-2 mm de ancho, por estar provistas de vilano, provoca que sean fácilmente separadas de la planta y diseminen por el viento; por ello su recolección se debe hacer en las horas frescas de la mañana con poco viento. Para la cosecha se recomienda tener una bolsa grande que se introduce en la infrutescencia y esta se sacude para que caiga la semilla madura, luego se procura limpiar del vilano, que es una tarea tediosa ya que este se convierte en una especie de algodón que dificulta la separación. La viabilidad de la semilla es, de 2-3 meses, por lo que debe hacerse la siembra lo mas pronto después de la cosecha. Para la reproducción se siembra en un sustrato adecuado (puede utilizarse peat moss), en bandejas o cajas. Las plántulas emergen a los 7-8 días después de la siembra. Son plántulas pequeñas pero con una raíz larga, que deben trasplantarse a bolsas a las 3-4 semanas. En bolsa pueden estar en la época seca y trasplantarlas a inicios de las lluvias.

Preparación del terreno: Realizar un picado profundo de unos 30 cm, si el suelo es sueltorevolver con arena blanca y broza, sino quitar el suelo dejar el espacio vacío y sustituirlo por una mezcla 1:1:1 de suelo franco, broza y arena blanca cernida.

Establecimiento de la plantación: Se siembran las plantas haciendo un agujero con diámetro adecuado al pilón, a una distancia de 0.8 m entre surcos y 0.6 m entre planta, para dejar espacio que permita un crecimiento del sistema de raíces.

Fertilización: No se tiene información generada.

Requerimientos nutricionales: No se tiene información generada.

Riego: En los estudios fitoquímicos preliminares se ha encontrado que es posible utilizar las hojas como droga vegetal. En este caso si se justificaría utilizar riego en época seca para poder obtener una cosecha de hojas.

Poda de formación: No tiene necesidad.

Aporcado: No tiene necesidad.

Tutorado: No tiene necesidad.

Destallado: No tiene necesidad.

Deshojado: Cuando se coseche hojas se puede ir quitando las más maduras.

Aclareo de frutos: No aplica.

Polinización con abejas: No aplica.

Limpias: Es necesario realizar limpias al inicio del cultivo, después sus hojas cubrirán el suelo con lo cual hay un control de malezas.

Plagas: No se le conocen plagas.

Insectos que causan daño: No se le conocen.

Control preventivo de insectos:

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Enfermedades que causan daño: Se ha notado manchas en hojas viejas, haciendo un corte de hojas maduras se puede eliminar este problema.

Control preventivo de enfermedades:

Fitotoxicidades:

Cosecha: Se debe arrancar toda la planta, cortar las hojas por separado, separar hijuelos para resiembra y sacudir la raíz principal.

Clasificación:

Poscosecha: Las raíces se lavan dos veces con agua potable, utilizando cepillos de varios tamaños para eliminar la tierra de exceso, se puede realizar un tercer lavado utilizando agua clorinada a razón de 10 gotas de cloro comercial por galón de agua. Posteriormente las raíces se ponen a escurrir y luego se pican finamente para facilitar el secado. Se ponen en bandejas, en el caso de secador solar, dura de 8-10 días el secado hasta alcanzar un máximo de 10% de humedad.

Calidad: La droga vegetal debe tener un color café claro y el olor característico de valeriana.

Almacenamiento: La materia médica se puede almacenar en bolsas de papel y luego en una bolsa de nylon, en toneles de plástico herméticos.

Rendimientos: Datos preliminares, no se tienen amplias extensiones sembradas.Rendimiento raíz fresca 5,208.33kg/ha (250 g/pl)Relación peso fresco a seco 5:1; rendimiento de raíz seca 1,042 kg/ha

Transporte: No se tienen información.

5. ZONAS Y EPOCAS DE PRODUCCIÓN:

Áreas del altiplano occidental por arriba de los 2,000 msnm. La época de producción de preferencia en la época seca de enero a abril.

6. IMPORTANCIA ECONOMICA Y ASPECTOS DE MERCADO:

Principales mercados: Mercado nacional con laboratorios como Farmaya, Ica.

Países exportadores y competidores: Ninguno.

Ventanas de mercado: Se puede sustituir importaciones de V. officinalis.

Precios promedio: Precio de compra = Q 20-30/kg Precio de venta = Q 80-110/kg

7. COSTO DE PRODUCCIÓN:

No se tiene información.

8. BIBLIOGRAFIA

Alonso JR (1998) Tratado de Fitomedicina. Bases Clínicas y Farmacológicas. Buenos Aires, Isis Ediciones SRL, 1039p.

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Upton R 1999 (Ed.) Valerian Root Valeriana officinalis. Santa Cruz, CA, American Herbal Pharmacopoeia, 26 p.

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IV.4.2 Monografía de Valeriana officinalis L. (Valerianaceae)

1. DENOMINACIÓN, SINÓNIMOS Y EQUIVALENCIAS- Denominación: Raíz de Valeriana- Nombres Vulgares: Raíz de gato.

2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

Hierba perenne, vivaz, rizoma pequeño productor de estolones subterráneos de los que salen múltiples raíces, 1-2 cm de grueso; tallo hueco, acanalado, 70-170 cm de alto (1). Hojas de dos tipos, basales y caulinas, las primeras son pecioladas mientras las segundas son subsésiles; imparipinadas, 11-21 seg-mentos dentados lanceolados, márgenes dentados o enteros (2). Tallo floral solitario, que surge al segundo o tercer año, redondo, estriado, hasta de 15-150 cm de alto (2,3). Flores en umbelas pequeñas, tubulares, irregulares, blancas o rosadas (1,2); la inflorescencia puede ser terminal o axilar y posee una aroma pronunciado (2,3). Frutos en aquenio coronado de un vilano plumoso de 4.5-5 mm. La mayoría de las poblaciones europeas son diploides o tetraploides; pero pueden llegar a ser hasta octaploides, como la británica (2).

3. DATOS AGROTECNOLÓGICOS

3.1 Distribución geográfica y hábitat:

Nativa de Europa y Asia septentrional, naturalizada en el noreste de América, se encuentra en lugares húmedos y umbrosos, de manera silvestre o cultivada en clima templado o de montaña, en bosques hasta de 2,100 msnm (1,2).

3.2 Agricultura:

Se adapta a varios tipos de suelo, preferentemente lugares frescos y húmedos (600-700 mm/año). Se propaga por semilla (1,000 semillas pesan 0.46 g) o división de pies. La semilla tiene poder germinativo de 65% a 20ºC durante 16-20 días en obscuridad. Para pies madres se usan los de más de un año, pueden obtenerse 10-20 plantas cada uno, asegura la multiplicación de genotipos aunque menos abundante. Se trasplantan a 60-80 cm entre surcos y 30-40 cm entre planta, requieren mucho cuidado y humedad, fertilización orgánica y química. Las principales enfermedades son producidas por Septoriosis y Oidium. La planta se corta a los dos años, se extraen los rizomas en otoño, se lavan y secan inmediatamente pero de forma lenta (40-50ºC). Se esperan rendimientos de 12-18 ton/ha de raíces frescas, la pérdida de peso al secarlas es de 65% (1). Estudios recientes aseguran que la adición de metil jasmonato, incrementa la producción de valepotriatos en rizomas injertados de la especie Valerianella locusta (3).

4. DROGAS EMPLEADAS Y USO TRADICIONAL

La infusión y tintura de raíz se usan oralmente para tratar afecciones nerviosas (agotamiento, convulsiones, epilepsia, histeria, insomnio, mareos, nerviosismo, neuralgia, neurastenia); catarro, fiebre, resfrío, reumatismo, infección renal, problemas cardíacos y afecciones digestivas (cólera, cólico, dispepsia, parasitismo) (1,2,4,5). La decocción de raíz se aplica tópicamente en cataplasmas o compresas para curar contusiones, heridas, llagas y raspones, así como resolver tumores y enfermedades de los ojos; administrada como enema se utiliza para tratar afecciones intestinales (1,2,5).

Se le atribuye propiedad antibacteriana, anodino, anticaspa, calmante, carminativa, depurativa, diurética, espasmolítica, estomáquica, expectorante, hepatoprotectora, hipnótica, hipotensora, sedante, sudorífica, tónica, tranquilizante y vulneraria (2,4).

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5. PARA CADA DROGA

5.1 Denominación: Raíz de Valeriana officinalis. Valerianae radix.

5.2 Definición:

La raíz consiste en los órganos subterráneos desecados, enteros o fragmentados de V. officinalisL. s, l, incluyendo el rizoma acompañado por las raíces y los estolones.

5.3 Obtención:

Se cultiva en Europa, Asia y Norte América. El material que se usa medicinalmente en Mesoamérica es importado de Estados Unidos o Europa (1,2). También se utiliza el proveniente de otras especies del género Valeriana, como V. collina Wallr. o V. sambucifolia Mikan son aceptadas como fuentes de materia vegetal por la USP; así como también la especie europea V. repens Host (4,5). Las especies cultivadas o silvestres que se asumen tienen composición química parecida y efectos farmacológicos similares, el género tiene cerca de 200 especies, 12 se han descrito en Guatemala y al menos seis se usan medicinalmente en la región (V. cerapophyllaHBK, V. dondollana Cardn., V. edulis Nutt, V. paniculata Ruis & Pavon, V. scorpioides DC, V. sorbifolia HBK) (1). Actualmente se está caracterizando la V. prionophylla, especie nativa de Guatemala, que según su perfil fitoquímico y propiedades farmacológicas se sugieren cultivar para asegurar el aprovisionamiento nacional.

5.4 Descripción macroscópica y organoléptica:

Cuando está seco, el rizoma completo mide más de 50 mm de largo y 30 mm de diámetro, obcónico a cilíndrico, con una base elongada o comprimida. Presenta un color café-amarillento a café oscuro en el exterior con un tallo circular y cicatrices foliares. El rizoma contiene numerosas raicillas más claras localizadas alrededor de un cordón lignificado. La raíz es longitudinalmente rugosa y mide unos 100 mm de longitud y 1-3 mm de diámetro, casi cilíndrica y de color similar al del rizoma. En corte longitudinal presenta una cavidad central atravesada por un septo. Los estolones son de 20-50 mm de longitud, color amarillo-gris pálido con prominentes nodos separados por internodos longitudinales. Las raicillas, que contienen la mayor parte del aceite esencial se quiebran en fragmentos cortos, blanquecinos o amarillentos en el interior. Aroma: cuando se seca adecuadamente, la raíz posee un olor característico producido por la hidrólisis de los valepotriatos, es por ello que se intensifica con el transcurso del tiempo. Cuando no se seca bien, posee un olor fuerte característico de la hidrólisis enzimática de ésteres de valepotriatos. Sabor: moderadamente dulce y alcanforado, deja un suave sabor amargo y condimentado (2,5).

5.5 Descripción microscópica:

Examinada al microscopio se observan numerosos granos de almidón de unos 20 μm de diámetro, mayormente en grupos de 2-4, con un hilio central, empacados dentro de las células del parénquima cortical, las que presentan paredes ligeramente gruesas. Las esclereidas del rizoma son pequeñas con paredes gruesas, lumen reducido y numerosas hendiduras. Las esclereidas de la base del tallo son más grandes y sus paredes son ligeramente gruesas. La capa pilífera muestra cicatrices de las raíces de los tricomas y en pocas ocasiones se observan tricomas unicelulares adheridos y células alargadas de la hipodermis. Las venaciones reticuladas o con hendiduras laterales, fibras ocasionales, lignificadas y con hendiduras simples. Las células lignificadas del tejido tegumentario del rizoma presentan un contenido granular, los fragmentos de la endodermis muestran paredes sinuosas. No presentan gránulos de oxalato de calcio (2,5).

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Microscopic characteristics of Valeriana officinalis

1. Piliferous layer showing cicatrices and attached root hair.

2. Sclereids from rhizome.

3. Sclereids from base of stem.

4. Parenchyma.

5. Starch grains.

6. Fragment of vessels.

7. Tegumentary tissue showing brown contents.

8. Fibers from stem base.

Tomado de Upton, R. (1999). Valerian Root, Valeriana officinalis.

5.6 Composición:

El rizoma contiene aceite esencial de composición bastante compleja, contiene acetato de bornilo, -cariofileno, α- y β-pineno, veleranona, valeranal, β-ionona, isovalereato de eugenilo, isovalerato de isoeugenilo, alcohol patchouli, valerianol, borneol, camfeno, β-bisaboleno, ledol, ácido isovalérico, terpinoleno, alcaloides (actinidina, valerianita, valerina, catidina); iridoides

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(valepotriatos, didrovaltratos, isovaltratos); colina (3%), metil 2-pirrolil cetona, ácido caféico y clorogénico, β-sitosterol, taninos y gomas. El aceite de corteza de raíz contiene ácido orgánicos (acético, fórmico, valérico); alcaloides (catidina, valerianina); borneol, formato de bornilo, acetato de bornilo, butirato de bornilo, isovalerianato de bornilo, camfeno, pineno. Las flores contienen tocoferol. Las semillas secas contienen proteína (19%) y grasa (30-34%) (1,2,4-6).

En peso seco contiene un total de aminoácidos libres de 33.2 mmol/Kg, constituído por ácido γ-aminobutírico (3.6 mmol/Kg); arginina (15.5 mmol/Kg); glicina (5.7 mmol/Kg); alanita (2.0 mmol/Kg), asparagina (1.4 mmol/Kg) y triptófano (0.4 mmol/Kg). (2)

6 MONOGRAFÍA DE CONTROL DE CALIDAD:

6.1 Definición y límites:

La raíz consiste en los órganos subterráneos desecados, enteros o fragmentados de V. officinalisL. incluyendo el rizoma acompañado por las raíces y los estolones. La droga entera contiene no menos de 5ml/Kg de aceite esencial y la droga cortada no menos de 3 ml/Kg de aceite esencial, en ambos casos calculado respecto a la droga desecada (4). Tampoco debe poseer menos de 0.17% de ácidos sesquiterpenlactónicos, expresados en ácido valerénico (C15H22O2) y calculado respecto a la droga desecada. No menos del 0.10% de ácidos sesquiterpenlactónicos, expresados en ácido valerénico (C15H22O2) y calculado respecto a la droga desecada (2,4-8).

6.2 Identificación

6.2.1 Descripción macroscópica: El rizoma es gris amarillento o gris parduzco claro, es de forma obcónica o cilíndrica, de hasta 50 mm de largo y 30 mm de diámetro; la base es alargada o comprimida, con numerosas raíces que la recubren completamente; el ápice presenta habitualmente una cicatriz cóncava, originada por las partes aéreas; sólo raramente presenta las bases de los tallos. En el corte longitudinal, la medula presenta una cavidad central con tabiques trasversales. Las raíces son numerosas, casi cilíndricas, del mismo color que el rizoma, de 1-3 mm de diámetro, y a veces con más de 100 mm de largo. Presenta pocas raíces secundarias, filiformes y frágiles. La fractura es corta. Los estolones presentan nudos prominentes separados por entrenudos estriados longitudinalmente, de 20-50 mm de largo cada uno, con fractura fibrosa (2,4).

6.2.2 Descripción microscópica: Reducir la droga a polvo. El polvo es de color gris amarillento claro o pardo-grisáceo claro. Examinar al microscopio utilizando disolución de hidrato de cloral R. El polvo presenta células que contienen una resina de color pardo claro o gotitas de aceite esencial; esclereidas rectangulares aisladas, con paredes punteadas, de 5-15 μm de espesor; vasos leñosos reticulados; ocasionalmente fragmentos (1,2,4-7).

6.3 Prueba de la mancha:

Prueba para la autenticación de Valeriana spp publicada en la edición de la farmacopea europea de 1998. Esta prueba es específica para valepotriatos que están presentes en gran cantidad de especies de valeriana y por tanto, no es específico para V. officinalis. Debido a la creciente preocupación de la citotoxicidad de los valepotriatos, este test puede utilizarse para asegurar la ausencia de los mismos. Agregar 5 ml de diclorometano a 0.2 g de rizoma recientemente pulverizado, dejar reposar por 5 min, agitar varias veces y filtrar. Lear el filtro y los sólidos remanentes con 2 ml de diclorometano y agregar los lavados al filtrado. Colectar el filtrado y los lavados en un tubo de ensayo y secarlo por soplado con nitrógeno, sólo por el tiempo necesario para remover el disolvente. Disolver el residuo en 0.2 ml de metanol. Agregar 3 ml de una mezcla 50:50 de ácido acético glacial y HCl a 0.1 ml de metanol. Agitar bien. Si los valepotriatos se encuentran presentes, la solución se tornará de color azul en el transcurso de 15 min (2).

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6.4 Cromatografía de capa fina, utilizando una placa de silica gel.

Disolución problema: Agitar 1.0 g de droga pulverizada con 6.0 ml de metanol R en un matraz de25 ml durante 15 min y filtrar. Lavar el matraz y el filtro con ayuda de un pequeño volumen de metanol hasta obtener 5 ml de filtrado. Evaporar el filtrado hasta 2 ml y añadir 3 ml de una disolución de 100 g/L de KOH R. Agitar dos veces con 5 ml de diclorometano R cada vez. Dejar reposar hasta que se separen las dos fases y eliminar la inferior. Calentar la fase acuosa en un baño de agua a 40ºC durante 10 min. Enfriar y añadir HCl diluido R hasta obtener reacción ácida. Agitar dos veces con 5 ml de diclorometano R cada vez. Reunir las dos fases inferiores obtenidas y filtrar sobre sulfato de sodio anhidro R. Evaporar el filtrado a sequedad. Disolver el residuo con 1.0 ml de diclorometano R (2,4).

Disolución de referencia: Disolver 5 mg de fluoresceína R y 5 mg de rojo Sudán en 20.0 ml de metanol R.

Aplicar separadamente sobre la placa, en bandas, 20 μl de cada disolución. Desarollar hasta una distancia de 10 cm utilizando una mezcla de 0.5 volúmenes de ácido acético glacial R, 35 volúmenes de acetato de etilo R y 65 volúmenes de hexano R. Dejar secar la placa al aire y a continuación examinarla a la luz visible. El cromatograma obtenido con la disolución de referencia presenta en su parte media una banda roja debida al rojo Sudán G y en su parte inferior una banda amarillo verdosa debida a la fluoresceína. Pulverizar la placa con disolución de aldehído anísico R y examinarla a la luz visible mientras se calienta de 100-105º C, durante 5-10 min. El cromatograma obtenido con la disolución problema presenta una banda azul-violeta correspondiente al ácido hidroxivalerénico, aproximada-mente a la misma altura de la banda de la fluoresceína presente en el cromatograma obtenido con la disolución de referencia, y también presenta una banda violeta correspondiente al ácido valerénico, aproximadamente a la misma altura que la banda de rojo Sudán G presente en el cromatograma obtenido con la disolución de referencia. El cromatograma obtenido con la disolución problema presenta en la mitad superior otras manchas de color rosa a violeta, generalmente de menor intensidad (2,4).

6.5 Ensayos

6.5.1 Elementos extraños: No más de 5% de bases de tallos y no más de 2% de otros elementos extraños (4)

6.5.2 Pérdida por desecación: No más del 12.0 % determinada en 1,000 g de droga pulverizada y bien homogenizada, mediante desecación en estufa de 100-105º C durante 2 horas (4,6,7).

6.5.3 Cenizas totales: No más del 12% (4,6,7)

6.5.4 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico: No más del 5% (4,6,7), o no más de 7% (9).

6.6 Valoración

6.6.1 Aceite esencial: Realizar la determinación de aceites esenciales en drogas vegetales. Utilizar 40.0 g de droga recién pulverizada, un matraz redondo de 2000 ml y 500 ml de agua R como líquido de destilación. Introducir 0.5 ml de xileno R en el tubo graduado. Destilar a una velocidad de 3-4 ml/min durante 4 horas. No menos del 0.5% (9). La droga entera contiene no menos de 5 ml/Kg de aceite esencial y la droga cortada no menos de 3 ml/Kg de aceite esencial, en ambos casos calculado respecto a la droga desecada (4). No menos de 4 ml/Kg (7).

6.6.2 Ácidos Sesquiterpénicos. Examinar por cromatografía de líquidos.

Disolución problema: Introducir 1.5 g de droga pulverizada en un matraz de 100 ml de fondo redondo y cuello esmerilado. Añadir 20 ml de metanol anhidro R, mezclar y calentar a reflujo en baño de agua durante 30 min. Dejar enfriar y luego filtrar. Situar el filtro con el residuo en el matraz de fondo redondo de 100 ml. Añadir 20 ml de metanol anhidro R y calentar a reflujo en

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baño de agua durante 15 min. Dejar enfriar y luego filtrar. Reunir los filtrados y completar hasta 50.0 ml con metanol anhidro R, enjuagando el matraz y el filtro.

Disolución de referencia: Preparar la disolución inmediatamente antes del uso, protegida de la luz brillante. Disolver 30 mg de dantrona R en metanol anhidro R y completar hasta 100.0 ml con el mismo disolvente. Diluir con 5.0 ml de esta disolución hasta 50.0 ml con metanol anhidro R.

La cromatografía se puede realizar utilizando: Columna de acero inoxidable de 0.25 m de largo y 4 mm de diámetro interno, rellena de sílica

gel octadecilsililado para cromatografía R (5μm). Como fase móvil a un caudal de 1.5 ml/min. Fase móvil A: mezclar 20 volúmenes de acetonitrilo R y 80 volúmenes de una disolución de

5g/L de ácido fosfórico R. Fase móvil B: Mezclar 80 volúmenes de acetonitrilo R y 20 volúmenes de una disolución de

5g/L de ácido fosfórico R. Detector: Espectrofotómetro ajustado a 220 nm. Inyector de bucle de 20 μl.

Inyectar la solución problema y la disolución de referencia. Cuando los cromatogramas son registrados en la condiciones prescritas, los tiempos de retención relativos a la dantrona son de alrededor de 0.7 para el ácido acetoxivalerénico y 1.2 para el ácido valerénico (Farmacopea Española, 2002).

Calcular el porcentaje de ácido acetoxivalerénico con la ayuda de la fórmula correpondiente (Farmacopea Española, 2002; Farmacopea Británica, 2005; Farmacopea Europea, 2008)

A2 x M1 x 11.51

A1 x M2

Calcular el porcentaje de ácido valerénico usando la expresión (Farmacopea Española, 2002; Farmacopea Británica, 2005; Farmacopea Europea, 2008).

A3 x M1 x 8.09

A1 x M2

Calcular el porcentaje de ambos ácidos utilizando la expresión. (Farmacopea Española, 2002; Farmacopea Británica, 2005; Farmacopea Europea, 2008)

[(A2 x 11.51/A1) + (A3 x 8.09/A1)] x M1

M2

A1 = Area del pico de la dantrona en el cromatograma obtenido con la solución de referencia.

A2 = Area del pico de ácido acetoxivalerénico en el cromatograma de la muestra.

A3 = Area del pico del ácido valerénico en el cromatograma de la muestra.

M1 = Peso de la Dantrona, en gramos, utilizada para preparar la solución de referencia.

M2 = Peso de la droga a ser examinada, en gramos.

7. FICHA TÉCNICA DE SEGURIDAD Y EFICACIA.

7.1 Formas farmacéuticas.

Raíz o rizoma seco; 2-3 g de materia vegetal por taza de infusión oral, 1-5 veces al día, sin rebasar 10 g al día. Tintura (1:5, etanol al 70%), 0.5-1 cucharadita (1-3 mL), una o varias veces al día. Para uso externo; 100g de materia vegetal para baño de inmersión completo (5).

106

7.2 Datos clínicos.

Se utiliza como un sedante medio que promueve el sueño. La droga es también utilizada como una alternativa intermedia o posible sustituto de otros sedantes sintéticos más fuertes, como las benzo-diacepinas, en el tratamiento de estados de excitación nerviosa, ansiedad y transtornos de inducción del sueño. Entre los usos descritos en farmacopeas y sistemas tradicionales de medicina; es de utilidad como espasmolítico del musculo liso gastrointestinal en trastornos de origen nervioso. Asociado con papaverina, belladona y otros espasmolíticos ha mostrado actividad adyuvante es estados espásticos del músculo liso como la colitis espástica (5,9).

7.3 Contraindicaciones.

No utilizarse en personas sensibles a los componentes, ni en embarazo y lactancia

7.4 Advertencias y precauciones especiales.

Carcinogénesis, mutagénesis: Se ha manifestado cierta preocupación por la citotoxicidad de los vale-potriatos. La cual ha sido demostrada in vitro, pero no in vivo, incluso en dosis de 1350 mg/Kg. Algunos de los valepotriatos han demostrado actividad alquilante in vitro. De cualquier manera, éstos compuestos se descomponen rápidamente en la droga almacenada, lo cual disminuye la preocupación al respecto. También debe considerarse que los valepotriatos se absorben pobremente y se metabolizan rápidamente a baldrinales, que tienen mejores efectos sedantes. In vitro, los baldrinales son menos tóxicos que los valepotriatos, pero in vivo son más citotóxicos porque se absorben libremente en el intestino. Se han detectado concentraciones de baldrinales en valores por encima de 0.988 mg/dosis de preparaciones comerciales, cuya concentración de valepotriatos se ha estandarizado, lo cual causa preocupación (5).

Embarazo, efectos teratogénicos: La administración prolongada de valepotriatos no ha producido ningún efecto teratogénico (5). Sin embargo, la seguridad de su uso durante el embarazo no ha sido establecida por lo que no debe ser administrada durante el mismo.

Madres lactantes: La excreción de rizoma de valeriana en la leche materna y sus efectos en el recién nacido, no se ha establecido por lo que no debe administrarse durante este período (5).

Uso pediátrico: No debe utilizarse la materia vegetal ni sus preparados en niños menores de doce años sin supervisión médica (5).

7.5 Interacciones con otros medicamentos.

Posee efecto espasmolítico adyuvante cuando se administra con otras sustancias anti-espasmódicas como la papaverina, belladona, etc. No debe administrase de forma conjunta con otros tranquilizantes o sedantes-hipnóticos (5).

7.6 Efectos sobre la capacidad de conducción.

Puede causar somnolencia, por lo no se recomienda la operación de maquinaria ni conducir un vehículo cuando se encuentre en este estado. Aunque no se han demostrado clínicamente la interacción entre la valeriana y el alcohol, como una medida preventiva no se deben consumir con bebidas alcohólicas o de forma conjunta con otros sedantes (5).

7.7 Efectos adversos.

Se han reportado efectos adversos menores, asociados con el uso crónico de rizoma de valeriana e incluye dolor de cabeza, excitabilidad, ansiedad e insomnio (5).

7.8 Sobredosificación.

Dosis muy elevadas pueden causar bradicardia y arritmias; así como disminución de la motilidad intestinal. La medida de primeros auxilios por sobredosificación que se recomienda es lavado

107

gástrico con carbón activado y sulfato de sodio. Dosis por veinte veces por encima de las recomendadas han reportado síntomas ligeros que se resuelven en un plazo de 24 horas. Cuatro casos de daño hepático han sido asociados con el uso de preparaciones que contienen rizoma de valeriana. De cualquier manera los pacientes estaban tomando una combinación de plantas y esto puede ser la causa de dicho daño (5).

8. REFERENCIAS1. Cáceres, A. (1996). Plantas de Uso Medicinal en Guatemala. Guatemala: Editorial Universitaria, 402p.

(pp.365-368)

2. Upton, R. (1999). Valerian Root, Valeriana officinalis. En C, Petrone (Ed.), American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium (pp.1-25). California: American Herbal Pharmacopoeia

3. Kittipongpatana N.; Davis D.L; Porter J.R. (2002). Methyl jasmonate increases the production of valepotriates by transformed root cultures of Valerianella locusta. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 71:65-75.

4. Farmacopea Española (2002). 2a. edición. Monografías Generales. (pp. 2507-2509)

5. WHO (1999) Radix Valerianae. WHO Monographs on Selected Medicinal Plants. 1, 267-276.

6. British Pharmacopoeia (2005) Valerian. British Pharmacopoeia. (pp 2047-2048).

7. European Pharmacopea (2008). Valerian Root. European Pharmacopoeia (pp. 3173-3176)

8. USP (2006). XXX Edición. Supplemental Information/Dietary Supplements. (pp.726-728)

9. ESCOP Monographs (2003). Valerianae Radix (pp. 539-546). Exeter, England: Thieme, 556 p.

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IV.4.3 Monografía de Valeriana prionophylla Stand. (Valerianaceae)

1. DENOMINACIÓN, SINÓNIMOS Y EQUIVALENCIAS

- Denominación: Raíz de valeriana- Sinónimos: Hierba del gato, raíz del gato

2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

Hierba perenne de numerosas hojas basales, puede formar macollas que le dan una apariencia cespícola, sus hojas presentan nervadura central y algunas veces se dividen en dos, tienen una forma de espátula con bordes crenados. Las dimensiones de sus hojas van de 0.8-28.2 cm de largo y de 0.7-3.0 cm de ancho. Cada planta está formada de 2 a 14 macollas, cada una con 6 a 30 hojas. El tallo es glabro o casi glabro. Presenta una raíz principal pivotante que puede medir hasta 66.0 cm de largo y 3.5 cm de diámetro en su parte media, con olor moderado cuando está fresca. El rizoma moderado a abundante, un poco más claro que la raíz principal con raicillas claras. El eje de la inflorescencia puede estar emergiendo de entre los hijuelos, o en la parte media de cada hijuelo. La inflorescencia posee pedúnculo largo, las numerosas flores dispuestas en un dicasio compuesto, denso o difuso; brácteas lineales; cáliz en el limbo con 9-11 segmentos, corola rotada, 1.5-3mm de largo, de color blanco, rosadas o violeta pálido, glabros, filamentos excertos, anteras aparecen 4- lobadas, estilo excerto; aquenio de 2-3mm de largo, suave o transversalmente rugoso, glabro o piloso, las costillas adaxiales usualmente conspicuas (Datos experimentales) (1-5).

Figura 1. Plantación silvestre de Figura 2. Inflorescencia Figura 3. Raiz y rizoma (5)

3. DATOS AGROTECNOLÓGICOS

3.1 Distribución geográfica y hábitat:

Especie nativa de Guatemala y distribuida en México, Costa Rica y Panamá. Hasta el momento se han encontrado especímenes en toda la zona occidente del país, principalmente en los departamentos de El Quiche, San Marcos, Totonicapán y Chimaltenango. Se ha encontrado en una variedad de alturas que van desde 1,600-3,500 msnm.

Se encuentra distribuida en las zonas montañosas de la zona de vida que corresponde a bosque muy húmedo montano bajo (bmh-MB) que presenta una precipitación promedio de 2,730 mm/año, con biotemperaturas de 12.5-18.6°C. Dentro de su vegetación indicadora se encuentran Cupressus lusitanica, Pinus ayacahuite y Pinus hartwegii. Se desarrolla en las cumbres, con crecimiento de matorrales y regeneraciones de pino.

Puede estar creciendo en sectores donde el pajón es denso o ralo. En ocasiones se observan agrupamientos de plantas de valeriana que parecieran estar formados por plantas individuales, sin embargo, son macollas que se han prolongado desde una misma raíz hospedada en suelo firme, debido a que en la superficie se aloja una abundante capa de materia orgánica en descomposición. La consistencia de las prolongaciones es distinta a la de la raíz (3,4).

109

4. DROGAS EMPLEADAS Y USO TRADICIONAL

Según las encuestas etnobotánicas realizadas, a la infusión y tintura de raíz, se le atribuyen las mismas propiedades que a V. officinalis. Oralmente se utiliza para tratar afecciones del sistema nervioso (agotamiento, convulsiones, epilepsia, histeria, insomnio, mareos, nerviosismo, neuralgia, neurastenia); del sistema respiratorio (catarro y resfrío), fiebre, reumatismo, infección renal, problemas cardíacos y afecciones digestivas (cólera, cólico, dispepsia, parasitismo) (1-7).

5. PARA CADA DROGA

5.1 Denominación: Raíz y hojas de Valeriana prionophylla

5.2 Definición:

La droga incluye fragmentos de raíz, rizoma y estolones, desecados y reducidos a trozos irregulares. Según los resultados obtenidos hasta el momento, la hoja desecada tamizada en mesh #5 de color verde-blancuzco a verde-pardo, también puede utilizarse como materia vegetal (3,4).

5.3 Obtención:

Se desarrolla de manera silvestre en los departamentos occidentales del país, como San Marcos, El Quiché y Totonicapán en donde se utiliza la raíz fresca o seca en decocción o cataplasma (3,4).

5.4 Descripción macroscópica y organoléptica:

La raíz principal pivotante cuando está entera y fresca, puede medir hasta 54.0 cm de largo y 2.6 cm de diámetro en su parte media, con olor moderado y en corte transversal presenta una cavidad central con trabéculas (Fig. 3). La droga vegetal seca presenta trozos de color pardo-amarillento en el exterior y amarillo claro a blanquecino en el medio, de olor característico provenientes de raíz y rizoma. Si el color es muy oscuro indica la degradación de algunos metabolitos de interés por una técnica inadecuada de secado. Las raíces auxiliares cilíndricas y de aproximadamente 0.3 cm de diámetro también pueden estar presentes. Las hojas frescas están divididas a lo largo por una gruesa nervadura central, con forma de espátula y bordes crenados. Sus dimensiones de 0.8-30.0 cm de largo y de 0.7-4.9 cm de ancho. En la droga seca proveniente de las hojas, se observan fragmentos de hojas de diversos tamaños, de color verde-amarillento o blancuzco a verde pardo, polvo amarillento, fragmentos de pedúnculos florales y de nervaduras centrales de las hojas enrolladas sobre sí mismas. El olor es más penetrante y picante en las raíces que en las hojas y se intensifica con la humedad y el transcurso del tiempo (5).

5.5 Descripción microscópica:

Con la técnica de diafanizado en las hojas se observó la venación de tipo reticular, la nervadura central dividida en venas secundarias que se unen y de las que salen venas terciarias y cuaterna-rias. En el haz se observa la epidermis con paredes celulares gruesas de tipo biestratificada, pre-sencia de dos tipos de tricomas, de tipo glandular pluricelular, de cuatro células en la parte globu-lar y una célula en la parte basal (Fig. 4) y de tipo tector unicelular (Fig. 5), con estomas de tipo anomocítico y anisocítico (Figs. 6 y 7). En el envés de la hoja numerosos estomas anisocíticos (Fig. 8), presenta poca cantidad de tricomas glandulares en comparación con el haz. Las células endodérmicas con paredes tangenciales sinuosas (Fig. 9), y las células del parén-quima con numerosas granulaciones en el interior. Con la técnica de disociado se observan estructuras de la raíz primaria, el rizoma y las raicillas secundarias. Se observan células de la epidermis amorfas, casi rectangulares (Fig. 10); células del parénquima casi cuadrangular (Fig. 11), gránulos de almidón de forma redondeada con un hilio o hendidura central (Fig. 12); elementos de los vasos del xilema reticulados y extremos perforados (Fig. 13), elementos cribosos del floema (Fig. 14), fibras xílicas (Fig. 15) y traqueidas en grupos (Fig. 16). En cortes trans-versales se observo: cilindro vascular de tipo poliarca (2, 3 o 4 ramales) en la raíz principal (Fig. 17) y el rizoma con médula central (Fig. 18). Se realizó una plantilla con caracteres particulares (Fig.19) (5).

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Figura 4 Figura 5 Figura 6

Figura 7 Figura 8 Figura 9

Figura 10 Figura 11 Figura 12

Figura 13 Figura 14 Figura 15

Figura 16 Figura 17 Figura 18

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Fig. 19

5.6 Composición:

Se ha determinado la presencia de aceite esencial con un promedio de (0.1±0.15%) para las hojas y de (0.41±0.28%) para los rizomas. Posee una composición compleja que incluye ácido isovalérico, ácido-3-metilvalérico, ácido valérico, isovalerato de alilo, ácido 3-metil-2-oxovalérico, hexili de sesquiterpenos (como α, β y transcariofileno, β-pineno, camfeno acetato de bornilo, farnesol, limoneno y β-bisaboleno); ácidos carboxílicos, hidrocarburos, alcoholes y cetonas, entre otros (3-4). Por CCF se estableció la presencia de flavonoides, antocianinas, saponinas, cumarinas, principios amargos, cardenólidos, bufadie-nólidos y valepotriatos. Algunos estudios anteriores reportan la presencia de alcaloides, en este estudio no se evidenciaron a través de las pruebas de tubo y de la CCF. Los extractos de las hojas presentan aceites esenciales cuyas bandas coinciden con el citronelal; mientras que los aceites volátiles obtenidos de hojas y raíz presentan multitud de bandas, algunas de las cuales coinciden con citronelal y limoneno (3-4).

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Las hojas poseen flavonoides en cantidades aproximadas de 1.12±0.43%, mientras que el rizoma los presenta de manera no cuantificable con los métodos farmacopéicos empleados. En cuanto a los ácidos valerénicos, están presentes tanto en la hoja (0.01±0.01%) como en la raíz (0.02± 0.02%) y únicamente un especimen de los estudiados presentó los tres ácidos característicos de V. officinalis (hidroxivalerénico, acetoxivalerénico y calerénico). En las hojas predomina la presencia de ácido hidroxivalerénico, mientras en la raíz predomina la presencia del ácido acetoxivalerénico (3-4). Investigaciones realizadas por estudiantes del curso de Farmacobotánica supervisados por su catedrática, demuestra que el rizoma y raíz poseen almidón, alcaloides, taninos, suberina, ceras; lignina en la raíz; suberina y ceras en la hoja, como puede apreciarse en los siguientes resultados histoquímicos:

Cuadro 1. Pruebas histoquímicas V. prionophylla.Reactivo Sustancia ergástica Órgano Resultado Tejido

Lugol Almidón Rizoma + ParénquimaRaíz + Parénquima

Sudan IV Suberina, ceras y cutícula

Hoja + EpidermisRizoma + Peridermis

Raíz + PeridermisSulfato férrico Taninos Rizoma + Parénquima

Raíz + ParénquimaDragendorff Alcaloides Rizoma + Parénquima

Raíz + ParénquimaNaranja G Cristaloides en

globoidesHoja - -

Rizoma - -Raíz - -

Floroglucina HCl Lignina Rizoma - -Raíz + Peridermis

Fuente: FOCEDYT 102-2006

6. MONOGRAFÍA DE CONTROL DE CALIDAD:

6.1 Definición y límites:

La materia vegetal consiste en los órganos subterráneos desecados, enteros o fragmentados, incluyendo el rizoma acompañado por las raices y raicillas. Esta materia vegetal no contiene menos de 3ml/Kg de aceite esencial en droga desecada. Tampoco debe poseer menos de 0.02% de ácidos sesquiterpenlactónicos o valerénicos, con respecto a la droga desecada. Cuando se desee aprovechar el efecto ansiolítico y el alargamiento del período de sueño se pueden emplear las hojas desecadas, enteras o fragmentadas, incluyendo el peciolo. Esta materia vegetal no contiene menos del 1.0% de flavonoides en base seca, posee al menos 0.1% de aceite esencial y 0.01% de ácidos valerénicos o sesquiterpenlactónicos (3-4,6-7).

6.2 Identificación

6.2.1 Descripción macroscópica: La raíz principal pivotante cuando está fresca puede medir hasta 66.0 cm de largo y 3.5 cm de diámetro en su parte media, con olor moderado cuando está fresca. Los trozos o fragmentos son de color pardo-amarillento en el exterior y amarillo claro en el medio, de olor característico. Cuando está seco el rizoma es gris amarillento o gris parduzco claro, es de forma obcónica o cilíndrica, puede medir hasta 50 mm de largo y 30 mm de diámetro; la base es alargada o comprimida, con numerosas raíces que la recubren; puede presentar una cicatriz cóncava, originada por las partes aéreas; raramente presenta las bases de los tallos. Las raíces auxiliares cilíndricas y de aproximadamente 0.3 cm de diámetro también pueden estar presentes. En el corte longitudinal, la medula presenta una cavidad central con tabiques trasversales. Las raíces secas son casi cilíndricas, del mismo color que el rizoma, de 1-3 mm de diámetro, y a veces con más de 100 mm de largo. Presenta pocas raíces secundarias, filiformes y

113

frágiles. La fractura es corta. Los estolones presentan nudos prominentes separados por entrenudos estriados longitudinalmente, de 20-50 mm de largo cada uno, con fractura fibrosa. Las hojas son numerosas, basales, divididas a lo largo por una gruesa nervadura central, con forma de espátula y bordes crenados. Sus dimensiones de 0.8-30.0 cm de largo y de 0.7-4.9 cm de ancho. En la droga proveniente de las hojas se observan fragmentos de diversos tamaños de hojas de color verde-amarillento o blancuzco a verde pardo, polvo amarillento, fragmentos de pedúnculos florales y de nervaduras centrales de las hojas enrolladas sobre sí mismas. Es quebradiza y de olor característico (3-6).

6.2.2 Descripción microscópica: Con la técnica de disociado en la hoja se observo; venación de tipo reticular, la vena central dividida en venas secundarias que se unen y de las que salen venas terciarias y cuaternarias. En el haz una epidermis con paredes celulares gruesas de tipo biestratificada, presencia de tricomas de tipo glandular pluricelular de cuatro células en la parte globular y una célula en la parte basal, las células del parénquima en empalizada, con forma alargada y rectangular, con poca cantidad de estomas de tipo anisocítico. En el envés de la hoja numerosos estomas de tipo anomocíticos, presenta poca cantidad de tricomas glandulares en comparación con el haz (5).

Con la técnica de diafanizado se observaron estructuras del rizoma y raíz. En la raíz; células de la epidermis amorfas, aplanas; células del parénquima con forma casi cuadrangular, gránulos de almidón de forma redondeada; elementos traqueales de tipo anular y reticulado. Raíz se observo; cilindro vascular de tipo tetrarca, elementos traqueales de tipo anular y reticulado (5).

6.2.3 Caracteres organolépticos: Se hizo la descripción organoléptica de la materia vegetal. El color se estableció por comparación con una carta de color Comex Colorlife (Cuadro 2).

Cuadro 2. Características organolépticas de los rizomas analizados (17 muestras de 8 procedencias)

Lugar Color Olor Descripción Macroscópica

ChajúlHabano H4-I2, NA41 pág 180

Característico, intenso y picante

Trozos irregulares de rizoma de aproximadamente 1 cm de largo x 0.5 cm de ancho; con restos cilíndricos longitudinales de raices

secundarias.

ChoanláHabano H4-I2, NA41 pág 180

Característico, intenso y picante

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 1.5 cm de largo y diferentes anchos; con restos cilíndricos longitudinales de raices

secundarias.

ChuchucáCartón H4-09, NA42 pág 179

Característico, intenso y picante

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 2.0 cm de largo y 0.6 cm de ancho; restos longitudinales cilíndricos de raices secundarias <

8.5 cm.

JoyabajCartón H4-09, NA42 pág 179

Característico, intenso y picante

Trozos irregulares de rizoma < 2.0 cm de largo y 1.0 cm de ancho; con restos longitudinales cilíndricos de raicillas o raices secundarias.

NebajBellota I4-I2,

AM06 pág 175Característico,

intenso y picante

Trozos irregulares de rizoma de aproximadamente 1cm de largo x 0.5 cm de ancho; con restos cilíndricos longitudinales de raices

secundarias.

PanquixArrachera G4-I4, NA06 pág 215

Característico, intenso y picante

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 1 cm de largo; con restos cilíndricos longitudinales de raices secundarias.

RaxquimOcote H4-I4,

NA41 pág 180Característico,

intenso y picante

Trozos irregulares de rizoma no mayores a 1.5cm de largo y diferentes anchos; con restos cilíndricos longitudinales de raices

secundarias.

TutuapaJabalí I4-O9,

AM07 pág 174Característico,

intenso y picante

Trozos cilíndricos longitudinales, irregulares de rizoma; no mayoresa 1.5 cm de largo; con restos cilíndricos longitudinales de raices

secundarias.

Fuente: FOCEDYT 102-2006

6.2.4 Prueba de la mancha: Prueba para la autenticación de Valeriana spp. según Farmacopea Europea. Esta prueba es específica para valepotriatos que están presentes en gran cantidad de especies de valeriana y por tanto, no es específico para V. officinalis. Por la creciente preocu-

114

pación de la citotoxicidad de los valepotriatos, este test puede utilizarse para asegurar la ausencia de los mismos. Agregar 5 ml de cloruro de metileno a 0.2 g de rizoma recientemente pulverizado, deje reposar por cinco minutos, agite varias veces y filtre. Lavar el filtro y los sólidos remanentes con 2 ml de cloruro de metileno y agregue los lavados al filtrado. Colectar el filtrado y los lavados en un tubo de ensayo y secarlo por soplado con nitrógeno, sólo por el tiempo necesario para remover el solvente. Disolver el residuo en 0.2 ml de metanol. Agregar 3 ml de una mezcla 50:50 de ácido acético glacial y ácido clorhidrico a 0.1 ml de metanol. Agite bien. Si los valepotriatos se encuentran presentes, la solución se tornará de color azul en el transcurso de 15 min (3-4,6).

6.2.5 Perfil cromatográfico en placa de sílica gel 60 F254: Pesar 0.2 g de material vegetal seco y molido, agregar 5 ml de diclorometano y calentar en baño María a 60°C durante 5 min. Agitar, filtrar, lavar el residuo con diclorometano, mezclar y evaporar a sequedad. Al residuo agregar 2 ml de acetato de etilo. Cuando se parte de extracto seco se disuelven 0.1 g del mismo en 1 ml del solvente utilizado en la extracción. Aplicar 10µL de la solución preparada en la cromatoplaca, dejando al menos 0.8 cm entre una y otra aplicación. Dejar secar e introducir en cámara cromatografica previamente saturada. Dejar correr la fase móvil al menos 8 cm. Fase móvil: tolueno:acetato de etilo (75:25); n-hexano:metiletilcetona (80:20)Detección: Ácido clorhidrico y ácido acético, luz UV 254 nm, calentar a 100oC. Zonas azules indican la presencia de valtratos y acevaltratos, zonas cafés indican dihidrovaltratos. Con dinitrofenilhidrazina, luz UV 254nm; zonas verdes gris ó azules; si hay calor excesivo se observan zonas cafés-amarillas (7-9).

7. ENSAYOS

7.1 Características fisicoquímicas de la droga vegetal.

7.1.1 Porcentaje de humedad. Menor de 10%: Tamizar aproximadamente 1g de hojas y distribuir uniformemente sobre platillo de balanza de humedad previamente tarado, secar a 105°C durante 15 min. El porcentaje final no debe ser mayor a 10%.

7.1.2 Cenizas totales. Hoja (7.73±1.96%) Rizomas (7.38±2.45%): Ignicionar crisoles de porce-lana a 675°C durante 2 h un día antes de realizar la prueba, introducir con pinzas en desecadora (silica gel) al menos 30 min. Manipulando con pinza marcar con lápiz cada uno en la base. Determinar el peso inicial de cada crisol en g utilizando balanza analítica. Pesar exactamente 0.5-2 g de materia vegetal tamizada o reducida de tamaño. Quemar sobre estufa, en campana de extracción, hasta que se aprecie la carbonización de la muestra. Ignicionar en mufla a 675°C durante 4 h. Introducir en desecadora al menos 30 min. Determinar exactamente el peso final.

Calcular el porcentaje de cenizas totales aplicando la siguiente fórmula% = (Peso final-peso inicial crisol vacío/ peso droga) x 100.

7.1.3 Cenizas insolubles en ácido. Hoja (0.65±0.51), Rizoma (0.70±0.43)%: Agregar a las cenizas totales 25 ml de HCl 2M y hervir durante 5 min. Filtrar a través de papel resistente al ácido y con la menor cantidad de cenizas insolubles. Lavar el embudo o filtro con agua caliente. Introducir el papel en crisol de porcelana, previamente ignicionado, seco y tarado. Ignicionar durante 2 h a 675°C. Secar en desecadora durante 30 min. Pesar en balanza analítica (8,9).

Calcular el porcentaje de cenizas insolubles en ácido aplicando la siguiente fórmula% = (Peso final-peso inicial crisol vacío/ peso droga) x 100.

7.1.4 Obtención de aceite esencial. Hojas 0.1%, Rizomas (0.41±0.28)%: Pesar 30-50 g de materia vegetal recientemente tamizada (Mesh #5) o reducida de tamaño, llevar a cabo hidrodestilación con neoclevenger durante dos horas y media, utilizando trampa de pentano y posterior evaporación del mismo en campana de extracción. Calcular el porcentaje p/p del aceite obtenido. Guardar en congelación utilizando viales de vidrio bien cerrados e identificados. El Cuadro 3 muestra las características fisicoquímicas de la variabilidad analizada.

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Cuadro 3. Perfil fisicoquímico de la variabilidad analizada (33 muestras de 8 procedencias)

Organo y origen % Cenizas Totales% Cenizas

insolubles en ácido% de Rendimiento

extracto seco% Rendimiento aceite esencial

Identificación de valepotriatos.

Hojas cultivadas 9.43 ± 210 2.45 ± 1.60 36.63 ± 9.59 0.18 ± 0.27 1.89 ±0.33Hojas silvestres 7.39 ± 0.82 0.56 ± 0.61 37.58 ± 5.99 0.10 ± 0.05 2.00 ± 0.00Rizomas cultivados 8.78 ± 2.51 1.23 ± 1.82 30.89 ± 7.30 0.37 ± 0.18 2.36 ± 0.67Rizomas silvestres 6.77 ± 3.40 0.86 ± 0.62 42.64 ± 6.33 0.37 ± 0.27 2.67 ± 0.82

Fuente: FOCEDYT 102-2006

7.1.5 Contenido de isovaltrato en hojas y raíces: En muestras de Tutuapa y Raxquim se realizó una extracción con diclorometano y separación por cromatografía tipo empalme en columna utilizando como fase estacionaria silica gel y como fase móvil tolueno:acetato de etilo 75:25; a las fracciones colectadas se les corrió un barrido en un espectrofotómetro UV-Vis contra un estándar de isovaltrato. Se comprobó la presencia de isovaltrato tanto en hojas como raíces (11)

7.2 Características fisicoquímicas de las tinturas y extractos.

Las tinturas y extractos se preparan por percolación de la raíz o las hojas con etanol al 50%. En el caso de la tintura 1:1 se aparta el 85% de la misma del primer menstruo obtenido de la percolación y el 15% es el resultado de la concentración del resto del menstruo y los lavados posteriores. En el caso del extracto seco, se sigue el mismo procedimiento, con la diferencia de que el 85% que se apartó inicialmente se rotavapora en la última fase de concentración, para evitar la descomposición de metabolitos de interés. En todos los casos se concentran las tinturas y extractos en rotavapor a 45oC y presión reducida.

7.2.1 Determinación de pH. Tintura 1:10 (5.51±0.22), Extracto1:1 (5.18±0.16): Utilizar potenciómetro previamente calibrado con buffer 4.0 y 7.0 y curva de calibración de 95-105%. Trasvasar la muestra a beaker de 50 ml, ajustar la temperatura a 20°C. Introducir el electrodo y anotar valor de pH obtenido.

7.2.2 Determinación de densidad relativa. Tintura 1:10 (0.94±0.01), Extracto 1:1 (1.08±0.03): Establecer el peso del picnómetro vacío a 20°C y el peso del picnómetro con agua desmi-neralizada a 20°C. Llenar el picnómetro con muestra y pesar a 20°C. Calcular la densidad relativa utilizando la siguiente expresión:

Peso picnómetro con muestra a 20oC– Peso picnómetro vacío 20oC.

Peso picnómetro con agua 20oC – Peso picnómetro vacío 20oC .

7.2.3 Determinación de sólidos extraíbles. Tintura 1:10 Hojas (3.2±1.1), Extracto1:1 (27.93± 8.92), Extracto seco (65.93±16.45): Secar cápsulas de porcelana limpias y numeradas por 3 h a105°C. Dejar enfriar sobre silica gel en desecadora. Pesar exactamente utilizando balanza analítica. Pesar 2.0 g o 2.0 ml de extracto o tintura a investigar. Evaporar a sequedad en baño maría y secar por 3 h a 105°C. Enfriar en desecador y pesar exactamente. Calcular el porcentaje p/p o p/v (7-9).

Cuadro 4. Características fisicoquímicas de tinturas y extractos obtenidos (33 muestras de 8 procedencias)Parámetros Hojas Cultivadas Hojas silvestres Rizomas cultivados Rizomas silvestrespH tinturas 1:5 en EtOH 70% 5.83 ± 0.35 5.54 5.92 ± 0.18 5.74 ± 0.35Sólidos extraíbles tinturas 1:5 EtOH 70% 3.31 ± 0.58 4.71 4.73 ± 1.68 5.22Densidad tinturas 1:5 en EtOH 70% 1.026 ± 0.10 0.895 1.037 ± 0.10 0.909pH tinturas 1:10 en EtOH 50% 5.77 ± 0.28 5.61 ± 0.06 5.77 ± 0.26 5.41 ± 0.22Sólidos extraíbles tinturas 1:10 EtOH 50% 2.81 ± 0.32 3.30 ±0.25 2.22 ± 0.64 3.77 ± 0.93Densidad tinturas 1:10 en EtOH 50% 0.985 ± 0.09 0.944 ± 0.00 0.938 ± 0.00 0.980 ± 0.09pH extracto 1:1 en EtOH 50% NR NR 5.11 5.18 ± 0.17Sólidos extraíbles extracto 1:1 EtOH 50% NR NR 30.87 ± 13.32 33.28 ± 4.26Densidad extracto 1:1 EtOH 50% NR NR 1.052 1.084 ± 0.03Sólidos extraíbles extracto seco EtOH 50% 79.70 ± 1.41 60.91 ± 1.41 79.69 ± 10.21 62.88 ± 17.38

Fuente: FOCEDYT 102-2006

116

7.3 Perfil cromatográfico observado en droga vegetal, extractos y tinturas.

Aplicando la metodología estándar para tamizaje fitoquímico de LIPRONAT (8), se analizaron 11 familias químicas, en 5 (alcaloides, antraquinonas, cardenólidos, bufadienólicos y saponinas) no se obtuvo ninguna banda, en los restantes se obtuvieron los siguientes resultados.

Cuadro 5. Perfil cromatográfico de la variabilidad analizada.

Fuente: FOCEDYT 102-2006

7.4 Valoración.

7.4.1 Caracterización de aceites esenciales por cromatografía de gases/espectrometría de masas. En muestra de hojas y raqiz de Tutuapa y Raxquim se extrajo el aceite esencial por hidrodestilación en Neocleavenger, obteniéndose el mejor rendimiento de 0.32% en raíz de Tutuapa; por TLC se demostró la presencia de ácido isovalérico en raíz y hoja de Tutuapa y un rfendimiento menor con presencia mínima de ácido isovalérico en la muestra de Raxquim (12). Aplicando la metodología especificada en el PEO correspondiente, se realizó la caracterización que se muestra en el Cuadro 6.

Lugar Flavonoides Antocianinas Cumarinas Principios Amargos Valepotriatos Ac.Volátiles Tinturas

Estándar

Fluorescencias amarillas y naranjas: rutina: 0.45, 0.83;

hiperósido: 0.69; ác. clorogénico: 0.52.

Cumarinas: 0.56 fluorescencia amarilla; fluorescencia azul ác.

p-cumárico: 0.15; umbeliferona: 0.12.

Neurolaena lobata (Nl): 0.24 violeta; 0.4, azul; 0.68 azul; 0.83 azul; 0.91 violeta

Rizoma de V. officinalis (Vo): 0.46

café; 0.57café.

Terpineno azul y morado; terpineol

azul; cariofileno fucsia y eucaliptol azul.

0

Manchas de color con fluorescencia amarilla, azul

o verde a 365nm con NP/PEG

UV 365 nm fluorescencia azul o verde con solución

etanólica de KOH 5%

Zonas rojas-violetas, café-rojas y azules verdes con reactivo

de Vainillina-H2SO4.

Zonas azules (valtrato, aceval),

zonas cafés (dihidroval) con

HCl-AcOOH glacial

Zonas azules, verdes, rojo- café en visible con anisaldehído-

H2SO4. Estándares: terpineol, cariofileno y

eucaliptol.

TutuapaLig. fluorescencia: 0.51

amarilla ——0.17 violeta; 0.47 azul; 0.91 café

0.15 café; Vo 0.57, 0.72 café 0.10 café; 0.17 fucsia.

NebajLig. fluorescencia: ac.

clorogénico 0.53 amarilla ——

0.5 café rojizo, 0.19 violeta; 0.44 azul; 0.93 café

0.14, 0.5, 0.59, 0.73 café

0.10 café; 0.17 morado; 0.41 morado;

0.76 café.

ChajulLig. fluorescencia: 0.51

amarilla ——0.13 café rojizo; 0.26 violeta; 0.32 azul

0.14 café; Vo 0.57 café

Vo 0.09 café, 0.10 morado; Vo terpineol

0.28 morado; 0.40 fucsia; Vo eucaliptol

0.72 morado; cariofileno 0.89 fucsia.

RaxquimLig. fluorescencia: 0.51

amarilla ——0.125 café; 0.26, 0.30 azul; 0.59, 0.88 café

0.13, 0.49, 0.57 café oscuro, 0.71 café

Vo 0.09 café; 0.19 morado;Vo terpineol

0.27 morado; Vo,eucaliptol 0.72

morado; cariofileno 0.89 fucsia.

Panquix ——Fluorescencia:

cumarina 0.47 amarilla0.18 azul; 0.40, 0.51, 0.62 violeta Vo 0.57 café

0.09 café; 0.19, 0.40 morado; Vo eucaliptol

0.72 morado; Vo terpineno 0.91 fucsia.

ChoanláLig. fluorescencia: 0.51 amarilla; 0.90 amarilla ——

0.17 café; 0.24 azul; 0.28, 0.5 violeta; 0.58 azul; 0.65 café; 0.77 violeta; 0.81, 0.88 café; Nl 0.93 café.

0.15, 0.25, 0.38 café; Vo 0.47 café oscuro; 0.54, 0.73

café; 0.72 café amarillo

0.08, 0.13 café; 0.19 morado; Vo terpineol

0.28, 0.40 morado; Vo, eucaliptol 0.72

morado; cariofileno 0.89 fucsia

JoyabajLigera fluorescencia: 0.52

amarilla ——0.15 café; 0.30 azul; 0.72, 0.90 café

0.48 café; Vo 0.58 café

0.20 fucsia; Vo 0.44 fucsia.

ChuchucáLig. fluorescencia: ac.

clorogénico 0.54 amarilla ——0.15 café; 0.31 azul; 0.71, 0.90 café 0.51, 0.59, 0.74 café

0.19 fucsia; 0.43 fucsia.

117

Cuadro 6. Caracterización de aceites obtenidos de la variabilidad analizada.

Lugar Composición según abundanciaTiempos de Retención de

InterésAbund.

Tot.

Chajul

Acido 3-metilvalérico (41.66%), ácido isovalérico (37.35%), isovalerato de alilo (5.81%), alcohol patchouli, β-bisaboleno, seycheleno, δ-guaieno,α-patchouleno.

Acido 3-metilvalérico (7.31), Acido Isovalérico (6.15) Isovalerato de Alilo (12.68) 84.82

Choanlá

Acido isovalérico (53.07%), ácido 3-metilvalérico (30.85%); trans-β-cariofileno, n-heneicosano, eicosano, α-eudesmol, n-docosano, seycheleno, nonadecano, alcohol patchouli, α-patchouleno, 1,7-tricicloheptano.

Acido Isovalérico (6.76), Acido 3-metilvalérico (7.74) 83.9-62.4

Nebaj

Acido isovalérico (52.60%), ácido 3-metilvalérico (26.24%); alcohol patchouli, seycheleno, α-patchouleno,δ-guaieno, α-selineno, ácido 1,2-dicarboxilbencenico; allo-aromadendreno,2,6-bis(1,1-dimetiletil)-fenol; acetato de bornilo.

Acido Isovalérico (6.89), Acido 3-metilvalérico (7.81) 78.84

Panquix

Acido 3-metilvalérico (53.67%), acido isovalérico (20.14%), ácido valérico (0.35%), farnesol, δ-guaieno, α-patchouleno,trans y β- cariofileno, seycheleno, alcohol patchouli, elemol, δ-cadineno, elemeno, 1,7-tricicloheptano.

Acido 3-metilvalérico (7.07), Acido Isovalérico(5.69), Acido valérico (9.30). 74.16

Raxquim

Acido 3-metilvalérico (21.26%), Ácido isovalérico (20.09%); 2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno; glucurónido de morfina, ácido hexadecanoico, dioctilester de ácido hexanedioico, 1-metiletil-tetradecanoato, ácido 9-octadecenoico, transcariofileno, ácido1,2-dicarboxilbencenico, ácido octadecanoico, ácido 9-hexadecenoico, seycheleno, ácido 2-propenoico, δ-guaieno, α y β-patchouleno,1-octadeceno, 3-hidroxybromacepam.

Acido 3-metilvalérico (7.32), Acido Isovalérico (6.15-6.20) 41.35

Tutuapa

Acido isovalérico (41.89%), ácido 3-metilvalérico (28.57%);β-sesquifelandreno, heneicosano, docosano, n-eicosano, seycheleno, tricosano, ácido 3-metil-2-oxo-valerico (2.15%),1,7-tricicloheptano; α-patchouleno, δ-guaieno, ácido α-camfolonico, ácido hexadecanoico, nonacosano, pentacosano.

Acido Isovalérico (5.93), Acido 3-metilvalérico (7.20), Ácido 3-metil-2-oxo-valerico (13.26) 72.6-94.2

Fuente: FOCEDYT 102-2006

En el caso de aceites obtenidos de hojas, los metabolitos de interés poseen una abundancia de 62.6±24.77; siendo el aceite de Nebaj (87%) el más promisorio y el de Chajúl (28%) el más pobre. Los aceites obtenidos de rizomas poseen una abundancia promedio superior con menor desviación (74.75±15.23), siendo nuevamente el de mejor perfil cuantitativo Nebaj (92%) y el menos abundante el de Raxquim (41%) (3-4).

7.4.2 Cuantificación de flavonoides en droga vegetal, tinturas y extractos por UV-VIS. Según metodología especificada en PEO correspondiente.

Cuadro 7. Porcentajes de flavonoides en extractos y tintura.

Organo y origen

Droga Vegetal mg% como Hiperósido,

según FE

Tintura 1:10 EtOH 50% mg% como rutina según FM

Tintura 1:5 EtOH 70%. mg% como Rutina según FM

Extracto 1:1 EtOH 50% mg% como Rutina según FM

Extracto Seco EtOH 50%. mg% como

Rutina según FMHojas Cultivadas 804.41 ± 442.81 500.67 ± 356.49 374.82 ± 270.87 NR 56.75Hojas silvestres 544.54 ± 363.82 780.47 ± 168.32 685.37 ± 629.03 NR 109.5Rizomas cultivados No Cuantificable 131.32 ± 151.80 25.66 ± 14.41 NR 10.34Rizomas silvestres No Cuantificable 586.9 ± 976.03 66.17 ± 22.15 No cuantificable 20.46 ± 10.55

Fuente: FOCEDYT 102-2006

7.4.3 Cuantificación de ácidos valerénicos en droga vegetal, tinturas y extractos por HPLC: Un estudio preliminar en muestras de Tutuapa y Raxquim demostró que las hojas contienen ácido hidroxivalerénico y que las raíces presentan además ácido valerénico, aunque no se evidenció ácido acetoxivalerénico en hojas ni raíces (13). Según la metodología propuesta en el PEO

118

correspondiente se han obtenido porcentajes de 0.01-0.04, tanto en hojas como en rizomas. En las hojas el ácido hidroxivalerénico es el más frecuente; mientras en el rizoma predomina el acetoxivalerénico. Solamente uno de los especímenes estudiados posee los tres ácidos valerénicos característicos de V. officinalis (3,4). El Cuadro 8 muestra los contenidos en cada unode los órganos y procedencias estudiados.

Cuadro 8. Contenido de ácidos velerénicos en droga vegetal, tinturas y extractos

Organo y origen

Droga Vegetal, sumatoria de ác.

valerénicos identificados

Tintura 1:5 EtOH 70% sumatoria de

ác. valerénicos identificados.

Tintura 1:10 EtOH 50%

sumatoria de ác.valerénicos

identificados

Extracto 1:1 EtOH 50%

sumatoria de ác.valerénicos

identificados.

Extracto seco EtOH 50% sumatoria de ácidos valerénicos

identificados.Hojas Cultivadas 19.47 ± 11.69 11.54 ± 12.42 16.42 ± 16.63 NR 60.76Hojas silvestres 16.50 ± 6.77 5.47 ± 0.64 11.45 ± 9.61 NR 155.25Rizomas cultivados 7.76 ± 13.48 33.69 ± 18.09 8.74 ± 3.43 88.9 311.14Rizomas silvestres 4.80 ± 1.10 8.98 ± 7.04 9.15 ± 5.88 37.82 ±13.50 278.94 ± 293.22

Fuente: FOCEDYT 102-2006

8. FICHA TÉCNICA DE SEGURIDAD Y EFICACIA.

8.1 Formas farmacéuticas.

Por lo datos preliminares podrá utilizarse en forma similar a V. officinalis. Raíz o rizoma seco, 2-3 g de materia vegetal por taza de infusión oral, 1-5 veces al día, sin rebasar 10 g al día. Tintura (1:5, etanol al 70%), 0.5-1 cucharadita (1-3 mL), una o varias veces al día (10).

8.2 Datos clínicos.

Se utiliza como un sedante medio que promueve el sueño y como una alternativa de otros sedantes, como las benzodiacepinas, en el tratamiento de estados de excitación nerviosa, ansiedad y transtornos de inducción del sueño. Entre los usos descritos en farmacopeas y sistemas tradicionales de medicina, es de utilidad como espasmolítico del músculo liso gastrointestinal en trastornos de origen nervioso (10).

8.3 Contraindicaciones.

No utilizarse en personas sensibles a los componentes, ni en embarazo y lactancia

8.4 Advertencias y precauciones especiales.

Carcinogénesis, mutagénesis: Se ha manifestado cierta preocupación por la citotoxicidad de los vale-potriatos, la cual ha sido demostrada in vitro, pero no in vivo, en dosis de 1350 mg/Kg. Algunos de los valepotriatos han demostrado actividad alquilante in vitro. Aunque éstos compuestos se descomponen rápidamente en la droga almacenada, lo cual disminuye la preocupación al respecto. Debe considerarse que los valepotriatos se absorben pobremente y se metabolizan rápidamente a baldrinales, que tienen mejores efectos sedantes. In vitro, los baldrinales son menos tóxicos que los valepotriatos, pero in vivo son más citotóxicos porque se absorben libremente en el intestino (10).

Embarazo, efectos teratogénicos: La administración prolongada de valepotriatos no ha producido ningún efecto teratogénico (10). Sin embargo, la seguridad de su uso durante el embarazo no ha sido establecida por lo que no debe ser administrada durante el mismo.

Madres lactantes: La excreción de rizoma de valeriana en la leche materna y sus efectos en el recién nacido, no se ha establecido por lo que no debe administrarse durante este período (10).

Uso pediátrico: No debe utilizarse la materia vegetal ni sus preparados en niños menores de doce años sin supervisión médica (10).

119

8.5 Interacciones con otros medicamentos.

No debe administrase de forma conjunta con otros tranquilizantes o sedantes-hipnóticos (10).

8.6 Efectos sobre la capacidad de conducción.

Puede causar somnolencia, por lo no se recomienda la operación de maquinaria ni conducir un vehículo cuando se encuentre en este estado. Aunque no se han demostrado clínicamente la interacción entre la valeriana y el alcohol, como una medida preventiva no se deben consumir con bebidas alcohólicas o de forma conjunta con otros sedantes (10).

8.7 Efectos adversos.

Se han reportado efectos adversos menores, asociados con el uso crónico de rizoma e incluye dolor de cabeza, excitabilidad, ansiedad e insomnio (10).

8.8 Sobredosificación.

Dosis muy elevadas pueden causar bradicardia y arritmias; así como disminución de la motilidad intestinal. La medida de primeros auxilios por sobredosificación que se recomienda es lavado gástrico con carbón activado y sulfato de sodio. Dosis veinte veces por encima de las recomendadas han reportado síntomas ligeros que se resuelven en 24 horas (10).

8.9 Datos farmacológicos

8.9.1 Estudios farmacológicos in vitro: El extracto etanólico es antioxidante y vasorelajante (14). Una investigación por estudiantes de Farmacología III de la Escuela de Química Farmacéutica demostró que la infusión de raíz es sedante, lo que fue confirmado por las pruebas de la placa agujereada y de la chimenea (15). El proyecto FODECYT 12-2004, confirmó estos hallazgos en modelos animales, por lo que se propone su desarrollo agrotecnológico y fitofarmacéutico.

8.9.2 Estudios farmacológicos en humanos: En 28 pacientes mayores de 40 años con diagnóstico de insomnio, la administración de la tintura 1:5 fue más efectiva que la técnica de relajación en disminuir la etapa de latencia del sueño, el número de veces que las personas despertaron y mejora la calidad del sueño (6). En 40 pacientes con cáncer de la mama que acuden a tratamiento de quimioterapia, en los que se demostró ansiedad por la prueba de Hamilton, se administró aleatoriamente a la mitad tintura de V. prionophylla 1:5 y a la mitad un placebo de extracto de maíz; la tintura redujo la ansiedad a valores normales en todeas las pacientes, superando significativamente el efecto placebo (16).

8.9.3 Datos de seguridad prclínica (Toxicología): La administración oral a ratones del elixir de una mezcla vegetal que incluye V. prionophylla no mostró signos de toxicidad a 1,200 mg/kg durante 8 días (DL50 >1,200 mg/kg) (15). En 28 pacientes con insomnio que tomaron tintura 1:5 no se observaron efectos secundarios (6), ni en 20 pacientes con cáncer de mama que presentaban ansiedad que lo consumieron por 40 días (16).

8. REFERENCIAS1. Cáceres, A. (1999). Plantas de Uso Medicinal en Guatemala. Guatemala: Ed.itorial Universitaria,

402p. (pp. 365-368).

2. Cáceres, A. (2006). Vademecum Nacional de Plantas Medicinales. Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social (MSPAS), Universidad de San Carlos de Guatemala, Agencia Sueca de Cooperación Internacional para el Desarrollo a través de la Organización Panamericana de la Salud. 262 p. (pp.217-218)

3. Cuadernos de análisis de laboratorio, proyecto FODECYT 102-2006.

4. Reportes de avance trimestral, proyecto FODECYT 102-2006.

120

5. Herrera CL. Paredes ME. Caracteres de identidad de Valerianas (Tesis de graduación). Guatemala: Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC, en preparación.

6. Cruz EC, Gomar GR, Barrientos M. (2005). Evaluación clínica de la efectividad de Valeriana prionophylla como inductora del sueño. Revista Tikalia 23 (1):85-99.

7. Upton, R. (1999). Valerian Root, Valeriana officinalis. En C. Petrone (Ed.), American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium. California: AHP, 25 p.

8. LIPRONAT, 2005. Procedimientos Estándar de Operación. USAC, Guatemala, uso interno.

9. Solis, P.N., Solis, N.G. de, Gattuso, S., Cáceres, A. (2005). Manual de caracterización y análisis de drogas vegetales y productos fitoterapéuticos. Guatemala: Proyecto OEA/AICD/USAC, 132 p.

10. WHO (1999) Radix Valerianae. WHO Monographs on Selected Medicinal Plants. 1, 267-276)

11. Riquett, D.J. (2007). Análisis por espectrofotometría de isovaltrato de extracto de hoja y raíz de Valeriana (Valariana prionophylla Standl.) de dos localidades diferentes de Guatemala (Tesis de Maestría). Guatemala: Escuela de Estudios de Posgrado, Facultad de CCQQ y Farfmacia, USAC, 55p.

12. Piedrasanta, R.aRB. (2007). Comparación química y de rendimiento de aceite esencial de hoja y raíz de Valeriana prionophylla Standl. De dos diferentes localidades de Guatemala (Tesis de Maestría). Guatemala: Escuela de Estudios de Posgrado, Facultad de CCQQ y Farmacia, USAC, 43 p.

13. Garrido, J.C. (2007). Análisis por cromatografía líquida de alta resolución de ácido valerénico o sus derivados en extractos de hoja y raíz de Valeriana prionophylla (Tesis de Maestría). Guatemala, Escuela de Estudios de Posgrado, Facultad de CCQQ y Fasrmacia, USAC, 38 p.

14. Piccinelli, A., Arana, S., Caceres, A., Villa Bianca, R.E., Sorrentino, R. & Rastrelli, L. (2004). New lignans from the root of Valeriana prionophylla with antioxidative and vasorelaxant activities. Journal of Natural Products 67, 1135-1140.

15. Roca, C.R. (2005). Evaluación comparativa de la acción sedante e hipnótica de un elixir fitoterapéutico y la combinación de las plantas originales (Tesis). Guatemala: Facultad de CCQQ y Farmacia, USAC, 77p.

16. Quiñonez, A.C. (2007). Comparación del efecto del extracto de Valeriana prionophylla Standl. versus placebo sobre la ansiedad de 30 pacientes en tratamiento de quimioterapia por cáncer de mama, durante 4 semanas, en el Hospital de Cancerología INCAN, Guatemala (Tesis de Maestría). Guatemala, Escuela de Estudios de Posgrado, 30 p.

Guatemala, 11 de diciembre de 2009

f.____________________________ Lic. Armando Cáceres Estrada Investigador Principal Vo.Bo. __________________________

Dr. Oscar Cobar Pinto, Decano Representante Legal Institución

121

V.1. INFORME FINANCIERO

AD-R-0013DOCEAVA CONVOCATORIA

LINEA FODECYT

Nombre del Proyecto: Variabilidad genética, desarrollo de tecnología agrícola y caracterización fitofarmaceútica de una especie de valeriana nativa de Guatemala con potencial como sedante natural.

Número del Proyecto: 102-2006Investigador Principal: Lic. Armando Cáceres Estrada Monto Autorizado: Q394,744.60

Fecha de Inicio y Finalización: 01/01/2007 al 31/12/2008 24 meses PRÓRROGA AL 31/03/2009

Grupo Renglon Nombre del GastoAsignacion

Presupuestaria

TRANSFERENCIA En Ejecuciòn

Menos (-) Mas (+)Ejecutado

Pendiente de Ejecutar

1 Servicios No Personales121 Publicidad y propaganda Q 2,000.00 Q 2,000.00 Q - 122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 2,000.00 Q 1,984.80 Q 15.20 133 Viáticos en el interior Q 7,000.00 Q 1,200.00 Q 4,084.00 Q 1,716.00 163 Mantenimiento de equipo de laboratorio Q 4,500.00 Q 10,000.00 Q 14,469.74 Q 30.26 181 Estudios,investigacionesy proyectos de factibilidad Q 157,500.00 Q 148,925.00 Q 8,575.00 181 Estudios de factibilidad (Evaluación externa) Q 8,000.00 Q 8,000.00 189 Otros estudios y/o servicios Q 2,000.00 Q 1,025.00 Q 975.00 194 Otras comisiones y gastos bancarios Q 621.19 Q 309.20 Q 311.99 195 Impuestos, derechos y tasas Q 2,529.00 Q 1,255.00 Q 1,274.00

2 Materiales y Suministros212 Alimentos para animales Q 2,000.00 Q 2,000.00 Q - 214 Productos agroforestales, madera y sus manufacturas Q 4,000.00 Q 1,585.99 Q 2,414.01 Q - 223 Piedra, arcilla y arena Q 586.00 Q 585.00 Q 1.00 232 Acabados textiles Q 3,000.00 Q 1,855.00 Q 1,145.00 Q - 241 Papel de escritorio Q 1,500.00 Q 1,466.40 Q 33.60 243 Productos de papel o cartón Q 2,000.00 Q 1,450.85 Q 549.15 Q - 244 Productos de artes gráficas Q 250.00 Q 242.90 Q 7.10 245 Libros, revistas y periódicos Q 3,000.00 Q 250.00 Q 2,750.00 249 Otros productos de papel, cartón e impresos Q 570.00 Q 570.00 Q - 261 Elementos y compuestos químicos Q 27,800.00 Q 1,564.20 Q 6,855.00 Q 33,086.24 Q 4.56 262 Combustibles y Lubricantes Q 2,500.00 Q 1,539.00 Q 4,039.00 Q - 263 Abonos y fertilizantes Q 5,000.00 Q 1,127.75 Q 3,872.25 Q - 264 Insecticidas, fumigantes y similares Q 3,000.00 Q 2,435.00 Q 565.00 Q - 266 Productos medicinales y farmaceúticos Q 1,000.00 Q 1,000.00 Q - 267 Tintes, pinturas y colorantes Q 245.00 Q 245.00 268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc Q 9,000.00 Q 3,480.00 Q 5,000.00 Q 10,519.22 Q 0.78 269 Otros productos químicos y conexos Q 2,000.00 Q 176.94 Q 2,176.94 Q - 272 Productos de vidrio Q 3,000.00 Q 540.81 Q 3,540.81 Q - 283 Productos de metal Q 3,500.00 Q 2,225.00 Q 1,262.50 Q 12.50 286 Herramientas menores Q 2,000.00 Q 1,113.15 Q 868.24 Q 18.61 291 Útiles de oficina Q 2,000.00 Q 1,983.15 Q 16.85 292 Útiles de limpieza y productos sanitarios Q 2,000.00 Q 1,854.15 Q 145.85 Q - 295 Utiles menores médico-quírurgicos y de laboratorio Q 2,000.00 Q 3,960.00 Q 5,960.00 Q - 297 Útiles, accesorios y materiales eléctricos Q 4,000.00 Q 2,815.85 Q 721.50 Q 462.65

3 Propiedad, planta y equipo323 Equipo médico-sanitario y de laboratorio Q 93,000.00 Q 10,000.00 Q 75,365.14 Q 7,634.86 329 Otras maquinarias y equipos Q 3,670.00 Q 3,670.00 Q -

9 Asignaciones Globales(-) Gastos Administrativos (10%) Q 35,888.60 Q 35,888.60 Q -

TOTAL Q394,774.60 Q 37,956.94 Q37,956.94 Q362,689.64 Q32,084.96

Monto Autorizado Q 394,774.60 Disponibilidad: Q 32,084.96 ( -) Ejecutado Q 362,689.64

Sub-total Q 32,084.96 ( -) Apertura de Caja Chica

Total por Ejecutar Q 32,084.96

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