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Contagem automatica de unidades formadoras de colonias de bacterias emplacas de Petri com o uso do algoritmo Template Matching
Kathiani Souza, Arthur Pinheiro, Willian Amorim, Valguima Odakura
Faculdade de Ciencias Exatas e Tecnologia (FACET)Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD)
[email protected], [email protected],[email protected], [email protected]
Abstract - This paper presents the study of Tem-plate Matching algorithm based on Normalized Cross-Correlation as a technique to perform the automaticcounting of colony forming units of bacteria in Pe-tri Dishes. We will also present the performance evaluationof the Template Matching algorithm for various as-pects of the colonies on the image and comparing the scoremade by the algorithm and count conducted by a specia-list.
Resumo - Este artigo apresenta o estudo do al-goritmo Template Matching com base em CorrelacaoCruzada Normalizada como tecnica para realizar a con-tagem automatica de unidades formadoras de coloniasde bacterias em placas de Petri. Apresentaremos tambema avaliacao de desempenho do algoritmo Template Mat-ching para varios aspectos das colonias na imagem e acomparacao entre a contagem feita pelo algoritmo e a con-tagem realizada por um especialista.
1. Introducao
A infeccao das vias urinarias caracteriza-se pelapresenca e multiplicacao de microorganismos no apare-lho urinario. A infeccao urinaria e a segunda causa mais co-mum de infeccao na populacao em geral. As infeccoes naocomplicadas, aquelas em que nao existem alteracoes es-truturais ou funcionais das vias urinarias, sao causa-das principalmente pela bacteria Escherichia coli. Essainfeccao e definida pela presenca de 100.000 unidades for-madoras de colonias por mililıtro de urina (ufc/mL),mas essa quantidade pode mudar de acordo com o es-tado clınico em que o portador do microorganismo seencontre [7].
O cultivo de microorganismos em meios de cultura euma das tecnicas utilizadas na Microbiologia quando se pre-tende quantificar ou isolar diferentes grupos de microorga-nismos. Em muitos casos o isolamento dos microorganis-mos causadores de doencas tem a finalidade de identificarquantos e quais sao os tipos de microorganismos existen-tes no meio de cultura, como forma de diagnostico e trata-mento medico. Sendo assim, uma das formas de diagnosticoda infeccao das vias urinarias e a Urocultura, um examerealizado em laboratorio, que isola o agente causador dainfeccao em uma placa de Petri. Na placa sao fornecidos nu-trientes e condicoes favoraveis ao seu crescimento para queas unidades formadoras de colonias possam ser quantifica-das para posterior decisao medica sobre um possıvel trata-mento [2].
Em alguns laboratorios de analises clınicas a tarefa dequantificar microorganismos, como os agentes bacterianoscausadores da infeccao urinaria, e realizada manualmente,a exemplo do Laboratorio de Analises Clınicas do HospitalUniversitario da UFGD - Universidade Federal da GrandeDourados. As colonias na placa de Petri, nem sempre estaoseparadas, em muitos casos elas ficam aglomeradas comopode-se observar na Figura 1. No entanto, em todos os casosa contagem das colonias e feita manualmente. De acordocom os trabalhos de Osowsky e Gamba [5], Alves [2] e So-vierzoski [8] a contagem manual de colonias de bacteriasapresenta varias desvantagens como:
• A fadiga do laboratorista que realiza a contagem queexige concentracao e atencao;
• Quando ha troca de tecnicos pode haver um desvio sig-nificativo nos resultados;
• E necessario repetir a contagem para validacao dos re-sultados;
• Limitacao das analises laboratoriais devido as dificul-dades de contagem que podem atrasar o termino doprocesso e a liberacao dos resultados.
Diante dos problemas encontrados com a contagem ma-nual pode-se perceber a necessidade de ferramentas compu-tacionais que auxiliem no processo de analise de coloniasbacterianas e aumentem a velocidade do processo, a con-fiabilidade e exatidao dos resultados. Aumentando a ve-locidade do processo, o laboratorista perde menos tempocom esta atividade repetitiva e suscetıvel de erro e utilizaseu tempo para outras atividades [8]. Sendo assim, o es-tudo e o desenvolvimento de algoritmos de processamentode imagens aliados a tecnicas de processamento de imagenspara o desenvolvimento de ferramentas computacionais, po-dem contribuir para melhorar o processo de contagem decolonias.
Esse trabalho apresenta o estudo e a analise de de-sempenho do algoritmo Template Matching, baseado emCorrelacao Cruzada Normalizada, na contagem automaticade unidades formadoras de colonias de bacterias em placade Petri. Template Matching e um algoritmo de reconhe-cimento de padroes que tem como objetivo a deteccao deobjetos similares em uma imagem. O trabalho de Alves[2] mostra que o algoritmo Template Matching baseado emcorrelacao, pode ser eficiente na contagem de unidades for-madoras de colonias. Ja no trabalho de Quinta [6] observa-se que esse algoritmo pode ser uma tecnica interessante parao reconhecimento de leveduras, que possuem o formato pa-recido com o de colonias de bacterias.
O trabalho esta organizado da seguinte forma. A secao2 apresenta o funcionamento do algoritmo Template Mat-ching, a secao 3 apresenta os experimentos realizados e osresultados obtidos, a secao 4 apresenta a analise do resulta-dos e por fim a secao 5, apresenta as conclusoes obtidas apartir das implementacoes e experimentos realizados.
2. Template Matching
O algoritmo Template Matching baseado em CorrelacaoCruzada Normalizada e um algoritmo de reconhecimento depadroes que realiza a deteccao de objetos similares em umaimagem. Ele tem como entrada uma imagem e o objeto aser detectado e como saıda uma imagem denominada ima-gem de Correlacao em que os pontos mais claros indicamos pontos detectados. Para tal deteccao o algoritmo utilizacomo medida de similaridade o coeficiente de CorrelacaoCruzada Normalizada conforme a Equacao 1. Esse coefi-ciente indica o grau de similaridade entre o template (ob-jeto a ser detectado) e a imagem de pesquisa. Ele varia de-1 ate 1. O valor 1 indica total correspondencia entre o tem-plate e a imagem de pesquisa, 0 indica que nao houve cor-respondencia e -1 indica que houve correlacao inversa, ou
seja, total incorrespondencia entre o template e a imagemde pesquisa [1].
r =
∑(xi − x)(yi − y)√
(∑
(xi − x)2)(∑
(yi − y)2)(1)
O algoritmo Template Matching baseia-se na corres-pondencia entre um modelo T e uma imagem I na qual estemodelo possa ser detectado [3]. Seja I a imagem de pes-quisa de dimensao m x n e a imagem T o template de di-mensao p x q tal que p < m e q < n, entao e realizadoo calculo do coeficiente de Correlacao Cruzada Normali-zada entre cada pixel da imagem I e os pixels da imagemT . A cada variacao de pixel na imagem I , o valor do coefi-ciente e calculado e armazenado em uma imagem denomi-nada imagem de Correlacao, na qual os valores proximos a1 indicam a correspondencia entre o template e a imagemde pesquisa. Por outro lado os valores proximos a -1 indi-cam a divergencia entre o template e a imagem de pesquisa.Na imagem de correlacao os pontos mais claros indicam oponto em que houve a deteccao do template como mostra aFigura 3(a). Os pixels das bordas da imagem I sao descon-siderados, pois a imagem T tem sua posicao inicial definidano centro da imagem, enquanto a imagem I possui a suaposicao inicial definida no canto superior esquerdo. Destaforma, ao posicionar o centro da imagem T na posicao ini-cial da imagem I tem-se uma perda de informacao [2].
3. Experimentos e Resultados
Foi realizada uma visita ao Laboratorio de AnalisesClınicas do Hospital Universitario da UFGD para a coletadas imagens das colonias de bacterias depositadas na placade Petri para a realizacao dos experimentos. Uma imagemda placa de Petri com as colonias de bacterias pode ser vistana Figura 1.
A ferramenta utilizada para o processamento e analisedas imagens foi o ImageJ1 baseado em Java, de uso livre eque permite a criacao de plugins e a expansao de suas fun-cionalidades. A IDE, do ingles Integrated Development En-vironment ou Ambiente Integrado de Desenvolvimento, uti-lizada para a implementacao do algoritmo Template Mat-ching foi o Eclipse 3.7.1.2 Para a aquisicao das imagens foiutilizada uma Camera Digital 14MP 15x Zoom Optico quefornece imagens com uma dimensao de 2560 x 1920 pixelsno formato JPG.
Para a realizacao dos testes de avaliacao do desempe-nho do algoritmo Template Matching, foi criado um bancode imagens com as melhores imagens entre as coletadas, emque foram escolhidas as mais nıtidas, com poucos ruıdos ereflexos provenientes da luz do ambiente.
1 http://rsbweb.nih.gov/ij/2 http://www.eclipse.org/downloads/index.php
Figura 1. Colonias de bacterias depositadasna placa de Petri.
Para a criacao desse banco foi desenvolvido um pluginpara o ImageJ, denominado CultImage, com a funcionali-dade de nomear as imagens com a quantidade de coloniasencontradas na contagem manual e salva-las em um di-retorio indicado pelo usuario. Foram escolhidas 34 imagens,entre as coletadas, para serem recortadas que deram origema 1.252 novas imagens. O objetivo do recorte das 34 ima-gens, foi selecionar as imagens em que nao apareciam asbordas da placa para aplicar o algoritmo nos experimentosiniciais, e utilizar as imagens que apresentam as bordas emexperimentos futuros, visto que ela e detectada pelo algo-ritmo.
Foi realizada a contagem das bacterias nas 1.252 ima-gens, como forma de compararmos a contagem realizadapelo especialista e a quantidade de colonias de bacterias en-contradas pelo algoritmo Template Matching.
Para a aplicacao do algoritmo Template Matching nacontagem das colonias foi desenvolvido um plugin em Java,que utiliza uma das classes do plugin CreateTemplate doImageJ, que contem a implementacao desse algoritmo. Parafalicitar os experimentos, foi utilizado um template fixopara evitar a escolha de um template para cada imagem,como acontece no CreateTemplate. Esse plugin converteuma imagem de pesquisa, representada pela Figura 2(a), e otemplate, representado pela Figura 2(b), do tipo RGB paraescala de cinza antes da aplicacao do algoritmo. Ele aplicao algoritmo Template Matching para deteccao das coloniase obtem uma imagem de correlacao, representada pela Fi-gura 3(a). Depois e aplicado o Threshold na imagem, vari-ando o limiar inferior de 0.4 ate 1, mantendo o limiar supe-rior igual a 1. Em seguida, e aplicado o metodo Analyse daclasse Java ParticleAnalyzer, que identifica os pontos queestao no intervalo entre o limiar inferior e superior, comomostra a Figura 3(b). Os resultados sao salvos em um ar-quivo para analise.
Figura 2. (a) A figura da esquerda apresenta aImagem de Pesquisa em escala de cinza. (b)A figura da direita apresenta o Template emescala de cinza.
Figura 3. (a) A figura da esquerda apresentaa Imagem de Correlacao em que os pontosmais claros indicam os pontos detectados;(b) A figura da direita apresenta Imagem deCorrelacao apos a aplicacao do Threshold edo metodo Analyse.
Foram realizados experimentos com 38 imagens, esco-lhidas entre as 1.252, nas quais foram aplicadas o algo-ritmo Template Matching. Essas 38 imagens apresentavamnenhuma aglomeracao ou um nıvel de aglomeracao mode-rado. Elas foram escolhidas inicialmente, para que se pu-desse analisar o comportamento do algoritmo, com o Th-reshold variando de 0.4 a 1, em busca do parametro em quehouvesse melhor deteccao.
Depois da aplicacao do algoritmo e da analise feita comas imagens de correlacao que mostraram os pontos detecta-dos, pode-se observar que em determinadas situacoes emque as colonias se encontravam na imagem, ocorreu al-guns problemas de deteccao. Nos pontos da imagem emque as colonias encontravam-se aglomeradas houve falhana deteccao, de modo que, algumas foram detectadas e ou-tras nao. Nos pontos em que o recorte da imagem ocasio-nou o recorte de algumas colonias, estas nao foram detec-tadas. Isso acontece porque a colonia recortada e um ob-jeto diferente do template, sendo assim, o coeficiente decorrelacao nao indica um ponto de correspondencia. Os re-sultados obtidos com as 38 imagens, mostraram que, o me-
lhor Threshold variou entre 0.4 e 0.7. Diante dessa variacaoforam analisadas as caracterısticas das imagens que obtive-ram valores iguais para o melhor Threshold e foi constatadoque essas imagens tinham caracterısticas em comum. Sendoassim, percebeu-se a necessidade de classificar as imagensem tres categorias de acordo com a intensidade dos pro-blemas que elas apresentavam, para possibilitar a analisedo desempenho do algoritmo Template Matching em cadasituacao. As imagens de cada uma das tres categorias po-dem ser vistas nas figuras 4(a), 5(a) e 6(a). As imagens es-colhidas para cada categoria foram cuidadosamente analisa-das, de modo que, suas caracterısticas se ajustassem ao per-fil da categoria.
Para as categorias 1, 2 e 3 foram selecionadas 10 ima-gens para realizar os experimentos. Como mostra a Figura4(a), nas imagens da categoria 1, a maioria das coloniasencontram-se separadas, porem alguns problemas como aaglomeracao e o recorte de colonias ainda podem ser en-contrados, mesmo que em menor intensidade. A Tabela 1apresenta a quantidade de colonias detectadas pelo algo-ritmo em cada limiar e a quantidade de colonias quantifi-cadas pelo laboratorista, representada pela letra L. A Tabela1 mostra tambem que o valor do limiar em que houve me-lhor deteccao foi entre 0.7 e 1 e que em todos os casos o re-sultado da contagem indicou um numero menor de coloniasdo que realmente existia. Atraves da analise das imagensde correlacao geradas pelo algoritmo pode-se observar quehouve a deteccao de todas as colonias que estavam total-mente separadas e ıntegras como mostra a Figura 4(b).
Figura 4. (a) A figura da esquerda apresentauma imagem da categoria 1;(b) A figura dadireita apresenta a imagem de Correlacaoem que os pontos vermelhos indicam ascolonias detectadas.
Como mostra a Figura 5(a) nas imagens da categoria 2 amaioria das colonias se encontravam separadas, mas apre-sentavam um ındice mais elevado de colonias aglomeradase recortadas que nas imagens da categoria 1. Conforme a Fi-gura 5(b) nos pontos de aglomeracao e recorte houve pro-
Imagem L 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.91 7 31 14 8 6 4 12 7 33 17 8 5 4 03 6 50 21 7 5 5 24 8 48 22 10 5 4 45 9 14 11 12 6 1 06 10 15 10 10 7 5 07 10 17 10 10 9 1 08 13 29 10 10 9 9 39 4 18 10 4 2 2 010 5 17 11 5 5 0 0
Tabela 1. Resultado do experimento com asimagens da categoria 1 mostra os valores en-contrados em cada limiar.
blema na deteccao, de modo que, nao foram reconhecidas.A Tabela 2 apresenta a quantidade de colonias encontradaspelo especialista, representada pela letra L, e o valor do li-miar em que houve melhor deteccao, que foi entre 0.5 e 1.
Figura 5. (a) A figura da esquerda apresentaa imagem da categoria 2;(b) A figura da di-reita apresenta a imagem de Correlacao.
Nas imagens da categoria 3 a maioria das colonias se en-contravam aglomeradas e algumas foram recortadas comomostra a Figura 6(a). As imagens dessa categoria apresen-taram maior numero de colonias aglomeradas e recorta-das que nas categorias 1 e 2. Algumas colonias que esta-vam aglomeradas e recortadas nao foram detectadas comomostra a Figura 6(b). A Tabela 3 mostra a quantidade decolonias encontradas pelo especialista, representado pela le-tra L, e o limiar em que houve melhor deteccao, que foi en-tre 0.4 e 1.
4. Analise dos Resultados
Durante a realizacao dos experimentos com as imagensda categoria 1, todas as imagens de correlacao foram anali-sadas e como mostra a Figura 4(b), todas as colonias sepa-radas e ıntegras foram corretamente detectadas.
Imagem L 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.91 19 28 22 17 6 1 02 50 40 39 33 23 12 13 27 25 24 22 17 9 04 55 35 35 30 27 17 105 12 31 17 9 8 7 36 43 31 34 34 28 18 117 25 35 19 14 13 9 38 27 21 22 21 18 10 09 18 23 17 13 12 7 010 10 19 11 11 9 8 0
Tabela 2. Resultado do experimento com asimagens da categoria 2 mostra os valores en-contrados em cada limiar.
Figura 6. (a) A figura da esquerda apresentaa imagem da categoria 3;(b) A figura da di-reita apresenta a imagem de Correlacao.
Como pode-se perceber, o nıvel de problemas apresen-tados nas imagens foi aumentando a cada categoria. Paraa analise do desempenho do algoritmo em cada categoriafoi realizado o calculo do erro medio de colonias conformea Equacao 2, onde ce indica o numero de colonias presen-tes na imagem, cd indica o numero de colonias detectadaspela tecnica e n o numero total de imagens.
Imagem L 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.91 48 33 34 31 17 10 02 70 45 44 36 16 7 03 62 43 36 28 15 10 04 63 36 36 37 30 19 95 90 47 46 42 28 9 56 55 35 35 30 27 17 107 72 38 37 38 26 14 58 62 42 36 31 23 15 69 68 47 45 37 28 19 810 40 30 34 29 18 5 0
Tabela 3. Resultado do experimento com asimagens da categoria 3 mostra os valores en-contrados em cada limiar.
Categoria erro mınimo erro medio erro maximo1 0 2 62 0 6 203 1 14 43
Tabela 4. Media de erros mınimo, medio emaximo para cada categoria.
ME =
n∑i=img1
|cei − cdi|
n(2)
Como mostra a Tabela 4 a media de erros na contagemfoi gradativa de acordo com a disposicao das colonias nasimagens, isto significa que, o desempenho do algoritmo di-minui a medida que aumenta a intensidade dos problemasnas imagens. Alem disso, o limiar tambem foi gradativocom os valores 0.7, 0.5 e 0.4 para as categorias 1, 2 e 3 res-pectivamente.
Outra forma encontrada para analisar o desempenho doalgoritmo foi o calculo F-Score conforme a Equacao 3:
F = 2 ∗ precision ∗ recallprecision + recall
(3)
O F-Score e uma medida de desempenho que varia de 0a 1, sendo que 1 indica alto desempenho. Ela e calculadaatraves do Precision e Recall conforme as Equacoes 4 e 5onde:
• hy e o numero de colonias corretamente detectadaspela tecnica, visto que, pode ocorrer a deteccao de ob-jetos presentes na imagem que nao sao colonias;
• hc e o total de colonias detectadas pela tecnica;
• ty e o numero de colonias encontradas na imagem.
Recall =hy
ty(4)
Precision =hy
hc(5)
Foi realizado o calculo do F-Score para as 10 imagens decada categoria, para todos os valores de Threshold. A tabela5 apresenta a media do F-Score para cada categoria em cadaThreshold. Ela mostra que os Thresholds nos quais o algo-ritmo apresentou o melhor desempenho foi de 0.4, 0.5 e 0.7para as categorias 1, 2 e 3 respectivamente. Isso pode mos-trar que os resultados obtidos conforme as tabelas 1, 2 e 3sao realistas.
Como mostra a Tabela 5 o melhor desempenho do algo-ritmo ocorreu com a imagem da categoria 1 e o pior com aimagem da categoria 3. Isso mostra que o desempenho doalgoritmo na contagem de unidades formadoras de coloniasdiminui de acordo com a disposicao das colonias na imagem
Categoria 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.91 0,357 0,528 0,708 0,856 0,637 0,1412 0,720 0,8264 0,8262 0,705 0,467 0,08973 0,590 0,510 0,323 0,134 0,066 0,001
Tabela 5. Calculo do F-Score para cada cate-goria em cada Threshold.
e que ele pode ser eficiente na contagem de unidades forma-doras de colonias que se encontram separadas e ıntegras.
5. Conclusao
Neste trabalho foi apresentado o estudo do algoritmoTemplate Matching como tecnica para contagem de unida-des formadoras de colonias de bacterias em placa de Petri ea analise de seu desempenho em varias situacoes.
Atraves da analise dos resultados dos experimentos edas imagens de correlacao, verificou-se que o algoritmofoi eficiente na contagem de colonias separadas e ıntegras.Nos casos em que houve erro de deteccao pela tecnica, asimagens apresentavam problemas de aglomeracao e recortedas colonias. Apesar da Tabela 4 mostrar que para a ca-tegoria 1 o Template Matching ainda apresentou erros dedeteccao, cabe lembrar que, como foi dito anteriormente, asimagens da categoria 1 ainda apresentavam problemas deaglomeracao e recorte, mesmo que em menor grau que asoutras categorias. Sendo assim, o algoritmo pode ser efi-ciente na contagem de colonias que estejam separadas eıntegras.
Outro problema a ser resolvido e o aparecimento deruıdos nas imagens, adquiridos no momento da aquisicaodas mesmas. Para o calculo da media do F-Score foi ne-cessario calcular a media do Precision. O Precision indica aprecisao do algoritmo. Nenhuma das medias do Precision,para o melhor Threshold, foi igual a 1. Isso significa quehouve deteccao de falsos-positivos. Sendo assim, um sis-tema de iluminacao pode resolver esse problema, sendo uti-lizado no momento da aquisicao das imagens.
Os trabalhos futuros visam o estudo de tecnicas queresolvam os problemas de aglomeracao, ruıdos e recortedas imagens. Uma das tecnicas propostas para resolver oproblema de aglomeracao e a Segmentacao. Dessa forma,o algoritmo Template Matching, em conjunto com outrastecnicas, podera realizar a contagem de colonias das ima-gens das categorias 1, 2 e 3, aumentando a velocidade doprocesso de contagem e a confiabilidade e exatidao dos re-sultados.
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