conteos fuera de este rango se determinan como “valor ... · coliformes en placa de la NOM-113-SSA1-1994 con el método de recuento de coliformes en placa petrifilm de la AOAC

“Estudio comparativo de los Métodos para la Cuantificación de Coliformes en

Lapan S.C.”

Pérez-Ramírez, J; Herrera-Rodríguez, P. (*)

(*)Laboratorio de análisis de Productos Agropecuarios del Norte.Instituto Tecnológico

Superior de Álamo Temapache (LAPAN-TSAT). Km 6.5 Carretera Tuxpam- Potrero del Llano.

Xoyotitla, Álamo. Ver. CP. 92750. Tel y Fax. 01 765 84 4 00 38, [email protected].

Resumen

En esta investigación se comparó el método para la cuenta de microorganismos

coliformes en placa de la NOM-113-SSA1-1994 con el método de recuento de

coliformes en placa petrifilm de la AOAC.

Para hacer este trabajo se analizaron tres matrices. Experimentalmente con un método

de contaminación artificial y por niveles de contaminación se detecta que hay

diferencia en la matriz de formula láctea ya que en un rango de contaminación se

obtuvo un resultado por debajo de lo esperado. En el nivel de contaminación ensayado

de 100 a 1000 se cuantifico un promedio de 30 UFC/g.

En la matriz de vegetales se determina un promedio de 84 UFC/g como Limite de

Detección ensayado (práctico), cumple con el nivel teórico esperado de 10 a 100

UFC/g.

En la matriz de salchicha se determina un promedio de 51 UFC/g como Limite de

Detección ensayado (práctico). Cumple con el nivel teórico esperado de 10 a 100

UFC/g. Con respecto a la cuantificación se analizaron 5 muestras por matriz a un nivel

que dieran una respuesta de 15-150 UFC en el conteo directo en la primera dilución, los

conteos fuera de este rango se determinan como “valor estimado para cuantificar”.

Después de evaluar 3 alimentos que fueron fortificados en 5 diferentes rangos, Punto 1:

Control negativo, Punto 2: 10-100, Punto 3: 100-1000, Punto 4: 1000-10000 Punto 5:

10000-100000 UFC/g, ya que no aplican especificaciones normativas, se concluyen las

siguientes observaciones.

Los resultados obtenidos cumplen en cada uno de los rangos esperados al ser

contaminados por la cepa de referencia Escherichia Coli ATCC10536.

.

Los resultados son significativos porque no se cuentan con materiales de referencia

cuantitativos y tampoco hay especificaciones, así que se evalúa contra el resultado de

referencia del método petrifilm. Se comprueba que el método utilizado en la

preparación de las diluciones cumple con los resultados, al obtenerse resultados

2

logarítmicos, se observa una mayor dispersión de resultados del método cuando se

trabaja a un nivel bajo de concentración de 10-100 ufc/g o ml.

En la matriz de vegetales, el resultado obtenido más bajo fue de 30 ufc/g y el más alto

fue de 28000 ufc/g, rango significativo de trabajo en ésta matriz, por lo que es

comparable con el método de referencia en placa petrifilm. En la matriz fórmula láctea

el resultado más bajo fue de 10 ufc/ml y el más alto fue de 26000 ufc/ml, rango

significativo de trabajo en esta matriz, comparable con los conteos obtenidos por el

método de referencia en placa petrifilm. En la matriz salchicha, el resultado obtenido

más bajo fue de 35 ufc/g y el más alto fue de 21000 ufc/g, significativo en ésta matriz,

que también es comparable con los conteos obtenidos por el método de referencia en

placa petrifilm.

La validación se llevo a cabo cumpliendo con todos los parámetros que se requieren en

la Norma ISO 17025 para acreditar el método ante SSA y poder demostrar la

competencia técnica del laboratorio para poder realizar el ensayo. Además de que se

está cumpliendo con los requisitos de la norma NOM-113-SSA1-1994 método para la

cuenta de microorganismos coliformes en placa para llevar a cabo el análisis, al

comparar los resultados obtenidos con el método de referencia se puede concluir que los

resultados son similares en ambos métodos, pudiendo utilizarse cualquiera de los dos

métodos para determinar coliformes en placa en el laboratorio.

PALABRAS CLAVE: Matriz Fórmula Láctea, Matriz Vegetales, Matriz Salchicha,

Norma, Petrifilm.

3

I. INTRODUCCION ...............................................................................................................4

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................6

III. JUSTIFICACION ............................................................................................................6

IV. OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................7

4.1 Objetivos específicos..........................................................................................................7

V. MATERIALES Y METODOS ...............................................................................................8

Reactivos ................................................................................................................................8

Materiales ...............................................................................................................................9

Aparatos e instrumentos .......................................................................................................9

Preparación de la muestra .................................................................................................12

Metodología ..........................................................................................................................12

5.2 Método en placa petrifilm para recuento de coliformes ...............................................14

5.2.1 Requerimientos ..........................................................................................................14

5.2.2 Procedimiento ............................................................................................................15

5.3. Procedimiento estadístico...............................................................................................16

VI. RESULTADOS ...................................................................................................................17

6.1 Pruebas previas de validación ........................................................................................17

6.2 Evaluación de los medios de cultivo .............................................................................17

6.3 Determinación del nivel de inoculo .................................................................................18

6.4 Selección de matrices ......................................................................................................19

6.5 Parámetros de Validación ................................................................................................19

6.5.1 Limite de detección ....................................................................................................19

6.5.2 Limite de cuantificación .............................................................................................21

6.5.3 Linealidad ..................................................................................................................22

6.5.4 REPETIBILIDAD ........................................................................................................29

6.5.5 REPRODUCIBILIDAD...............................................................................................33

6.5.6 SESGO .......................................................................................................................38

6.5.7 SELECTIVIDAD .........................................................................................................39

VII.CONCLUSIONES ..............................................................................................................42

VIII. RECOMENDACIONES...................................................................................................42

IX.BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................43

PAGINAS WEB CONSULTADAS .........................................................................................45

4

I. INTRODUCCION

La calidad e inocuidad de los alimentos destinados a la exportación han

adquirido gran importancia en América Latina. Según la Organización Mundial

del Comercio (OMC), el comercio mundial de alimentos en 1999 fue de 437 mil

millones de dólares y se espera que aumente.

En América Latina y el Caribe, cuyo ingreso en divisas depende principalmente

de la exportación de productos básicos, la exportación de alimentos representa

un tercio de las exportaciones de la región, con una participación del 9,5 por

ciento del comercio mundial de alimentos. Con los recursos adicionales que

podrían disponer los países al tener un acceso más amplio a los mercados,

podrían hacer frente más fácilmente a los problemas de inseguridad alimentaria

y la pobreza.

El acceso a los exigentes mercados importadores se ve afectado por el hecho

de que los gobiernos e industrias de los países de la región están poco

familiarizados con los requisitos de los países importadores de alimentos. La

Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA),

durante el primer semestre de 2004, ha retenido 451 importaciones

provenientes de países de América del Sur, de las cuales 182 han sido

rechazadas por motivos de inocuidad.

En el comercio internacional la tendencia es exigir que los productores y

exportadores puedan asegurar la inocuidad del producto desde el lugar de

origen hasta el punto de consumo. Esto debe estar garantizado mediante

certificados emitidos por organismos reconocidos y con certificados de análisis

acreditados.

A nivel internacional desde junio de 1997, la Comisión del Codex Alimentarius

recomienda que los laboratorios responsables del control de exportación e

importación de alimentos cumplan con los requisitos de la norma ISO/IEC

5

17025 y sean acreditados por un organismo competente. Por otra parte el

Comité del Codex de Métodos de Análisis y Muestreo (CX/MAS) sólo

recomienda métodos acreditados con la norma ISO/IEC 17025, ya que cumple

con los requisitos de competencia en los ensayos en el laboratorio para

garantizar la calidad de los análisis.

La Directiva 93/99 EEC de la Unión Europea, en vigencia, establece que los

laboratorios centrales de control de alimentos deberán acreditarse con normas

internacionalmente reconocidas como la ISO/IEC 17025, participar en

programas interlaboratorio y emplear métodos validados.

En particular, los resultados obtenidos por los laboratorios de microbiología

basados en principios de aseguramiento de calidad, validados y acreditados

son internacionalmente reconocidos y considerados de referencia para la

evaluación de conformidad de los productos de intercambio en el comercio

internacional.

La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse

mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características

selectivas o diferenciales.

El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades

formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994. Método para la Cuenta de

Microorganismos Coliformes Totales en Placa). Esta Norma Oficial Mexicana

establece el método microbiológico para determinar el número de

microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por

medio de la técnica de cuenta en placa.

6

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El Laboratorio De Análisis De Productos Agropecuarios Del Noreste S.C.,

trabaja en el área de microbiología con 6 métodos validados por SAGARPA,

Con la finalidad de crecer cada día más en el ámbito laboral se quieren

implementar métodos del área de SSA de acuerdo a pruebas efectivas que

cumplan con los requisitos particulares de las normas donde se establecen los

procedimientos para dichos métodos de SSA, uno de los métodos es el de la

NOM-113-SSA1-1994 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA

Se requiere validar y acreditar el método comparándolo con el método de

referencia de RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA

PETRIFILM de la AOAC (Association of Analytical Communities).

III. JUSTIFICACION

Al validar el método de Coliformes totales en placa se está cumpliendo un

punto de la Norma ISO 17025 por la cual se rige y se califica el laboratorio

como competente para realizar el análisis, en los Requisitos Técnicos apartado

5.4 Métodos de Ensayo y Calibración y Validación de los Métodos de la Norma

ISO/IEC17025:2005 dice:

“Se deben emplear los métodos y los procedimientos más indicados para cada

ensayo y/o calibración. Se debe garantizar el muestreo, la manipulación, el

transporte, la preparación, y todas aquellas fases que conformen la operación

de ensayo o calibración precisa. Se debe ser riguroso en la selección de

método cuando el cliente no lo especifique, se seleccionarán métodos

publicados en normas internacionales, nacionales, o en revistas o por

fabricantes de prestigio. Los métodos empleados han debido ser previamente

validados. El cliente debe ser informado del método a elegir. La incorporación

de métodos de ensayos y calibración desarrollados por el laboratorio para su

propio uso debe ser de un modo planificado y contar con personal debidamente

calificado y provisto con los recursos adecuados. En caso de emplear métodos

no normalizados, deben ser acordados con el cliente incluyendo unas

especificaciones y la finalidad del mismo. En todo caso el método desarrollado

7

debe haber sido validado convenientemente antes de su uso. La validación

consiste en la confirmación mediante examen y la demostración de evidencias

objetivas que demuestren el cumplimiento de ciertos requisitos para el uso

específico previsto. Es decir es comprobar que una actividad es apta para el fin

hacia el que va orientada, en este caso un método que debe ser por ello

validado”.

La Norma NOM-113-SSA1-1994 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES

EN PLACA cumple con los requerimientos necesarios para llevar a cabo la

validación del análisis ya que esta dentro de la organización SSA siendo un

punto importante para LAPAN S.C. ya que no cuenta con análisis validados por

SSA hasta este momento solo se trabaja con métodos validados por

SAGARPA, así se obtendrá un método nuevo con el cual se beneficia la

empresa económicamente, creciendo en el campo laboral y ofreciendo nuevos

análisis a los diferentes clientes con los que trabaja al realizar los análisis de

sus productos.

IV. OBJETIVO GENERAL

Validar y Comparar el método para la cuenta de microorganismos coliformes en

placa de la NOM-113-SSA1-1994 con el método de recuento de coliformes en

placa petrifilm de la AOAC (Association of Analytical Communities).

4.1 Objetivos específicos

Validar la norma NOM-113-SSA1-1994 método para la cuenta de

coliformes totales en placa.

Comparar los resultados del método de la Norma Oficial Mexicana con el

de la AOAC (Association of Analytical Communities).

Comprobar que ambos métodos son eficientes en el recuento de

coliformes.

Confirmar que el laboratorio puede aplicar correctamente los métodos

normalizados antes de utilizarlos para el ensayo.

8

V. MATERIALES Y METODOS

5.1 Método para la cuenta de microorganismos coliformes en placa

El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades

formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994. Método para la cuenta de

Microorganismos Coliformes Totales en placa). Esta Norma oficial Mexicana

establece el método microbiológico para determinar el número de

microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por

medio de la técnica cuenta en placa, se debe mencionar que esta Norma es de

observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas y

morales que requieran efectuar este método en productos nacionales o de

importación, para fines oficiales.

El método permite determinar el número de microorganismos coliformes

presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo Agar Rojo Violeta Bilis

Lactosa (rvba) en el que se desarrollan bacterias a 35ºC en aproximadamente

24 hrs. dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos los

cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.

Reactivos

Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)

INGREDIENTES CANTIDADES

Fosfato monopotásico 34,0 g

Agua 1,0 l

Agua peptonada


Peptona 1,0 g

NaCl 8,5 g

Agua 1,0 l

9

Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (rvba)


Peptona 7,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Lactosa 10,0 g

Sales biliares 1,5 g

Cloruro de sodio 5,0 g

Rojo neutro 0,03 g

Cristal violeta 0,002 g

Agar 15,0 g

Agua 1,0 l

Materiales

Pipetas bacteriológicas

Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.

Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.

Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas,

tijeras, cucharas, espátulas, etc.

Cajas Petri.

Aparatos e instrumentos

Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.

Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de

máximas y mínimas.

Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica,

provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1° C y que

mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.

Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien

un homogeneizador peristáltico (Stomacher).

Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para

homogeneizador peristáltico.

10

Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0° C,

provista con termómetro calibrado.

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de

cristal cuadriculada y lente amplificador.

Registrador mecánico o electrónico.

Microscopio óptico.

Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.

11

12

Preparación de la muestra

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-

110-SSA1-1994 "Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su

Análisis Microbiológico".

Metodología

PESAR 10 gr DE MUESTRA

HOMOGENEIZAR LA MUESTRA

REALIZAR DILUCIONES DECIMALES

DEPOSITAR 1 ml DE CADA DILUCION EN CAJAS PETRI

POR DUPLICADO

VERTER 4 ml DEL MEDIO RVBA EN LA SUPERFICIE

DEL MEDIO INOCULADO

ADICIONAR 15 A 20 ml DEL MEDIO RVBA FUNDIDO Y

MANTENIDO A 45°C

HOMOGENEIZAR LA MUESTRA CON MOVIMIENOS

ROTATORIOS

INCUBAR LAS CAJAS EN POSICION INVERTIDA

CONTAR LAS PLACAS QUE DEN UN CONTEO DE

15 A 150 COLONIAS.

13

1. Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra líquida directa o

de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.

2. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se

requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada

dilución.

3. Verter de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C

en baño de agua. En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se

vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la

preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el

medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

4. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos

de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas

del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas

del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y

nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri

reposar sobre una superficie horizontal fría.

5. Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la

esterilidad.

6. Después de que está el medio completamente solidificado en la caja,

verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la

superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.

7. Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2

horas.

8. Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias

con el contador de colonias.

9. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las

colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran

rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual

es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes

biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.

14

5.2 Método en placa petrifilm para recuento de coliformes

La placa Petrifilm para Recuento de Coliformes es un sistema de medio de

cultivo listo para ser usado, que contiene los nutrientes de Bilis Rojo-Violeta

(VRB), un agente gelificante soluble en agua fría y un indicador tetrazolio

(TTC), que facilita la enumeración de las colonias.

Pueden ser usadas para alimentos y monitoreo ambiental, son rápidas y fáciles

de usar, siguiendo los pasos a continuación descritos:

1. Preparar la muestra

2. Inocular y distribuir 1 ml de la muestra sobre la placa Petrifilm

3. Incubar a la temperatura apropiada durante 24 horas.

4. Contar todas las colonias de color rojo. Asociadas a gas (AOAC) o bien

todas las colonias de color rojo con o sin gas (AFNOR) como coliformes.

5.2.1 Requerimientos

Para su uso se necesita:

Estufa incubadora (para temperaturas entre 30 y 37°C)

Diluyentes estériles (use alguno de los siguientes diluyentes: tampón

Butterfield, agua peptonada al 0,1%, diluyente de sal peptonada (método

ISO 6887), Agua peptonada tamponada, solución salina (0,85 a 0,90%),

caldo letheen libre de bisulfito, o agua destilada).

15

Material de laboratorio (pipetas, vasos, bolsas de muestreo, balanzas,

(etc.)

Refrigerador para el almacenamiento de placas (Nota: los envases de

placas Petrifilm sellados deben ser almacenados a Temperaturas ≤ 8 °C.

Una vez abiertos se almacenan a Temperatura ambiente).

Método de destrucción de placas usadas. (Autoclave o Incineración).

5.2.2 Procedimiento

Solo se requieren 3 pasos:

1. Inocule 1 ml de la dilución de la muestra y espárzalo.

2. Incube a la temperatura apropiada.

3. Cuente las colonias.

Son un método consistente de análisis y fácil de realizar, por lo que se reducen

las oportunidades de error cuando se compara contra otros métodos. La

cuadrícula de fondo facilita el conteo de las colonias, entregando resultados

rápidos, precisos y consistentes. Las Placas Petrifilm pueden leerse también en

un contador de colonias tipo Québec u otro tipo lupa con luz.

Un tinte indicador rojo provee un mejor contraste para facilitar el conteo de las

colonias y la lámina superior atrapa el gas producido por los Coliformes en

forma de burbujas. Las colonias confirmadas de Coliformes son rojas y se

encuentran asociadas a burbujas de gas. Los no Coliformes se colorean de rojo

pero no están asociadas a burbujas de gas.

16

5.3. Procedimiento estadístico

Se utilizara la evacuación de regresión lineal en el parámetro de Linealidad

para saber la proporcionalidad entre la concentración del analito y su

respuesta. Se determinó los parámetros siguiendo la fórmula general de la

recta.

y = a + bx Se trabajara con la formula de Desviación Estándar par los parámetros de

repetibilidad y reproducibilidad.

Para llevar a cabo la estimación en la diferencias de la precisión de 2 analistas

se compara la precisión de analistas usando la prueba de F para varianzas de

dos muestras usando α=0.05 Y también se lleva a cabo el análisis de la prueba

de t para dos muestras donde se suponen varianzas iguales.

En el parámetro de selectividad se trabajara con la formula de especificidad:

Para determinar la capacidad del método de distinguir el analito o

microorganismo de interés entre otras sustancias o microorganismos

interferentes, para demostrar que el método es especifico para cada

determinación indicada en el procedimiento de análisis.

17

VI. RESULTADOS

6.1 Pruebas previas de validación

El tipo de Análisis que se va a llevar a cabo es un Análisis Cuantitativo

haciendo una validación parcial del Método de la norma NOM-113-SSA1-1994.

En la siguiente tabla se muestra la evaluación de los medios de cultivo

utilizando como cepa control positivo Escherichia coli ATCC 10536 y cepas de

control negativo Staphylucoccus Aureus ATCC 25963, Enterobacter aerogenes

ATCC 13048 donde el medio a evaluar es el Agar bilis rojo violeta (RVBA)

Marca: BD Difco, Catalogo: 211695 Lote 9061762. Utilizando el medio de

referencia ACS: Agar cuenta estándar. Marca: BD Difco, Catálogo: 247940,

Lote: 6170172. Para la determinación de Coliformes en Placa.

6.2 Evaluación de los medios de cultivo

El objetivo es definir la metodología para evaluar la productividad y selectividad

de medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiología. {Norma

ISO/TS 11133-2:2000}. Para la interpretación de los resultados de todas las

pruebas es necesario comparar la cantidad de crecimiento sobre el medio a

evaluar con respecto al crecimiento sobre un medio de referencia. El uso de un

medio de referencia específico es obligatorio en los métodos cuantitativos.

Fecha de evaluación: 2010-Agosto-17

Cepa de prueba

% T

suspensión madre

Dilución 10 -6

Dilución 10-7

Dilución 10 -8

ACS

RVBA

ACS

RVBA

ACS

RVBA

E.aerogenes

43,67 %

MNC

MNC

158

67

17

10

E. coli

55,81 %

375

238

43

31

2

5

S. aureus

44,00 %

MNC

0

UFC/ml

MNC

0

117

0

18

6.3 Determinación del nivel de inoculo

Por los resultados obtenidos en la evaluación de los medios de cultivo se

determinó utilizar como control la dilución 10-7 de la suspensión madre de la

cepa de referencia (control positivo).

Tabla 4: Resultados de los controles sembrados en la dilución 10-7 por el

método de Petrifilm.

Fecha % T

dilución

madre

Resultado del

control UFC/ml

Estimado de la

solución madre

Log

solución

madre

10-08-17 55,81 43 430000000 8,63

10-09-01 61,85 26 260000000 8,41

10-09-02 61,65 22 220000000 8,34

10-09-03 61,83 24 240000000 8,38

10-09-04 60,53 21 210000000 8,32

10-09-09 58,84 9 90000000 7,95

10-09-10 55,00 27 270000000 8,43

Promedios 24,57 245700000 8,35

Valor asignado en la dilución: 10-7 = 24,57 UFC/ ml

A partir de la cuantificación en la dilución 10-7

se determina los siguientes

valores para contaminar (fortificar) artificialmente las muestras de validación

Tabla 5: valores para contaminación artificial de la muestra.

Nivel de

inoculo

UFC/g

Dilución decimal

utilizada

ml/dilución

1-10 2ml/ 10-7

10-100 1ml/ 10-6

100-1000 1ml/ 10-5

1000-10000 1ml/ 10-4

19

10000-

100000

1ml/ 10-3

6.4 Selección de matrices

Para escoger los tipos de matrices a validar se debe considerar los tipos de

matrices por los cuales esta especificada la norma de referencia. La selección

de las matrices a evaluar se llevo de acuerdo a la categoría de

microorganismos no patógenos.

Tabla 6: Selección de Matrices a validar.

Microorganismo (genero,

especie y colección)

Matriz a validar: (categoría de

alimento/producto)

Escherichia coli ATCC 10536 Frutas y vegetales / Vegetales precocidos congelados

Lácteos / Fórmula láctea ultrapasteurizada

Productos cárnicos / Salchichas ahumadas de pollo

6.5 Parámetros de Validación

6.5.1 Limite de detección

Es el número mínimo de microorganismos que pueden ser detectados por el

método, pero en cantidades que no pueden estimarse con precisión.

Se analizaron 5 muestras por matriz a un nivel que de un conteo de 1-10 UFC

(1 ml dil 10-7) en el conteo de la primera dilución, obteniéndose los siguientes

resultados:

MATRIZ VEGETALES

Número de muestra Nivel de contaminación

(UFC/g)

Resultado (UFC/g)

Resultado (log UFC/g)

LIMITE DETECCION1 10-100 80 1,90

LIMITE DETECCION 2 10-100 90 1,95

20




PROMEDIO

84

1,92

MATRIZ FORMULA LACTEA


(UFC/g)

Resultado (UFC/g)







PROMEDIO

30

1,47

MATRIZ SALCHICHA


(UFC/g)

Resultado (UFC/g)







PROMEDIO

51

1,69

El Límite de Detección teórico es de 10 UFC/g o UFC/ml, al tener el conteo de

1 UFC en la primera dilución, experimentalmente con un método de

contaminación artificial por niveles de contaminación se llega a la conclusión de

que hay diferencia en las matriz de formula láctea ya que en un rango de

contaminación se obtuvo por debajo de lo esperado, ya que el nivel de

contaminación ensayado de 100 a 1000 se cuantifica un promedio de 30

UFC/g.

En la matriz de vegetales se llega a determinar un promedio de 84 UFC/g como

Limite de Detección ensayado (práctico), cumple con el nivel teórico esperado

de 10 a 100 UFC/g.

21

En la matriz de salchicha se llega a determinar un promedio de 51 UFC/g como

Limite de Detección ensayado (práctico). Cumple con el nivel teórico esperado

de 10 a 100 UFC/g.

6.5.2 Limite de cuantificación

Número mínimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que

puede determinarse en las condiciones experimentales del método evaluado.

Tomar en cuenta la incertidumbre del método para valores bajos.

Se analizaron 5 muestras por matriz a un nivel que dieran una respuesta de

15-150 UFC en el conteo directo en la primera dilución, los conteos fuera de

este rango se determinan como “valor estimado para cuantificar”.

MATRIZ VEGETALES


(UFC/g)

Resultado (UFC/g)


LIM CUANTIFICAC 1 100-1000 340 2,53




LIM CUANTIFICAC 5 100-1000 270 2,43 PROMEDIO 282 2.45



(UFC/g)

Resultado (UFC/g)






LIM CUANTIFICAC 10 100-1000 310 2,49

PROMEDIO 300 2,47

22

MATRIZ SALCHICHA


(UFC/g)

Resultado (UFC/g)


LIM CUANTIFICAC 11 100-1000 220 2,34

LIM CUANTIFICAC 12 100-1000 210 2,32

LIM CUANTIFICAC 13 100-1000 200 2,30

LIM CUANTIFICAC 14 100-1000 160 2,20

LIM CUANTIFICAC 15 100-1000 200 2,30

PROMEDIO 198 2,29

Los conteos obtenidos de esta fase se determinaron dentro de un rango de 15

a 150 UFC, se estableció la contaminación artificial en un nivel de 100-1000

ufc/g, los resultados cumplen dentro del conteo esperado.

6.5.3 Linealidad

Capacidad del método cuando se utiliza con una matriz dada a dar resultados

que están en proporción a la cantidad de analito en la muestra, es decir, un

aumento en la sustancia analizada corresponde aun lineal o proporcional.

Se contaminaron (fortificaron) 3 productos que pertenecen a 3 diferentes

grupos de alimentos, por 3 días diferentes, aplicados por duplicado aplicados

por el método de referencia con placas petrifilm y por el método de la NOM 113

SSA1 1994 con la cepa Escherichia coli ATCC 10536.

Las matrices trabajadas fueron:

Vegetales precocidos congelados

Formula Láctea ultra pasteurizada

Salchichas de pollo

Se contaminaron en los rangos de:

Punto 1: Control negativo

Punto 2: 10-100,

Punto 3: 100-1000,

Punto 4: 1000-10000

Punto 5: 10000-100000 UFC/g

23

Obteniéndose los siguientes resultados:

DIA 1

Matriz

Nivel de contamina

ción (UFC/g o

ml)

Resultados en 10 g (UFC/g o UFC/ml)

Resultado (log UFC/g o UFC/ml)

Método NOM 013

Método PETRIFIL

M

Método NOM 013

Método PETRIFIL

M

Control negativo vegetales

<10 <10 <10 N/A N/A

Vegetales 10-100 55 55 1,74 1,74

Vegetales 100-1000 810 440 2,90 2,64

Vegetales 1000-10000 3200 2900 3,50 3,46

Vegetales 10000-1000000

28000 28000 4,44 4,44

Control negativo fórmula láctea

<10 <10 <10 N/A N/A

Formula Láctea 10-100 10 25 1 1,40

Formula Láctea 100-1000 120 270 2,08 2,43

Formula Láctea 1000-10000 1400 2700 3,14 3,43

Formula Láctea 10000-100000

26000 30000 4,41 4,47

Control negativo salchicha

<10 <10 <10 N/A N/A

Salchicha 10-100 35 20 1,54 1,30

Salchicha 100-1000 180 310 2,25 2,50

Salchicha 1000-10000 2500 3400 3,40 3,53

Salchicha 10000-100000

21000 26000 4,32 4,41

24

DIA 2

Matriz

Nivel de contamina

ción (UFC/g o

ml)



Método NOM 013

Método PETRIFIL

M

Método NOM 013

Método PETRIFILM


<10 <10 <10 N/A N/A

Vegetales 10-100 30 10 1,47 1

Vegetales 100-1000 180 190 2,25 2,27

Vegetales 1000-10000

2000 1900 3,30 3,27


15000 18000 4,17 4,25


<10 <10 <10 N/A N/A

Formula Láctea 10-100 15 20 1,17 1,30

Formula Láctea 100-1000 180 180 2,25 2,25


550 1900 2,74 3,27


9900 28000 4,00 4,44


<10 <10 <10 N/A N/A

Salchicha 10-100 <10 20 0.70 1,30

Salchicha 100-1000 110 230 2,04 2,36


1700 2100 3,23 3,32


8700 17000 3,93 4,23

25

DIA 3

Matriz

Nivel de contamina

ción (UFC/g o

ml)



Método NOM 013

Método PETRIFIL

M

Método NOM 013

Método PETRIFILM


<10 <10 <10 N/A N/A

Vegetales 10-100 60 60 1,77 1,77

Vegetales 100-1000 160 290 2,20 2,46


1600 2700 3,20 3,43


20000 35000 4,30 4,54


<10 <10 <10 N/A N/A

Formula Láctea 10-100 20 45 1,30 1,65

Formula Láctea 100-1000 110 280 2,04 2,44


1000 2100 3 3,32


7300 26000 3,86 4,41


<10 <10 <10 N/A N/A

Salchicha 10-100 45 40 1,65 1,60

Salchicha 100-1000 230 300 2,36 2,47


2400 2900 3,38 3,46


21000 25000 4,32 4,39

Se obtienen las siguientes gráficas por las matrices trabajadas:

26

Figura 1: linealidad matriz vegetales comparando los resultados de la norma con

los de las placa petrifilm.

Figura 2: linealidad matriz formula láctea comparando los resultados de la norma

con los de la placa petrifilm

MATRIZ VEGETALES y = 1.0796x - 0.2324

R2 = 0.9717

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0 1 2 3 4 5

LOG UFC/g NOM

LO

G U

FC

/g

PE

TR

IFIL

M

MATRIZ FORMULA LACTEA y = 0.9636x - 0.2128

R2 = 0.9768

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

LOG UFC/g NOM

LO

G U

FC

/g P

ET

RIF

ILM

27

Figura 3: linealidad matriz salchicha de pollo comparando los resultados de la

norma con los de las placa petrifilm

Figura 4: regresión lineal del método

MATRIZ SALCHICHA DE POLLO y = 1.0504x - 0.044

R2 = 0.9814

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

LOG UFC/g NOM

LO

G U

FC

/G P

ET

RIF

ILM

REGRESION LINEAR DEL METODO

y = 0.9996x + 0.1564

R2 = 0.9566

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0 1 2 3 4 5

LOG NOM (UFC/G)

LO

G P

ET

RIF

ILM

(U

FC

/G)

28

Se obtienen los siguientes resultados:

Categoría de alimento

Producto ensayado/Microorganismo

(género, especie y colección)

Regresión lineal

R2

Frutas y vegetales

Vegetales pre cocidos congelados /

Escherichia coli ATCC 10536

y = 0,08x - 0,23 0,9717

Lácteos Formula Láctea ultra pasteurizada

/Escherichia coli ATCC 10536

y = 0,96x - 0,21 0,9718

Productos cárnicos

Salchichas ahumadas de pollo/

Escherichia coli ATCC 10536

y = 1,05x - 0,04 0,9814

La ecuación de regresión linear del método de todas las categorías de

alimento es la siguiente

y = 0,9996X + 0,1564

Después de evaluar 3 alimentos que fueron fortificados en 5 diferentes rangos,

Punto 1: Control negativo, Punto 2: 10-100, Punto 3: 100-1000, Punto 4: 1000-

10000 Punto 5: 10000-100000 UFC/g, ya que no aplican especificaciones

normativas, se concluyen las siguientes observaciones,

-Los resultados obtenidos cumplen en cada uno de los rangos esperados al ser

contaminados por la cepa de referencia Escherichia Coli ATCC10536.

-Todos los resultados se aplicaron por los dos métodos en placas petrifilm y

medio Rojo Bilis Verde Brillante y se evalúan comparando los resultados.

-Los resultados son significativos porque no se cuentan con materiales de

referencia cuantitativos y tampoco hay especificaciones, así que se evalúa

contra el resultado de referencia del método petrifilm.

29

-Se comprueba que el método utilizado en la preparación de las diluciones

cumple con los resultados, ya que se obtienen resultados logarítmicos.

-Se observa una mayor dispersión de resultados del método cuando se trabaja

un nivel bajo de concentración de 10-100 ufc/g o ml.

MATRIZ VEGETALES

- El resultado obtenido más bajo fue de 30 ufc/g y el más alto fue de 28000

ufc/g, este es el rango significativo de trabajo en esta matriz.

-Se obtienen resultados muy similares entre los conteos obtenidos por el

método de referencia en placa petrifilm


- El resultado obtenido más bajo fue de 10 ufc/ml y el más alto fue de 26000

ufc/ml, este es el rango significativo de trabajo en esta matriz.



MATRIZ SALCHICHA

- El resultado obtenido más bajo fue de 35 ufc/g y el más alto fue de 21000

ufc/g, este es el rango significativo de trabajo en esta matriz.




método de referencia en placa petrifilm en las 3 matrices.

6.5.4 REPETIBILIDAD

Precisión en condiciones de reproducibilidad.

Se contaminaron (fortificaron) y analizaron a un nivel de 1000 – 10000 UFC/g

ó UFC/ml 3 muestras de cada matriz por 3 días diferentes obteniéndose los

siguientes resultados:

30

Día 1

No Muestra

Matriz

Nivel de contaminación

UFC/g o UFC/ml

Resultado UFC/g o UFC/ml

log UFC/g o UFC/ ml

REPETIBILIDAD 1 Vegetales 1000-10000 1200 3,07 REPETIBILIDAD 2 Vegetales 1000-10000 1500 3,17

REPETIBILIDAD 3 Vegetales 1000-10000 1600 3,20 Promedio: 1433 3,14

REPETIBILIDAD 4 Fórmula láctea

1000-10000 1700 3,23

REPETIBILIDAD 5 Formula láctea

1000-10000 1200 3,07


1000-10000 990 2,99

Promedio: 1296 3,09

REPETIBILIDAD 7 Salchicha 1000-10000 2600 3,41 REPETIBILIDAD 8 Salchicha 1000-10000 2400 3,38

REPETIBILIDAD 9 Salchicha 1000-10000 2500 3,39

Promedio: 2500 3,39

PROMEDIO 1743 3.21

DESVIACIÓN ESTÁNDAR log ufc/gr o ml (s) 0,154

Cálculo de Repetibilidad del día 1

Se determina obteniendo la desviación estándar s

s =√Σ(xi – x)2 n-1 grados de libertad

n-1

Sr (log ufc/g o ml) = 0,15

Se determina el coeficiente de variación en el día 1:

MATRIZ S X % CV

VEGETALES 208.1666 1433.333 14.52325

FORMULA LACTEA 364.7373 1296.667 28.12884

SALCHICHA 100 2500 4

31

Día 2

No Muestra

Matriz


UFC/g o UFC/ml


log UFC/g o UFC/ ml

REPETIBILIDAD 1 Vegetales 1000-10000 2700 3,43


Promedio: 2600 3,41 REPETIBILIDAD 4 Fórmula

láctea 1000-10000 1960 3,29


1000-10000 2000 3,30


1000-10000 1900 3,27

Promedio: 1953 3,29 REPETIBILIDAD 7 Salchicha 1000-10000 2100 3,32


Promedio: 2290 3,35 PROMEDIO 2266 3,35

DESVIACIÓN ESTÁNDAR log ufc/gr o ml (s) 0,06




n-1



MATRIZ S X % CV

VEGETALES 100 2600 3,84

FORMULA LACTEA 50,33 1953 2,57

SALCHICHA 165,22 2290 7,21

32

Día 3

No Muestra

Matriz


UFC/g o UFC/ml


log UFC/g o UFC/ ml


REPETIBILIDAD 3 Vegetales 1000-10000 2500 3,39 Promedio: 2426 3,38


1000-10000 1640 3,21


1000-10000 1400 3,14


1000-10000 1650 3,21

Promedio: 1563 3,18


REPETIBILIDAD 9 Salchicha 1000-10000 2260 3,35

Promedio: 2186 3,33

PROMEDIO 2033 3,30

DESVIACIÓN ESTÁNDAR (s) 0,09




n-1



MATRIZ S X % CV

VEGETALES 70,23 2426 2,89

FORMULA LACTEA 141,53 1563 9,05

SALCHICHA 64,29 2186 2,94

Una vez estimada la desviación estándar se promedia cuadráticamente las

estimaciones de repetibilidad de los 3 días:

33

SR (log ufc/g o ml) =√ (s1)2+ (s2)2+(s3)2/3=√ (0,15)2+(0,06)2+(0,09)2/3= 0,10

Se estima la reproducibilidad entre los tres días (SR), obteniendo la desviación

estándar de los promedios de los tres días

SR (log ufc/g o ml)=0,70

La desviación estándar de repetibilidad de las 3 matrices validadas en 3

días es de 0,10

La desviación estándar de reproducibilidad los 3 días ensayados en las

3 matrices validadas es de 0,70

No hay una diferencia significativa entre los resultados obtenidos por matriz , ya

que todas las muestras fortificadas artificialmente cumplen dentro del rango de

trabajo planeado, el cual era de 100-1000 ufc/g o ml.

No hay una diferencia significativa entre los resultados obtenidos por diferente

día, ya que todas las muestras fortificadas artificialmente cumplen dentro del

rango de trabajo planeado, el cual era de 100-1000 ufc/g o ml.

A pesar de que todas las muestras fueron fortificadas al mismo nivel de

contaminación, la formula láctea presenta una menor recuperación con la cepa

de e. coli ATCC 10536, a diferencia de las matrices de vegetales y salchicha.

6.5.5 REPRODUCIBILIDAD

Condiciones en las que operadores diferentes obtienen resultados de ensayo

independientes con el mismo método e idénticas muestras de ensayo, en

laboratorios diferentes y en equipos diferentes.

Para llevar a cabo la reproducibilidad, se incluyen resultados de un segundo

analista y resultados del analista titular de la fase de Repetibilidad.

El nivel fue de 1000 a 10000 UFC/g ó UFC/ml

34

Resultados del segundo analista:

Cálculo de Repetibilidad del analista 2.


–

n-1 grados de libertad


Se determina el coeficiente de variación del analista 2:

MATRIZ S X % CV

VEGETALES 416 2266 18,35

FORMULA LACTEA 173 1800 9,61

SALCHICHA 353 1060 33,30

No Muestra

Matriz


UFC/g o UFC/ml


log UFC/g o UFC/ ml

REPRODUCIBILIDAD 1 Vegetales 1000-10000 2600 3,41

REPRODUCIBILIDAD 2 Vegetales 1000-10000 1800 3,25 REPRODUCIBILIDAD 3 Vegetales 1000-10000 2400 3,38

Promedio: 2266 3.34 REPRODUCIBILIDAD 4 Fórmula

láctea 1000-10000 1900 3,27

REPRODUCIBILIDAD 5 Formula láctea

1000-10000 1900 3,27

REPRODUCIBILIDAD 6 Fórmula láctea

1000-10000 1600 3,20

Promedio: 1800 3.24 REPRODUCIBILIDAD 7 Salchicha 1000-10000 930 2,96

REPRODUCIBILIDAD 8 Salchicha 1000-10000 1460 3,16 REPRODUCIBILIDAD 9 Salchicha 1000-10000 790 2,89

Promedio: 1060 3.0 PROMEDIO 1708 3,20

DESVIACIÓN ESTÁNDAR (s) 0,17

35

Comparación con resultados del tercer día del analista titular contra los

resultados de del segundo analista:

No Muestra

Matriz

Nivel de contaminación log UFC/g o ml

Resultados analista 1 Log UFC/g

o ml

Resultados analista 2 Log UFC/g

o ml

REPRODUCIBILIDAD 1 Vegetales

3-4 3,37 3,41


3-4 3,38 3,25


3-4 3,39 3,38

Promedio: 3,38 3.34 REPRODUCIBILIDAD 4 Fórmula

láctea 3-4 3,21 3,27

REPRODUCIBILIDAD 5 Formula láctea

3-4 3,14 3,27

REPRODUCIBILIDAD 6 Fórmula láctea

3-4 3,21 3,20

Promedio: 3,18 3.24 REPRODUCIBILIDAD 7 Salchic

ha 3-4 3,33 2,96

REPRODUCIBILIDAD 8 Salchicha

3-4 3,33 3,16

REPRODUCIBILIDAD 9 salchicha

3-4 3,35 2,89

Promedio: 3,33 3.0 PROMEDIO 3,30 3,20

DESVIACIÓN ESTÁNDAR (s) 0,09 0,17

Se estimo si hay diferencia entre la precisión de los dos analistas, comparando

la precisión entre los dos analistas usando la prueba de F para varianza de dos

muestras usando α=0,05.

36

Prueba de f para varianza de 2

muestras

Variable

1

Variable

2

Media 3.301111 3.198889

Varianza 0.008186 0.030511

Observaciones 9 9

Grados de

libertad 8 8

F 0.268299

P(F<=f) una

Cola 0.040399

Valor critico

para f una cola 0.290858

Suponiendo que la prueba de f es una hipótesis en donde el valor límite para f

es de 0,29.

Obtenemos que F<0,29

Por lo tanto concluimos que no se observa diferencia significativa entre la

varianza de los dos analistas con α=0,05, después de analizar los resultados

del método validado en tres diferentes matrices.

37

Comparamos las medias de los dos analistas usando α=0,05

Prueba de t para dos muestras

suponiendo varianzas iguales

Variable

1

Variable

2

Media 3.301111 3.198889

Varianza 0.008186 0.030511

Observaciones 9 9

Varianza agrupada 0.019349

Diferencia hipotética de

las medias 0

Grados de libertad 16

t estadístico 1.55893

P(T<=t) one cola 0.069286

Valor critico de t una

cola 1.745884

P(T<=t) dos colas 0.138571

Valor critico de t dos

colas 2.119905

Evalúo diferencias en las medias entre ambos analistas (uso t como valor

absoluto para t de dos colas)

ItI <2,11

Por medio de este test no se observa diferencia significativa entre la diferencia

de los dos analistas con α=0,05

Se estima la reproducibilidad entre analistas (SR) obteniendo la desviación

estándar de los promedios de los dos analistas:

SR= Desviación estándar: = 0,07

38

El coeficiente de variación, muestra el grado de confianza de los datos

presentados presentan un grado de concordancia mayor del 20% en la matriz

de formula lactea y vegetales, no así en la matriz de salchicha del segundo día,

en la que se reporto un coeficiente de variación del 33 %. Por lo tanto se

evaluara un coeficiente de variación de >33% en estas matrices.

No existe diferencia significativa entre los resultados de los dos analistas,

después de realizar el análisis estadístico f y t con un nivel de significación

α=0,05

6.5.6 SESGO

Es el error sistemático total en contra posición al error aleatorio. No puede

haber una o más sistemática componentes de error que contribuyen a la

polarización. Una diferencia más sistemática del valor de referencia aceptado

se refleja por un valor de sesgo más grande.

En base a los resultados de repetitibilidad y reproducibilidad se calculó el sesgo

del ensayo.

Calculamos el promedio de los 3 días y del segundo analista:

= (log promedio, día 1+ log promedio día 2 + log promedio día 3 + log

promedio analista 2)/4*

= (3,21+3,35+3,30+3,20)/4

= 3,26

*No. de repeticiones: 4

Se da un valor asignado de 2457 ˜ 2500 UFC/g en base a la determinación del

nivel de inoculo

Se resta el log del valor asignado menos el promedio de los analistas:

= log (2500)-(3,26)=3,39-3,26= 0,13

Resultado del sesgo: 0,13

39

El coeficiente de variación, muestra el grado de confianza de los datos

presentados presentan un grado de concordancia mayor del 20% en la matriz

de formula láctea y vegetales, no así en la matriz de salchicha del segundo día,

en la que se reporto un coeficiente de variación del 33 %. Por lo tanto se

evaluara un coeficiente de variación de >33% en estas matrices.

No existe diferencia significativa entre los resultados de los dos analistas,

después de realizar el análisis estadístico f y t con un nivel de significación

α=0,05

6.5.7 SELECTIVIDAD

Determinar la capacidad del método de distinguir el analito o microorganismo

de interés entre otras sustancias o microorganismos interferentes, y/o

demostrar que el método es específico para cada determinación indicada

procedimiento de análisis.

Se analizaron doce muestras de 3 matrices diferentes, estas se contaminaron

con las cepas:

-Staphylococcus Aureus ATCC 25963

-Bacillus spizizenii ATCC 6633

Se obtuvieron los siguientes resultados del analista titular:

No Muestra

Matriz

Cepa / Nivel de

contaminación UFC/g o UFC/ml

Resultado esperado UFC/g o UFC/ml

Resultado obtenido UFC/g o UFC/ml

SELECTIVIDAD 1 Verduras S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g

SELECTIVIDAD 2 Verduras S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g SELECTIVIDAD 3 Verduras B. spizizenii/

1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g

SELECTIVIDAD 4 Verduras B. spizizenii/ 1x105

<10 UFC/g <10 UFC/g

SELECTIVIDAD 5 Fórmula láctea

S. aureus/ 1x105 <10 UFC/ ml <10 UFC/ ml

SELECTIVIDAD 6 Formula láctea



B. spizizenii/ 1x105

<10 UFC/ ml <10 UFC/ ml

40




SELECTIVIDAD 9 Salchicha S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g

SELECTIVIDAD 10 Salchicha S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g SELECTIVIDAD 11 salchicha B. spizizenii/

1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g

SELECTIVIDAD 12 salchicha B. spizizenii/ 1x105

<10 UFC/g <10 UFC/g

TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS 0

TOTAL DE MUESTRAS NEGATIVAS 12

TOTAL DE MUESTRAS 12

Resultados del analista 2:

No Muestra

Matriz

Cepa / Nivel de

contaminación UFC/g o UFC/ml

Resultado esperado UFC/g o UFC/ml

Resultado obtenido UFC/g o UFC/ml

SELECTIVIDAD 1 Verduras S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g SELECTIVIDAD 2 Verduras S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g


<10 UFC/g <10 UFC/g


<10 UFC/g <10 UFC/g

SELECTIVIDAD 5 Form. láctea










SELECTIVIDAD 9 Salchicha S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g SELECTIVIDAD 10 Salchicha S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g


<10 UFC/g <10 UFC/g


<10 UFC/g <10 UFC/g

TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS 0 TOTAL DE MUESTRAS NEGATIVAS 12

TOTAL DE MUESTRAS 12

41

Con los datos obtenidos se estiman los parámetros que caracterizan el

rendimiento del método:

Especificidad relativa

Donde

SP=especificidad relativa

NA=total de muestras negativas

PD=total de muestras positivas

Se cumple con el parámetro de especificidad relativa ≥ 90%.

42

VII.CONCLUSIONES

Se evaluó la eficiencia de las placas Petrifilm TM en comparación con la

técnica de la norma NOM-113-SSA1-1994 Método para la cuenta de

Microorganismos Coliformes Totales en placa. Concluyéndose que la

técnica de las placas PetrifilmTM estudiada proporciona resultados

equivalentes a los obtenidos por el método de la norma de SSA.

No hay diferencias estadísticamente significativas entre las técnicas

evaluadas para cada muestra de alimento con un nivel de confianza del

90%.

Existe un alto grado de concordancia entre las técnicas realizadas, lo

que significa que entre las técnicas de recuentos utilizadas existe una

variación menor del 10%.

Se demostró la selectividad del medio Agar Rojo Violeta Bilis Lactosa

(rvba) para monitoreo de Escherichia coli ATCC 10536.

VIII. RECOMENDACIONES

Acreditación por Secretaria de Salud

43

IX.BIBLIOGRAFIA

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