Control Microbiologico de Materias Primas y Productos Farmaceuticos No Esteriles

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� Objetivo

� Fundamento

� Materiales

� Procedimiento

� Resultados

� Conclusiones

� Actividades adicionales

� Bibliografía

Trabajo Práctico Nº 1

CONTROL MICROBIOLÓGICODE MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTOS

FARMACÉUTICOS NO ESTÉRILES

INTRODUCCIÓN

Durante el proceso de fabricación, almacenamiento yuso, los medicamentos son susceptibles de contami-narse con microorganismos como bacterias, mohos ylevaduras, y por consiguiente se pueden deteriorar.

La contaminación de los productos farmacéuticos,representa un riesgo para la salud del usuario; esteriesgo se relaciona con la severidad de la infección oenfermedad que los microorganismos contaminantes,patógenos u oportunistas, pueden producir.

Por otra parte, el deterioro microbiano podría conlle-var a cambios en las características físicas y quími-cas que conducirían a que el producto deteriorado nosea apto para ser usado.

Es por ello, que las materias primas y los productosfarmacéuticos terminados, deben ser sometidos a unanálisis microbiológico que demuestre que cumplencon ciertas especificaciones establecidas por los or-ganismos oficiales, para garantizar que los productosson adecuados para el uso al que están destinados.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – CONTROL MICROBIOLÓGICO DE MATERIAS PRIMAS YPRODUCTOS FARMACÉUTICOS NO ESTÉRILES

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1. 2

Este análisis o control microbiológico de las materias primas y de los productosmedicamentosos no estériles, involucra la realización de dos tipos de ensayos:

a. Recuentos microbianos, referidos básicamente al recuento total de bacte-rias aerobias mesófilas y/o recuento de mohos y levaduras.

b. Investigación de microorganismos patógenos objetables, llamados tambiénindicadores específicos, como Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonasaeruginosa y Staphylococcus aureus.

OBJETIVO

Al finalizar el trabajo práctico, el estudiante estará en capacidad, mediante la con-sulta bibliográfica y la aplicación de las técnicas microbiológicas, de realizar elcontrol microbiológico de materias primas y productos farmacéuticos no estériles,utilizando metodologías oficiales (USP).

FUNDAMENTO

Consiste en determinar el número de bacterias aerobias mesófilas y el número demohos y levaduras en materias primas y productos farmacéuticos no estériles, yrealizar la investigación de los microorganismos objetables que puedan estar pre-sentes en ese producto, mediante técnicas de siembra en placas.

1. Numeración de bacterias aerobias mesófilas. Recuento en placas (Métododel vaciado en placas).

MATERIALES

Muestras de materias primas y medicamentosPlacas estérilesPipetas estériles de 1 mL y de 10 mLPropipetasTubos de agar soya-caseína (18-20 mL) fundido y enfriado a 45-50ºCFrascos de dilución con buffer fosfato pH 7.2Baño de María a 45-50ºCEstufa o incubadoraContador de colonias

PROCEDIMIENTO

1. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra homogeneizada por agita-ción, y añadirlos a un frasco de dilución que contiene 90 mL de buffer fosfato pH7,2 estéril. Agitar el frasco vigorosamente (25 veces). Rotular 10-1.

2. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la dilución 10-1 a un frasco de dilución

con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar. Rotular 10--2.


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1. 3

3. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la dilución 10-2 a un frasco de dilucióncon 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar. Rotular 10--3.

4. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-1 a cada

una de 2 placas de Petri estériles. 5. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-2 a cada una

de 2 placas de Petri estériles.

6. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-3 a cada unade 2 placas de Petri estériles.

7. Verter en cada una de las placas, 15 mL de agar soya caseína, fundido y enfria-

do a 45ºC, mezclando cuidadosamente las muestras con el agar. Dejar solidificare incubar en posición invertida a 37ºC por 48 horas.

Esquema para la numeración de bacterias aerobias mesófilas.


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RESULTADOS

Contar el número de colonias en las placas usando el contador de colonias.

Calcular el número de microorganismos viables por mL de muestra, expresadocomo unidades formadoras de colonias por mL (u.f.c./mL) (ver Anexo de notacióncientífica y diluciones).

Anotar los resultados:

Número promedio de colonias (seleccionar las placas que tengan entre 30 y 300

colonias por placa): _____________________

Factor de dilución de las placas seleccionadas: _____________________

Número de u.f.c./mL: _____________________

CONCLUSIONES

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2. Numeración de mohos y levaduras.

MATERIALES

Muestras de materias primas y medicamentosPlacas estérilesPipetas estériles de 1 mL y 10 mLPropipetasTubos de agar Sabouraud o papa-glucosa (18-20 mL) fundido y enfriado a 45-50ºC.Frascos de dilución con buffer fosfato pH 7.2MecheroBaño de María a 45-50ºCEstufa o incubadoraContador de colonias

PROCEDIMIENTO

Proceder de la misma forma descrita para la numeración de bacterias aerobiasmesófilas, pero utilizando agar Sabouraud o agar papa-glucosa, en vez de agarsoya caseína, e incubar las placas (sin invertir) a 20-25ºC por 5 a 7 días.


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RESULTADOS

Contar el número de colonias en las placas usando el contador de colonias.

Calcular el número de mohos y levaduras por mL de muestra, expresado comounidades formadoras de colonias por mL (u.f.c./mL) (ver Anexo de notación científi-ca y diluciones).


Número promedio de colonias (seleccionar las placas que tengan entre 30 y 300

colonias por placa): _____________________

Factor de dilución de las placas seleccionadas: _____________________

Número de u.f.c./mL: _____________________

CONCLUSIONES

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3. Investigación de microorganismos patógenos objetables

3.a. Investigación de Salmonella (género) y Escherichia coli.

MATERIALES

Pipetas de 10 mL y de 1 mLPropipetasPlacas estérilesCaldo lactosado (90 mL)Caldo tetrationatoCaldo selenito cistinaAgar verde brillanteAgar desoxicolatoAgar sulfito bismutoAgar triple azúcar hierro (TSI)Agar MacConkeyAgar LevineAsa y filamentoMecheroEquipo para coloración de GramEstufa


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PROCEDIMIENTO

Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra a un balón que contiene 90mL de caldo lactosado. Incubar a 30 - 35ºC por 24 a 48 horas.

Aislamiento de Salmonella

1. Agitar la mezcla incubada y transferir 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo sele-nito-cistina y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato. Incubar a 35ºCpor 12 - 24 horas.

2. Después del período de incubación, mediante un asa, hacer aislamientos a par-tir de los caldos selenito-cistina y tetrationato a los agares verde brillante, deso-xicolato citrato y sulfito-bismuto. Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas.

3. Notar la presencia de colonias típicas de Salmonella: Agar verde brillante: Pequeñas, incoloras, rosadas ó fucsias, transparentes u opacas, sobre el mediocoloreado de rosado a rojo. Agar desoxicolato- citrato: Pequeñas, incoloras, elevadas, opacas; algunas cepas producen colonias con elcentro negro.


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Agar sulfito-bismuto: Marrones o negras, algunas veces con brillo metálico alrededor de la colonia (S.typhi). Algunas cepas producen colonias verdes con poco o ningún oscurecimientodel medio. 4. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausen-

cia de Salmonella. 5. Si se encuentran colonias típicas, transferir a agar nutritivo inclinado y a agar

hierro tres azúcares (TSI, triple sugar iron). Incubar a 35ºC por 18 - 24 horas. 6. Los cultivos típicos de Salmonella en agar TSI presentan la parte inferior del

medio amarilla (formación de ácido) y el bisel rojo (alcalino), con o sin oscure-cimiento, generalmente con formación de gas.

Agar TSI Salmonella en agar TSI (sin inocular) 7. Hacer una coloración de Gram: los miembros del género Salmonella, son baci-

los Gram negativos no esporulados. 8. Confirmar la presencia de Salmonella por pruebas bioquímicas tradicionales y/o

por sistemas miniaturizados tales como API� o MicroID� y mediante pruebas se-rológicas.

Bisel

Taco

Lactosanegativo

H2S positivo

Glucosa positivo


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Aislamiento de E. coli.

1. Con un asa, hacer un aislamiento a partir de caldo lactosado, a agar MacCon-key. Incubar a 35ºC por 24 horas.

2. Las colonias de coliformes en agar MacConkey son de color rojo ladrillo, even-

tualmente rodeadas de zonas de bilis precipitada. 3. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausen-

cia de coliformes. 4. Si hay colonias típicas, transplante una de estas colonias a agar eosina-azul de

metileno-lactosa, según Levine. Incubar a 35ºC por 24-48 horas. Las coloniasde E. coli en este medio, se caracterizan por dar color negro azulado al trasluz ybrillo metálico dorado verdoso a la luz incidente.

5. Transferir las colonias típicas del agar eosina-azul de metileno-lactosa (agarLevine), a agar nutritivo inclinado y a agar TSI. Incubar a 35ºC por 24 horas.

6. Los cultivos típicos de E. coli en agar TSI presentan el bisel amarillo, sin oscu-

recimiento y con formación de gas.Lactosa positivo

Lactosa negativo

H2S positivo

Agar TSI Glucosa positivo (sin inocular)

E. coli

Bisel

Taco


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7. Hacer una coloración de Gram: E. coli es un bacilo Gram negativo no esporula-

do. 8. Confirmar la presencia de E. coli por medio de pruebas bioquímicas adicionales

como por ejemplo el Test del IMViC, o utilizando sistemas miniaturizados talescomo API� o MicroID�.

3. b. Investigación de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa .

MATERIALES

Pipetas de 10 mLPropipetasPlacas estérilesCaldo Soya Caseína (90 mL)Agar Vogel-Johnson (o Baird Parker o manitol sal)Agar nutritivo inclinadoPlasma EDTA (para coagulasa)Caldo cerebro corazónAgar cetrimidePapel de filtroReactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruroAsa y filamentoMecheroEquipo para coloración de GramEstufa

PROCEDIMIENTO

Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra a un balón que contiene 90mL de caldo soya-caseína. Incubar a 30 - 35ºC por 24 - 48 horas.

Aislamiento de Staphylococcus aureus.

1. Agitar la mezcla incubada y mediante un asa hacer aislamiento a agar Vogel-Johnson (o agar Baird-Parker o agar manitol sal). Incubar a 35ºC por 24-48horas.


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2. Las colonias típicas de Staphylococcus aureus en agar Vogel-Johnson o enagar Baird-Parker, son pequeñas, negras, rodeadas de una zona amarilla.

Agar Baird-Parker Agar Vogel-Johnson 3. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia

de Staphylococcus aureus. 4. Si hay colonias típicas, con ayuda de un filamento, transferir un número repre-

sentativo de las colonias sospechosas a tubos de agar nutritivo inclinado. Incu-bar a 35ºC por 24 horas.

5. A partir de los tubos de agar nutritivo, hacer coloración de Gram: el S. aureus es

un coco Gram positivo. Transplantar a tubos con caldo cerebro corazón. Incubara 35ºC por 24 horas.

6. Efectuar la prueba de coagulasa de la siguiente forma:

En un tubo de Wassermann colocar 0,5 mL de Plas-ma EDTA (para coagulasa) reconstituido; añadir 2gotas (0,1 mL) del cultivo de 24 horas del microorga-nismo desarrollado en caldo cerebro corazón. Incubaren baño de agua a 37ºC, durante 3 horas. Examinaral cabo de este tiempo y luego periódicamente du-rante 24 horas, para comprobar la formación de coá-gulos; cualquier grado de coagulación, por pequeñoque sea , se considera positivo.

Si no se observa coagulación, la muestra cumple el requisito en cuanto a au-sencia de Staphylococcus aureus.

7. Confirmar la presencia de S. aureus por medio de pruebas bioquímicas.


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1. 11

Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa .

1. Mediante un asa hacer aislamiento del caldo soya caseína a agar cetrimide.Incubar a 35ºC por 24 horas.

2. Las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimide son peque-

ñas, generalmente de color verdoso, con fluorescencia verdosa a la luz ultra-violeta.

3. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia

de Ps. aeruginosa. 4. Si hay colonias típicas, transferir a agar nutritivo inclinado. Incubar a 35ºC por

24 horas. 5. A partir del agar nutritivo hacer una coloración de Gram: la Ps. aeruginosa es un

bacilo Gram negativo no esporulado. 6. Efectuar la prueba de oxidasa:

En una placa de Petri colocar un disco de papel de filtro. Impregnar con el reac-tivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro y dejarlo secar en la estufa. Con una pipeta Pasteur estéril con la punta cerrada, transferir una pequeñacantidad del cultivo del tubo de agar inclinado, al papel de filtro. El desarrollo de un color rosado, casi púrpura, se considera una prueba de oxi-dasa positiva. Oxidasa positiva

7. Si esta última es negativa, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia

de Ps. aeruginosa.

Oxidasa negativa


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1. 12

8. Si la prueba de oxidasa es positiva, la presencia de Ps. aeruginosa debe con-firmarse por pruebas bioquímicas adicionales.

La validez de los resultados de los ensayos descritos (determinación del tipo demicroorganismo), dependerá de la demostración de que las muestras bajo ensayono presentan de por sí, efectos inhibidores de la multiplicación de los microorga-nismos que pudieran estar presentes. Por consiguiente, para demostrar el efectoinhibidor de las muestras, se realiza un ensayo adicional, preliminar o simultáneoconsiderado como control positivo que consiste en inocular los caldos de enrique-cimiento que se utilizan en las técnicas descritas anteriormente, con 1 mL de unadilución 10-3 de un cultivo de 24 horas de cada uno de los microorganismos eninvestigación, añadir la cantidad apropiada de muestra y proceder de la mismaforma como se describió para el ensayo de la muestra sola.

RESULTADOS


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CONCLUSIONES

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ACTIVIDADES ADICIONALES

1. Escoja un medio selectivo de los que Ud. utilizó en el trabajo asignado. Ex-plique porqué fue seleccionado ese medio.

2. Qué significa el test del IMViC y cuáles microorganismos nos permite iden-tificar.

3. Porqué en el medio agar TSI, se puede observar fermentación de azúcaresy la producción de H2S.


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1. 13

4. En qué caso se considera que una placa proveniente de una numeración demicroorganismos es contable.

5. Señale si existe alguna (s) diferencia (s) entre el método del recuento enplaca por incorporación y el método del recuento en superficie.

6. Cuándo se considera que un producto está deteriorado y cuáles son lascausas.

BIBLIOGRAFÍA

Brock T.D. Madigan M.T. Martenko J.J. y Parker J. (Eds) Biología de los microor-ganismos. 8ª Edición. Prentice Hall International. (1999).

Prescott, L.M. y col. Microbiology. W.C. Brown Publishers. 4ª Edición. (1998).

The Official Compendia os Standards USP 24 NF. The United States Pharmaco-peia. The National Formulary. Pharmacopeial Convention Inc. Rockville MD(1999).

www.bact.wisc.edu/bact102/102bactid2.html

Norma De CastroMaría Luisa De CurtisEnero 2002

Fotografías tomadas por el Farmacéutico Wilson Infante

Agradecimiento al Preparador de la Cátedra Osmar Alvarado por la elaboración delos cultivos.

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