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Controllo Qualità, Validazione Metodi Multiresiduo e
Accreditamento: Considerazioni
dott.ssa Patrizia Stefanelli
X CONVEGNO
Attività dell’ Amministrazione Pubblica In Materia di Controllo dei Residui di Fitofarmaci negli Alimenti
Roma, 24 Gennaio 2013
Reg (CE) 882/2004 - Controlli Ufficiali
Capo III: CAMPIONAMENTO e ANALISI
Articolo 11 Metodi di campionamento e di analisi
1. I metodi di campionamento e analisi utilizzati nel contesto dei controlli ufficiali sono conformi alle pertinenti norme comunitarie oppure
a) se tali norme non esistono, a norme o protocolli riconosciuti internazionalmente, ad esempio quelli accettati dal CEN o quelli accettati dalla legislazione nazionale; oppure
in assenza, ad altri metodi utili al raggiungimento degli obiettivi o sviluppati conformemente a protocolli scientifici.
2. Allorquando il paragrafo 1 non è d’applicazione, i metodi di analisi possono essere convalidati in un unico laboratorio conformemente ad un protocollo riconosciuto internazionalmente.
3. I metodi di analisi devono essere caratterizzati, quando possibile, dai criteri opportuni elencati nell’allegato III
Reg (CE) 882/2004 - Controlli Ufficiali
ALLEGATO III
1. I metodi di analisi devono essere caratterizzati dai seguenti criteri:
a) esattezza; b) applicabilità (matrice e gamma di concentrazione); c) limite di rivelazione; d) limite di determinazione; e) precisione; f) ripetibilità; g) riproducibilità; h) recupero; i) selettività; j) sensibilità; k) linearità; l) incertezza della misurazione; m) altri criteri a scelta.
Reg (CE) 882/2004 - Controlli Ufficiali
Capo III: CAMPIONAMENTO e ANALISI
Articolo 12 Laboratori ufficiali
1. L’autorità competente designa i laboratori che possono eseguire l’analisi dei
campioni prelevati durante i controlli ufficiali.
2. Le autorità competenti, tuttavia, possono designare soltanto i laboratori che operano, sono valutati e accreditati conformemente alle seguenti norme europee:
a) EN ISO/IEC 17025 su “Criteri generali sulla competenza dei laboratori di prova e di taratura” ….omissis….
3. L’accreditamento e la valutazione dei laboratori di prova di cui al paragrafo 2 possono riguardare singole prove o gruppi di prove.
Reg (CE) 396/2005
Capo V - Controlli Ufficiali, Relazioni e Sanzioni
Sezione 1 - Controlli ufficiali degli LMR
Articolo 28 Metodi di analisi
1. I metodi di analisi dei residui di antiparassitari devono essere conformi ai
criteri stabiliti dalle pertinenti disposizioni della legislazione comunitaria relativa ai controlli ufficiali per alimenti e mangimi
… omissis … 3. Tutti i laboratori incaricati dell’analisi dei campioni ai fini dei controlli ufficiali
sui residui di antiparassitari partecipano alle prove interlaboratorio comunitarie per i residui di antiparassitari ed organizzate dalla Commissione.
UNI EN ISO/IEC 17025:2005 Paragrafo 4.2
“Il Laboratorio deve stabilire, attuare e mantenere attivo un sistema di gestione adatto al campo delle sue attività”
“… è politica del Laboratorio che le attività siano svolte ad un elevato livello di professionalità, che le dichiarazioni di conformità sui campioni analizzati dai Reparti e i pareri richiesti sui quesiti posti al Dipartimento, in considerazione anche del ruolo di riferimento riconosciuto all’Istituto, siano basati su dati certi, affidabili, ottenuti in conformità ai requisiti normativi vigenti …
… di migliorare con continuità le prestazioni del Dipartimento … di soddisfare le esigenze delle istituzioni, enti e singoli cittadini interessati ai servizi resi dal Dipartimento … ”
Analisi di revisione
Casi di allerta
Laboratorio non routinario
Attività non programmabile
Politica della Qualità
Realizzazione Servizi
Gestione Risorse
Responsabilità Gestione
Analisi, Controllo,
Miglioramento
Revisione del Sistema
Non Conformità
Metodi : validazione
verifica
Controllo qualità
Conformità
Presentazione risultati
SANCO/12495/2011 Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide
Residues Analysis in Food and Feed
Controllo
Qualità
SANCO/12495/2011 Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide
Residues Analysis in Food and Feed
On going performance validation/verification
dimostrare la robustezza attraverso la valutazione
dei recuperi e della RSDwr
dimostrare l’applicabilità ad altre matrici
appartenenti alla stessa categoria di prodotti
alimentari
determinare i limiti di accettabilità per i risultati dei
recuperi singoli
raccogliere informazioni per stimare l’incertezza
della misura intra-laboratorio
integrare la validazione del metodo a nuovi
principi attivi
Metodo interno
Si definisce metodo di prova interno un metodo che:
è stato interamente o in parte sviluppato dal Laboratorio, anche se pubblicato su riviste, oppure un metodo pubblicato su riviste o definito dal costruttore della apparecchiatura, anche se riportante dati di validazione,
oppure
un metodo i cui dati di validazione non sono riconosciuti da una organizzazione aventi come finalità quello di definire metodi di prova, come ad es. l’EPA, l’AOAC, il CNR-IRSA, in quanto di responsabilità dei soli autori del metodo
Metodo non interno
Si definisce “metodo non interno” un metodo di prova che:
è stato emesso da un ente di normazione, come ad es. UNI, ISO, CEN, ASTM, ecc. o da altre organizzazioni riconosciute aventi come finalità quello di definire metodi di prova, come ad es. l’EPA, l’AOAC, il CNR-IRSA, l’ISTISAN, ecc. Rientrano in questa categoria di definizione anche i metodi richiamati da leggi in vigore, (metodi ufficiali), norme per la certificazione di prodotto, o richiesti da organismi notificati
Validazione Metodi Multiresiduo Parametri Criteri di Accettabilità
Esattezza Recuperi medi 70 – 120%
Singolo recupero 60 – 140%
n ≥5 due livelli concentrazione
Precisione (Ripetibilità)
RSD 20%
Selettività (Specificità)
S 30% Analisi di bianchi
Limite di quantificazione
Livello di aggiunta più basso (con esattezza e precisione accettabili)
0.01mg/kg o al Limite determinazione analitica
Linearità Strumentale
Incertezza U (x) 50%
Precisione (Riproducibilità intra – lab) RSD 20%
Annualmente al LOQ
Robustezza
Sensibilità
Controllo Qualità e Robustezza
0
50
100
150
200
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
140
(%) Recovery control chart of the "initial" method for
pesticides in olive oil
0
50
100
150
200
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
(%)
Recovery control chart of the "modified" method for
pesticides in olive oil
Internal Quality Control as tool for planning a ruggedness study regarding a pesticide multi residue method in olive oil
Patrizia Stefanelli, Tiziana Generali, Silvana Girolimetti and Roberto Dommarco
Poster Presentation at the EURACHEM Workshop on Key Challenges in Internal Quality Control, October 2012, Berlin
http://www.eurachem.org/index.php/events/completed/91-wks-qc-2012
Un metodo di prova non interno, prima della sua esecuzione per le prove e prima del suo inserimento nella richiesta di accreditamento, è da sottoporre ad una serie di verifiche per accertare se il Laboratorio è in grado di eseguirlo correttamente. In pratica vanno rideterminate ed esaminate quelle caratteristiche prestazionali del metodo che dipendono dal Laboratorio in cui viene effettuata la prova. Devono essere confermate le seguenti competenze:
Ripetibilità
Esattezza
Limite di quantificazione
Verifica metodi non interni
Verifica Metodo Normato UNI EN 15662:2009
Metodo di prova verificato a due livelli di concentrazione (0.01mg/kg e 0.1mg/kg)
Risultati comparabili con quanto previsto dal Metodo Normato
Risultati conformi a quanto previsto dalle linee guida di settore (SANCO/12495/2011)
40
60
80
100
120
140
160
2-F
en
ilfen
olo
3-I
dro
ssic
arb
ofu
ran
o
Ace
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iprid
Ald
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Azin
fos-m
etile
Azin
fos-e
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Bife
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Ca
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Clo
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s
Clo
rpirifo
s-m
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Cip
erm
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n
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do
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so
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to
EP
N
Etio
n
Recu
pero
(%
) Confronto delle prestazioni del laboratorio con quelle del metodo
Scelta delle Matrici SANCO/12495/2011
Metodo Normato
Verifica Metodo Normato UNI EN 15662:2009
Matrici (M)
Composti analizzati (N)
Verifica metodo (Fase iniziale) LOQ – 10 LOQ
Controllo Qualità Interno
(annualmente LOQ)
High water content (Ma)
Ma,1; N1 Ma,2; n1+n2+n3+n4
High starch content and low water and
fat content (Mb)
Mb,1; N2 Ma,2; n1 +n2+n3+n4
High acid content (Mc)
Mc,1; N3 Mc,2; n1 +n2+n3+n4
High sugar and low water content
(Md) Md,1; N4 Md,2; n1 +n2+n3+n4
Pro
do
tti d
i o
rig
ine
veg
eta
le
Specificità e Selettività P
rod
ott
i d
i o
rig
ine
veg
eta
le
Risposta del bianco sia < 30% rispetto il livello del residuo corrispondente
al LOQ
Richieste per l’identificazione per differenti tipi di MS
MS Mode Esempi di
sistemi Acquisizione Richieste per
l’identificazione
Singolo MS (std. mass res.)
Quad., Ion Trap, TOF
Full scan, SIM, lim. m/z range
≥ 3 ioni diagnostici (preferibilmente incl. Ione molecolare)
Singolo MS (High mass res.)
TOF, Orbitrap,
Magnetic sector Full scan, SIM, lim. m/z range
≥ 2 ioni diagnostici (preferibilmente incl. Ione molecolare)
Almeno 1 ione frammento (mass accuracy< 5ppm)
MS/MS QQQ, Ion Trap, Ibridi MS (es. Q-TOF, Q-trap)
SRM, MRM, Full scan ion product
≥ 2 ioni prodotto
Controllo Qualità e Specificità/Selettività
ESEMPIO
Ethion - Riso
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
0.75
0.8
0 2 4 6 8 10 12 14
Low Level High Level STDM
Ion
Rat
io
Controllo Qualità e Specificità/Selettività
ESEMPIO
Isofenphos Methyl - Riso
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Low Level High Level STDM
Ion
Rat
io
Controllo Qualità ed Incertezza della Misura
documento SANCO/12495/2011
Al fine di armonizzare i laboratori preposti al controllo ufficiale dei
residui di pesticidi negli alimenti, raccomanda l’utilizzo di un valore
predefinito di incertezza estesa del 50%, basato su risultati ottenuti da
prove interlaboratorio a livello UE.
L’utilizzo di tale valore predefinito è subordinato alla dimostrazione che
l’incertezza estesa del laboratorio non sia significativamente superiore
al 50%.
Controllo Qualità e Incertezza della Misura
Top - down Bottom - up
difficile
applicazione
per Metodi
Multiresiduo
Controllo Qualità ed Incertezza della Misura
Top – down Approach
Annex C documento SANCO/12495/2011
22
C )(')('u' biasuRwu
Il Laboratorio può utilizzare i dati prodotti in corso di Controllo Qualità Interno ed Esterno
Controllo Qualità e Incertezza della Misura
(Qn/N1/2) 1.9124
u'(Cref) 0.0705
u'(Cref)2 0.0050
(bias’)2 1.5926
RMSibias 0.2164
(RMSibias)
2 0.0468
u'(bias) 0.2276
u'(bias)2 0.0518
u’(Rw) 0.07
u'(Rw)2 0.0049
u'(c) mg/kg 0.2381
U (c) mg/kg 0.4763
U (c) % 48
ESEMPIO Annex C documento SANCO/12495/2011
Uncertainty Estimation in the Analysis of Pesticide Residues in Olive Oil using Data From Proficiency Tests
Patrizia Stefanelli, Tiziana Generali, Danilo Attard Barbini, Silvana Girolimetti , Roberto Dommarco
Accepted for publication at J. of ENVIRONMENTAL SCIENCE AND HEALTH, PART B - 2013
Controllo Qualità e Incertezza della Misura
Top – down Approach
Annex C documento SANCO/12495/2011
22)(')(' ' CRMS refbias
ubiasu
m
biasRMS bias
2' )'(
m
N
Qn
Cu ref'
Controllo Qualità ed Incertezza della Misura
Top – down Approach
Annex C documento SANCO/12495/2011
)(' Rwu
Min–Max
25%-75%
Median value
Observed value
Exp
ect
ed
no
rmal
Normal Q–Q plot of all recovery data
= incertezza standard relativa di
riproducibilità intra-laboratorio
Schema procedurale ISO 5725
1. Raccolta dei dati sperimentali prodotti in corso di validazione
iniziale e QC - Metodo Multiresiduo su olio di oliva
(0.01 mg/kg – 0.5 mg/kg)
2. Verifica della Normalità (Test Shapiro – Wilks)
3. Ipotesi di raggruppare i recuperi in due gruppi di dati
High Level (HL) and Low Level concentration (LL)
4. Verifica dell’omogeneità della varianza (Test F) dei due gruppi
5. Stima di uno scarto tipo pool (spool)
