Correction du Contrôle continu 2007

Durée: 2 heures

Sujet proposé par Sébastien BLOYER d’après Viré et al (2006), Nature (439)16-871-874 et Kirmizis et al (2004), Genes & Dev (18) 1592-1605.

Question 1 (10 points). Donnez la définition du terme épigénétique dans le cadre de la régulation de l’expression des gènes. Quelle(s) différence(s) y a-t-il entre génétique et épigénétique ? A quel(s) niveau(x) agissent les mécanismes épigénétiques ? (1 page maximum)

Figure 1. A- Des cellules U2OS ont ˇtˇ traitˇ es 48 heures par des ARN interfˇ rents (ARNi) ciblant le g¸ ne de la GFP (green fluorescent protein ; RNAi control) ou le g¸ne EZH2 (RNAi EZH2). Apr¸s extraction des ARN totaux de ces cellules, des expˇr iences de transcription inverse suivies dÕune PCR (RT-PCR) utilisant des amorces spˇc ifiques des transcrits EZH2, MYT1 et Actin sont rˇa lisˇs. Les produits de PCR sont ensuite sˇ parˇs par fractionnement dans un gel dÕagarose puis rˇvˇ lˇs par fixation de bromure dÕthidium. B- En para ll¸ le, il a ˇ tˇ rˇa lisˇ des e xpˇr iences dÕimmunodˇtect ion lÕaide dÕanticorps anti-EZH2 et anti-actine (Western Blot : WB) avec des extraits protˇ iques issus de ce s mmes cellules fractionnˇ s par ˇ lectrophor¸ se monodimensionnelle en conditions dˇ naturantes et rˇ ductrices.

Question 2 (3 points). Analysez et commentez la figure 1. Q uelle fonction

poss¸de la protˇin e EZH2 sur le g¸ ne MYT1 ? (15 lignes maximum)

1- Dans les cellules U2OS, EZH2 est exprimé:- Présence de transcrits EZH2 par RT-PCR- Présence de protéine EZH2 par WB

2- Dans les cellules U2OS traitées par un ARNi ciblant EZH2 on observe que le gène EZH2 est inactivé:

- Absence de transcrits EZH2 par RT-PCR- Absence de protéine EZH2 par WB

CONCLUSION #1:EZH2 est exprimé dans les cellules U2OS et l’ARNi EZH2 permet d’inactivé spécifiquement le gène EZH2 dans les cellules U2OS car un ARNi ciblant la GFP n’a aucun effet.

3- Le gène MYT1 semble réprimé dans les cellules U2OS4- Cette répression est levée dans les cellules U2OS traitées par un ARNi ciblant EZH2 car on observe bcp plus de transcrit MYT1

CONCLUSION #2:EZH2 réprime l’expression/transcription du gène MYT1 dans les cellules U2OS.

Question 3 (5 points). Rappelez brièvement le but ainsi que les différentes étapes de la technique d’immunoprécipitation de chromatine. Analysez la figure 2B. Pour quelle raison avoir utilisé des anticorps anti-H3K9me3, anti-Histone H3 et anti-ARN polymérase II ? (1/2 page)

But: Analyser les interactions protéine-ADN in vivo

Fixation des cellules par le HCHO

+ SLOT/DOT Blot

Analysez la figure 2B. Pour quelle raison avoir utilisé des anticorps anti-H3K9me3, anti-Histone H3 et anti-ARN polymérase II ? (1/2 page)

1- La protéine EZH2 se fixe en amont (-800/-2000), en aval (-200/+600) et au niveau (+1) du promoteur du gène MYT1.2- On observe que la lysine 27 de l’histone H3 est tri-méthylée dans ces même régions

Pour quelle raison avoir utilisé des anticorps anti-H3K9me3, anti-Histone H3 et anti-ARN polymérase II ?

3- anti-H3K9me3 : Témoin négatif de l’expérience (H3K9me3 étant une marque épigénétique associée à l’hétérochromatine)

4- anti-Histone H3: Témoin positif de l’expérience5- anti-ARN Pol II: Rapporteur de l’activité transcriptionelle

Question 4 (4 points). Interprˇtez les rˇsul tats de la figure 2C. Quelle(s) principale(s) conclusion(s) pouvez-vous en tirer ? Est-ce en accord avec les rˇsu ltats prˇse ntˇs fi gure 1 ? (20 lignes maximum)

1- Dans les cellules traitées avec l’ARNi EZH2 on observe pas de H3K27me3 en aval du promoteur.

CONCLUSION #1 (+ cours): EZH2 est une protéine a activité histone methyltransférase (HMTase) dont la fonction est de triméthylé spécifiquement la lysine 27 de l’histone H3.

2- On observe la fixation de l’ARN Pol II en aval du promoteur.

CONCLUSION #2: Ceci est en accord avec les résultats de la figure 1 (le gène MYT1 est déréprimé dans les cellules traitées avec l’ARNi EZH2) puisque le gène MYT1 est transcrit (présence de l’ARN Pol II)

Question 5 (5 points).Quel est le but de l’expérience présentée dans la figure 3 ? Interprétez les figures 3 et 4. Quelle(s) principale(s) conclusion(s) pouvez-vous en tirer ? (1 page maximum)

Figure 3. Un extra it nuclˇa ire prˇpa rˇ partir de cellules HeLa a ˇ tˇ soumis une immunoprˇc ipitation avec un sˇru m prˇ -immun (P.I.) ou avec des anticorps (Ab) ant i-PLZF (tˇ moin nˇgat if) ou anti-EZH2. Les complexes immunoprˇc ipitˇs (IP) ont ensuite ˇ tˇ incubˇs avec 500 ng dÕoligonuclˇot ides double brin de 33 paires de bases hˇ mi-mˇthy lˇs sur l es cytosines et avec du S -adˇ nosyl-mˇ thionine (SAM) marquˇ radioactivement au [14C]. Apr¸s une heure dÕincubation 37C, les oligonuclˇ otides sont purifiˇs sur colonne dÕaffinitˇ et la radioactivitˇ incorporˇe est mesurˇ e. En o rdonnˇe est indiquˇe la mesure de la radioactivitˇ en c.p.m. (coups par minute).

CONCLUSION:

Le(s) complexe(s) immuno-précipité(s) par l’anticorps anti-EZH2 possède(ent) une activité ADN-méthyltransférase (de maintient).

2 hypothèses:1- C’est une activité intrinsèque de la protéine EZH22- Cette activité est indirecte et dépend des protéines immunoprécipitées avec EZH2

Expérience de co-immunoprécipitation (CoIP):- EZH2 est immunoprécipitée par les anticorps anti-DNMTs- les DNMTs sont immunoprécipitées par l’anticorps anti-EZH2

CONCLUSION:EZH2 et les DNMTs interagissent ensemble in vivo.Possibilité d’un complexe protéique EZH2/DNMTsCe complexe pourrait avoir une activité de méthylation de l’ADN de novo (DNMT1) et de maintient (DNMT3a/b, cf. Figure 3)

L’hypothèse #2 formulée précédemment (2- Cette activité dépend des protéines immunoprécipitées avec EZH2) est favorisé. Des expérience complémentaires sont nécessaire afin infirmer l’hypothèse #1 (activité ADN méthyltransférase intrinsèque d’EZH2).

Question 6 (6 points). A lÕaide dÕun schˇma simple, dˇcrivez bri¸vem ent le principe de la technique de sˇ quen¨age au Na-bisulfite. Quelle est la fonction du domaine SET de la protˇ ine EZH2 ? Interprˇtez succinctement les expˇrienc es de la figure 5. (1 page maximum)

Question 6 (6 points). A lÕaide dÕun schˇma simple, dˇcrivez bri¸vem ent le principe de la technique de sˇ quen¨age au Na-bisulfite. Quelle est la fonction du domaine SET de la protˇ ine EZH2 ? Interprˇtez succinctement les expˇrienc es de la figure 5. (1 page maximum)

Figure 5. Des cellules U2OS ont ˇtˇ t raitˇ es (A : Down-regulation) par un ARNi ciblant la GFP (RNAi control) ou EZH2 (RNAi EZH2) ou transfectˇes ( B : Over-expression) avec un p lasmide Ē vide Č (mock), un p lasmide permettant la surexpression de lÕADNc sauvage dÕEZH2 (EZH2 wt) ou de lÕADNc dÕEZH2 dˇ lˇt ˇ du domaine SET (EZH2 ĘSET). Apr¸ s 48 heures, lÕADN gˇ nomique de ces cellules a ˇtˇ e xtrait, traitˇ au Na-bisulfite et utilisˇ comme matrice dans des rˇact ions de PCR de fa¨on amplifier lÕ”lot CpG localisˇ en amont du promoteur du g¸ne MYT1 (-1700/-1500). Les diffˇ rents amplicons obtenus ont ensuite ˇtˇ sˇ quencˇs et les sˇquences comparˇes celle dÕADN tˇ moin de cellules non traitˇes au Na-bisulfite. Chaque case reprˇ sente la sˇ quence dÕun amplicon. Les cases blanches reprˇs entent lÕADN non-mˇthy lˇ et l es cases noires lÕADN mˇthy lˇ. A droite de chaque diagramme est prˇsentˇ un graphique rˇ capitulatif sur lequel figure le pourcentage de CpG mˇthy lˇs pour chaque expˇr ience.

1- Dans les cellules traitées avec l’ARNi EZH2 on observe une baisse de la méthylation de l’ADN d’environ 50% au niveau de l’îlot CpG localisé en amont du promoteur MYT1

2- Elle est 3 fois plus importante lorsque EZH2 est surexprimée

3- Cette activité dépend de la présence du domaine SET d’EZH2

CONCLUSION:La méthylation de l’ADN au niveau du gène MYT1 dépend de la présence de l’HMTase EZH2. Cette dernière est necessaire!

Elle dépend également du domaine SET de la protéine EZH2.

Hypothèse: c’est le domaine SET d’EZH2 qui sert au recrutement des DNMTs

Figure 6. Des ce llules U2OS ont ˇ tˇ traitˇes 48 heures par un ARNi ciblant la GFP ( piste 1, RNAi control), EZH2 (piste 2), DNMT1 (piste 3), DNMT3A (piste 4) ou DNMT3B (piste 5). Des expˇr iences de transcription inverse suivie dÕune PCR (RT-PCR) utilisant des amorces spˇc ifiques des transcrits MYT1 et Actin ont ˇ tˇ rˇa li-

-sˇes avec des e xtraits dÕARN prˇparˇs partir de ces cellules. Les produits de PCR ont ˇtˇ sˇpa rˇs par migration ˇ lectrophorˇt ique dans un gel dÕagarose et rˇ vˇ lˇs par fixation de bromure dÕthidium.

Question 7 (1 point). Interprˇtez les rˇsul tats de la figure 6. Concluez bri¸vement. (10 lignes maximum)

Dans des cellules traitées par des ARNi ciblant EZH2, DNMT1, DNMT3a ou DNMT3b on observe une dérépression du gène MYT1.

CONCLUSION: L’action conjointe de ces 4 protéines est nécessaire pour réprimer la transcription du gène MYT1.

Figure 7. Expˇr iences dÕimmunoprˇc ipitation de chromatine pontˇe (XChIP) rˇa lisˇ es avec des anticorps (Ab) anti-EZH2, anti-H3K27me3, anti-DNMT1, anti-DNMT3A, anti-DNMT3B, anti-ARN Polymˇrase II (RNA pol II) ou avec un s ˇ rum prˇ -immun (IgG) partir de cellules U2OS traitˇes 48 heures par un ARNi ciblant la GFP (RNAi control), EZH2, DNMT1, DNMT3A ou DNMT3B. Les produits de PCR (amplicons 9, figure 2A) ont ˇtˇ sˇparˇs par migration ˇ lectrophorˇt ique dans un gel dÕagarose puis colorˇs au bromure dÕˇthidium. Ē Input Č : PCR r ˇ alisˇe avec 2% d e chromatine prˇ levˇ e avant immunoprˇc ipitation et dˇpont ˇ e.

Question 8 (6 points). Interprˇtez les rˇ sultats de la figure 7. En une page

maximum et lÕaide dÕun schˇma explicatif, fa”tes une synth¸s e chronologique du mode dÕaction de la p rotˇine EZH2 et de ses interacteurs sur lÕexpression du g¸ ne MYT1.

Dans les cellules traitées par l’ARNi EZH2:- Perte de fixation des DNMTs

CONCLUSION: EZH2 recrute les DMNTs

Dans les cellules traitées par les ARNi DNMTs:- EZH2 est fixée et active (H3K27me3)- la fixation des autres DNMTs n’est pas affecté- La pol II est fixée- Le gène MYT1 est transcrit (Figure 6)

CONCLUSION: EZH2 est nécessaire mais pas suffisante pour réprimer la

transcription du gène MYT1 de manière stable

H3H3 MYT11- Fixation d’EZH2 en amont (-800/-2000), en aval (-200/+600) et au niveau (+1) du promoteur du gène MYT1.

EZH2EZH2

2- EZH2 trimethyle les lysines 27 de l’histone H3 au niveau de ces même région

H3H3

MYT1EZH2EZH2H3K27me3

H3K27me3

H3K27me3

H3K27me3

H3

3- EZH2 recrute (via son domaine SET) les DNMTs MYT1EZH2EZH2H3

K27me3

H3K27me3

H3K27me3

H3K27me3

H3

DNMTsDNMTs

4- Les DNMTs méthylent l’ADN au niveau des îlots CpGs du gène MYT1

MYT1EZH2EZH2H3K27me3

H3K27me3

H3K27me3

H3K27me3

H3

DNMTsDNMTs

CH3 CH3 CH3CH3

Le gène MYT1 est réprimé de façon stable

PcG PcG(Optionnel: la marque épigénétique H3K27me3 permet le recrutement du complexe répresseur PcG - > nécessaire mais pas suffisant! )