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Cos’ é uno spettrometro di massa?. Misura la massa di molecole convertite in ioni allo stato gassoso. Cio’ che viene effettivamente misurato in uno spettrometro di massa è il rapporto massa/carica. Si indica come generica unità di carica (che puo’ essere sia positiva che negativa) z. m/z. - PowerPoint PPT Presentation
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Cos’ é uno spettrometro di massa?
Misura la massa di molecole convertite in ioni allo stato gassoso
Cio’ che viene effettivamente misurato in uno spettrometro di massa è il rapporto massa/carica
Si indica come generica unità di carica (che puo’ essere sia positiva che negativa) z
m/z
Principio fisico
Porto la molecola allo stato gassoso
Trasformo la molecola neutra in uno ione, o positivo o negativo
Utilizzo campi elettrici e/o campi magnetici per separare i vari ioni della miscela in funzione del diverso valore di m/z
Osservo i vari ioni della miscela, ciascuno con un diverso m/z
Dalla Chimica organica alla proteomicaStoria: dall’inizio del 1900 oggetto di studio dei fisici
Durante la II guerra mondiale applicazioni per lo studio della composizione degli idrocarburi nei combustibili
1950-1980: Spettrometria di massa in chimica organicaFrammentazione, riconoscimento di gruppi funzionali, determinazione del peso molecolare, struttura molecolare
1980- Applicazioni in chimica biologica, determinazione precisa del peso molecolare di proteine e acidi nucleici
1995- Proteomica.
Applications
Mass spectrometers are used in industry and academia for both routine and research purposes. Brief summary of the major mass spectrometric applications:
•Biotechnology: the analysis of proteins, peptides, oligonucleotides •Pharmaceutical: drug discovery, combinatorial chemistry, pharmacokinetics, drug metabolism •Clinical: neonatal screening, haemoglobin analysis, drug testing •Environmental: PAHs, PCBs, water quality, food contamination •Geological: oil composition
La “vecchia” Spettrometria di massa
zV=1/2 mv2
z= carica dello ioneV= Potenziale del campo elettricom= massa dello ionev=velocità dello ione
Energia cinetica di ogni particella dipende dal potenziale del campo elettrico applicato
Il campo magnetico esercita una forza centripeta
La forza centripeta è equilibrata dalla forza centrifuga dello ione, che dipende dalla sua velocità e dal raggio di curvatura
Hzv=mv2/R v= zHR/m
zV=1/2 mv2
z= carica dello ioneV= Potenziale del campo elettricom= massa dello ionev=velocità dello ione
Hzv=mv2/R
v= zHR/m
zV=1/2 m(zHR/m)2 zV=1/2 z2H2R2/m m/z=H2R2/2V
R è fisso, H e V sono variabili, individuo ciascun frammento caratterizzato da diversa m/z
Ogni molecola M, in fase gassosa viene ionizzata e diviene uno ione M+
Se l’energia di ionizzazione è maggiore o dello stesso ordine della energia dei legami chimici covalenti, i legami possono rompersi e la molecola è soggetta a frammentazione.
IonizzazioneLa ionizzazione è il processo che, partendo dalla molecola neutra, porta alla formazione della specie ionizzata in fase gassosa
La scelta del metodo di ionizzazione è importante. Metodi diversi producono diversi tipi di ioni e, soprattutto, hanno efficacia diversa in funzione del tipo di molecole studiata.
Ionizzazione
Ionizzazione “hard”
Eccesso di energia nella molecole (rispetto alla energia di ionizzazione)
Estesa frammentazione
Ionizzazione “soft”
Basso contenuto energia nella molecole
Frammentazione limitata
How can Mass Spectrometry help Biochemists?
•Accurate molecular weight measurements sample confirmation, to determine the purity of a sample, to verify amino acid substitutions, to detect post-translational modifications, to calculate the number of disulphide bridges •Reaction monitoringto monitor enzyme reactions, chemical modification, protein digestion •Amino acid sequencingsequence confirmation, de novo characterisation of peptides, identification of proteins by database searching with a sequence “tag” from a proteolytic fragment •Oligonucleotide sequencingthe characterisation or quality control of oligonucleotides •Protein structureprotein folding monitored by H/D exchange, protein-ligand complex formation under physiological conditions, macromolecular structure determination
MALDI
Adatto allo studio dei composti polari
Applicazione alle molecole biologiche è tendenzialmente limitata ai bassi pesi molecolariCa. 10000
ElectroSpray Ionization
L’obiettivo è ottenere ioni con il rapporto m/z piu’ alto possibile
ESI permette di ottenere degli ioni con molte cariche z, e di consequenza permette di studiare sistemi di elevata massa m
La formazione degli ioni a temperatura ambiente permette di studiare sistemi anche labili. Tra esse le proteine multimeriche.
Nanospray
La diminuzione del diametro del capillare e la diminuzinoe del flusso della soluzione e alla base del cosidetto NANOSPRAY.
Nanospray è una tecnica di ionizzazione ancora piu’ “soft”.
Dunque crea ioni a piu’ alto rapporto m/z rispetto all’ESI “convenzionale”. Nanospray è dunque particolarmente adatto per la analisi di biomolecole
Folded and unfolded
Proteins in their native state, tend to produce multiply charged ions covering a smaller range of charge states. These charge states tend to have fewer charges than an unfolded protein would have, due to the inaccessibility of
many of the protonation sites.
Increasing the sampling cone voltage may provide sufficient energy for the protein to begin to unfold and create
a wider charge state distribution centering on more highly charged ions in the lower m/z region of the spectrum.
Folded and unfolded statesHolo and apo proteins
30-Oct-199814:50:44apo-pseudoazurin + Cu BMB, The University of Leeds
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000m/z0
100
%
0
100
%
SJ06 1 (1.242) Sm (SG, 2x1.00); Sb (10,10.00 ) Scan ES+ 9.15e5A9;1494.9
A101345.5
1223.7
1490.7
B81693.9
B91506.0
1513.01676.8
1706.5B7
1935.81718.6
SJ04 1 (1.415) Sm (SG, 2x1.00); Sb (10,10.00 ) Scan ES+ 2.08e6A15;893.0
A17788.0
744.5
A19705.3
A14956.7
A131030.3
958.5
A121116.0
1034.9
A111217.3 A10
1339.0 A91487.8
MW 13,381 Da apo-pseudoazurinanalysed in 1:1 aq. MeCN, pH 2
MW 13,444 Daapo-pseudoazurin with Cu bound analysed in water, pH 7
Positive or Negative Ionisation?
If the sample has functional groups that readily accept a proton (H+) then positive ion detection is used
e.g. amines R-NH2 + H+ R-NH3+
as in proteins, peptides
If the sample has functional groups that readily lose a proton then negative ion detection is used e.g. carboxylic acids R-CO2H R-CO2
– and alcohols R-OH R-O– as
in saccharides, oligonucleotides