Cours Aa2 Cml Paces 17sept-2013

I- Généralités!!

II- Les différents acides aminés!!II-1 Les acides aminés courants!

!II-2 Les acides aminés rares !!

III- Propriétés acido-basiques des acides aminés !!III-1 Ionisation/dissociation!!III-2 Courbes de titration acides aminés à chaîne latérale non ionisable!

!III-3 Courbes de titration acides aminés à chaîne latérale ionisable !!

IV- Autres propriétés des acides aminés !!!IV-1 Propriétés physiques!!IV-2 Réaction à la ninhydrine!

!

V- Rôle Biologique des acides aminés!!V-1 Intermédiaires métaboliques!!V-2 Précurseurs!

!

VI-Techniques dʼanalyse des acides aminés!!

LES ACIDES AMINES!

Diagramme de Venn !

Caroline Moyret-Lalle © !

Le groupe carboxyle (-COOH) se comporte comme un acide faible et libère un proton (-COO-) en milieu basique!

Le groupe amine (-NH2) se comporte comme une base faible et accepte un proton (-NH3

+) en milieu acide!

-N: + H+ ---------------> -N+-H !

H!

H!

H!

H!

AH+!

A-!

III- Propriétés acido-basiques des acides aminés!III-1 Ionisation/Dissociation des acides aminés!


Zwitterion!

- A un certain pH (caractéristique de l’AA), chaque AA est complètement ionisé :!

-le radical aminé (-NH3+) contient un proton!

-le radical carboxyle est dissocié (-COO-)!=> cʼest un ion dipolaire, appelé ion amphotère!!- Lorsque la somme des charges portées par lʼAA est nulle, lʼAA est alors appelé zwitterion!

Ion amphotère!

- Le pH est appelé point isoionique ou isoélectrique de l’AA = pHi !


On peut suivre l’état d’ionisation! d’un AA en fonction du pH !

Forme cationique! Forme zwitterionique! Forme anionique!

H-CH-COOH!! NH3

+!

H-CH-COO-!! NH3

+!

H-CH-COO-!! NH2!

H+! H+!

OH-! OH-!

A+! A0! A-!

pHi!chaîne latérale non dissociable!


!•  Les acides aminés ont des courbes de titration caractéristiques!

•  La courbe de titration permet de!

!- mesurer le pKa de chaque groupement ionisable! !

!- prédire la charge électrique des acides aminés à un pH donné!!

!- définir les régions de pouvoir tampon de l'acide aminé!

Courbes de titration des acides aminés!

Le titrage implique l’addition (ou l’élimination) graduelle de protons!


La courbe de titration est biphasique !

A+! A0! A-!

A+!

A0!

A-!

Points d’équivalence!100% d’une forme!

Points de demi équivalence!50%/50% de 2 formes pH = pKa!

III- Propriétés acido-basiques des acides aminés!III-2 Courbes de titration acides aminés à chaîne latérale non ionisable!


Equation d’Henderson-Hasselbach! !pH = pKa + log B/A !avec : B = R-COO-/ R-NH2!

! ! ! A = R-COOH/ R-NH3+!!Qd B=A => pH = pKa + log 1 => pH = pKa!!

Détermination des valeurs de pKa!

A+! A0! A-!

pHi = pI= ½ (pKa1 + pKa2)!!

pKa1! pKa2!



Courbe de titration de la glycine!

Espèce totalement protonée!

pH = pKa!

H3N+ -CH2-COO-!

H3N+ -CH2-COOH!

En concentrations équimolaires!

H2N -CH2-COO-!H3N+ -CH2-COO-!

En concentrations équimolaires!

Effet tampon dans les zones voisines des pKa!

pH = pKa!

Chaînes latérales sans groupe ionisable!

Les valeurs des pKa des acides aminés dont les chaînes latérales ne sont pas ionisables sont très proches mais pas identiques!


pHi = 3,25

pKa1!pKa2!

pKa3!

III- Propriétés acido-basiques des acides aminés!III-2 Courbes de titration acides aminés à chaîne latérale ionisable!

Attention: L’ordre de dissociation des fonctions dépend de la nature (donc du pKa) de la fonction portée par chaîne latérale!

!•  Groupe α-carboxylique (-COOH)!•  Groupe α-aminé (-NH2)!

•  Groupe ionisable de R !! ! !!

3 étapes d'ionisation = 3 valeurs de pKa!

Courbe de titration de l’acide glutamique!

A0! A-!A+! A2-!


H+!

OH-!

H+!

OH-!

A+! A0! A-!

Zwitterion!pI!

H+! OH-!

A2-!

pKa1 2,1! pKaR 3,8!

pKa2 9,8!

On peut suivre l’état d’ionisation d’un AA en fonction du pH !

chaîne latérale dissociable (Acide) : Glu!

NH3+-CH-COOH!

! !

COOH!

CH2!CH2!

NH3+-CH-COO-!

! !

COOH!

CH2!CH2!

NH3+-CH-COO-!

! !

COO-!

CH2!CH2!

NH2-CH-COO-!

! !

COO-!

CH2!CH2!


Courbe de titration de la Lysine!

pKa1!pKa2!

pKa3!

9.2!

pHi = 9,85!

A2+! A+! A0! A-!


pKa1 2,1! pKa2 9,2!

NH3+-(CH2)4-CH-COOH!

!! NH3

+!

pKaR 10,5!

NH3+-(CH2)4-CH-COO- !

!! NH3

+!

NH3+-(CH2)4-CH-COO-!

!! NH2!

NH2-(CH2)4-CH-COO-!!! NH2!

H+!

OH-!

H+!

OH-!

H+!

OH-!

A2+! A+!

A0! A-!

On peut suivre l’état d’ionisation d’un AA en fonction du pH !

chaîne latérale dissociable (Basique) : Lys!


7 acides aminés ont des chaînes latérales ionisables!!

•  Groupement carboxyle !: Acide aspartique ! !! ! ! ! Acide glutamique!

•  Groupement amine ! !: Lysine!•  Groupement guanidyle !: Arginine!

!!•  Noyau imidazole ! ! : Histidine!

!

Histidine : noyau imidazole!

pKaR = 12,5!

pKaR = 6,0!


• Groupement thiol ! ! !: Cystéine!

•  Groupement phénol ! !: Tyrosine!

NH2—CH —COOH! ! CH2!! S-!!

NH2—CH —COOH! ! CH2!! SH! pKaR = 8,3!

pKaR = 10,1!


Hydrophobicité des acides aminés!•  Le caractère hydrophobe ou hydrophile des acides aminés repose sur la possibilité pour leurs atomes d’échanger des liaisons hydrogène avec H2O!

•  La chaîne latérale des acides aminés est + ou – hydrophobe !

•  Attribution d’un indice d'hydrophobie et dʼun indice dʼhydrophilie à chaque acide aminé !

!! Hopp and Wood !(indice hydrophilie)!

Kyte and Doolittle!(indice hydrophobie)!


2 Enantiomères!

NH3+ à droite = D !

ou à gauche, L!

IV- Autres propriétés des acides aminés!!!

IV-1 Propriétés physiques!

L’isoleucine et la thréonine ont 2 carbones asymétriques!


•  Tryptophane ! !280 nm!•  Tyrosine ! !275 nm!•  Phénylalanine! !257 nm!

Cette propriété est utilisée pour le dosage des protéines en solution aqueuse!

Spectre d’absorption!des AA aromatiques!


La détermination de la concentration se fait en mesurant l’absorbance (A) de la solution - Loi de Beer-Lambert!

A = ε x L x c!A !Absorbance!L !Longueur du trajet optique (cm)!c !Concentration molaire!

ε !Coefficient d’extinction molaire (M-1 x cm-1). Constant pour !!chaque molécule dosée. !

I0! I!

I0 = Intensité du faisceau lumineux incident!I = Intensité du faisceau lumineux transmis!!

A=log I0/I!

La loi de Beer-Lambert est additive!


"."

"

La ninhydrine!révélateur !des acides aminés!

!réagit avec les amines !

primaires!

Réduction de la ninhydrine !

pourpre de Ruhemann"

IV- Autres propriétés des acides aminés!!!

IV-2 Réaction à la ninhydrine!

Ninhydrine réduite!Caroline Moyret-Lalle © !

Fonction essentielle des AA: composition des protéines,des peptides!!Certains AA (Gly, Glu) possèdent une activité biologique propre sous forme libres!

!- De nombreux AA sont les précurseurs de nombreuses molécules indispensables comme : !! !- Intermédiaires métaboliques la créatine, la citrulline, l’ornithine ! !- Hormones : les catécholamines, le GABA, les hormones thyroïdiennes! !- Nucléotides purique et pyrimidique (Asp et Gln)! !- Coenzymes comme le NAD (Nicotinamide-Adénine-Dinucléotide)!

!- Certains AA servent de substrats énergétiques!

V- Rôle Biologique des acides aminés!


Phosphate de pyridoxal!

Phosphate de !pyridoxamine!

« ping-pong »!

transaminase!

échange d’azote en 2 étapes!

irréversible!

réversible!


V- Rôle Biologique des acides aminés!!

V-1 Intermédiaires métaboliques!

NH2-CH2-CH2-SO3H!

taurine!

HO3S-CH2-CH-COOH!

NH2!

acide cystéique!

SH-CH2-CH-COOH!

NH2! cystéine!

oxydation!

décarboxylation!

Métabolisme de la cystéine!

Sels biliaires!


Acide Glutamique précurseur de GABA!

GABA (acide γ amino butyrique) : principal inhibiteur du SNC! !!!

GAD : Glutamique !acide décarboxylase!

Réponse au GABA modulée par d’autres molécules : benzodiazépines, barbituriques, alcool….!

Glu! GABA!GAD!

CO2!

Traitement!épilepsie!

V- Rôle Biologique des acides aminés!V-2 Précurseurs!!


!Allergies, anaphylaxie, urticaire, inflammation!!

L’histidine précurseur de l’histamine!

NH2—CH —COOH! ! CH2!! CH!CH!

N! NH!

CH!

NH2—CH2! ! CH2!! CH!CH!

N! NH!

CH!

Histidine!

CO2!

Histamine!

L-histidine décarboxylase. !

amine hydrophile vasoactive

Pathologie


Phe!

Tyr! hormones thyroïdiennes !T3 et T4!

DOPA!

Noradrénaline!

Adrénaline!

Dopaquinone!

Mélanine! Dopamine!

tyrosinase! Cu++!


La Phénylcétonurie!

-Des mutations produisant la maladie ont été décrites dans le gène codant l'enzyme : phénylalanine-hydroxylase!!

! ! !Phe ---------> Tyr!! ! phénylalanine-hydroxylase!

!- Phénylcétonurie : 1 / 15 000 naissances.!!- Le dysfonctionnement de la phénylalanine-hydroxylase => Phe => î Tyr => î de la synthèse des catécholamines => destruction progressive du cerveau et des cellules nerveuses => retard mental sévère!

Normes : 8 mg/l!

Test de Guthrie !!

Pathologie > 40 mg/l!

Bacillus subtilis! + analogue de F!


Soumis à un champ électrique, les AA migrent vers l'électrode de polarité opposée :!!pH>pHi, l'acide aminé a une charge globale négative => électrode positive (anode)!!pH<pHi, l'acide aminé a une charge globale positive => électrode négative (cathode)!!pH=pHi, l'acide aminé est sous forme zwitterionique => ne migre pas !

Séparation des acides aminés par électrophorèse!

Dans un tampon de pH 6!

VI-Techniques dʼanalyse des acides aminés!


Séparation d’acides aminés par CCM !

-La phase stationnaire est composé de cellulose déposé sur une feuille d’aluminium !!-Le solvant est composé de butanol, acide acétique, eau (70, 18, 12 ; v %)!!-La révélation se fait à la ninhydrine!

CCM de 20 acides !aminés protéinogènes !


échange réversiblement !des cations!!Résine-G- / X+ + cation+!! Résine-G- / cation + + X+!!!!

Résines cationiques!

SO3-!H2PO4-!COO-!

Na+!H+!

Chromatographie par échange d’ions!

Résines anioniques!

(R)2-N+H!

Cl-!OH-!

échange réversiblement !des anions !!Résine-G+ / Y- + anion- !!Résine-G+ / anion- + Y-!


NaCl 1M!Citrate 0,2M!

pH = 6,4!

Citrate de Na!0,2M!

pH =3.19!

Citrate de Na!0,2M!

pH = 4,25!

DST

EA

P

GC

MV L

I!

YF H

K

R

Chromatographie sur échangeurs dʼions!

Profil !

Chromatographie par échange d’ions!

Résine cationique


colonne!solvant!

V a n n e d’injection!

Robinet!

enregistreur!

Détecteur!Spectro, fluo…!UV!

Collecteur de fractions!

Chromatographie Liquide Haute Pression HPLC!

Injection à la seringue!

Augmentation de l’efficacité de la colonne, mais augmentation considérable de la résistance au passage du solvant.!


Séparation d’acides aminés par HPLC !

AA + PITC (phenylisothiocyanate) !

PTC-AA (phénylthiocarbamyl-AA)!

254

nm!

+ méthanol!

Chromophores-PTC!

Colonne de silicate!Caroline Moyret-Lalle © !

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