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CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS Determinação da Estrutura tri-dimensional de Proteínas utilizando difração de Raios-X. CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS. O processo completo - PowerPoint PPT Presentation
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http://www.cbi.cnpia.embrapa.br Paula Kuser Falcão
CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS
Determinação da Estrutura
tri-dimensional de Proteínas
utilizando
difração de Raios-X
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O processo completoconsiste em produzir cristais de proteínas (>0.1 mm na sua menor dimensão), nos quais as moléculas estejam razoavelmente bem ordenadas para que o feixe de raios-X incidente sobre esse cristal seja difratado gerando um padrão de reflexões que, através da análise dos dados cristalográficos, produzam um mapa tri-dimensional de densidade eletrônica da molécula. Um modelo da proteína com sequência conhecida deve então ser modelado neste mapa.
CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS
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POR QUE RAIOS-X ?
Adaptado de http://www.ipac.caltech.edu/Outreach/Multiwave/
O uso de radiação eletromagnética para visualizar objetos requer que a radiação tenha um comprimento de onda comparável às menores características que desejamos resolver. Os raios-X tem um comprimento de onda de 1.54Å. Este valor é próximo à distância entre átomos de carbono numa ligação peptídica, sendo então ideal para estudar estruturas de proteínas.
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Incidir Raios-X sobre uma única molécula resultaria num sinal extremamente fraco que nunca poderia ser detectado acima do nível de barulho, gerado pelo espalhamento da água e do ar. Um cristal arranja um número grande de moléculas na mesma orientação, então as ondas espalhadas podem ser adicionadas em fase aumentando o sinal a um nível que possa ser medido. O cristal atua como um
amplificador.
POR QUE CRISTAIS?
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• Uma gota é formada misturando-se volumes iguais de solução de proteína e de uma solução precipitante.
gota contendo proteína e precipitante
• Inicialmente a concentração de precipitante na gota é metade da sua concentração no poço.
• Um volume bem maior de precipitante é colocado em um reservatório abaixo da gota.
Método de difusão de vapor com a gota sentada
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GP120 - uma glicoproteína do
envelope exterior do vírus HIVtipo 1 Universidade de
Columbia
Proteína que liga quitina
Tjaard Pijning RU Groninger
Lisozima Eddie Snell NASA
Dihidrolipoamida desidrogenase Tassie & Roeber NASA
Biliverdina-IX redustase
complexada com NADP
Rosa Perez-Luque IBMB-CSIC Barcelona
Exemplos de cristais de proteínas já estudados
TIMAparícioLNLS
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Raios-X e Cristais de Proteínas
O Experimento :
Uma vez obtido, o cristal da proteína é irradiado com Raios-X
Placa de Imagem
Espelhos para focalizar o feixe de raios-x
Os raios-X são difratados pelo cristal
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Padrão de Difração de Raios-
X
A organização dos pontos no padrão está relacionada com a distribuição de moléculas no cristal;
Diferenças de intensidade relacionam-se com a distribuição dos átomos na molécula.
O espalhamento do feixe de raios-X pelo cristal produz o padrão de difração;
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Mapa de densidade eletrônica
O resultado do experimento não é a figura dos átomos , mas um mapa de distribuição dos elétrons
na molécula, isto é, um mapa de densidade eletrônica. No entanto, uma vez que os elétrons são
mais localizados ao redor do núcleo, o mapa de densidade eletrônica nos dá uma boa idéia da
molécula.
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Resolução
Todos os modelos tem uma incerteza na posição dos átomos. Valores numéricos pequenos para resolução significam uma pequena incerteza, então resolução alta; valores altos significam uma grande incerteza, então resolução baixa.
A resolução é medida em Ångstroms (Å).
Está diretamente relacionada com a distância mínima a que dois objetos podem estar e ainda serem vistos como dois objetos.
7.0 Å é uma resolução baixa para proteína
3.0 Å é uma resolução média
1.6 Å é alta resolução
Quebra na densidade eletrônica
Posição do CO não está bem definida
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Mapa de densidadeeletrônica
Átomos são inseridos na densidade
para construir o modelo daproteína
Ajustando o modelo na densidade eletrônica
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Construção do modelo da proteína
Uma vez obtido o mapa de densidade eletrônica, é necessário colocar a sequência de aminoácidos da proteína dentro da densidade para construir o modelo:
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Uma vez obtida a estrutura tri-dimensional da proteína podemos utilizá-la para: entender seu funcionamento...
Análise do modelo para estudo da função da proteína
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… visualizar partes específicas de uma proteína como sítios de ligação de pequenas moléculas, para entender como a ligação acontece...
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… fazer comparações entre estruturas de proteínas, ...
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Azul: cargas positivas
… visualizar a distribuição de cargas na superfície da proteína, etc.
Vermelho: cargas negativas