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ev Esp Med Legal. 2014;40(1):30---38
REVISTA ESPAÑOLA DEMEDICINA LEGAL
www.elsevier.es/mlegal
EVISIÓN
riterios cuantitativos en toxicología forense
aría Antonia Martínez González
nstituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses, Departamento de Madrid, Las Rozas de Madrid, Madrid, Espana
ecibido el 31 de enero de 2013; aceptado el 4 de marzo de 2013isponible en Internet el 18 de abril de 2013
PALABRAS CLAVECriterios;Cuantitativos;Toxicología;Forense
Resumen La toxicología forense requiere resultados analíticos científicamente indiscutiblesy legalmente defendibles. Disponer de datos analíticos fiables es indispensable para interpre-tar correctamente los resultados toxicológicos. Los criterios analíticos en toxicología forense,basados en las normativas y recomendaciones vigentes son proporcionados por prestigiososorganismos de ámbito internacional y local, y su cumplimiento es fundamental para obtenerresultados toxicológicos científicamente sólidos. Este trabajo supone una continuación en larevisión y evaluación de los criterios analíticos en toxicología forense, iniciada con el anteriortrabajo recientemente publicado en esta revista «Criterios cualitativos en toxicología forense».Su objetivo es contribuir a la calidad de la pericia y al avance en la unidad de criterio científico,aspectos cruciales en toxicología forense. Este trabajo revisa, evalúa y recopila los criterios parauna correcta cuantificación detallándose los requisitos para validar las metodologías. Además,pretende servir a aquellos profesionales que deban evaluar resultados toxicológicos emitidospor laboratorios forenses.© 2013 Asociación Nacional de Médicos Forenses. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos losderechos reservados.
KEYWORDSCriteria;Quantitative;Toxicology;Forensic
Quantitative criteria in forensic toxicology
Abstract Forensic toxicology requires indisputable and legally defensible analytical results.Reliable analytical results are essential for the accurate interpretation of toxicological findings.Analytical criteria in forensic toxicology ----based on the regulations and recommendations---- are
provided by prestigious international and local organizations, and their fulfilment is essential toachieve toxicological results based on solid scientific foundations. This work is a continuationof the review and assessment of analytical criteria in forensic toxicology, started with therecently published work in this journal «Qualitative criteria in forensic toxicology». It is aimedat contributing to the quality of the expert witness report and implementing common scientific criteria, both crucial aspects in forensic toxicology. The criteria necessary for an accurateCorreo electrónico: [email protected]
377-4732/$ – see front matter © 2013 Asociación Nacional de Médicos Forenses. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.ttp://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2013.03.002
Criterios cuantitativos en toxicología forense 31
quantification are reviewed, assessed and compiled in this work, detailing the requirements tovalidate methodologies. Moreover, this work is intended to serve those professionals who needto assess toxicological findings submitted by forensic laboratories.© 2013 Asociación Nacional de Médicos Forenses. Published by Elsevier España, S.L. All rightsreserved.
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Introducción
La toxicología forense (TF), se define como una de las disci-plinas científico-técnicas que constituyen las denominadasCiencias Forenses y que sitúa a la Toxicología al servicio dela Administración, fundamentalmente de la Justicia1.
No es posible hablar de TF sin hablar de toxicología ana-lítica. Esta hace uso de las herramientas que proporcionala química analítica en la estimación cualitativa y cuantita-tiva de las sustancias de interés toxicológico presentes enlos distintos tipos de matrices2.
El cumplimiento en TF de los criterios analíticos, basa-dos en las normativas y recomendaciones vigentes, esfundamental para lograr obtener resultados toxicológicoscientíficamente sólidos. En sus aspectos más generales,estos criterios son proporcionados por prestigiosos organis-mos de ámbito internacional y local en el área, entre los quedestacan:
- «Laboratory Guidelines»3, de la Asociación Internacionalde Toxicólogos Forenses (TIAFT).
- «Forensic Toxicology Laboratory Guidelines, 2006Version»4, de la Sociedad de Toxicólogos Forenses y laAcademia Americana de Ciencias Forenses (SOFT/AAFS).
- «Guidelines and Recommendations of the GTFCh»5, dela Sociedad Alemana de Química y Toxicología Forense(GTFCh).
Dichos criterios referentes a la cuantificación, estánbasados en varias recomendaciones y normativas entre lasque destacan citadas por orden cronológico de aparición:
- Las recomendaciones referentes al análisis cuantitativode drogas y/o sus metabolitos en muestras biológicasmediante cromatografía de gases (GC) o cromatografíade líquidos de alta presión (LC) y sus modernas combina-ciones con la espectrometría de masas (MS), tales comoLC-MS, LC-MS-MS, GC-MS, y GC-MS-MS elaboradas por laFDA, el CDER y el CVM y que aparecen recogidas en eldocumento «Guidance for Industry. Bioanalytical MethodValidation»6.
- La reglamentación sobre el análisis de residuos en los pro-ductos de origen animal. En Europa aparece recogida enel Diario Oficial de las Comunidades Europeas «EuropeanUnion Decision 2002/657/EC»7.
- La reglamentación analítica para el control del dopaje
en las prácticas deportivas elaborada por la WADA enel documento «WADA Technical Document TD2003IDCR,Identification Criteria for Qualitative Assays, Incorpora-ting Chromatography and Mass Spectrometry»8.tipl
Los requisitos generales para la Competencia de los Labo-atorios de Ensayo y Calibración que están recogidos en laorma UNE-EN ISO/EC 17025:20059, constituyen la base dea acreditación y, también están presentes en la filosofíae las recomendaciones y normativas anteriormente cita-as.
El presente trabajo «Criterios cuantitativos en TF», tieneomo objetivo continuar con la revisión, evaluación y reco-ilación en un único documento de las distintas directricesxistentes sobre criterios analíticos en TF, ya iniciada con elnterior trabajo recientemente publicado en esta revista10,Criterios cualitativos en TF». Con ello, se pretende enfati-ar la necesidad de su cumplimiento en las prácticas rutina-ias de los laboratorios de TF. Además, también se pretendeon ello contribuir a la calidad de la pericia y al avance en lanidad de criterio científico, aspectos cruciales en TF parabtener resultados analíticos basados en fundamentos cien-íficos sólidos, y que sean, por tanto, comparables y legal-ente defendibles ante los Tribunales de Justicia. Asimismo,
sta revisión y recopilación de criterios pretende servir aquellos profesionales que deban evaluar los resultados toxi-ológicos emitidos por los laboratorios forenses (tabla 1).
l análisis toxicológico cuantitativo
egún la TIAFT3, el análisis toxicológico comprende laetección, identificación y cuantificación de sustancias connterés toxicológico y la interpretación de sus resultados.
El análisis cuantitativo, tiene como objetivo determi-ar mediante una serie de procesos (pretratamiento deuestras, extracción-purificación y análisis instrumental) la
antidad o concentración en que los tóxicos se encuentrann la muestra en cuestión.
riterios de cuantificación
adas las connotaciones legales y sociales derivadas de losesultados analíticos, cualquier aspecto o procedimientoelacionado debe ser científicamente indiscutible y legal-ente defendible. Por ello, siempre deben conocerse losarámetros de validación del método, someterse a consi-eración y documentarse en los informes analíticos con eln de que los resultados puedan ser interpretados correcta-ente.A continuación se revisan, evalúan y recopilan los cri-
erios cuantitativos en TF, basados en las recomendacionesnternacionales, con relación a los aspectos analíticos claveara acometer la cuantificación de tóxicos en muestras bio-ógicas.
32 M.A. Martínez González
Tabla 1 Siglas utilizadas en el texto
Siglas Significado
CDER Center for Drug Evaluation and Research (Centro para la Evaluación e Investigación de Fármacos,dependiente de la USFDA)
CV Coeficiente de variación (indica la precisión de un método analítico, se expresa en porcentaje)CVM Center for Veterinary Medicine (Centro de Medicina Veterinaria, dependiente de la USFDA)GC Gas Chromatography (cromatografía de gases)GC-MS/GC-MS-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry (cromatografía de gases-espectrometría de masas)
GTFCh Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie (Sociedad Alemana de Química y ToxicologíaForense)
HPLC High Performance Liquid Chromatography (cromatografía de líquidos de alta resolución o presión)HS-GC-FID Cromatografía de gases con detector de ionización de llama acoplada a un autoanalizador de espacio en
cabezaIS Internal Standard (patrón interno)LC Liquid Chromatography (cromatografía de líquidos de alta resolución o presión)LC-MS/LC-MS-MS Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (cromatografía de líquidos-espectrometría de masas)
LD Límite de detecciónLLQ Lower limit of quantitation (límite de cuantificación bajo)LQ Límite de cuantificación (usualmente suele referirse LLQ, aunque, obviamente, existe también un ULQ)RPM Redistribución postmortemSD Standard deviation (desviación estándar)S/N Relación senal/ruidoSI Sistema InternacionalSOFT/AAFS Society of Forensic Toxicologists and American Academy of Forensic Sciences (Sociedad de Toxicólogos
Forenses y Academia Americana de Ciencias Forenses)TF Toxicología forenseTIAFT The International Association of Forensic Toxicologists (Asociación Internacional de Toxicólogos Forenses)Tra Tiempo de retención absolutoTrr Tiempo de retención relativoULQ Upper limit of quantitation (límite de cuantificación alto)UNE-EN ISO/
EC 17025:2005Requisitos generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración 17025:2005
USFDA United States Department of Health and Human Services Food and Drug Administration (AdministraciónAmericana de Alimentos y Medicamentos)
Xm Valor de una muestra utilizada como blancoal An
G
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-
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C
Li
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pedgoLtcj
WADA World Antidoping Agency (Agencia Mundi
eneralidades
on relación al análisis cuantitativo en TF conviene tenerresentes/adoptar los siguientes criterios3,4:
El análisis cuantitativo solamente se acometerá cuandosea significativo desde el punto de vista toxicológico parala interpretación del caso forense.
Los fármacos administrados en el hospital normalmenteno se cuantifican salvo petición expresa por denunciamédica.
Lo ideal es realizar el análisis cuantitativo en una alícuotade muestra distinta de la que se empleó para realizar elanálisis de barrido «screening» y/o cualitativo de la mues-tra.
riterios toxicológicos para la cuantificación
a sangre (o el plasma, en sujetos vivos) es la muestra másmportante objeto de cuantificación, ya que lo que en ella se
mr
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tidopaje)
etecta, sería, en principio, indicativo del efecto, terapéu-ico, tóxico o letal producido sobre el individuo11. Al evaluarstas concentraciones, hay que tener siempre en cuenta,ue en los consumos asociados de drogas de abuso y psico-ármacos (u otros tóxicos en general) los efectos tóxicos sonusceptibles de potenciarse por fenómenos de sinergismo.
Con relación a las drogas de abuso, si bien estas siem-re suelen ser objeto de cuantificación y muy especialmenten la muestra de sangre, cabe resaltar que de los resulta-os cuantitativos de las mismas no se puede desprender elrado de afectación tóxica, no pudiendo aquí, además, serlvidados los fenómenos de tolerancia en los toxicómanos.as drogas de abuso no son fármacos, no existiendo, poranto, concentraciones terapéuticas («seguras») y/o tóxi-as/letales, ya que en ausencia de otra circunstancia queustifique la causa de la muerte, su sola presencia en las
uestras biológicas puede ser compatible con la misma poreacción adversa.Las cuantificaciones realizadas en vísceras y contenido
ástrico (si se conoce su totalidad) aportan información
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Criterios cuantitativos en toxicología forense
complementaria a la obtenida de la muestra de sangre,siendo muy valiosas, especialmente, en casos de ingestasmasivas de tóxicos. Sin embargo, los resultados cuantitativosen orina no aportan ninguna información, por considerarsela orina muestra de eliminación, estando las concentracio-nes afectadas por la cantidad de líquidos ingeridos y por laactividad de la función renal12.
Para ser lo más preciso y exacto posible en la valo-ración toxicológica de las concentraciones de tóxicos, esfundamental conocer todos los detalles de la historia delcaso.
Las concentraciones de tóxicos en sangre postmortemdeben ser siempre evaluadas con cautela, pues muchos tóxi-cos son inestables, por sufrir degradación (bacteriana y/ometabólica)13---15, y/o redistribución postmortem (RPM)16---23,desde las etapas más tempranas de acontecer el falleci-miento. Las concentraciones postmortem no reflejarían,pues, con exactitud las concentraciones antemortem. Lostubos que tienen como conservante fluoruro sódico y comoanticoagulante oxalato potásico, y que usualmente tienentapón de color gris, son los ideales para tomar la muestrade sangre, pues evitarán que los tóxicos se degraden y, ade-más, facilitarán su correcta medición. No obstante, tambiénes necesario tomar muestra de sangre en tubos sin aditivos,usualmente son los de tapón rojo, pues hay tóxicos como lospesticidas organofosforados24 y muchos psicofármacos13---15
susceptibles de degradarse por la acción del ión fluoruro.Mantener las muestras biológicas congeladas hasta su aná-lisis al menos a −20 ◦C es clave para evitar la degradaciónde los tóxicos. Se sabe que, especialmente, los tóxicos decarácter básico y de alto volumen de distribución (p. ej.,los antidepresivos) sufren RPM, por ello sus concentracio-nes pueden estar incrementadas hasta 20 veces en sangrede cavidad central (p. ej., cardiaca) en comparación conla sangre periférica (p. ej., femoral)16,23. Los barridos toxi-cológicos iniciales deben por ello, realizarse en sangre decavidad central, pues es donde en general, los tóxicos van aestar más concentrados. Cuando las concentraciones detec-tadas en las sangre de cavidad central se encuentran enrango tóxico, se debe proceder a realizar la cuantificaciónen la sangre periférica para aclarar si se trata de un fenó-meno de la RPM. Contar pues, con ambos tipos de sangre,central y periférica, permitirá aclarar si el tóxico objetode interés ha estado sujeto a RPM, ello, posteriormente,permitirá poder realizar una correcta interpretación de losresultados toxicológicos.
De todo lo anteriormente expuesto, también sededuce que en matrices en descomposición, obviamente,las concentraciones obtenidas tienen un valor inter-pretativo altamente limitado desde el punto de vistatoxicológico.
Tipos de calibración
Para poder acometer con corrección el análisis cuantitativode las muestras los instrumentos de medida deben estarcalibrados. El calibrado en un método instrumental es el pro-
ceso mediante el que se obtiene una relación matemática(«función analítica») entre la senal del analito y su concen-tración mediante la comparación con uno o más patrones(«calibradores»).33
Los tipos de calibración que se recomienda emplear enos laboratorios de TF son12,25:
Curva de calibrado multinivel. Requiere un mínimo de3 calibradores, siendo deseables al menos 5, 2 de ellospróximos al límite de detección. Los gráficos de calibra-ción se construirán a partir de los patrones anadidos almismo tipo de matriz que la muestra objeto del análisisy someterse a los mismos procedimientos de extracciónque las muestras problema. El gráfico de calibracióndebe construirse representando los ratios (relaciones)analito/patrón interno (IS) de respuestas obtenidas en eldetector (eje de ordenadas) frente a las concentraciones(eje de abscisas). Es necesario determinar si la calibra-ción se ajusta a un modelo lineal, cuadrático u otro. Elmodelo lineal de calibración es el preferible, pero si esnecesario se debe emplear un modelo no-lineal. Los mode-los lineales deben aplicarse para conjuntos de datos conhomoscedasticidad, esto quiere decir que debe de exis-tir una homogeneidad de las varianzas a lo largo de todoel rango de calibración. Como regla de oro, esto debeesperarse para rangos de calibración que no se expan-dan más de un orden de magnitud. Sin embargo, la mayorparte de los métodos de análisis toxicológico se expanden2 o 3 órdenes de magnitud, lo cual suele llevar implícitoun grado significante de heteroscedasticidad. Para com-pensar la heteroscedasticidad debe adoptarse un modelode calibración basado en el ajuste ponderado mediantemínimos cuadrados utilizando un factor de ponderaciónde 1/×, 1/×2, 1/×3, etc. En el caso de adoptarse elmodelo lineal, debe siempre comprobarse que existe unarelación lineal entre la respuesta y la concentración alo largo de todo el rango de calibración establecido26---31.En todo caso, la concentración de un calibrador calcu-lada frente a la curva de calibrado con él generada debeestar comprendida en ± 20% de su valor. La curva de cali-brado se verificará en cada tanda de análisis mediante eluso de controles obtenidos de fuentes diferentes de lasque se han generado los calibradores y los resultados quearrojen también deben estar comprendidos en ± 20% desu valor nominal.
En el caso de que no se prepare una recta de cali-brado completa, por no tratarse de analitos objeto decuantificación frecuente en el laboratorio, los patronespara la cuantificación deben estar en torno a la con-centración del analito en la muestra problema. En estesentido, y con relación a los métodos analíticos basadosen un punto de calibración, Peters y Maurer32 concluye-ron, tras sus estudios, que la utilización de solo un puntode calibración en GC-MS y en LC-MS puede ser válida yconstituir una alternativa a la utilización de un rango com-pleto de calibradores si el punto de calibración elegidose sitúa cerca del punto medio del rango total de cali-bración. Tan et al.33 más recientemente han llegado a lamisma conclusión utilizando solo 2 puntos de calibraciónen LC-MS.
Método de las adiciones estándar. Se utiliza cuando
existe un efecto matriz que no es posible corregir. Con-siste en medir las respuestas de «n» alícuotas iguales dela muestra a las que se adicionarán (a todas menos a una)cantidades crecientes (en igual volumen) del analito que
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se pretende medir. La propia muestra problema actuarácomo blanco del método. Es un método laborioso que sesuele utilizar fundamentalmente en los métodos espec-trofotométricos y potenciométricos y, también, cuandoel blanco de matriz no es fácil de obtener como en elcaso de las muestras procedentes de embalsamamientos.El gráfico de calibración debe construirse representandolas respuestas detectadas (eje de ordenadas) frente a lasconcentraciones (eje de abscisas). El punto de corte de lagráfica (normalmente es lineal, recta de regresión) con eleje de abscisas determinará la concentración del analitoen la muestra.
Cualesquiera que sea el tipo de calibración utilizado,os resultados se expresarán siempre de forma inequívoca
utilizando unidades de medida del sistema internacionalSI).
ipos de calibradores
os tipos de calibradores que existen en los laboratoriosorenses son6,12,25:
Disoluciones de patrones: Son útiles cuando el métodono obliga al uso de otro tipo de patrones, y cuando noexiste efecto matriz (p. ej., análisis de volátiles por GCcon detector de ionización de llama acoplada a un autoa-nalizador de espacio en cabeza [HS-GC-FID]).
Material de referencia: En este material una o más pro-piedades deben estar confirmadas mediante un métodovalidado. Por ejemplo, la concentración certificada de unanalito en una determinada matriz, así una sangrecon una concentración certificada de alcohol etílico seríaun material de referencia certificado.
Calibradores fabricados en el propio laboratorio: Sonlos de mayor objeto de preocupación, se usan en métodosanalíticos complejos que requieren extracción, evapora-ción, etc. A partir de disoluciones «madre» del principioactivo de 1 mg/mL (en el disolvente adecuado) se obtie-nen lo que se llaman «disoluciones de patrones de trabajo»«working standard solutions» que se conservan a −20 ◦Cy en tubos de vidrio ámbar. Deben atemperarse antes desu uso y establecer su periodo de validez. Se utilizaránpara enriquecer («sembrar») las matrices y así generar loscalibradores.
atrón interno
e recomienda el uso del IS en todos los métodos de aná-isis cromatográficos 3,12,25,31. El IS corrige la cuantificaciónel analito, al minimizarse errores aleatorios y sistemáti-os, bien debidos a pérdida del analito por: adsorción a lasuperficies, extracción, evaporación, derivatización; comoambién a la irreproducibilidad del método durante la trans-erencia e inyección de la muestra en los equipos de análisis.o ideal es que el IS sea un homólogo del analito, y sio es posible, se elegirá un compuesto con propiedades
ísico-químicas muy similares. Cromatográficamente debeluir cerca del analito, y estar resuelto (suficientementeeparado) de cualquier otra sustancia que pueda estar pre-ente. Si el analito se va a derivatizar, el IS que se elijayldd
M.A. Martínez González
ebe formar un compuesto derivatizado análogo. Los isóto-os estables (p. ej., deuterados) son los que se recomiendanara los análisis por GC-MS y LC-MS, aunque los IS no deu-erados bien elegidos pueden proporcionar en ocasionesesultados equivalentes e incluso mejores. En el caso deos análisis por LC-MS los IS marcados isotópicamente sonos únicos que pueden compensar la «supresión iónica» (ionupression)34---36. Siempre que sea posible, el IS se prepararán disolución acuosa para facilitar su miscibilidad con lasuestras biológicas, y debe anadirse a estas lo antes posi-le en las etapas iniciales del método, y en cualquier caso,ntes de anadir el tampón y de proceder a la extracción.os marcadores que se anaden después de la extrac-ión inicial se consideran «patrones externos» y su uso esesaconsejable.
alidación y aspectos relacionados
ara garantizar la calidad y, por tanto, la fiabilidad de losesultados analíticos obtenidos en los laboratorios de TF,stos deben dimanarse de metodologías analíticas escritas,alidadas y aprobadas por el responsable del laborato-io, todo ello de acuerdo con la norma UNE-EN ISO/EC7025:20059, y siguiendo las directrices de los organismosnternacionales y la normativa internacional anteriormenteitados.
La validación de las metodologías junto a otras activi-ades englobadas en el control del aseguramiento de laalidad, permite demostrar a los laboratorios, en general,ue sus métodos analíticos proporcionan resultados fiables.alidar un método consiste en verificar y documentar sualidez, esto es, su adecuación a unos determinados requisi-os, previamente establecidos por el laboratorio para poderesolver un problema analítico particular.
Todos los métodos analíticos deben ser vali-ados6,26---31,37---47 utilizando la misma matriz en la quee manera rutinaria se van a realizar los análisis (p. ej.,angre, suero, tejidos), para ello las matrices se sembraránon cantidades conocidas de drogas/tóxicos y se analizarániguiendo el procedimiento analítico completo. Los paráme-ros analíticos que deben ser validados son la exactitud, larecisión y el rendimiento absoluto, todos ellos a diferentesoncentraciones, el rango de calibración, la selectividad,os límites de detección (LD) y de cuantificación (LQ) y sis posible también la robustez y la incertidumbre. Se reco-ienda que los límites bajo y alto de cuantificación (LLQ
ULQ) coincidan, respectivamente, con los calibradoresnferior y superior de la recta de calibración31. El rango dealibración en sangre debe ser tal, que, en principio, sirvaara abarcar concentraciones de fármacos desde terapéu-icas hasta letales22,48---58. En la validación de métodos porC-MS-MS es especialmente importante conocer el efectoatriz44,45.Modernamente, el rendimiento de extracción no se con-
idera, obviamente, un parámetro esencial de validación,ues los calibradores se preparan en la misma matriz31.in embargo, sí que es fundamental estudiar la exactitud
precisión (intra-ensayo e inter-ensayo). Para ello, se uti-izarán un mínimo de 5 determinaciones procedentes deiferentes tandas, por nivel de concentración (excluyén-ose las muestras blanco). Deben estudiarse un mínimo de 3
35
Tabla 2 Rangos de aceptabilidad* de tiempos de retencióncromatográficos
Tra Trr
GC ≤ ± 2% ≤ ± 1%HPLC ≤ ± 5% ≤ ± 2,5%
Fuente: tomado de las referencias4---6.* Con relación al material de referencia.
-
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Criterios cuantitativos en toxicología forense
concentraciones comprendidas en el rango de medida: baja,media y alta. El valor medio de la exactitud debe estar com-prendido en ± 15% del valor teórico, excepto en el LLQ quedebe estar comprendido en ± 20%. La precisión en torno alvalor medio no debe exceder el 15% del coeficiente de varia-ción (CV), excepto en el LLQ, donde el CV no debe excederel 20%6.
La SOFT/AAFS hace además especial mención a lossiguientes aspectos fundamentales a tener en cuenta conrelación al diseno de protocolos de validación de métodosanalíticos4:
- Al realizar los análisis en los laboratorios las muestrasdeben de agruparse en «tandas». Cada «tanda» debe decontener un número suficiente de controles y calibrado-res que dependerá del tamano de la tanda y del tipo deprueba.
- Cuando los análisis se vayan a realizar sobre muestrasno habituales (tejidos en descomposición, humor vítreo,etc.) deben emplearse, siempre que sea posible, calibra-dores apropiados a esas matrices, que sean preparados yanalizados a la par que las que las muestras.
- En el caso de los inmunoensayos, el laboratorio puedecalcular el LD sumando al valor medio del blanco (Xm)3 desviaciones estándar (SD), o sea, LD = Xm + 3 SD. Conrelación a las técnicas cromatográficas (p. ej., GC y cro-matografía de líquidos de alta resolución [HPLC]), si bienexisten diferentes métodos, para su cálculo, uno de ellosconsistiría en calcular el LD como la menor concentraciónde una droga que proporcionara una senal con una alturade pico de 3 veces la relación senal/ruido de fondo (S/N)correspondiente a un blanco de muestra. El valor del LDnunca debe de ser menor que el valor del blanco más 3 SD.El LQ puede ser calculado anadiendo al valor del blanco 10SD (LQ = Xm + 10 SD). Sin embargo, es preferible determi-nar el LQ experimentalmente como la concentración másbaja que puede medirse con un coeficiente de variaciónno superior al 20%.
- La linealidad del método debe establecerse utilizando almenos 3 calibradores. La concentración inicialmente esti-mada de la muestra problema debe estar comprendidadentro del rango de calibración. En el caso de que lamuestra problema tenga una concentración mayor quela del calibrador más alto, entonces la muestra debe pri-mero diluirse con agua desionizada, y después sometersea extracción. Si ello no se realizara, entonces debe dereportarse la concentración como mayor que el calibra-dor más alto. Si la concentración de la muestra estuvierapor debajo del calibrador más bajo se debe de anadir uncalibrador adicional que esté por debajo de la concen-tración del analito en la muestra. Otra opción posible esduplicar el volumen de la muestra y proceder a la re-extracción, siempre y cuando se haya demostrado que elanálisis no sea dependiente de la matriz. Si no se requiereuna cuantificación exacta, entonces se puede reportar quela muestra contiene al analito en una concentración menorque el calibrador más bajo («traza»). La utilización deltérmino «traza» implica que la sustancia está presente en
una concentración por encima del LD, pero por debajo delLQ del método.- El criterio de aceptación de una calibración cromato-gráfica debe de quedar establecido en el método. En el
tipm
caso de una calibración multinivel este factor es habitual-mente el coeficiente de correlación. En la mayor parte delas aplicaciones, se considera como un factor aceptable0,99. Sin embargo, puede haber casos en los que un coe-ficiente de correlación de 0,98 se pueda considerar comomínimamente aceptable. Además, se considera una buenapráctica evaluar la calibración calculando el valor de cadacalibrador frente a la curva generada. Valores de ± 20% seconsideran, en general, aceptables para la mayoría de lasaplicaciones, aunque en el caso del etanol se prefierenvalores de ± 10%.
Para muestras con concentraciones significativamentemayores que los calibradores más altos, el laboratoriodebe asegurarse y tomar precauciones para que no se pro-duzcan arrastres «carryover» en las siguientes muestrasque se analicen. Para asegurarse de que no existen posi-bilidades de falsos positivos por arrastres se debe realizaruna comprobación de la metodología analizando mues-tras similares con muy bajas concentraciones después delanálisis de una muestra con un valor positivo muy alto.
Es un hecho conocido que en un laboratorio, debido a dife-rentes causas, algunos resultados analíticos se desvían demodo falso y significativo del valor real («outliers»). Siesto le sucede a un blanco, a un control, o a un calibra-dor la percepción del hecho por el analista es obvia. Sinembargo, si esto le sucede a una muestra procedente deun caso, ello no se detectaría. Por esta razón, se reco-mienda replicar la extracción y el análisis cuantitativo,al menos en duplicado. El laboratorio debe determinar elcriterio de aceptabilidad para replicados de análisis. Unadesviación como máximo de ± 20% del valor medio se sueleconsiderar aceptable.
El tiempo de retención en los análisis cromatográficostiene también su rol dentro de los criterios de acep-tabilidad. Así, para análisis mediante GC se admitendesviaciones de los tiempos de retención (Tra) del 1-2%con relación a los calibradores o controles. En el casode análisis mediante HPLC son aceptables desviacionesligeramente superiores, y más concretamente si se hanrealizado en modo programado no-isocrático (tabla 2)4,5,7.
Finalmente, y como complemento ilustrativo y prácticoe este trabajo, de revisión, evaluación y recopilación deriterios para la correcta cuantificación de tóxicos en losaboratorios de TF, se hace referencia a los trabajos cien-íficos publicados en los últimos anos por los grupos denvestigadores del Dr. Maurer59---64 y de la Dra. Huestis65---68
or describirse en ellos excelentes ejemplos prácticos deétodos analíticos validados.
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onclusiones
l cumplimiento de los criterios cuantitativos, basados enas normativas y recomendaciones vigentes, es fundamentalara poder obtener resultados toxicológicos científicamenteólidos y, por tanto, indiscutibles y legalmente defendiblesnte los Tribunales de Justicia. La calidad de la pericia yl avance en la unidad de criterio científico, aspectos fun-amentales en TF, se sustentan en su cumplimiento. Laorrecta cuantificación de tóxicos requiere la aplicacióne metodologías analíticas de detección validadas basa-as en los criterios establecidos. En definitiva, la correctauantificación de tóxicos en las muestras biológicas, es indis-ensable para poder acometer posteriormente una correctanterpretación de los resultados toxicológicos. En base allo, el médico-forense, junto con el resto de la informaciónelativa al caso, podrá establecer finalmente la causa de lauerte. Es por tanto fundamental, que estos profesionales
stén familiarizados con los criterios existentes.
onflicto de intereses
a autora declara no tener ningún conflicto de intereses.
ibliografía
1. Society of Forensic Toxicologists «What is Forensic Toxicology»[consultado 31 Ene 2013]. Disponible en: http://www.abft.org/files/WHAT%20IS%20FORENSIC%20TOXICOLOGY.pdf
2. García-Rodríguez S, Gímenez MP. Recursos humanos en un labo-ratorio de toxicología forense. Rev Toxicol. 2005;22:1---11.
3. The International Association of Forensic Toxicologists (TIAFT),Laboratory Guidelines (fuente: TIAFT-Bulletin XXXI Number 4 p.23---26) [consultado 31 Ene 2013]. Disponible en: http://www.tiaft.org/files/bulletin/Volume%20XXXI%20Number%204.pdf
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