Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (CCF) Anlisis Instrumental II Diciembre, 20111

Operacin de CCF El adsorbente se mezcla con un aglutinante, a menudo yeso; esta mezcla se suspende en agua y se deposita sobre una placa de vidrio o sobre una superficie plana rgida, metlica o de un material plstico por medio de un dispositivo embadurnador apropiado. Al secarse, la suspensin queda adherida a la placa de vidrio, bien directamente o por efecto de un aglutinante, como una capa delgada y rugosa de adsorbente de un espesor de 0.1 a 2 mm. Esta capa puede utilizarse en cromatografa en forma similar a una hoja de papel. La separacin depende de las propiedades adsorbentes de la capa, tal como si el adsorbente estuviera rellenando una columna.2

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Ejemplo de aplicacin.

Separacin del sesquiterpenoide Hernandulcina de la planta P. dulcis.

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Mecanismos de separacin Adsorcin Reparto Intercambio inico Exclusin por tamao5

Adsorbentes y otros separadores cromatogrficos Los mismos o similares a los usados en CC. Menor tamao de partcula que en CC. Algunos adsorbentes cuentan con indicador fluorescente (Silicato de zinc emite luz de 254 a 360 nm) Adsorbente ms utilizado en CCF, Slica gel6

El proceso de adsorcin

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Separacin de dos componentes en un experimento de CCF

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Seleccin de las condiciones cromatogrficasSolventes seleccionados en orden de polaridad creciente.

Solvente hexanos ciclohexano tolueno Eter dietlico Acetato de etilo Cloruro de metileno acetona metanol agua

Constante dielctrica 1.89 2.02 2.38 4.34 6.02 8.93 20.7 32.7 80.1

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Diagrama que relaciona la polaridad de la muestra con la del solvente y la actividad del adsorbente para una buena separacin por CCF.

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Familias de compuestos orgnicos en orden creciente de polaridad: Hidrocarburos alifticos, halogenuros de alquilo, hidrocarburos insaturados, hidrocarburos aromticos, halogenuros de arilo, teres, steres, cetonas, aldehidos, amidas, aminas, alcoholes, fenoles, cidos carboxlicos, aminocidos.11

Enlaces de hidrgeno intra a intermoleculares

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Separacin de mezclas hipotticas. Compuesto 1 es ms polar que el compuesto 2.

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Ejercicio:Los siguientes fenoles fueron analizados por CCF en Slica Gel G usando una mezcla de tolueno, metanol y cido actico (10:2:1) como fase mvil. los valores de Rf medidos fueron: 0.20, 0.41, 0.63, 0.84. Indique el valor de Rf que corresponde a cada estructura.

resorcinol cido glico

salicilaldehido

Galato de etilo

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Separacin de mezclas hipotticas.

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Adsorbentes y otros separadores cromatogrficosxido de Aluminio (Almina) Adsorbente alcalino, preparado tambin como almina neutra y cida. Utilidad: Separacin de compuestos neutros y alcalinos, hidrocarburos policclicos, alcaloides, aminas, vitaminas liposolubles y algunas cetonas. La almina puede catalizar la descomposicin de muchos compuestos organicos, en particular cetonas insaturadas16

Adsorbentes y otros separadores cromatogrficos Slica Gel: Para separar: aldehdos, cetonas, alcaloides, azcares, fenoles, esteroides, terpenoides, cidos grasos y aminocidos. Cuando la slica gel no se activa por calor, contiene agua suficiente para que las separaciones ocurran por un mecanismo de reparto.17

Adsorbentes y otros separadores cromatogrficosClasificacin de la Almina de acuerdo al contenido de aguaCantidad de agua a adicionar al Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV Tipo V Cantidad de Agua determinada por el mtodo de Karl-Fischer (%) 4-4.5% 7-7.5% 11-11.5% 16-16.5%

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Adsorbentes y otros separadores cromatogrficos Celulosa y resinas cambiadoras de iones: Se emplean en la cromatografa de capa fina por intercambio inico y las resinas se usan tambin para separacin de compuestos orgnicos por mecanismo de reparto.

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Adsorbentes y otros separadores cromatogrficosPolvo de poliamidas: Formacin de enlaces de hidrgeno entre cadenas de polmero y solutos. Preparadas a partir de nylon 66, nylon 11 y nylon 6 Tipos de compuestos separados: flavonoides, fenoles, nitroanilinas, benzofenonas, derivados de aminocidos, etc.20

Adsorbentes y otros separadores cromatogrficos Aglutinantes: Su objeto es retener la capa del adsorbente sobre la placa; el ms comn es el yeso (sulfato de calcio monohidratado), que se aade a los adsorbentes en un 10 a 15%. Otro es el almidn que se aade en cantidades de 1 a 3%.

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Preparacin de PlacasAplicador Kensaco Espesores mltiples y compuertas intercambiables: capas de 250, 275, 500, 1500 y 2000 m de espesor. Compuerta para capas de espesores de 50 a 3000 m en etapas de 50 m. Valores de Rf constantes dentro de un intervalo de espesor razonablemente amplio (10 a 20 m) Compuertas con gradiente de espesor. Aplicadores con separadores de adsorbente, para dos a cinco secciones paralelas de diferentes capas de adsorbentes sobre la misma placa. Aplicador Camag: Estacionario, la placa se desplaza por debajo del aplicador. Se producen placas de 300 a 500 m de espesor y durante el secado se encoge la capa a 200-250 m. Preparacin de portaobjetos por sumergimiento en suspensin adsorbente. de

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Preparacin de PlacasSecado: Slica gel o almina, son secadas durante 15 minutos manteniendo el soporte en posicin vertical. Despus se seca en posicin vertical en un horno durante 1 a 2 h a 10-120 C. Actividad determinada efectuando la cromatografa de una mezcla patrn de colorantes (azobenceno, p-metoxiazobenceno, paminoazobenceno, sudn III y sudn IV) o mediante sustancias del tipo de las que se desean separar.24

Preparacin y aplicacin de muestrasProcedimientos similares a CP y CC.Aplicacin de resinas intercambiadoras de iones en punto de origen Muestras en disoluciones de 0.1 a 1% se aplican con micropipetas o microjeringas de 10 a 100 l de capacidad o con tubos capilares que terminen en un orificio de 0.5 a 0.1 mm de dimetro. Manchas deben tener de 1 a 3 mm de dimetro y estar separadas por 1 a 2 cm Separaciones analticas: aplicaciones de 5 a 100 g.25

Aplicacin de la muestra

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Anlisis del cromatograma

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Anlisis del cromatogramaRf depende principalmente de: El grosor del adsorbente La naturaleza de la fase estacionaria y su grado de activacin. La fase mvil La cantidad de material aplicado28

Anlisis del cromatograma El Rf es difcil de reproducir. Puede usarse un estndar del compuesto de inters para identificacin preliminar, deben realizarse anlisis posteriores, para confirmacin. Puede utilizarse tambin la co-cromatografa. En CCF el nmero de manchas indica el nmero mnimo de compuestos presentes en una muestra.29

Seleccin de sistemas de disolventes Tipos de disolventes utilizados en CCF dependiendo del adsorbente, su actividad y los solutos: Disolventes puros de las series eluotrpicas Mezclas de disolventes Disolventes totalmente acuosos, totalmente orgnicos, acuoso-orgnicos e inicos. Pequeas variaciones en la composicin de las mezclas de disolventes pueden variar Rf.30

Seleccin de sistemas de disolventes Mezclas equielutrpicas: Mezclas diversas de disolventes que pueden originar iguales desplazamientos de una misma mancha. En el estudio de productos naturales o de productos farmacuticos es conveniente correr cromatografas de la muestra usando mezclas de los mismos disolvente en diferentes proporciones.31

Mtodos de desarrollo en CCFPara publicar valores de Rf se recomienda: 1) Usar adsorbentes comerciales estndar 2) Preparar y activar siempre las capas de la misma manera 3) Aplicar cantidades pequeas y conocidas de los compuestos que se van a separar 4) Preequilibrar las cromatoplacas en una cmara cuidadosamente saturada 5) Desarrollar los cromatogramas a una distancia constante 6) Registrar el promedio de tres determinaciones o ms.32

Localizacin de zonas, identificacin y documentacinLocalizacin: Agentes cromgenos (tcnicas de visualizacin destructivas y no destructivas). Localizacin con luz UV a 254 nm (uso de silicato de Zn) Manchas radiactivas: contador de radiaciones o autorradiografa. Identificacin: Comparacin con compuestos de referencia Tcnicas espectrofotomtricas Documentacin: Delineacin en papel cebolla Fotografas Fotocopias33

Cromatoplacas CCF con indicadores fluorescentes visualizadas por luz UV

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Reactivos cromgenos utilizados en las CCF CCF, recomendable, rociado de la cromatoplaca con el reactivo. Hacerlo en campana de extraccin y a una distancia de 20 a 30 cm. Los cromatogramas deben examinarse con luz UV, (254 nm y 360 nm) antes y despus de la aplicacin de los agentes cromgenos. Agentes cromgenos permiten localizar en el cromatograma en papel de 1 a 10 g de compuesto y en cromatogramas en capa fina, de 0.1 a 1 g.35

Isotermas de adsorcin en CCF La calidad de una separacin cromatogrfica depende de la concentracin de la muestra, entre otros factores. Existe un nmero limitado de sitios de enlace en la superficie del adsorbente, por lo que hay tambin un lmite para la cantidad de material que puede ser adsorbido por unidad de rea. La grfica de la relacin entre las concentraciones den la Fase estacionaria ([A]s) y en la fase mvil ([A]m) para un compuesto hipottico, es llamada isoterma de adsorcin.36

Isotermas de adsorcin en CCF

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Efecto de la concentracin sobre la forma del pico

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Efecto de la concentracin sobre la forma del pico

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Ventajas y desventajas de CCF Ventajas: Facilidad de realizar en cualquier laboratorio. Velocidad Necesita solo pequeas cantidades de muestra (g) Utilidad: Seguimiento de reacciones, determinacin de nmero de compuestos en una mezcla, identificacin de compuestos, para seguimiento de cromatografas en columna y para verificar la pureza de las muestras.

Limitaciones: No se pueden analizar compuestos voltiles. Cuantificacin ms difcil que en CG y HPLC.40

Disolventes usados en la CCF de algunos grupos de compuestos orgnicos (Relacin v/v)

Esteroides y Esteroles: Benceno o benceno-acetato de etilo (9:1 8:2), (Slica gel G) Cloroformo-etanol (96:4), (almina) Acetato de etilo-ciclohexano (mezclas diversas), (cido silcico aglutinado con almidn) Benceno-cloroformo (9:1), (Slica gel G)41

Disolventes usados en la CCF de algunos grupos de compuestos orgnicos (Relacin v/v)

Terpenoides Hexano o hexano-acetato de etilo (85:15), (cido silcico aglutinado con almidn) Benceno o mezclas de benceno-ter de petrleo o etanol (almina) ter isoproplico o ter isoproplico-etanol (5:2 o 19:1) (Slica gel G)

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Disolventes usados en la CCF de algunos grupos de compuestos orgnicos (Relacin v/v)

Aceites esenciales Benceno-cloroformo (1:1), (Slica Gel G) ter de petrleo (Slica gel G)

Cardenlidos Cloroformo-piridina (6:1), (Slica Gel G)

cidos grasos ter de petrleo-ter isoproplico-cido actico (70:30:1), (Slica Gel C) Cloroformo-ter de petrleo (Almina)43

Disolventes usados en la CCF de algunos grupos de compuestos orgnicos (Relacin v/v) Vitaminas Metanol-tetracloruro de carbono-xileno, cloroformo (almina) Cloroformo-ter de petrleo (Almina) Metanol, propanol o cloroformo (gel de slice G)

Alcaloides Cloroformo o etanol o hexano-cloroformo (3:7) ms 0.05% dietilamina (Almina) Benceno-etanol (9:1), (Slica Gel) Cloroformo-acetona-dietilamina (5:4:1), (Slica Gel G)44

Separacin I: Slica gel GF Fase mvil: Benceno Revelador: fosfomolibdato, 10 min, 100C Anisaldehido-cido sulfrico, 10 min 100C

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Separacin 2: Fase estacionaria: Slica Gel G Fase mvil: cloroformo-benceno (75+25) Revelador: fosfomolibdato, 10 min, 100C

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Separacin 3: Fase estacionaria: Slica Gel G Fase mvil: benceno-Acetato de etilo (70+30) Revelador: anisaldehido-Acido sulfrico, 10 min, 100C

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Bioautografa

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Anlisis Cuantitativo1) In situ

Fluorescencia Radiocromatogramas 2) Espectrofotomtricas Raspado y disolucin Elucin de las manchas49

Densitmetro

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Cromatografa en Capa Fina Preparativa Para separar mezclas de masa < 0.5g Capas gruesas de adsorbente (0.2-2 mm) Aplicacin de la muestra de hasta 5 mL Localizacin de bandas por formacin de tiras gua Raspado de bandas para recuperacin de compuestos separados51

CCF preparativa

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CCF de dos dimensiones

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