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Cromatografia
Universidade Federal de PernambucoDepartamento de Química Fundamental
Química Analítica
Universidade Federal de PernambucoDepartamento de Química Fundamental
Química Analítica
Introdução
Cromatografia
“Técnica de separação e análise de misturas por interação dos seus componentes entre uma fase estacionária
e uma fase móvel”
M.Tswett (1903), 1º experimento de Cromatografia com plantas para separar seus pigmentos. fase estacionária inulina (carboidrato) CaCO3 ou a sacarose (mais tarde) fase móvel hidrocarboneto
A separação em bandas coloridas fez a técnica chamar-se de cromatografia. cromatos (grego) significa “cor”
Classificação dos Métodos CromatográficosClassificação Geral Método
EspecíficoFase estacionária Tipo de Equilíbrio
Cromatografia líquida (CL) (fase móvel:líquido)
Líquido-líquido ou partição
Líquido adsorvido em um sólido Partição entre líquidos imiscíveis
Fase líquido-ligado Espécies orgânicas ligadas a uma superfície sólida
Partição entre líquidos e superfície ligada
Líquido-sólido ou adsorção
Sólido Adsorção
Troca iônica Resina de troca iônica Troca iônica
Exclusão por tamanho
Líquido em interstícios de sólido polimérico
Partição/filtração
Cromatografia gasosa (CG) (fase móvel:gás)
Gás-líquido Líquido adsorvido em um sólido Partição entre gás e líquido
Fase gás-ligado Espécies orgânicas ligadas a uma superfície sólida
Partição entre líquidos e superfície ligada
Gás-sólido Sólido Adsorção
Cromatografia com fluido supercrítico(CFS) (fase móvel:fluido supercrítico)
Espécies orgânicas ligadas a uma superfície sólida
Partição entre fluido supercrítico e superfície ligada
Principais tipos de Equilíbrio
soluto adsorvido na superfície da fase estacionária
Adsorção
Partição
Troca iônica
Exclusão molecular
Afinidade
Seção transversalde uma coluna capilar
soluto dissolvidona fase líquida
ligada à superfície da coluna
As moléculasmaiores são
excluídas
As moléculaspequenas penetram
nos poros das partículas
Um tipo de molécula na mistura complexa torna-se ligada à molécula
que está covalentemente ligada à fase estacionária
Todas as outras moléculas
são simplesmente descartadas
Ânions móveis mantêm perto de si, cátions que estão
covalentemente ligadosà fase estacionária
Resina de troca iônica;apenas os ânions são
Atraídos para ela
A+B
BA
BA
B
A B
amostra fase móvel
colunaempacotada
detector
t0 t1 t2 t3 t4
Sin
al d
o
de
tect
or
Tempo
A+B
BA
BA
B
A B
amostra fase móvel
colunaempacotada
detector
A+B
BA
BA
B
A B
amostra fase móvel
colunaempacotada
detector
t0 t1 t2 t3 t4
Sin
al d
o
de
tect
or
Tempo
t0 t1 t2 t3 t4
Sin
al d
o
de
tect
or
t0 t1 t2 t3 t4
Sin
al d
o
de
tect
or
Tempo
Eluição cromatográfica em coluna
A amostra é transportada por uma fase móvelEx.: gás, líquido ou fluido supercrítico
A fase móvel é forçada através de uma fase estacionária imiscível fixa, colocada
na coluna ou em uma superfície sólida
Os componentes que são mais fortemente retidos na fase estacionária movem-se muito lentamente
no fluxo da fase móvel, enquanto que aqueles que se ligam mais fracamente, movem-se
mais rapidamente
Os componentes da amostra se separam em bandas ou zonas discretas que podem ser analisados
qualitativamente e/ou quantitativamente
Eluente = fase móvelEluato = espécie que sai da coluna (A e B)
Fase estacionária(coluna empacotada)
Velocidade de Migração de Solutos
Constantes de Distribuição
Tempo de Retenção Fator de retenção (Velocidades de Migração do soluto)
Fator de separação (Velocidades Relativas de Migração)
A eficiência de uma coluna cromatográfica depende das velocidades relativas nas quais as duas espécies eluem.
Constante de Distribuição (K) Amóvel AestacionáriaK
CE → concentração molar do soluto na fase estacionáriaCM → concentração molar do soluto na fase móvel
Tempo de Retenção (tR)Tempo que a amostra leva para chegar ao detector
espécie não retida
espécie retida
Mt
Lu
Rt
Lvelocidade de
migração das espécies não retidas
velocidade média de deslocamento das moléculas na
fase móvel
M
E
C
CK
Tempo Morto(tM)
Tempo que a amostra leva para passar pela coluna
Velocidade de Migração de Solutos
Fator de Retenção (k’) 2 < k’ < 10
M
MR
t
ttk
'
Fator de Separação () MAR
MBR
tt
tt
A
B
K
K
Alargamento da Zona Cromatográfica e Eficiência da Coluna
Alargamento da Zona cromatográfica
Eficiência de uma coluna Variáveis cinéticas que afetam eficiência da coluna
Fatores que influenciam no Alargamento da Zona
O tempo gasto em uma fase é irregular (depende do ganho acidental de energia térmica) O tempo de residência em uma fase (curto ou longo) A velocidade de movimento das moléculas varia consideravelmente Algumas moléculas viajam rapidamente devido a inclusão acidental na fase móvel Algumas moléculas podem ser incorporadas na fase estacionária por um tempo acima da média
flui móvel fase a qual na velocidade
coluna na residência de tempobanda uma de Largura
Eficiência de uma coluna
A eficiência da coluna aumenta à medida que o número de pratos (N) torna-se maior e a altura do prato diminui.
H
LN
Onde,
H = Altura equivalente a um prato teórico
N = Número de pratos teóricos
L = Comprimento da coluna empacotada
De onde vêm os termos “número de pratos teóricos” e “altura do prato” ?
De um estudo teórico feito por Martin e Synge no qual trataram uma coluna cromatográfica como uma coluna de destilação
soluto(fase móvel) soluto(fase estacionária)
O movimento do soluto coluna abaixo é tratado como uma transferência em passos da fase móvel em
equilíbrio, de um prato para o próximo
pratos discretos pratos teóricos
Número de Pratos Teóricos (N)
Altura do Prato (H)
As zonas ou bandas cromatográficas possuem o formato de uma curva
Gaussiana onde a largura está diretamente ligada com a variança 2
ou desvio-padrão
A altura do prato é o comprimento da coluna que contém uma fração do analito entre L e L (34% do analito)
LH
2
Núm
ero
de
mo
lécu
las
L
(L-1) (L+1)
Perfil do analito no final da fase estacionária
Distância percorrida
Fase estacionária
LEntrada da amostra Detector
34 % do analitoNúm
ero
de
mo
lécu
las
L
(L-1) (L+1)
Perfil do analito no final da fase estacionária
Distância percorrida
Fase estacionária
LEntrada da amostra Detector
Distância percorrida
Fase estacionária
LEntrada da amostra Detector
34 % do analito
Variáveis Cinéticas que afetam o Alargamento da Zona
Variável Símbolo Unidades Usuais
Velocidade linear da fase móvel u cm.s-1
Coeficiente de difusão na fase móvel DM cm2.s-1
Coeficiente de difusão na fase estacionária DE cm2.s-1
Fator de retenção k’ adimensional
Diâmetro da partícula da fase estacionária dp cm
Espessura da camada de líquido que recobre a fase estacionária
df cm
CuuBAH
uCCuBAH ME
Difusão longitudinal (B/u) Difusão do soluto do centro concentrado de uma zona para regiões mais diluídas, a frente e atrás do centro da zona (na região paralela e oposta ao fluxo da fase móvel)
Caminhos múltiplos (A) múltiplos caminhos que a a molécula ou íon pode encontrar através da fase estacionária
Coeficiente de transferência de massa (Cu) O equilíbrio entre a fase estacionária e a fase móvel é estabelecido tão lentamente que uma coluna cromatográfica opera sempre sob condições de não-equilíbrio. CEu = freqüência média com que as moléculas do analito alcançam a interface na qual pode ocorrer a transferência para a fase móvel CMu= freqüência média com que as moléculas do analito alcançam a interface na qual pode ocorrer a transferência para a fase estacionária
Equação de van Deemter
Processo
Caminhos múltiplos de fluxo
Difusão longitudinal
Transferência de massa para eda fase líquida estacionária
Transferência de massa na fasemóvel
Relação entre Altura do Prato e o tipo de coluna
CuuBAH
Otimização da Eficiência da Coluna
Redução do alargamento da zona
Alteração das velocidades relativas de migração dos componentes
Uma separação cromatográfica é otimizada com a variação das condições experimentais até que os componentes de uma mistura sejam claramente separados com o consumo mínimo
de tempo
Os experimentos visam:
Variáveis que afetam a Resolução da Coluna
Variação de N
Variação de H Variação do fator de retenção
Variação do fator de separação
Resolução da Coluna RE
Fornece uma medida quantitativa da sua habilidade de separar dois analitos
BA
RRE WW
ttR
AB )()(
Efeito da Retenção sobre a Resolução4'1
''
B
AB N
k
kkRE
222 )'
'1()
1(16
B
BE k
kRN
Efeito do Fator de Separação
sobre a Resolução
Fornece apenas uma peça de informação qualitativa acerca de cada espécie em uma amostra (presença ou ausência).
Exige confirmação por outros métodos.
Dados adicionais podem ser obtidos com diferentes fases móvel e estacionária.
É um precursor crucial de análises espectroscópicas qualitativas
Análise Qualitativa
Aplicação da Cromatografia
Análise baseada em Altura de Pico (Hpico 1/Lpico)
Análise baseada em Áreas de Picos (integradores, planímetros ou recorte da área) (Apico independe Lpico)
Calibração e Padrões (curva de calibração de padrões de composição próxima a da amostra)
Método do Padrão Interno (injeção de padrão junto com a amostra e compara as áreas)
Método da Normalização da Área (compara-se a área total de todos os picos eluídos e corrigidos de acordo com as suas diferentes respostas no detector, com a área individual do pico do analito)
Análise Quantitativa
Aplicações Práticas da Cromatografia
QUÍMICA:Determinação de antioxidantes, nutrientes ou contaminantes em alimentos
SAÚDE:Análises dos constituintes do sangueAnálise forense
AMBIENTE:Determinação de resíduos de pesticidas em produtos alimentares, águas ou esgotosDeterminação de gases e solventes orgânicos na atmosfera, solos ou rios
Cromatografia Gasosa
Universidade Federal de PernambucoDepartamento de Química Fundamental
Química Analítica
Separação de componentes de uma amostra por partição entre uma fase móvel, gasosa, e uma fase estacionária, filme de líquido não volátil, dispersa à superfície de um suporte sólido
Cromatografia Gasosa
Cromatografia gás-líquido
Cromatografia gás-sólido
Na cromatografia gasosa a fase móvel é um gás inerte. A fase móvel não interage com o analito. Sua única função é transportá-lo através da
coluna
Separação de componentes de uma amostra por partição entre uma fase móvel, gasosa, e uma fase estacionária, absorvente sólido
Ela é aplicável a substâncias voláteis (ou substâncias que facilmente se podem transformar em substâncias voláteis)
Princípios da Cromatografia Gasosa
Volume de Retenção Para se levar em conta os efeitos da pressão e da temperatura é útil se considerar os volumes de retenção em vez do tempo de retenção
FtV RR FtV MM F = é a vazão volumétrica média dentro da colunaV e t = são os volumes e o tempo de retenção R e M = espécies retida e não-retida pela coluna
Medida da vazão volumétrica média do gás dentro da coluna (F)
P
PP
T
TFF OHC
m2
TC = temperatura da coluna em KelvinT = temperatura do medidor(T ambiente)Fm = velocidade do fluxo medidaP = pressão do gás no final da coluna(P ambiente)
Princípios da Cromatografia Gasosa
C
MRg TW
ttjFV
273
Volume de Retenção Específico (Vg)
Como a pressão dentro da coluna é uma função não linear entãoos volumes de retenção devem ser corrigidos por um fator decorreção da queda de pressão j
Vg = volume do gásW = massa da fase estacionáriaTc = Temperatura em Kelvin
Relação entre Vg e K
CEg T
KV
273
densidade do líquido que compõe a fase estacionáriak’ = fator de retenção
Cromatografia Gasosa
• A amostra é injetada (injetor da amostra) e arrastada pela fase móvel (gás de arraste) através da coluna que contém a fase estacionária (coluna CG aquecida), onde ocorre a separação da mistura. As substâncias separadas saem da coluna dissolvidas na fase móvel e passam por um detector que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de material separado.
Escolha dos Gases
• Devem ser quimicamente inertes• A escolha pode ser em função do detector• Devem ser eficazes em fazer avançar os analitos na coluna• Devem proteger a coluna de oxigênio e água
Ar ,
Splitter (divisor de amostra)• Possibilidade de rejeitar parte da amostra. Evita a saturação da coluna (a capacidade de separação das colunas capilares é baixa)
Pequeno volume e tempo curto, sem decomposição e sem alterar as condições da coluna A injeção exige um elevado grau de precisão
Para uma evaporação total dos componentes da amostra a temperatura do injetor deve estar a cerca de 50ºC acima do composto menos volátil. A amostra tem que estar em forma de vapor ao entrar na coluna (exceto nos injetores on-column)
Sistema de Injeção da amostra
A rapidez da evaporação é essencial para evitar a discriminação
Amostras de 0,01 a 50 L (válvula / seringa)
Universais / splitless / on-column / head-space / autoinjetores
Injetores
• Ponta da agulha da micro-seringa é introduzida
no início da coluna.
Volume injetado – depende da coluna, do detector e do estado físico da amostra
• Amostra injetada é vaporizada instantaneamente no início da coluna
• Amostra vaporizada é forçada pelo gás de arraste a fluir pela coluna.
Injeção da Amostra
• Considerando os dois componentes de separação mais difícil
As colunas empacotadas estão caindo em desuso
Avaliação da qualidade de uma coluna cromatográfica
Colunas empacotadas e colunas capilares
Colunas
Poder de separação
Capacidade de carga
A determinação destes fatores deve ser rotineiraA resolução é uma boa medida da qualidade
Seletividade
• Peso máximo em mg para o qual a coluna mantém 90% do seu poder de separação
• Número de pratos teóricos por metro
Colunas Empacotadas
Vidro / aço / Teflon - 2 a 6 mm de diâmetro interno e de 1 a 3 m de comprimento 500 a 1000 pratos/m
GL - suporte inerte revestido de uma fase líquida não volátil
Terra de diatomáceas - resíduos de plantas unicelulares / SiOHPolímeros porosos - Porapak e Chromosorb (250 C máx.)
GS - suportes sólidos adsorventes (crivos moleculares)
Baixa volatilidade Quimicamente inertes
Colunas Capilares
Sílica (revestida com uma fina camada de fase estacionária) com 0,1 a 0,53 mm DI e 25 a 100 m de comprimento Gás-sólido(GS)
Filme líquido (fase estacionária) reveste o interior da coluna (filmes de 0,1 a 5 m) Gás-líquido(GL)
Tubos capilares (aço, Al,Cu, plástico, vidro) revestidos interiormente com um filme (0,1 e 5 m) de fase estacionária
(FSOT)Tubo de sílica purificada(conteúdo mín. de óxidos
metálicos)
Filme (~30m) de suporte sólido (ex. diatomita) efase estacionária
Tipo de Colunas Capilares
Filmes espessos são usados para amostras muito voláteis (retêm solutos
durante mais tempo / melhor separação) Filmes mais finos são usados para amostras menos voláteis
Filme de suporte sólido poroso (ex. polímeros porosos) e fase estacionária
Características das colunas
Capilar EmpacotadaDiâmetro
Comprimento
Material
Fase estacionária
0.10 a 0.50 mm
5 a 100 m
Vidro, aço
É depositada como filme, aplicado diretamente às paredes do tubo
3 a 6 mm
0.5 a 5 m
Vidro ou metal
É depositada como filme, sobre partículas de um suporte adequado
VANTAGENS DESVANTAGENS
Em
pa
cotad
a
Mais econômica
Maior capacidade de carga
Maior quantidade de amostra
Se o material de enchimento não for colocado na coluna de forma compacta e uniforme, os espaços vazios resultantes funcionarão como câmaras de diluição da amostra.
Menor eficiência
Análise mais lenta
Ca
pila
res
Maior comprimento maior eficiência
Separação de misturas complexas
Análise mais rápida
Maior separação
Capacidade de processamento da amostra inferior. Satura rapidamente.
Menor quantidade de amostra
Colunas
Cromatogramas Típicos em Colunas Tubulares Abertas (tipo WCOT ou PLOT)
Fase Estacionária
a= polidimetil-siloxanob= fenilmetildimetil-siloxano 5%c= fenilmetildimetil-siloxano 50%d= poli(trifuorpropil-dimetil- siloxano 50%e= polietilenoglicolf= poli(cianopropil-dimetil) - siloxano 50%
Aquecimento da coluna
Faixa de temperatura entre 50 a 450º C
Depende do p.e. da amostra e do grau de separação necessário
O aumento de temperatura diminui a separação mas diminui drasticamente o tempo de eluição
Para amostras onde observa-se grande variação de pontos de ebulição deve usar-se um programa de temperaturas
Rampa por patamares
Rampa contínua
Isotérmica
Programa de temperaturas
Programa de temperaturas
Isotérmica a 45 ºC
Isotérmica a 145 ºC
Temperatura programada: 30 -180ºC
Características próximas das dos solutos a serem separados
Selectividade, deve ser um bom solvente diferencial dos componentes da amostra
Quimicamente inerte relativamente à amostra
Pouco viscosa
Pura
Volatilidade baixa (ponto de ebulição 200ºC acima da temperatura máxima a utilizar)
Estabilidade térmica
Características de uma Fase Estacionária
Colunas não polares (BP1; OV1; SE30) Colunas mediamente polares (BP5; OV-3; SE52) Colunas polares (BP20; carbowax20M, DBwax)
Fases Estacionárias
Fases Estacionárias
Polaridade de Solutos
Útil para a separação de substâncias não retidas nas colunas Gás-Líquido (partição) tal como os componentes do ar, sulfeto de hidrogênio, dissulfeto de carbono, óxidos de nitrogênio, monóxido de carbono, dióxido de carbono e gases raros
Cromatografia Gás-Sólido (GS)
Adsorção de substâncias gasosas sobre superfícies sólidas
Podem ser usadas colunas empacotadas ou tubulares abertas (camada fina de adsorvente é fixada na parede interna do capilar)
Polímeros Porosos Leitos de polímeros porosos (de tamanho de poro uniforme) são fabricados a partir de estireno com ligações cruzadas com divinilbenzeno (Bom para espécies gasosas polares)
Peneiras moleculares Trocadores de íons de silicato de alumínio cujo tamanho de poro depende do tipo de cátion presente (40/60 até 100/120 mesh)
PLOT
Peneiras moleculares versus Polímeros porosos
Pré-coluna gás-líquidopara separação do CO2
Coluna de peneiramolecular
Cromatografia Gás-Sólido (GS)
Examinam continuamente o material, gerando um sinal na passagem de substâncias que não o gás de arraste
Dispositivo que indica e quantifica os componentes
separados pela coluna.
Detectores
Resposta linear que se estenda por várias ordens de grandeza
Um intervalo de temperatura que abranja desde a temperatura ambiente até pelo menos 400ºC
Resposta rápida independentemente da vazão
Confiabilidade e de fácil uso
Ser altamente sensível
Não ser destrutivo
Boa estabilidade e reprodutibilidade durante grandes intervalos de tempo
Responder a uma grande variedade de compostos com similaridade de resposta
Características do Detector Ideal
Universais – Geram um sinal para qualquer composto
Seletivos – Geram um sinal apenas para compostos com determinadas características
Específicos – Geram um sinal para compostos que tenham um determinado elemento na sua estrutura
Classificação dos Detectores
Tipos de Detectores
Condutividade Térmica
UniversalDetecta matéria
orgânica e inorgânica
O gás de arraste tem uma condutividade térmica conhecida.
A resistência do filamento muda com a condutividade do gás.
A presença de analitos altera a condutividade térmica do gás de arraste (H ou He).
A sensibilidade aumenta com a diminuição da temperatura, do fluxo e da corrente.
Os filamentos queimam na presença de oxigênio.
Baseia-se na alteração da condutividade térmica de um fluxo de gás na presença da amostra
Detector de Ionização de Chama
O efluente da coluna (amostra+gás de arraste) é misturado com hidrogênio e ar e entra em ignição eletricamente produzindo íons e elétrons que conduzem
eletricidade através da chama.
Um potencial de centenas de volts é aplicado no eletrodo coletor gerando uma corrente (sinal).
O número de íons é grosseiramente proporcional ao número de átomos de carbono reduzidos na chama.
Não é sensível a H2O, CO2, SO2 e NOx. Bom para determinar poluentes orgânicos em amostras de águas naturais.
Quase UniversalTem uso mais geral sendo útil para a análise da maioria das amostras orgânicas incluindo
contaminadas por água e óxidos de nitrogênio e enxofre. É destrutivo
Detector Termiônico
Seletivo com relação a compostos orgânicos com P e N São detectores por ionização que utilizam sais de metais alcalinos emum plasma gerado pela aplicação de um potencial elétrico adequado
em um fluxo de ar e hidrogênio.
CsBr, Rb2SO4
queimadorCatalisador de compostos
contendo N ou P
Detector de Captura de Elétrons
SeletivoAplica-se na separação de halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados,
nitrilas, nitratos e organometálicos (ótimo para pesticidas)
Gás de arraste ionizadoproduzindo elétrons
(N2)
de 3H e 63Ni e-
e-
e-
e- e-e-
e-
Moléculas eluidas da colunacapturam os elétrons
produzidos pela ionização do gás de arraste
Os elétrons são coletados no anodo gerando uma corrente
amplificada no eletrômetro
Detector de Emissão Atômica
Seletivo O eluente é introduzido em um plasma de hélio energizado por
microondas acoplado a um espectrômetro de emissão óptica
Conjunto de diodos
O plasma atomiza e excitatodos os elementos da amostra
emissão
Detector de Espectrometria de Massa (GC/MS)
Alguns Detectores de Massa
Detector de massa
Registro típico de um GC/MS
benzeno
1- ar2- água3- HCN4-desconhecido5-acetaldeído6-etanol7- acetonitrila8-acetona8b-desconhecido9-CS2
10-desconhecido11-desconhecido12-benzeno13- tolueno14- xileno
Aplicações Práticas
Quimica:Determinação de antioxidantes, nutrientes ou contaminante em alimentos
Indústria:Monitoramento de processos industriais
Saúde:Análises dos constituintes do sangueAnálise forense
Ambiente:Determinação de resíduos de pesticidas em produtos alimentares, águas ou esgotos
Determinação de gases e solventes orgânicos na atmosfera, solos ou rios
Conclusão
A importância principal deste método é a de conseguir obter separação de misturas complexas
Para uma análise quantitativa ou qualitativa deve-se associar a este método outro método analítico como por exemplo:
Espectrometria de massa
Espectrometria por absorção no infravermelho
Espectrometria de emissão atômica
