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06/04/2010
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Universidade Federal de SergipeCentro de Ciências Exatas e Tecnologia
Departamento de QuímicaNúcleo de Pós-Graduação em Química
Métodos Cromatográficos (PG404006)
Métodos Cromatográficos (PG404006)
Prof: Dr. Marcelo da Rosa Alexandre
Escritório: LCP – Pólo da Física/Química
Horário: a combinar
E-mail: [email protected]
Website: http://mralexandre.wordpress.com
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Informações Gerais
Horário: Terça e Quinta 7:00 até 9:00 (??????)
Local: Sala do NPGQ
Bibliografia: Modern Practice of Gas Chromatography, 4 edição, 2004, Grob and Barry
Basic Gas Chromatography, 1997, McNair and Miller
F d t d C t fi 2006 C lli B B tFundamentos de Cromatografia, 2006, Collins, Braga e Bonato
Informações GeraisRevisão crítica: Serão feitas (em duplas) 4 revisões de artigos científicos de no máximo 2 laudas
“Term paper”: Ao final do curso, cada dupla, deverá escrever um artigo científico (review) sobre um tema à sua escolha
Laboratório: Haverá, no mínimo, uma aula complementar no laboratório de cromatografia
Avaliação: Ao final do curso, em data a ser definida, haverá uma avaliação individual versando sobre o assunto estudado
N t P i l (A li ã *0 4 T P *0 3 Médi RC*0 3)Nota Parcial: (Avaliação*0,4 + Term Paper*0,3 + Média RC*0,3)
Nota Final: (NP Prof. Marcelo + NP Prof. Sandro)/2
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PERGUNTAS ?
CROMATOGRAFIA
1834 – 1903: Runge, Goppelsroeder, Schonbein e Day – Análise de extrato de l l i d ã d plantas com papel picado, separação de
soluções salinas, análise utilizando capilaridade em tira de papel, etc....
Michael Tswett - 1906
Separação da clorofila de uma mistura de pigmentos de planta.
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Carbonato de cálcio em pó
Pequena quantidade de amostra
Éter de petróleo Éter de petróleo
Bandas separadas e de cores distintas.
éter depetróleo
mistura depigmentos
CaCO3 pigmentosseparados
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CROMATOGRAFIA
Kroma = cor Graph = escrever
Escrevendo em cores
Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
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USOS E APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA
A grande variedade de combinações entrefases móveis e estacionárias a torna umatécnica extremamente versátil e de grandegaplicação.
A cromatografia pode ser utilizada para aidentificação de compostos, por comparaçãocom padrões previamente existentes, para a
f d dpurificação de compostos, separando-se assubstâncias indesejáveis e para a separaçãodos componentes de uma mistura.
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CLASSIFICAÇÃOCLASSIFICAÇÃO
Segundo a forma física do sistema cromatográfico:Segundo a forma física do sistema cromatográfico:
Cromatografia planar Cromatografia planar, cromatografia em coluna e centrífuga
Segundo o modo de separação:Segundo o modo de separação:
adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos.
Segundo a fase estacionária utilizada: Fase estacionárias sólidas, Líquidas e quimicamente ligadas
Segundo a fase estacionária utilizada: Fase estacionárias sólidas, Líquidas e quimicamente ligadas
Segundo a fase móvel empregada:Segundo a fase móvel empregada:Segundo a fase móvel empregada:Segundo a fase móvel empregada:
Cromatografia líquida – LíquidoCromatografia Gasosa – GásCromatografia supercrítica – Fluído supercrítico
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CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA
Pl E lTé i Planar Em coluna
Gás Fluidosupercrítico
LíquidoLíquido
Técnica
Fase
Móvel
L S FL L LS S SFL FL FLFase
Estacionária
L= líquido, S = sólido, FL= fase ligada
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Velocidade de passagem de um soluto
Separação dos Componentes
Velocidade de passagem de um soluto individual na fase estacionária depende da partição da molécula entre as duas fases.
Kd = Ce / Cm
Kd = coeficiente de partição
Ce = concentração do soluto na fase estacionária
Cm = concentração do soluto na fase móvel
Valor de Kd elevado.
O soluto tem maior afinidade com a fase estacionária.
Maior tempo de retenção.
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Tempo de retenção.
Distância percorrida por cada soluto num certo tempo.
Resultado das forças de eluição e resistência.
Substâncias que se movimentam vagarosamente: mais fortemente presas à
fase estacionáriafase estacionária.
Substâncias que se movimentam rapidamente – gastam uma fração de rapidamente gastam uma fração de
tempo menor na fase estacionária devido à menor solubilidade ou
afinidade a essa fase.
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CHROMATOTRON
Chromatotron é umacromatografia em camada delgadag f gpreparativa e aceleradacentrifugamente.
Foi desenvolvida pelos autores do Compendium of Organic Synthetic Methods. Substitue as CCDpreparativas, pequenas colunas e HPLC Com dimensiões 30 cmHPLC. Com dimensiões ~ 30 cm.
Cromatografia em Papel
A cromatografia em papel (CP) é umatécnica de partição líquido–líquido,p ç q qestando um deles fixado a um suportesólido. O suporte é saturado em água e apartição se dá devido à presença de águaem celulose (papel de filtro). Este método,embora menos eficiente que a CCD, émuito útil para a separação de compostospolares, sendo largamente usado embioquímicabioquímica.
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Cromatografia em Camada Delgada
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica deadsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação dosç q p çcomponentes da mistura ocorre em função da migraçãodiferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixonuma superfície plana, por meio de uma fase móvel (um líquidoou misturas de líquidos).
O parâmetro mais importante a serconsiderado em CCD é o fator deretenção (Rf), o qual é a razão entre adistância percorrida pela substância emquestão e a distância percorrida pela fasemóvel Os valores ideais para Rf estãomóvel. Os valores ideais para Rf estãoentre 0,4 e 0,6
Por ser um método simples, rápido,visual e econômico, a CCD é atécnica predominantementeescolhida para o acompanhamentode reações orgânicas, sendo
bé l dtambém muito utilizada para apurificação de substâncias e para aidentificação de frações coletadasem cromatografia líquida clássica.
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Cromatografia em Coluna
A cromatografia em coluna é uma técnica usadapara a separação de muitos compostos orgânicos.Essa técnica fundamenta-se basicamente napolaridade relativa das moléculas envolvidas.
Utiliza-se tubos de vidro compactado com ummaterial polar finamente dividido (suporte sólidoou fase estacionária), em geral, alumina ousilicagel, empacotado com um solvente orgânicoou uma mistura de solventes.
Uma solução contendo o composto que seUma solução contendo o composto que sedeseja purificar é aplicada na superfície superiorda fase estacionária, e após eluição coletarfrações com volume predeterminados, as quaismuito provavelmente conterão os componentesda mistura separados.
Cromatografia Gasosa (CG) e Cromatografiia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE)
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Cromatografia Gasosa (CG)x
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
GCGC
Em CG, a amostra tem que ser volátil e termicamente estávelnas condições de análise.
Limitada na separação de substância com caráter iônico, fotoe termicamente sensíveis e que apresentam masssa molecularalta.
Dificuldade de ser utilizada como técnica preparativa(normalmente destrutiva)
Cromatografia Gasosa (CG)x
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
CLAECLAE
O principal requisito é que a amostras seja solúvel na fasemóvel de trabalho
Permite a separação de compostos de alta massa molar ecompostos iônicos
d õ bA maioria das separações ocorre em temperatura ambiente
É uma técnica analítica que pode ser adaptada para a escalapreparativa
Permite posterior caracterização estrutural
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Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)
TR´ -Tempo de Retenção Ajustado = O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito
tRt ’ = t - t
tM
tR = tR - tM
TEMPO
SIN
AL
t = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in-jeção e otR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in-jeção e o ápice do pico cromatográfico)tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)
Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)
VR´ -Volume de Retenção Ajustado = É um parâmetro não diretamente mensurável
vazão do gás de arraste
VR = Volume de Retenção (volume de gás de arraste necessário para eluir um analito)VM = Volume de Fase Móvel (volume de gás de arraste contido na coluna; “volume morto”)
MRR ttt −=′ x CF
VR’ = Volume de Retenção Ajustado (volume de gás de arraste consumido enquanto o analito está sorvido na FE)
VR’ = fFatores termodinâmicos
Parâmetros dimensionais da coluna
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Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)
Kc – Constante de Distribuição
Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária e no gás de arraste:arraste:
Ocorre um “quase-equilíbrio” en-tre o analito sorvido na FE e dis-solvido no gás de arraste.
Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)
Kc – Constante de Distribuição
[A]S = concentração do analito na FE[ ]SAK [A]M = concentração do analito no gás[ ][ ]M
SC A
K =
MENOR RETENÇÃO !!!
Afinidade pela FE [A]S
Volatilidade [A]M
Nota: Apesar de Kc ser uma constante de equilíbrio, o processo cromatográfico não é, uma vez que que o gás de arraste está continuamente se movendo. No entanto, se a cinética de transferência de massa for rápida o suficiente, o sistema cromatográfico irá operar próximo do equilíbrio
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Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)
Escrevendo o equilíbrio em termos de quantidade de matéria (massa)do analito em cada fase, ao invés da concentração, temos:
S
M
VV
=βRAZÃO DE FASES, β: razão entre volumes de FE e gás de arraste na coluna
Onde:
Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)
k – Fator de Retenção (capacidade)
SWkFATOR DE RETENÇÃO, k: razão entre as
d lit tid FE (W )
Assim:
M
S
WWk =massas de analito contidas na FE (Ws) e
gás de arraste (WM)
O fator de retenção k depende da constante termodinâmica de distribuição KC e da razão de fases β da coluna
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Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)
β – Razão de Fases: Depende das dimensões da coluna:
L = comprimento da colunarC = raioda colunada coluna
df = espessura do filme de FE
( )fC
fC
drdr
2
2−=β
rC >> df
Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)
Relação entre VR´ , Kc e β
V ’ pode ser definido em função de K e β:VR pode ser definido em função de KC e β:
VR’ depende diretamente da constante de distribuição do soluto entre a FE e o gás de arraste e das dimensões da coluna.
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Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)
Relação entre VR´ , Kc e β
Outra combinação possível:
É possível estimar tanto o fator detanto o fator de
retenção quanto a constante de
distribuição a partir do cromatograma e das
informações da coluna
Teoria Básica – Formato de picos
a) Normalb) Alargado (broad)b) Alargado (broad)c) Assimetria – frontal (fronting)d) Assimetria – posterior (tailing)e) Picos dobrados (doubled peaks)
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Teoria Básica – assimetria
Fator de Assimetria
Fator de alargamento
Teoria Básica – Eficiência de sistemas cromatográficos
A migração um analito pela coluna provoca
inevitavelmente o alargamento do pico
TEMPO
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Teoria Básica – Eficiência de sistemas cromatográficos
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
Separação deficiente de lit t õ
Picos mais largos e i tanalitos com retenções
próximas.menos intensos = menor
detectabilidade
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
Teoria Básica – Quantificação da Eficiência
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e o gás de arraste:
Cada “estágio” de equilíbrio éequilíbrio é
chamado de PRATO TEÓRICO
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Teoria Básica – Quantificação da Eficiência
O número de pratos teó-ricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:
Coluna mais eficiente
tR
wb
N
Teoria Básica – Quantificação da Eficiência
Altura equivalente de uma prato teórico (H) : é o tamanho de cada estágio de equilibrio
dC df H N
(L = comprimento da coluna)
C f H N0.10 0.25 0.081 3703700.25 0.25 0.156 1923080.32 0.32 0.200 1500000.32 0.50 0.228 1315790.32 1.00 0.294 1020410.32 5.00 0.435 689660.53 1.00 0.426 70423
Capilares, L = 30 m
0.53 5.00 0.683 439242.16 10% 0.549 36432.16 5% 0.500 4000
Empacotadas, L = 2 m
Nota: Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes
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Teoria Básica – Quantificação da Eficiência
Fator de separacação/seletividade (α): é uma medida da separação de picos
Se α = 1: Os picos possuem a mesma retenção (co-eluição)
Resolução (Rs): é uma medida da separação tendo em conta a largura dos picos
)()(2
21 wwdRs+
=d
Teoria Básica – Quantificação da Eficiência
Resolução
Rs ≥ 1,5 – Significa picos totalmente separados
Rs < 1 5 – Significa picos com sobreposiçãoRs < 1,5 Significa picos com sobreposição
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Teoria Básica – Quantificação da Eficiência
Resolução (Rs) versus Seletividade (α)
A Seletividade (α) tem pouco significado se a Resolução (Rs) não for considerada
Em Cromatografia, o objetivo é a resolução dos picos
Teoria Básica – Quantificação da Eficiência
Equação de van Deemter: Relaciona a alturaequivalente a um prato, velocidade linear do gás dearraste e fatores que provocam o alargamento depicosp
Onde
A : Refere-se ao alargamento dos picos devido aos diferentescaminhos seguidos pelas moléculas da amostra (eddy diffusion)
uCuBAH ++=
B : Está relacionado com a difusão do soluto na fase móvel(longitudinal molecular diffsusion)
C : Está relacionado com a facilidade de transferência demoléculas do soluto da fase estacionária para a fase móvel(mass transfer in the stationary liquid phase).
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Teoria Básica – Quantificação da Eficiência
Equação de Golay: Equação de van Deemtermodificada para colunas capilares (tubulares)
Onde
B : Está relacionado com a difusão do soluto na fase móvel(longitudinal molecular diffsusion)
( )uCCuBH MS ++=
CS e CM : Está relacionado as transferências de massa na fasegasosa (CM) e na fase estacionária (CS)
Teoria Básica – Quantificação da Eficiência
N2 : Maior massa molar => provoca diminuição na difusão dosoluto diminuindo o termo B => permite baixa velocidade linearsoluto, diminuindo o termo B > permite baixa velocidade lineardo gás de arraste.
He e H2 : Possibilitam maiores velocidades de fluxo sem perdade eficiência, minimizando tempo de análise.