HPLCCromatografía Líquida de Alta Resolución

Introducción

La cromatografía se basa en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una estacionaria y otra móvil. En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija fueron disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluyera la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de HPCL, que requiere de instrumental especial que permite trabajar con las altas presiones requeridas.

En sus comienzos, se practicó en columnas de 1 a 5 cm de diámetro y de 50 a 500 cm de longitud. Para asegurar caudales razonables, el diámetro de la partícula de la fase estacionaria era de 150 a 200 μm, pero los caudales eran de solo pocas decimas de ml. por minuto por lo que se alargaba varias horas el proceso.

Aplicaciones

Ampliamente utilizada con una gran sensibilidad Determinación de compuestos no volátiles (alto peso

molecular, iones metálicos) . Determinaciones cuantitativas exactas Aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos,

hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, etc.

Clasificación Según el mecanismo de separación o el tipo de fase

estacionaria: a) Cromatografía de reparto (Líquido-Liquido) b) Cromatografía de adsorción (Líquido-Sólido) c) Cromatografía de intercambio iónico d) Cromatografía de exclusión molecular e) Cromatografía de afinidad f) Cromatografía quiral

Cromatografía de reparto Variante más usada en HPCL en la que la

fase estacionaria es un segundo líquido inmiscible con la fase móvil líquida.

Cromatografía de adsorción En este tipo de cromatografía la fase móvil

suele ser un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos, mientras que la fase estacionaria consiste en partículas finamente divididas de sílice o alúmina.

Cromatografía de intercambio iónico Se emplean rellenos en los cuales la

partícula está constituida por un polímero o por sílica gel, en cada caso unida a un grupo funcional aniónico o catiónico.

Cromatografía de exclusión molecular Esta es la variante de la HPCL más

reciente y poderosa ya que es aplicable a especies de alto peso molecular; puede ser por filtración en gel en el cual el empaquetamiento es hidrofílico (sustancias polares) o por permeación en gel donde el empaquetamiento es hidrofóbico (sustancias no polares).

Cromatografía de afinidad Consiste en enlazar de manera

covalente un reactivo llamado ligando de afinidad a un soporte sólido. Su ventaja es ser específica y se usa para asilar biomoléculas rápido.

Cromatografía quiral Usada para separar compuestos quirales.

Para esta se requieren fases estacionarias quirales o aditivos quirales de fase móvil. El agente de resolución quiral (fase estacionaria o aditivo) forma complejos de manera preferente con uno de los enantiómeros.

Diferencias entre CG y HPCL

Ventajas HPCL

Puede usarse con compuestos no volátiles ni termoestables y es aplicable en general a iones inorgánicos.

Ventajas de la CG Equipo sencillo y de bajo costo. Rapidez. Es fácil establecer la interfase con la

espectroscopia de masas.

Instrumentación

Clasificación de equipos

Integrados: Cada una de sus partes están reunidas en un gabinete y su intercambio o conexión con otros componentes es difícil.

Modulares: Los módulos son instrumentos

individuales que permiten no solo armar el equipo según las necesidades, sino aumentar su complejidad según esa necesidad varíe.

Componentes principales Solvente Bomba de alta presión Inyector Columna Detector Graficador

Elección del solvente Disponible comercialmente Precio Pureza y Estabilidad. Disolver la muestra Miscible con otros solventes para formar mezclas

útiles No degradar o disolver la fase estacionaria Tener baja viscosidad para reducir las caídas de

presión Ser compatible con el detector utilizado.

Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV)

Solventes como fase móvil Las interacciones químicas entre la muestra, la fase

móvil y el relleno de la columna determinarán la migración y separación de los componentes que contenga nuestra muestra. La fase móvil puede programarse en la bomba ya sea para que tome de diferentes botellas ya sea un solvente puro o realice una mezcla de solventes en una cámara de mezclado.

Compuestos con interacciones más fuertes con la fase móvil que con la fase estacionaria eluirán más rápidamente de la columna (tiempos de retención menores). La fase móvil puede ser alterada en el transcurso del análisis para manipular las interacciones de los componentes de la muestra con la fase estacionaria, teniéndose así una:

Elución isocrática: Composición constante de la fase móvil.

Elución por gradiente: Los distintos analitos son eluídos con un cambio en la composición de la fase móvil (dos o más disolventes que difieren en su polaridad).

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Filtración y Desgasificación de solventes Las partículas pueden ocasionar costosos

daños a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre ( 0.45 o 0.22 micras) y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.

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Filtración y Desgasificación de solventes El Oxígeno Disuelto puede producir

mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y electroquímicos.

El Nitrógeno Disuelto es el otro componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base.

El Dióxido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente

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Métodos de Filtración de Solventes en HPLC

Hay tres(3) métodos comunes que se utilizan hoy para la filtración previa de los Solventes en HPLC :

Filtro a la Entrada del Solvente Filtración al Vacío Filtración en Línea

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Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC

Existen cuatro métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:

Sonificación Burbujear Helio Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo Desgasificación al Vacío en Línea Temperatura

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Preparación de fase móvil

Ajuste de pH, parámetro critico en la retención de solutos ionizables ( medir antes de dosificar modificador orgánico)

El pH de la solución aumenta con la incorporación de un modificador orgánico.

A valores pH mayores de 7.5 disolución de sílice ( sangrado)

A pH menor a 2 se hidroliza la unión entre la sílice y la fase enlazada.

DESCRIPCIÓN DE LOS PRINCIPALES ELEMENTOS

DEL SOFTWARE DEL HPLC

• Hoy en día las aplicaciones de software las podemos encontrar en la mayoría de las actividades que realizamos; he ahí la importancia de conocer el funcionamiento del programa que se usa para operar el HPLC, es decir, manipular el software.

• El manejo de este software facilita muchísimo la comprensión del funcionamiento del equipo del HPLC, así como también genera el interés por poder aprender el funcionamiento total del equipo y la importancia que este adquiere en las actividades que se realizan.

Hoy en la actualidad las innovaciones y actualizaciones de software avanzan rápidamente por lo que se tienen que actualizar los software para que los equipos no se vayan volviendo obsoletos y su rendimiento sea bajo en comparación con las mejoras que brindan las nuevas actualizaciones.

• 1. Indica el volumen de las soluciones en cada una de las fases (móvil y estacionaria)

• 2. Indica con que solución se esta trabajando y que cantidad de ésta en caso de que se usen dos soluciones al mismo tiempo.

• 3. Indica la cantidad de inyección que vas a meter. Al lado de la cantidad expresada en l (microlitros) se encuentra la letra “W” que indica “con lavado, después de cada muestra corrida”.

• 4. Indica la presión del sistema. • 5. Indica el flujo que está pasando por la bomba

cuaternaria indicada en ml/min.

6. Indica la temperatura de la columna. Desde -10°C hasta los 80°C.

7. Indica el detector de diodos (DAD, por sus siglas en inglés).

8. Indica el detector de Fluorescencia (FLD, por sus siglas en inglés).

9. Indica la integración de los resultados obtenidas de las muestras corridas.

10. Indica el reporte de la muestra corrida, tanto escrito como en un cromatograma

• 11. Indica el tiempo que se da para limpiar la columna después de correr una muestra.

• 12. Indica Mantenimiento Preventivo Asistido (EMF, por sus siglas en inglés).

• 13. Indica el nombre de la secuencia de viales que se está usando.

• 14. Indica el nombre del método que se está usando para correr las muestras. Nota: cada método lleva una secuencia en específico para que no se mezclen con otros métodos.

• 15. Indica el tiempo de falta para correr la siguiente muestra, después del tiempo que pasa entre una muestra y otra, a fin de que se limpie la aguja del inyector.

• 16. Indica que solo se va a correr una muestra, cuando está seleccionado.

• 17. Indica que se va a correr una secuencia de muestras.

• 18. Indica la opción de abrir un método para usarlo o para editarlo.

• 19. Indica que cuando se ha editado un método puedes guardarlo con un nombre diferente para usarlo posteriormente.

• 20. Indica la opción de abrir una secuencia ya preestablecida para usarla o para editarla.

• 21. Indica que cuando se ha editado una secuencia puedes guardarla con un nombre diferente para usarlo posteriormente.

• 22. Se refiere a un reporte interno de las secuencia.

• 23. Se refiere a las señales que está detectando el detector de diodos. El operador puede estar detectando hasta 5 señales diferentes (señal A, B, C, D y E).

• 24. En esta área se muestra el cromatograma en línea de la muestra que se esta corriendo.

• 25. Indica el nombre de la muestra que se esta corriendo.

• 26. Indica donde se encuentra ubicado el vial que contiene nuestra muestra.

• 27. Indica la presión… • 28. Se refiere a un parámetro de la señal del

detector de fluorescencia (FLD). Basado en la excitación de los electrones.

• 29. Se refiere a un parámetro de la señal del detector de fluorescencia (FLD). Basado en la emisión de los electrones.

• 30. All in Peak, indica que todos los espectros durante el pico umbral, se almacenan. Esto es requerido para un control completo de pureza de pico. Se pueden elegir diferentes opciones para almacenar el espectro.

• 31. Indica donde se están almacenando los datos de la corrida de muestras.

• 32. Indica el nombre de la muestra. • 33. Este icono nos permite modificar las

propiedades del inyector, por ejemplo que cantidad necesitamos inyectar, etc.

• 34. Este icono nos permite modificar los parámetros de la bomba cuaternaria y controlar el flujo de la solución que está pasando por ella.

• 35. Este icono nos permite modificar la temperatura del compartimiento de la columna hasta estabilizarla.

36. Este icono nos permite modificar los parámetros del detector de fluorescencia (FLD) para modificar los rangos de la señal.

37. Este icono nos permite modificar los parámetros del detector de arreglo de diodos (DAD) para modificar los rangos de cada una de la señales que estemos usando.