Cultivo y enumeración de bacteriófagos

Dr. José A. Cardé-SerranoDr. Jesús Lee-Borges

Dra. Liza JiménezDr. José M. Planas-Rivera

Universidad de Puerto Rico en Aguadilla

Objetivo

Definir virus Explicar la morfología de un bacteriófago Conocer el ciclo de vida de un virus Realizar técnicas que permitan cultivar y

enumerar bacteriófagos

Definición virus

El termino virus deriva del latín "veneno” Acido nucleico rodeado de una capa de

proteína

Introducción

Este experimento demuestra la habilidad de los virus de replicarse dentro de células susceptibles.

Cultivo de virus Tipos de cultivo

Una sola capa Cultivo primario – células vienen

directamente del organismo Cultivo secundario – células provienen de

linaje de células En suspensión

Células no están en un medio sólido sino en un medio liquido

Introducción

Método de detección Efectos citopatológicos

Tabla 2.1 Página 29 Ensayo de placas Fluorescencia Centros infecciosos Ensayo de transformación

Páginas 27-33

Ciclo reproductivo de los virus

Entrada

La entrada en la célula consta a su vez de dos etapas: la adsorción o fijación del virus en la superficie celular penetración o paso a través de la membrana.

Hay una alta especificidad en la fijación de un virus a la membrana de su célula hospedadora.

A lo largo de un proceso evolutivo, cada virus ha ido adquiriendo sitios de unión específicos para anclarse en la membrana de un determinado tipo celular.

Entrada…

La penetración a través de la membrana sigue diversas modalidades: el virus completo, solamente su ácido nucleico

Por regla general, se necesita la participación de muchas partículas virales para que alguno de ellos logre penetrar en la célula

MOI – “Multiplicity of infection” – cuantas partículas virales son necesarias para infectar una célula

Figura III.1. Esquema de los principales eventos en la adsorción del bacteriófago T4 a la pared celular de la bacteria E. coli.(a)el fago libre muestra las fibras y clavijas de la cola. (b) Adhesión de las fibras de la cola. (c) El fago se acerca a la pared celular y las clavijas entran en contacto con la pared celular.

FIGURA III.2. Esquema del mecanismo de penetración del material genético del fago T4 o T2 a través de la pared celular de la bacteria. (a)Las clavijas del fago entran en contacto con la pared celular y la funda se encuentra extendida. (b) La funda de la cola se contrae y el material genético del fago penetra la pared celular; la lisozima presente en el fago digiere la porción de pared/membrana celular localizada directamente bajo la partícula viral.

http://www.hybridmedicalanimation.com/anim_bacteriophage.html

Modalidades de penetración en la célula

Los virus complejos producen una rotura en la membrana bacteriana en uno de los puntos de anclaje. gracias a la presencia de algunas moléculas de enzimas hidrolíticas entre las proteínas de la capsula.

A través de la rotura, el tubo central inyecta el ADN vírico, quedando la capsula vacía en el exterior de la bacteria.

La presencia de capsula en la superficie bacteriana es un buen indicio de que la bacteria ha sufrido una infección vírica.

Modalidades de penetración en la célula

Otros virus sin envoltura lipídica se introducen en la célula con capsula y todo, lo cual puede realizarse de dos maneras: Por penetración directa: después de la fijación, el virus

abre una brecha en la membrana y se introduce en el citoplasma.

Por endocitosis: la membrana forma una invaginación en torno al virus, llegando a formar una vesícula que penetra en la célula. Formada la vesícula, el virus abre una brecha en la membrana de la misma con ayuda de algunas enzimas hidrolíticas que él mismo transporta, penetrando así en el citoplasma.

Modalidades de penetración en la célula

Los virus con envoltura lipídica burlan la barrera de la membrana celular porque su cubierta lipídica se funde con la membrana, ya que tienen la misma naturaleza. Esta fusión de membranas puede realizarse en dos lugares distintos:Fusión en la superficie celular: de manera que el virión penetra directamente en el citoplasma.

Fusión con un lisosoma: se forma una vesícula por endocitosis, a la que se une un lisosoma para digerir la partícula introducida; entonces, la cubierta lipídica del virus se funde con la membrana del lisosoma y el virión escapa hacia el citoplasma.

“Uncoding” Integración

La fase de integración corresponde a un tiempo, después de la penetración, en que el virus parece desaparecer, pues no se advierte ningún indicio de su presencia ni de su actividad.

Lo que ocurre en esta fase es que se da un desensamblaje de las piezas del virus (si es que ha penetrado completo), y su ácido nucleico queda asimilado en las estructuras celulares aptas para los procesos de replicación y transcripción.

Esta fase, variable de unos tipos de virus a otros, termina con la síntesis de los mARN necesarios para que se sinteticen las proteínas que actuarán en la multiplicación del virus.

Modalidades de fase de integración

Ciclo ordinario o lítico: el ácido nucleico vírico procede inmediatamente a la transcripción de su mensaje genético en los mARN necesarios para su multiplicación, y prosigue rápidamente el ciclo vital. Este tipo de ciclo es el más común en la naturaleza.

Ciclo lisogénico: fue descubierto por Lwoff en bacteriófagos. El ADN vírico se cierra por sus extremos generando un ADN circular. Este ADN se inserta en el ADN bacteriano en un lugar específico en el que la secuencia de nucleótidos bacterianos es semejante alguna región del ADN vírico.

Multiplicación

La multiplicación del virus consiste tanto en la replicación de su ácido nucleico, como en la síntesis de las proteínas de la capsula.

Los ácidos nucleicos y las proteínas recién sintetizadas se ensamblan rápidamente, produciéndose nuevas partículas víricas.

Liberación

La liberación del virus consiste en la salida de las nuevas partículas víricas (viriones), que podrán infectar nuevas células iniciando un nuevo ciclo.

Laboratorio: Parte Práctica

Medida de unidades infecciosas

Se logra inoculando diluciones en serie de un virus en un cultivo de células hospederas.

La respuesta puede ser cuantitativa, Ensayos en placas, transformación,

Cualitativa Todo o nada

Ensayo en placas

PFU (Unidades de formación de placas)

Placa – Región clara en el césped de bacterias Infección lítica Lisis de la bacteria

PFU = # de placas x factor de dilución 20- 100, 30 – 300

Materiales:

Cinco tubos de agar suave de triptona Cinco platos de agar duro de triptona: Nueve tubos de caldo de triptona: Pipetas 1-ml Cultivo bacteriófago (M-13) Cultivo E. coli

Procedimiento

1. Rotule todos los tubos de dilución de la siguiente manera:

- Cinco tubos de agar suave de triptona: 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9- Cinco platos de agar duro de triptona: 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9- Nueve tubos de caldo de triptona: 10-1-10-9

2. Coloque los cinco tubos del agar suave en un baño de María ha 100°C para derretir el agar. Enfriar hasta 55°C y mantenerlo a esta temperatura hasta que lo vaya usar.3. Con pipetas de 1-ml, realice una dilución en serie (10-1-10-9) de la solución original del bacteriófago usando los nueve tubos de 9-ml del caldo de triptona.

Procedimiento

4. Al tubo de agar suave marcado 10-5, añada dos gotas del cultivo de E.coli y 0.1-ml del caldo de triptona con una concentración de 10-4 del bacteriófago. Mezcle, rotando el tubo de ensayo entre las palmas de su mano. 5. Vierta el contenido del tubo sobre la placa marcada 10-5 antes de que el agar se endurezca. Mueva la placa de manera gentil y uniformemente hasta que el agar suave cubre por completo la placa. Deje que se endurezca.6. Repita el paso 4 para las soluciones de 10-5-10-9 del caldo de triptona.7. Incube el plato con los cultivos por 24 horas a 37°C

Replication of M13 in E. coli

* Viral (+) strand DNA enters cytoplasm * Complementary (-) strand is synthesized by bacterial enzymes * DNA Gyrase, II topoisomerase, acts on double-stranded DNA and catalyzes formation of negative supercoils in double-stranded DNA * Final product is parental replicative form (RF) DNA * A phage protein, pII, nicks the (+) strand in the RF * 3'-hydroxyl acts as a primer in the creation of new viral strand * pII circularizes displaced viral (+) strand DNA * Pool of progeny double-stranded RF molecules produced * Negative strand of RF is template of transcription * mRNAs are translated into the phage proteins

Replication of M13 in E. coli

Phage proteins in the cytoplasm are pII, pX, and pV, and they are part of the replication process of DNA. The other phage proteins are synthesized and inserted into the cytoplasmic or outer membranes.

* pV dimers bind newly synthesized single-stranded DNA and prevent conversion to RF DNA * RF DNA synthesis continues and amount of pV reaches critical concentration * DNA replication switches to synthesis of single-stranded (+) viral DNA * pV-DNA structures from about 800 nm long and 8 nm in diamter * pV-DNA complex is substrate in phage assembly reaction

Assembly of phage is associated with the membrane of bacteria and requires five capsid proteins, three assembly proteins, ATP, a proton motive force, and at least one bacterial protein, thioredoxin.

¿Preguntas?

Diluciones:

-Cuando se hacen diluciones siempre se comienza con una concentración de algo (el primero)…

- Se añade mas del segundo, y el efecto es reducir la concentración del primero.

-Asi que si haces cálculos y ves que la concentración aumenta!!... algo hicistes mal!

-Revisa el trabajo para asegurarte que la concentración disminuyó.

C1V1=C2V2

Diluciones….

C1V1=C2V2 Lo importante aquí es definir las variables bien. Ej: Si tienes un amortiguador de fosfato de sodio 0.2M, y tomas 10 ml de el y lo añades a 90 ml de agua.

Cuál es la concentración final de la nueva solución o de la dilución?

Para esta fórmula necesitas 3 de las siguientes 4 variables:

C1= concentración inicial, 0.2MV1= volumen inicial, 10mlC2 = ? concentración final a la queda que no sabemos, x, lo que nos preguntan!V2= volumen final, 100 ml.

Este es un posible punto de error: 90 ml no es el volumen final!!!

Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial

Factores de dilución (fd): es la segunda forma de hacer diluciones.

-Un factor de dilución es una expresión matemática que te permite calcular cuanto mas diluído esta una solución resultante preparada a partir de una solución “stock”.

-Se calcula como: el volumen final dividido entre el volumen inicial. Cual es el factor de dilución en el ejercicio anterior?

100ml/10ml = 10 o lo que es igual, una dilución de 1 en 10; diluido 10 veces!, 10 veces mas diluido, 10 veces mas concentrado... factor de dilución es 10

Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial

Una vez tienes el factor de dilución que hacer?

•lo cambias a decimal o fraccion y lo multiplicas por la C1

•divides la C1 entre el fd. C2=C1/fd; •C2=0.2M/10=0.02M o C2=C1 x fd = 0.2M x 1/10

la [ ] será 1/10 de la original!

Diluciones Múltiples:

Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la concentración final se calcula :

Fd1= 100ml/10ml = 10Fd2 = 50ml/2ml = 25Fd3 = 90ml/30ml= 3FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces…

Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentracion:

Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM

Factor Para 10-5 = 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 0.1:1PFU = 4 x(10X10X10x10x10) == 4 x (100,000) = 400,000

Diluciones Múltiples:Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la concentración final

se calcula :Fd1= 100ml/10ml = 10Fd2 = 50ml/2ml = 25Fd3 = 90ml/30ml= 3FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces…

Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentracion:Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM

Factor Para 10-5 = 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 0.1:1PFU = 4 x(10X10X10x10x10) == 4 x (100,000) = 400,000