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CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

I.I.-- PRINCIPIOS Y MPRINCIPIOS Y MÉÉTODOS BTODOS BÁÁSICOSSICOS

II.II.-- TTÉÉCNICAS Y APLICACIONESCNICAS Y APLICACIONES

MMéétodos en Biotecnologtodos en Biotecnologííaa

Ana Isabel AlcaldeAna Isabel AlcaldeJosJoséé Emilio MesoneroEmilio Mesonero

Facultad de VeterinariaFacultad de VeterinariaUniversidad de ZaragozaUniversidad de Zaragoza

4.4.-- SeparaciSeparacióón celularn celular5.5.-- Viabilidad celularViabilidad celular6.6.-- ClonaciClonacióón, transformacin, transformacióón y transfeccin y transfeccióónn7.7.-- PCR, tipos. SecuenciaciPCR, tipos. Secuenciacióónn8.8.-- SeparaciSeparacióón de proten de proteíínas y protenas y proteíínas recombinantesnas recombinantes9.9.-- Western, Western, SouthernSouthern, Northern , Northern blotblot y marcaje y marcaje radioacticoradioactico10.10.-- InmunohistoquInmunohistoquíímicamica, , inmunocitoquinmunocitoquíímicamica

y y enzimoinmunoensayoenzimoinmunoensayo

TEMARIOTEMARIO

1.1.-- MonitorizaciMonitorizacióón animaln animal

2.2.-- Cultivo celular ICultivo celular I3.3.-- Cultivo celular IICultivo celular II

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BibliografBibliografííaa

• Cultivo de células animales. Morgan andDarling. (Ed Acribia)

• Casas comerciales: Sigma (www.Sigma-Aldrich.com)

Invitrogen (www.invitrogen.com)

• http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/tecnicas_de_cultivo_celular.htm

• http://www.protocol-online.org/prot/Cell_Biology/Cell_Culture/

http://http://www.unizar.eswww.unizar.es//depfarfidepfarfi//unidad_fisiologiaunidad_fisiologia//

DOCENCIADOCENCIA

METODOS EN BIOTECNOLOGMETODOS EN BIOTECNOLOGÍÍAA

TEORTEORÍÍAA

PROGRAMAPROGRAMA

CULTIVOS CELULARES I Y IICULTIVOS CELULARES I Y II

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CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

I.I.-- PRINCIPIOS Y MPRINCIPIOS Y MÉÉTODOS BTODOS BÁÁSICOSSICOS

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓNN

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EvoluciEvolucióón histn históóricarica

1885 1885 ccéélulas de embrilulas de embrióón de pollon de pollo1907 1907 mméédula espinal embrionaria de anfibiosdula espinal embrionaria de anfibios1916 1916 tripsina para disociar las ctripsina para disociar las céélulaslulas19201920--1940 1940 esterilidad y antibiesterilidad y antibióóticosticos1952 1952 primera lprimera líínea celular estable (nea celular estable (HeLaHeLa, Henrietta , Henrietta LacksLacks, tumor , tumor cervixcervix))

Concepto de cultivo celularConcepto de cultivo celular

Conjunto de tConjunto de téécnicas que permiten el mantenimiento de las cnicas que permiten el mantenimiento de las ccéélulas lulas ““in vitroin vitro””, conservando el m, conservando el mááximo de sus propiedades ximo de sus propiedades fisiolfisiolóógicas, bioqugicas, bioquíímicas y genmicas y genééticasticas

.

European Collection European Collection ofof cellcell cultures: http://cultures: http://www.ecacc.org.ukwww.ecacc.org.uk//

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Aplicaciones del cultivo celularAplicaciones del cultivo celular

, Efecto prote, Efecto proteíínana--proteproteíínana))

ÁÁreas de investigacireas de investigacióón en las que son n en las que son úútilestileslos cultivos celulareslos cultivos celulares

-- FisiologFisiologíía y biologa y biologíía celulara celular-- VirologVirologííaa-- InvestigaciInvestigacióón del cn del cááncerncer-- InmunologInmunologíía (a (AcAc monoclonales)monoclonales)-- IngenierIngenieríía de protea de proteíínas (snas (sííntesis)ntesis)-- Aplicaciones diagnAplicaciones diagnóósticassticas-- Aplicaciones mAplicaciones méédicas (tejidos para transplante)dicas (tejidos para transplante)-- Aplicaciones industriales y agronAplicaciones industriales y agronóómicasmicas

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VENTAJASVENTAJAS-- Control preciso del medioControl preciso del medio

ambiente extracelularambiente extracelular-- Homogeneidad de la muestraHomogeneidad de la muestra-- EconomEconomííaa-- Motivaciones Motivaciones ééticasticas

DESVENTAJASDESVENTAJAS-- TTéécnica sensible (asepsia)cnica sensible (asepsia)-- Cantidad y costeCantidad y coste-- Inestabilidad (pasajes)Inestabilidad (pasajes)-- Validez del modelo Validez del modelo ““in vitroin vitro”” (ECVAM(ECVAM

European European CenterCenter forfor ValidationValidation ofofAlternativeAlternative MethodsMethods, etc), etc)

ASPECTOS TASPECTOS TÉÉCNICOSCNICOS

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Tipos de cultivosTipos de cultivos

-- ÓÓrganosrganos-- ExplantesExplantes primariosprimarios-- Cultivo celularCultivo celular

MMéétodos de separacitodos de separacióón celularn celular

•• CentrifugaciCentrifugacióónn•• Capacidad de adherencia al vidrio o Capacidad de adherencia al vidrio o

plpláásticostico•• Mediante uniMediante unióón a anticuerpos especn a anticuerpos especííficos ficos

para determinados componentes para determinados componentes celularescelulares

•• UniUnióón a anticuerpos acoplados a marcaje n a anticuerpos acoplados a marcaje fluorescentefluorescente

•• MicrodisecciMicrodiseccióónn de captura por lde captura por lááserser

8

SeparaciSeparacióón de cn de céélulas marcadaslulas marcadaspor fluorescencia utilizando lpor fluorescencia utilizando lááser ser

y campo ely campo elééctricoctrico

BiologBiologíía de la ca de la céélula en cultivolula en cultivo

1.1.-- SelecciSeleccióón por disgregacin por disgregacióón, adhesin, adhesióón y proliferacin y proliferacióónn

2.2.-- SelecciSeleccióón por tasa de crecimiento hasta confluencian por tasa de crecimiento hasta confluencia

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EQUIPAMIENTO Y PREQUIPAMIENTO Y PRÁÁCTICA GENERALCTICA GENERAL

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EQUIPAMIENTO BEQUIPAMIENTO BÁÁSICOSICO::

-- CABINA DE CULTIVO CELULARCABINA DE CULTIVO CELULAR-- ESTUFA ESTUFA -- INCUBADOR DE COINCUBADOR DE CO22

-- MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES INVERTIDOMICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES INVERTIDO-- CENTRCENTRÍÍFUGASFUGAS-- AUTOCLAVEAUTOCLAVE-- CONGELADORES CONGELADORES -- INSTALACIONES DE CRIOGENIA (NINSTALACIONES DE CRIOGENIA (N22 LLÍÍQUIDO)QUIDO)-- PIPETEADORESPIPETEADORES

CABINA DE CULTIVO CELULARCABINA DE CULTIVO CELULAR

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ESTUFA ESTUFA -- INCUBADOR DE COINCUBADOR DE CO22

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASESMICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASESINVERTIDOINVERTIDO

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PIPETEADORESPIPETEADORES

MATERIAL PLMATERIAL PLÁÁSTICOSTICO

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MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO

CaracterCaracteríísticas:sticas:Medio nutritivo tamponado e isotMedio nutritivo tamponado e isotóóniconico

ComposiciComposicióón: n: Sales inorgSales inorgáánicas (Canicas (Ca2+2+ y Mgy Mg2+2+))Fuente de energFuente de energíía y aminoa y aminoáácidoscidosSuplementos : Suero, glutamina y antibiSuplementos : Suero, glutamina y antibióóticosticos

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOTIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

BME BME Medio bMedio báásico Eaglesico EagleDMEM DMEM Medio de Eagle modificado por Medio de Eagle modificado por DulbeccoDulbeccoRPMI RPMI Medio para cultivo de cMedio para cultivo de céélulas en suspensilulas en suspensióónn

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1.1.-- Adherentes: derivadas de Adherentes: derivadas de óórganosrganosmmúúsculosculohhíígadogadoccéélulas nerviosaslulas nerviosasepitelios renal e intestinalepitelios renal e intestinalorigen neuronalorigen neuronal

2.2.-- SuspensiSuspensióón: cn: céélulas inmunitariaslulas inmunitarias

a.a.-- CCéélulas primarias (cultivo primario y llulas primarias (cultivo primario y líínea primaria)nea primaria)b.b.-- CCéélulas inmortaleslulas inmortalesc.c.-- CCéélulas transformadaslulas transformadas

Tipos de lTipos de lííneas celulares establecidasneas celulares establecidas

CULTIVOS PRIMARIOS Y CULTIVOS PRIMARIOS Y LLÍÍNEAS PRIMARIASNEAS PRIMARIAS

Cultivo primario. Cultivo establececido a partir de un tejido u órgano. Las células mantienen la viabilidad un periodo de tiempo limitado y nose reproducen en cultivo. En general en cultivo presentan una reducción en el número total de células vivas a lo largo del tiempo. Ejemplos : hepatocitos obtenidos de hígado adulto, neuronas, etc...

Línea primaria. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de tiempo limitado pero con reproducción de las células en el cultivo. Ejemplos : fibroblastos dérmicos, queratinocitos, células endoteliales de aorta bovina (BAEC), células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC), etc...

Línea inmortal. Cultivo establecido mediante células que pueden proliferar indefinidamente para lo cual se manipulan genéticamente con el fin de hacerlas inmortales.

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Cultivo primario LCultivo primario Líínea primarianea primaria

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Alto (>10E6 Alto (>10E6 ccééll/ml, >10E5 /ml, >10E5 ccééll/cm2)/cm2)

Bajo (<10E6 cBajo (<10E6 céélulas/ ml, lulas/ ml, <10E5 <10E5 ccééll/cm2) /cm2)

Rendimiento en cultivoRendimiento en cultivo

RRáápida (12 a 24 h)pida (12 a 24 h)Baja (24 a 96 h tiempo de Baja (24 a 96 h tiempo de replicacireplicacióón)n)

Tasa de crecimientoTasa de crecimiento

Se suelen perderSe suelen perderSe mantienen Se mantienen Funciones especializadasFunciones especializadas

CromosomalesCromosomales, , enzimenzimááticos.. se pierdenticos.. se pierden

Pueden expresar Pueden expresar marcadores marcadores especificosespecificos

MarcadoresMarcadores

ElevadaElevadaBajaBajaEficiencia de Eficiencia de clonajeclonaje

BajosBajosElevadosElevadosRequerimientos de sueroRequerimientos de suero

Posible mantenerlas Posible mantenerlas quiescentesquiescentes

CCííclicoclicoMantenimiento Mantenimiento

NoNoSiSiLimitaciLimitacióón de crecimiento n de crecimiento por densidadpor densidad

NoNoSiSiInhibiciInhibicióón por contacton por contacto

NoNoSiSiDependencia de anclajeDependencia de anclaje

TumorogTumorogéénicanicaNoNo--tumorogtumorogéénicanicaTumorogenicidadTumorogenicidad

TransformadaTransformadaNormalNormalTransformaciTransformacióónn

HeteroploideHeteroploide / / AneuploideAneuploideDiploide / Diploide / EuploideEuploidePloidiaPloidia

ContinuaContinuaFinitaFinita

Cultivo primario / Cultivo primario / linealinea primaria y primaria y linealinea estableestable

PROTOCOLO BPROTOCOLO BÁÁSICOSICO

ExtracciExtraccióón del n del óórgano o discriminacirgano o discriminacióón tisularn tisular

DisgregaciDisgregacióón celular mecn celular mecáánica y enzimnica y enzimáática (tripsina)tica (tripsina)

SelecciSeleccióón por centrifugacin por centrifugacióónn

Siembra y mantenimiento del cultivoSiembra y mantenimiento del cultivo

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1.1.-- MMéétodos de aislamiento: todos de aislamiento: especespecííficos de cada tipo celularficos de cada tipo celular

A.A.-- Aislamiento de fibroblastos de polloAislamiento de fibroblastos de pollo

-- 1010--12 embriones12 embriones-- Se extrae el embriSe extrae el embrióón y se eliminan los n y se eliminan los óórganos internos y la cabezarganos internos y la cabeza-- TrituraciTrituracióón y agitacin y agitacióón con tripsinan con tripsina-- CentrifugaciCentrifugacióón y el precipitado se resuspende con SFB y medion y el precipitado se resuspende con SFB y medio-- IncubaciIncubacióón en hielo para dispersin en hielo para dispersióón mecn mecáánicanica-- FiltraciFiltracióón con tamiz y se centrifugan y el precipitado se resuspende en Dn con tamiz y se centrifugan y el precipitado se resuspende en DMEMMEM

y 10%SFBy 10%SFB-- Recuento y siembraRecuento y siembra

1.1.-- MMéétodos de aislamiento: todos de aislamiento: especespecííficos de cada tipo celularficos de cada tipo celular

B.B.-- Aislamiento de hepatocitos de pollo (supervivencia corta)Aislamiento de hepatocitos de pollo (supervivencia corta)

-- Disgregar el hDisgregar el híígado por digestigado por digestióón enzimn enzimáática y EDTA (perfusitica y EDTA (perfusióón)n)-- ExtracciExtraccióón y corte mecn y corte mecáániconico-- CentrifugaciCentrifugacióón y el precipitado contiene alta tasa de hepatocitos (Separacin y el precipitado contiene alta tasa de hepatocitos (Separacióón n

de hepatocitos de cde hepatocitos de céélulas de lulas de KupfferKupffer, , endotelialesendoteliales y biliares)y biliares)-- Lavado y recuento de hepatocitos y siembraLavado y recuento de hepatocitos y siembra

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2.2.-- InmortalizaciInmortalizacióón de cn de céélulas primariaslulas primarias

A.A.-- TransfecciTransfeccióón con genes inmortales (oncogenes den con genes inmortales (oncogenes deorigen vorigen víírico)rico)

gen T grande SV40 (antgen T grande SV40 (antíígeno T), virus DNA de 5Kbgeno T), virus DNA de 5Kb

Induce la sInduce la sííntesis de DNA y la replicacintesis de DNA y la replicacióón n en cen céélulas quiescenteslulas quiescentes

Problema: Problema: ¿¿siguen siendo el mismo tipo celular?siguen siendo el mismo tipo celular?

Fibroblastos humanosFibroblastos humanos

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Células en cultivo. A) Micrografías de contraste de fase de fibroblastos en cultivo. B) Micrografías de mioblastosen cultivo mostrando las células fusionadas para formar células musculares multinucleadas. C) Células precursoras de oligodendrocitos en cultivo. D) Células de tabaco en cultivo

QUERATINOCITOSQUERATINOCITOS

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HEPATOCITOS DE RATAHEPATOCITOS DE RATA

HEPATOCITOS DE PERROHEPATOCITOS DE PERRO

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HEPATOCITOS DE MONOHEPATOCITOS DE MONO

HEPATOCITOS HUMANOSHEPATOCITOS HUMANOS

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EPITELIO PIGMENTARIO EPITELIO PIGMENTARIO HUMANO DE LA RETINAHUMANO DE LA RETINA

CELULAS ENDOTELIALES DE CELULAS ENDOTELIALES DE CORDON UMBILICAL HUMANOCORDON UMBILICAL HUMANO

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CELULAS DE MUSCULATURA CELULAS DE MUSCULATURA LISA HUMANALISA HUMANA

LLÍÍNEAS CELULARES CONTINUASNEAS CELULARES CONTINUAS

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Protocolo de manejoProtocolo de manejo

1.1.-- PreparaciPreparacióónn

-- Acondicionar la cabina (esterilidad: UV)Acondicionar la cabina (esterilidad: UV)-- Medios de cultivo y suplementos a 37Medios de cultivo y suplementos a 37ººCC-- Material plMaterial pláástico al alcance de la manostico al alcance de la mano

2.2.-- Control de los cultivos celularesControl de los cultivos celulares

-- Observar el color del medio del cultivo (amarillento, rojo pObservar el color del medio del cultivo (amarillento, rojo púúrpura, turbidez)rpura, turbidez)-- ObservaciObservacióón al microscopion al microscopio (tapiz, grado de confluencia, etc)(tapiz, grado de confluencia, etc)

(c(céélulas redondas y membranas lisas)lulas redondas y membranas lisas)

3.3.-- DisgregaciDisgregacióón y Recuento de cn y Recuento de céélulaslulas

-- CCáámara de mara de NeubauerNeubauer RecuentoRecuento-- DiluciDilucióón con n con TripTripáánn azul azul ViabilidadViabilidad

--CCéélulas en suspensilulas en suspensióón: n: DiluciDilucióón 1:1 con n 1:1 con TripTripáánn AzulAzul

-- CCéélulas adherentes: lulas adherentes: Lavado con PBSLavado con PBSTripsinaTripsina--EDTAEDTAMedio y centrifugaciMedio y centrifugacióónnResuspensiResuspensióónnTripanTripan azul 2:1azul 2:1

Protocolo de manejoProtocolo de manejo

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SECUENCIA DE DESPEGUE DE LAS CSECUENCIA DE DESPEGUE DE LAS CÉÉLULAS LULAS

NNºº de cde céélulas = 10.000 x dilucilulas = 10.000 x dilucióón x cn x céélulas contadaslulas contadas

CuadrCuadríícula de la ccula de la cáámara de mara de NeubauerNeubauer

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Protocolo de manejoProtocolo de manejo

4.4.-- SubcultivoSubcultivo de cde céélulaslulas

-- CCéélulas en suspensilulas en suspensióón: 10n: 1055/ml/ml--8x108x1055/ml/ml

-- CCéélulas adherentes entre 2,5x10lulas adherentes entre 2,5x1055 y 5x10y 5x1055 para una caja de 25 cmpara una caja de 25 cm22

y entre 4x10y entre 4x10--44 y 5x10y 5x1044 /pocillo en una caja de 24 pocillos/pocillo en una caja de 24 pocillos

3030--505033162162Frasco 162 cmFrasco 162 cm22

1515--30301.51.57575Frasco 75 cmFrasco 75 cm22

55--10100.50.52525Frasco 25 cmFrasco 25 cm22

33--440.20.29.69.66 pocillos6 pocillos

220.090.094.54.512 pocillos12 pocillos

110.040.042224 pocillos24 pocillos

330.150.1588Placa 35 mmPlaca 35 mm

550.40.42121Placa 60 mmPlaca 60 mm

1010114949Placa 90 mmPlaca 90 mm

Volumen Volumen de mediode medio

mlml

NNúúmero de mero de ccéélulas lulas

adherentesadherentes

x 10x 1066

ÁÁrea de rea de crecimientocrecimiento

cmcm22

recipienterecipiente

Tabla de guTabla de guíía para la siembraa para la siembra

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CongelaciCongelacióón de las cn de las céélulas lulas de un determinado pasajede un determinado pasaje

Material: Material: Viales de Viales de crioconservacicrioconservacióónn (2 ml)(2 ml)Glicerol (concentraciGlicerol (concentracióón final 10%)n final 10%)Medio de cultivo con SFB elevado (30%)Medio de cultivo con SFB elevado (30%)

ConcentraciConcentracióón celular: n celular: entre 1 y 3 x10entre 1 y 3 x1066 ccéélulas/1,5 mllulas/1,5 ml

Protocolo de manejoProtocolo de manejo

5.5.-- ElaboraciElaboracióón de una curva de crecimienton de una curva de crecimiento

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Protocolo de manejoProtocolo de manejo

5.5.-- ElaboraciElaboracióón de una curva de crecimienton de una curva de crecimiento

LLííneas celulares derivadas de gliomas humanos. Caracterizacineas celulares derivadas de gliomas humanos. Caracterizacióón n inmunofenotinmunofenotíípicapica y moleculary molecular

PGFA EGFRp53

T98, p53 +

H4, p53 - SW1783, EGFR +

T98, EGFR +

H4, PGFA -

LN405, PGFA+

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3T33T3--SA FIBROBLASTOS DE RATSA FIBROBLASTOS DE RATÓÓNN

3T33T3--L1 FIBROSBLASTOS DE RATL1 FIBROSBLASTOS DE RATÓÓNN

30

M6 CARCINOMA DE COLONM6 CARCINOMA DE COLON

MDCK EPITELIO INTESTINAL MDCK EPITELIO INTESTINAL DE PERRODE PERRO

31

SHSH--SY5Y NEUROBLASTOMASY5Y NEUROBLASTOMA

HepG2HepG2--HEPATOMAHEPATOMA

32

CCéélulas COS (rilulas COS (riñóñón mono)n mono)

CHOCHO--K1 (Ovario de K1 (Ovario de hamsterhamster chino)chino)

33

ECVECV--304 (endoteliales)304 (endoteliales)